Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ thu trứng đến kết quả nuôi thành thục trứng một số loài vật nuôi

u của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và ch−a từng đ−ợc sử dụng và công bố trong bất cứ công trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đ đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ph−ơng Hiền Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 2 LờI CảM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Bùi Xuân Nguyên, chủ nhiệm đề tài nhà n−ớc về công nghệ phôi đ tận tình h−ớng dẫn, giúp đỡ các điều kiện để luận văn này có thể hoàn thành. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến các cô, chú, anh, chị em thuộc phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam và các bạn bè đồng nghiệp, đặc biệt là tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Ước, Tiến sĩ Nguyễn Hữu Đức, Thạc sĩ Nguyễn Văn Hạnh, Thạc sĩ Nguyễn Việt Linh, Đặng Nguyễn Quang Thành, Nguyễn Thị Thuỳ Anh đ nhiệt tình giúp đỡ, góp ý cho tôi trong quá trình thực hiện những thí nghiệm liên quan đến luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn đề tài hợp tác Việt - Pháp BIODIVA - VAST (hợp phần GT5) và đề tài nghiên cứu cơ bản m số 6.120.06 đ tạo điều kiện hỗ trợ để tôi hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Bá Mùi, giảng viên chính bộ môn sinh lý - sinh hóa động vật và tập thể cán bộ, giáo viên khoa thú y tr−ờng Đại học Nông nghiệp I đ tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, anh em, bạn bè đ động viên, ủng hộ và khích lệ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2007 Học viên Nguyễn Thị Ph−ơng Hiền Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 3 MụC LụC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các biểu đồ vii 1. ĐặT VấN Đề 0 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 8 1.2 Mục tiêu của đề tài 9 1.3 ý nghĩa của đề tài 10 2. TổNG QUAN CáC VấN Đề NGHIÊN CứU 11 2.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản trong và ngoài n−ớc 11 2.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản trên thế giới 11 2.1.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản ở Việt Nam 13 2.2 Những nét chung về quá trình sinh sản và thành thục trứng gia súc 14 2.2.1 Cấu tạo của buồng trứng 14 2.2.2 Quá trình sinh tế bào trứng 17 2.2.3 Cấu tạo tế bào trứng (tế bào non) 18 2.2.4 Sự thành thục tế bào trứng 20 2.3 Khai thác và nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm 24 2.3.1 Hiện trạng khai thác trứng trâu, bò, lợn 24 2.3.2 Phân loại chất l−ợng trứng 27 2.3.3 Nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm - In vitro 21 maturation (IVM) 2.3.4 Các yếu tố ảnh h−ởng đến kết quả khai thác và nuôi thành thục 26 trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm 3. ĐốI TƯợNG - NộI DUNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 37 3.1 Đối t−ợng nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu 38 3.3.1 Ph−ơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng 38 3.3.2 Phân loại nang bề mặt buồng trứng 39 3.3.3 Phân loại trứng theo chất l−ợng 39 3.3.4 Ph−ơng pháp nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm 39 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 4 3.3.5 Đ ánh giá các giai đoạn phát triển nhân của tế bào trứng 40 3.3.6 Ph−ơng pháp xử lý số liệu 40 4. KếT QUả Và THảO LUậN 42 4.1 Kết quả khảo sát về khối l−ợng của buồng trứng thu đ−ợc trên trâu, bò, lợn 35 trong hai mùa xuân, hè 4.1.1 Đối với buồng trứng trâu 42 4.1.2 Đối với buồng trứng bò 43 4.1.3 Đối với buồng trứng lợn 45 4.2 Kết quả khảo sát kích th−ớc của buồng trứng thu đ−ợc trên trâu, bò, lợn 39 trong hai mùa xuân, hè 4.2.1 Đối với buồng trứng trâu 46 4.2.2 Đối với buồng trứng bò 48 4.2.3 Đối với lợn 49 4.3 Kết quả khảo sát số nang trứng trên bề mặt buồng trứng trâu, bò, lợn 43 theo hai mùa xuân, hè 4.3.1. Đối với trâu 50 4.3.2 Đối với bò 51 4.3.3 Đối với lợn 52 4.4 Kết quả thu trứng từ buồng trứng trâu bò, lợn theo mùa 55 4.4.1 Đối với trâu 56 4.4.2 Đối với bò 57 4.4.3 Đối với lợn 58 4.5 Phân loại chất l−ợng trứng thu đ−ợc từ buồng trứng trâu, bò, lợn 52 theo hai mùa xuân, hè 4.5.1 Đối với trâu 59 4.5.2 Đối với bò 61 4.6 Kết quả nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong hai mùa xuân, hè 57 4.6.1 Đối với trâu 65 4.6.2 Đối với bò 66 4.6.3 Đối với lợn 68 5. KếT LUậN Và Đề NGHị 72 5.1. Kết luận 72 5.2 Đề nghị 73 TàI LIệU THAM KHảO 74 Phụ lục 72 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 5 DANH MụC CáC CHữ VIếT TắT CNSS Công nghệ sinh sản E Estradiol - 17 eCG Equine Chorionic Gonadotropin FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Releasing Hormone hCG Human Chorionic Gonadotropin LH Luteinising Stimulating Hormone MPF Maturation Promoting factor (yếu tố thúc trứng thành thục) OMI Oocyte Maturation Inhibitor (yếu tố ức chế trứng thành thục) P Progesteron PG, PGF Prostaglandin vcs Và cộng sự Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 6 DANH MụC CáC BảNG Số BảNG TÊN BảNG TRANG Bảng 2.1 Đ−ờng kính trứng của trâu, bò, lợn 20 Bảng 2.2 Phân loại chất l−ợng trứng 27 Bảng 4.1 Kết quả khảo sát khối l−ợng của buồng trứng trâu theo mùa xuân, hè 42 Bảng 4.2 Kết quả khảo sát khối l−ợng của buồng trứng Bò theo mùa xuân, hè 44 Bảng 4.3 Kết quả khảo sát khối l−ợng của buồng trứng lợn theo mùa xuân, hè 45 Bảng 4.4 Kết quả khảo sát kích th−ớc của buồng trứng Trâu theo mùa 47 Bảng 4.5 Kết quả khảo sát kích th−ớc của buồng trứng Bò theo mùa 48 Bảng 4.6 Kết quả khảo sát kích th−ớc của buồng trứng Lợn theo mùa 49 Bảng 4.7 Kết quả khảo sát số nang trứng trên buồng trứng trâu theo mùa 50 Bảng 4.8 Kết quả khảo sát số nang trứng trên buồng trứng bò theo mùa 51 Bảng 4.9 Kết quả khảo sát số nang trứng trên buồng trứng lợn theo mùa 53 Bảng 4.10 Kết quả thu trứng từ buồng trứng trâu theo mùa 49 Bảng 4.11 Kết quả thu trứng từ buồng trứng bò theo mùa 57 Bảng 4.12 Kết quả thu trứng từ buồng trứng lợn theo mùa 58 Bảng 4.13 Phân loại chất l−ợng trứng trâu thu đ−ợc theo mùa 60 Bảng 4.14 Phân loại chất l−ợng trứng bò thu đ−ợc theo mùa 61 Bảng 4.15 Phân loại chất l−ợng trứng lợn thu đ−ợc theo mùa 55 Bảng 4.16 Kết quả nuôi thành thục trứng trâu theo mùa 65 Bảng 4.17 Kết quả nuôi thành thục trứng bò theo mùa 67 Bảng 4.18 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn theo mùa 68 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 7 DANH MụC CáC BIểU Đồ Số BIểU Đồ TÊN BIểU Đồ TRANG Biểu đồ 4.1 Kết quả khảo sát số nang trứng 2mm/buồng trứng theo mùa 54 Biểu đồ 4.2 Kết quả khảo sát số nang trứng < 2mm/buồng trứng theo mùa 55 Biểu đồ 4.3 Kết quả thu trứng từ các nang có kích th−ớc ≥ 2mm theo mùa 59 Biểu đồ 4.4 Kết quả thu trứng loại A trên trâu, bò, lợn theo mùa 63 Biểu đồ 4.5 Kết quả thu trứng loại B trên trâu, bò, lợn theo mùa 64 Biểu đồ 4.6 Kết quả thu trứng loại C trên trâu, bò, lợn theo mùa 64 Biểu đồ 4.7 Tỷ lệ nuôi trứng trâu, bò, lợn thành thục theo mùa 69 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 8 1. ĐặT VấN Đề 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học công nghệ, công nghệ sinh học sinh sản đ và đang đ−ợc quan tâm và nghiên cứu trên nhiều quốc gia, bao gồm các tổ hợp nghiên cứu nh−: công nghệ phôi, công nghệ thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, nhân bản vô tính khác loài, cấy chuyển gen vào trứng, bảo vệ đa dạng sinh học, song để đạt đ−ợc những thành quả trong công nghệ sinh học sinh sản, chúng ta phải bắt đầu đi từ nguyên liệu đầu tiên đó là tế bào trứng. Trong công nghệ sinh sản hiện nay việc sử dụng trứng rất đa dang, trứng trâu, bò có thể dùng để nhân bản vô tính cho loài sao la (Bùi Xuân Nguyên (2006)[32]), trứng lợn có thể dùng để nhân bản vô tính cho loài gấu trúc, cừu, khỉ, lợn, chuột (Dominko T vcs, 1999)[22],…Trong điều kiện thực tế của nền chăn nuôi ở n−ớc ta, đối t−ợng vật nuôi phục vụ cho đời sống của con ng−ời, chủ yếu là ba loài trâu, bò, lợn; việc thu trứng từ ba loài trên để phục vụ cho tổ hợp các nghiên cứu trong công nghệ sinh học sinh sản là vấn đề đang đ−ợc quan tâm. “Hiện tại các nghiên cứu về sự phát triển của buồng trứng và tổ chức buồng trứng đ đ−ợc thực hiện trên nhiều loài khác nhau nh− chuột (Cahill vcs, 1981); lợn, cừu (Drian Court vcs, 1985); bò (Erickson, 1996 a; Mariana và Nguyên, 1973), ng−ời (Barker và Hunter, 1978). Các kết quả nghiên cứu cho thấy buồng trứng của các loài có tiềm năng khổng lồ về sản sinh tế bào non. Số l−ợng nang ở giai đoạn thành thục sinh sản là hơn 68000 - 70000 với bò (Erickson, 1996a); 12000 - 86000 đối với lợn (Driancourt vcs, 1985), (Dẫn theo Bùi Xuân Nguyên (2006)[32]). Trên thực tế trong sinh sản tự nhiên số l−ợng trứng đ−ợc sử dụng là rất hạn chế so với tiềm năng nang của buồng trứng. Ước tính một bò cái chỉ sử dụng từ 10 - 15 trứng trong suốt một đời sinh sản, tức là ch−a tới 0,01% tiềm năng nang trứng có trong buồng trứng (Nguyễn Thị Ước vcs 1996)[16]. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 9 Các nghiên cứu công nghệ sinh sản và các ứng dụng công nghệ sinh sản cần rất nhiều tế bào trứng đ thành thục, là những tế bào trứng có nhân phát triển ở giai đoạn trung kỳ II, biểu hiện bằng sự xuất hiện thể thực thứ nhất có thể quan sát thấy d−ới kính hiển vi. Theo kết quả nghiên cứu đánh giá trạng thái phát triển tế bào trứng đ−ợc khai thác từ buồng trứng nguyên thể cho thấy cần phải nuôi chín trong ống nghiệm vì tỷ lệ trứng thành thục, có thể thụ tinh trong ống nghiệm, trứng có nhiễm sắc thể ở giai đoạn trung kỳ II, có thể thấy thể cực thứ nhất lại chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ. Vì vậy để công nghệ sinh sản thật sự thành công, đáp ứng đ−ợc những mong muốn trong sản xuất chăn nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học, sản xuất tế bào phôi gốc phục vụ trong nghiên cứu và điều trị bệnh, ng−ời ta đ tiến hành khai thác trứng bằng ph−ơng pháp in vitro từ lúc ch−a thành thục với số l−ợng t−ơng đối lớn rồi nuôi thành thục. Kết quả nuôi trứng thành thục chịu ảnh h−ởng bởi rất nhiều yếu tố nh− môi tr−ờng nuôi, thời gian nuôi, nhiệt độ nuôi, điều kiện chăm sóc nuôi d−ỡng con vật,... Với môi tr−ờng sống ở miền bắc Việt Nam, điều kiện khí hậu nh−: nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, thức ăn n−ớc uống,... thay đổi giữa các mùa khác nhau trong một năm sẽ có rất nhiều ảnh h−ởng đến đời sống sinh hoạt của gia súc cái từ đó ảnh h−ởng đến hoạt động sinh lý sinh sản của chúng và kết quả khai thác và nuôi thành thục trứng. Chính vì vậy việc tiến hành những nghiên cứu so sánh khả năng nuôi thành thục trứng của ba loài vật nuôi có số l−ợng phong phú giữa các mùa trong năm ở miền bắc Việt Nam là một việc rất cần thiết để từ đó chúng ta chủ động trong thiết kế những thí nghiệm trong tổ hợp các công nghệ sinh học sinh sản, Với khuôn khổ của thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về khả năng nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn của hai mùa trong năm đó là mùa xuân và mùa hè, đây là hai mùa có kiểu thời tiết cũng khá khác biệt, với đề tài: “Nghiờn cứu ảnh hưởng của mựa vụ thu trứng ủến kết quả nuụi thành thục trứng một số loài vật nuụi” Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 10 1.2 Mục tiêu của đề tài - Đánh giá kết quả nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn và một số chỉ tiêu về sinh học sinh sản liên quan ở mùa xuân. - Đánh giá kết quả nuôi thành thục trứng trâ u, bò, lợn và một số chỉ tiêu về sinh học sinh sản liên quan ở mùa hè. - So sánh kết quả nuôi trứng thành thục và các chỉ tiêu về sinh học sinh sản liên quan vào mùa xuân với kết quả này vào mùa hè đối với mỗi loài trâu, bò và lợn. Qua đó có những đánh giá về ảnh h−ởng của mùa vụ thu trứng lên kết quả nuôi thành thục trứng ở các loài động vật nói trên. 1.3 ý nghĩa của đề tài Nghiên cứu này có ý nghĩa thúc đẩy các nghiên cứu cơ bản cũng nh− ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh sản tại Việt Nam (xác định giới tính phôi bằng ph−ơng pháp PCR, đông lạnh phôi, nhân bản vô tính, cấy chuyển gen vào trứng, bảo vệ đa dạng sinh học, sản xuất trâu, bò thịt cao sản,...) Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 11 2. TổNG QUAN CáC VấN Đề NGHIÊN CứU 2.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản trong và ngoài n−ớc 2.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản trên thế giới Thí nghiệm cấy phôi đầu tiên thành công trên thế giới do giáo s− Walter Heape thực hiện vào năm 1890. Thí nghiệm này đ đánh dấu sự ra đời của công nghệ phôi. Tr−ớc đó đ có một số nhà khoa học nghiên cứu về cấu tạo buồng trứng, nang trứng và tế bào trứng, tinh trùng, quá trình thụ tinh ở động vật bậc cao: “Năm 1672, Ringer de Graaf là ng−ời đầu tiên đ phát hiện ra nang trứng chín (nang trứng chín này đ đ−ợc lấy tên ông - non bao De Graaf) và tiếp theo đó là các công trình nghiên cứu của Prevots & Dumas (1824), William (1878), Betteridge (1881), Những năm tiếp theo, các nghiên cứu về sự phát triển của tế bào trứng và tổ chức của buồng trứng cũng đ đ−ợc thực hiện ở trên các loài khác nhau nh−: trên chuột (Cahill và cs, 1981), trên bò (Erickson, 1996), trên ng−ời (Baker và Hunter, 1978), trên lợn và cừu (Driancouet và cs, 1985) (Dẫn theo Dominko T, 1996)[22]. Các nghiên cứu đ cho thấy buồng trứng các loài có tiềm năng sinh sản rất lớn, thế nh−ng thực tế cho thấy trong sinh sản tự nhiên của các loài động vật, số l−ợng tế bào trứng đ−ợc khai thác và sử dụng là rất hạn chế so với tiềm năng của buồng trứng do phần lớn nang trứng đ bị thoái hóa, tiêu biến (số l−ợng nang trứng ở giai đoạn thành thục của bê là 68000 - 70000, sau 8 năm chỉ còn lại 2500 nang trứng, ở lợn 12000 - 86000 nang trứng; một bò sữa cao sản nếu sinh sản tự nhiên thì trong cả đời của nó (khoảng 15 - 16 tuổi) chỉ có thể sinh ra đ−ợc 10 - 15 bê, tức là ch−a tới 0,01% so với tiềm năng của buồng trứng (Nguyễn Thị Ước vcs 1996)[16]). Việc thu trứng từ các nang trứng non trên bề mặt buồng trứng của động vật, sau đó nuôi chín trứng thu đ−ợc trong ống nghiệm, rồi tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm để sản xuất phôi in vitro nhằm nâng cao khả năng sinh sản của động vật hoặc Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 12 dùng làm nguyên vật liệu cho công nghệ nhân bản động vật nhằm bảo tồn một số giống quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng đang là vấn đề đ−ợc quan tâm nghiên cứu. Những năm tiếp theo, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và các kỹ thuật liên quan đến công nghệ phôi tiếp tục đ−ợc nghiên cứu cải tiến nh− nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm (Fukui vcs, 1983) [24]; Beker vcs, (2002)[20], thụ tinh trong ống nghiệm (Leibfreid - Rutledge vcs 1986)[29], nuôi phôi trong ống nghiệm (Ali vcs, 2003)[19], xác định giới tính phôi giai đoạn sớm bằng kỹ thuật PCR, khai thác trứng ở con vật sống với sự hỗ trợ của máy siêu âm (Ovum Pick Up - OPU) (Galli vcs, 2001)[25]; (Oyamada vcs, 2004)[35],… Năm 1997, sự ra đời của cừu Dolly bằng cấy nhân của tế bào tuyến vú (tế bào Somatic) của một cừu cái tr−ởng thành vào tế bào trứng thành thục đ loại bỏ nhân của một cừu khác là một b−ớc ngoặt trong công nghệ nhân bản động vật. Từ khi cừu Dolly ra đời, nhiều loại động vật khác đ đ−ợc nhân bản thành công nh−: chuột, trâu, bò, lợn, dê, thỏ, ngựa, mèo hoang châu Phi, mèo Bangan (Nguyễn Quang Thạch vcs, 2005)[14]. Trên thế giới, công nghệ phôi đ đ−ợc tiến hành nghiên cứu trên một số loài động vật nh−: trâu bò, dê, cừu, ngựa, chó, mèo, Thế nh−ng công nghệ phôi trên lợn chỉ mới đ−ợc tiến hành nghiên cứu từ thập niên 70 của thế kỷ tr−ớc, với những nghiên cứu ban đầu về sự phát triển của buồng trứng, nang trứng và tế bào trứng của Black và Erickson (1968). C ông nghệ phôi trên lợn đ có b−ớc tiến v−ợt bậc từ khi con lợn đầu tiên ra đời bằng thụ tinh ống nghiệm vào năm 1986 (Cheng vcs, 1986) (Dẫn theo Bùi Xuân Nguyên, 2006)[32]. C ông nghệ sinh học sinh sản trên lợn tuy đ−ợc phát triển muộn hơn so với một số loài động vật khác nh−ng cho đến nay đ có một số kết quả nghiên cứu về tạo phôi lợn trong ống nghiệm của các tác giả nh−: Abeydeera vcs (1998)[18], Long vcs (1999)[30], Công nghệ nhân bản vô tính trên lợn đ và đang phát triển mạnh mẽ trên thế giới đặc biệt ở một số n−ớc có nền chăn nuôi phát triển nh−: ở Anh, Mỹ, Pháp, Nhật, Trung Quốc Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 13 2.1.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh sản ở Việt Nam ở Việt Nam, Công nghệ phôi đ đ−ợc bắt đầu nghiên cứu tại Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia vào những năm 1970 với sự thành công trên nhiều loài động vật nh− sự ra đời của thỏ cấy truyền phôi (1978), bê sữa do cấy phôi t−ơi (1986), bê Charolaise thuần chủng do cấy phôi đông lạnh vào bò nhận Hà - ấn (1990), dê Sanmen thuần chủng ra đời từ cấy phôi đông lạnh vào dê cỏ Việt Nam (1997), bê sữa Holstein thuần chủng ra đời từ cấy phôi đông lạnh vào bò LaiSind (1999),... Trong khuôn khổ các ch−ơng trình cấp Nhà n−ớc, cấp Bộ về Công nghệ Sinh học, các công trình nghiên cứu cơ bản và hợp tác quốc tế từ năm 1980. Tại phòng Công nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học các nghiên cứu công nghệ phôi trên trâu bò đ tiến hành ở mức độ in vitro và sinh học phân tử: đ hoàn thiện đ−ợc quy trình tạo phôi trâu bò trong ống nghiệm ổn định và hữu hiệu, đ sản xuất đ−ợc phôi trâu bò cao sản bằng ph−ơng pháp thụ thụ tinh ống nghiệm (Bùi Xuân Nguyên vcs, 1997, 2000)[10], [31],. Đồng thời là các nghiên cứu xác định giới tính của phôi ở giai đoạn sớm bằng kỹ thuật PCR (Bùi Linh Chi vcs, 1999)[1]; nghiên cứu tạo phôi bò bằng ph−ơng pháp cấy nhân tế bào sinh d−ỡng (Bùi Xuân Nguyên vcs, 2000)[11]; xây dựng đ−ợc quy trình đông lạnh tế bào trứng, tinh trùng và phôi để tiến tới thành lập ngân hàng tế bào trứng, tinh trùng và phôi dự trữ (Bùi Xuân Nguyên vcs, 2003)[12]; bê sữa thụ tinh ống nghiệm bởi tinh đông lạnh cọng rạ (Nguyễn Hữu Đức vcs, 2003)[4]; đ có kết quả b−ớc đầu trong việc phân lập tế bào gốc từ phôi bò thụ tinh ống nghiệm và nhân bản vô tính, tạo đ−ợc những nguyên liệu cho các nghiên cứu về tế bào gốc phôi: nhân nuôi các dòng tế bào fibroblast của chuột làm lớp đệm nuôi tế bào gốc phôi, tạo ra các thành phần cần thiết cho kỹ thuật vi phẫu thuật miễn dịch là huyết thanh của thỏ và bổ thể từ chuột lang, xây dựng chế độ vi phẫu thuật miễn dịch tối −u để phân lập các tế bào nút phôi (Nguyễn Việt Linh vcs, 2003)[8]; sản xuất bò sữa giống th−ơng phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước vcs, 2003)[17],… Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 14 Nghiên cứu trên lợn Bản, là một giống lợn nhỏ (10 - 20 kg/con) và có nguy cơ bị tuyệt chủng, đang đ−ợc tiến hành tại Viện khoa học Công nghệ Việt nam, với sự hợp tác của ch−ơng trình Việt - Nhật. Những nghiên cứu b−ớc đầu nhằm khảo sát khả năng thiết lập ngân hàng lạnh phôi lợn Bản đ−ợc tạo bằng ph−ơng pháp tiêm tinh trùng vào tế bào trứng để bảo tồn giống lợn này đ đ−ợc tiến hành (Dang Nguyen Quang Thanh vcs, 2006)[21]. Thí nghiệm gây rụng trứng nhiều trên lợn Bản cũng đ đ−ợc tiến hành, trong đó lợn cái đ−ợc chia làm 2 nhóm: nhóm 1, lợn không đ−ợc xử lý bằng hormone và nhóm 2, lợn đ−ợc xử lý bằng eCG (300 IU/ con) 3 ngày tr−ớc khi thu trứng. Nhóm lợn đ−ợc xử lý hormone gonadotropin thì số l−ợng nang trứng có kích th−ớc >2mm và tỷ lệ trứng loại A và B cao hơn nhóm lợn không đ−ợc xử lý hormone (25, 5 và 87,1% so với 0, 0 và 67,5% ; p<0,05). Tỷ lệ phân chia phôi và phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang ở nhóm lợn đ−ợc xử lý hormone cũng cao hơn nhóm lợn không đ−ợc xử lý bằng hormone (89, 1 và 18,8% so với 47, 2 và 9,1%)(B. X. Nguyen vcs, 2007)[33]. Tháng 9/1989, tại Viện Chăn nuôi quốc gia (Bộ N ông nghiệp & Phát triển nông thôn), Bộ môn Cấy truyền phôi đ−ợc thành lập và cho đến nay đ có một số công trình nghiên cứu về công nghệ phôi nh−: cấy phôi bò (Hoàng Kim Giao vcs, 1994)[6]; thụ tinh ống nghiệm trên bò (Nguyễn Văn Lý vcs, 2003)[9],... 2.2 Những nét chung về quá trình sinh sản và thành thục trứng gia súc 2.2.1 Cấu tạo của buồng trứng Theo giáo trình sinh sản gia súc (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)[2], buồng trứng của gia súc có cấu tạo chung: Buồng trứng gồm một đôi treo ở cạnh tr−ớc dây chằng rộng và nằm trong xoang chậu. Bên ngoài là một lớp màng liên kết sợi chắc nh− màng bao dịch hoàn. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 15 Buồng trứng chia làm hai miền: miền vỏ và miền tuỷ, hai miền đó đ−ợc cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp tạo ra cho buồng trứng một chất đệm. Buồng trứng nh− một tuyến nội tiết của con cái, làm nhiệm vụ nuôi d−ỡng cho trứng chín và tiết ra những hormone sinh dục, tác động đến chức năng của tử cung và thay đổi tính biệt giữa con đực và con cái. Bên d−ới lớp màng của buồng trứng là tế bào trứng nguyên thuỷ hay còn gọi là tế bào trứng non. Khi non bào chín thì các tế bào nang bao quanh tế bào trứng phân chia thành nhiều tế bào có hình hạt. Non bào ngày càng phát triển thì các tế bào nang tiêu tan tạo ra một cái xoang có chứa dịch. các tầng tế bào còn lại phát triển lồi lên tạo ra một lớp màng bao bọc ở ngoài, có chỗ dày lên để chứa tế bào trứng. Non bao nguyên thuỷ khi trở thành non bao chín đ−ợc bao bọc một lớp màng mỏng. Tổ chức màng liên kết ngoài buồng trứng lúc này dày lên để bảo vệ non bao chín, giữa màng bảo vệ liên kết và màng mỏng của non bao là tổ chức mạch quản dày đặc. Non bao chín nằm ở phần lồi lên của màng liên kết buồng trứng. Non bao chín có kích th−ớc 1cm. Tế bào trứng trong non bao là tế bào lớn nhất trong cơ thể, có thể trông thấy đ−ợc bằng mắt th−ờng, kích th−ớc 0,15 - 0, 25mm. Lúc non bao đ thành thục thì màng bọc nang, màng bao liên kết buồng trứng rách ra, tế bào trứng đ−ợc rời khỏi buồng trứng, cùng với dịch nang, tế bào hạt đi vào vòi loa kèn. Màng non bao rách xong liền lại ngay, các tế bào hạt trong xoang phân chia nhanh thành một khối tế bào lớn để lấp kín xoang non bao và trở thành thể vàng. Thể vàng tồn tại phụ thuộc vào tế bào trứng đ−ợc thụ tinh hay không đ−ợc thụ tinh. Nếu tế bào trứng không đ−ợc thụ tinh thì thể vàng tồn tại không lâu, rồi tiêu tan mất. Còn trứng đ đ−ợc thụ tinh thì thể vàng tồn tại cho tới khi sinh đẻ. Trong suốt thời gian có thai thể vàng tiết ra Hormone Progesteron. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 16 Chức năng nội tiết của buồng trứng: Non bao thành thục thì tế bào hạt trong biểu mô non bao tiết ra nhiều Oestrogen tràn đầy trong xoang. Oestrogen làm cho gia súc ch−a thành thục biểu hiện động dục. Oestrogen bao gồm: - Oestradiol và sản phẩm hoá học của nó: Oestron, Oestriol. - Oestrogen có chức năng tới đặc tính sinh dục thứ hai của gia súc cái, làm âm đạo nhiều dịch nhầy, sừng tử cung, ống dẫn trứng, dinh d−ỡng đ−ợc tăng c−ờng, tuyến vú phát triển, vỏ no h−ng phấn con vật xuất hiện động dục. - Oestrogen kích thích tuyến yên tiết ra LH và Prolactin. Khi non bao chín vỡ ra, tế bào trứng rời khỏi buồng trứng thì các nguyên sinh chất bên trong đó tích lại có sắc tố thể vàng. Thể vàng tồn tại tiết ra hormone Progesteron. Thể vàng đ−ợc hình thành theo chu kỳ sau mỗi lần rụng trứng. - Progesteron vào máu, ức chế tuyến yên không tiết ra Gonado sitimulin và ức chế non bao chín trong buồng trứng. - Progesteron kích thích cho niêm mạc tử cung tăng c−ờng dinh d−ỡng, màng nhầy phát triển để tế bào trứng đ−ợc thụ tinh về nơi làm tổ, đồng thời còn tác dụng với tế bào biểu mô màng nhầy tử cung tiết ra nhiều glycogen và các chất dinh d−ỡng cho trứng thụ tinh dễ cố định và phát triển trên màng nhầy tử cung. - Progesteron ức chế cơ trơn tử cung co bóp, giảm hormone thuỳ sau tuyến yên làm cho tử cung yên tĩnh trong thời gian gia súc có chửa. - Progesteron thúc đẩy tuyến vú phát triển. Loài gia súc khác nhau thì chúng khác nhau về vị trí buồng trứng, về kích th−ớc hay hình dáng và cũng khác nhau cả về chu kỳ rụng trứng. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 17 2.2.2 Quá trình sinh tế bào trứng Quá trình hình thành tế bào trứng đ−ợc xảy ra ở trong lớp vỏ của buồng trứng, từ những non bao nguyên thuỷ đ−ợc phân bố ở vùng ngoại biên. Non bao nguyên thuỷ bao gồm một (thỉnh thoảng có hai) tế bào trứng và bao bọc nó bằng một lớp tế bào biểu mô non bao, th−ơng thì non bao nguyên thuỷ đ−ợc hình thành ngay từ khi còn ở giai đoạn bào thai. ở thời kỳ sau thai, những non bao không ngừng đ−ợc hình thành và phát triển từ những biểu mô phôi thai và đ−ợc bắt đầu từ khi cơ thể đ hoàn toàn thành thục về tính. Non bao nguyên thuỷ có số l−ợng rất lớn, nh− ở bò có thể đến vài chục ngàn cái. Tất nhiên đa số non bao nguyên thuỷ không phát triển liên tục mà nó sẽ bị thoái hoá tiêu biến ở trong buồng trứng, còn lại chỉ phần nhỏ số l−ợng non bao đ−ợc phát triển. Sự phát sinh tế bào trứng bắt đầu từ tế bào trứng nguyên thuỷ và qua ba thời kỳ phân chia, cuối cùng hình thành nên tế bào trứng chính thức. Thời kỳ phát triển của tế bào trứng đ−ợc tiến hành trong non bao nguyên thuỷ. Tiếp sang thời kỳ sinh tr−ởng, non bao sơ cấp lớn lên và bắt đầu tích tụ nhiều chất non hoàng để cung cấp chất dinh d−ỡng cho quá trình phát triển về sau. Lúc này non bao sơ cấp đ−ợc gọi là non bao thứ cấp. Non bao thứ cấp trải qua thời kỳ thành thục cuối cùng hình thành non bao chín. Quá trình phát triển của tế bào trứng trong thời kỳ sinh tr−ởng trải qua hai giai đoạn: - Kỳ sinh tr−ởng ngắn: Bào t−ơng tăng lên và nhân có nhiều thay đổi. - Kỳ sinh tr−ởng dài: Từ tế bào trứng 1 hay Ovocyt 1 sau khi phân chia giảm nhiễm hình thành nên 2 tế bào một cái to và một cái nhỏ. Tế bào to thì thể tích to gần bằng tế bào trứng và gọi là tế bào trứng 2 hay Ovocyt 2. Tế bào Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 18 nhỏ gọi là thể cực thứ nhất. Sở dĩ nh− vậy là do sự phân chia thời kỳ đầu của tế bào trứng. Bào t−ơng của tế bào trứng 1 hầu nh− chuyển hết sang tế bào trứng 2, chỉ có một phần rất nhỏ sang thể cực 1. Tế bào trứng 2 lại tiếp tục phân chia lần thứ 2 để thành tế bào trứng chín và thể cực thứ 2 theo Hình thức phân chia lần thứ nhất. Từ tế bào trứng 1 hay Ovocyt 1 qua quá trình phân chia hình thành một tế bào. Nh−ng trong đó chỉ có một tế bào phát dục hoàn toàn, hình thành tế bào trứng chín và có khả năng thụ tinh, còn 3 thể cực còn lại đều là những tế bào phát dục không hoàn toàn. Ngoài ra thời kỳ thành thục cuối cùng của tế bào trứng đ−ợc tiến hành ở trong ống dẫn trứng. Tế bào trứng là một loại tế bào lớn nhất trong cơ thể, nó có dạng hình cầu. Tế bào trứng có độ dài trung bình. Ngựa: 0,135mm Bò: 0,135 - 0,14mm Lợn: 0,12 - 0,14mm Dê: 0,14mm Cừu: 0,12mm Thể tích của tế bào trứng lớn hơn tinh trùng rất nhiều lần, trung bình gấp 10 - 20 nghìn lần và dài gấp 2 lần. (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)[2]. 2.2.3 Cấu tạo tế bào trứng (tế bào noBn) Tế bào trứng là vật kỳ diệu nhất trên thế giới chúng ta. Đó là một loại tế bào lớn nhất trong cơ thể bất kỳ loại gia súc nào với những tính chất và vai trò đặc biệt trong sinh sản và di chuyền, là một loại tế bào khổng lồ và duy nhất có thể kết hợp với tinh trùng để hình thành nên cơ thể mới (Nguyễn Mộng Hùng, 1993)[7]. Cấu tạo tế bào trứng đ −ợc chia làm ba phần: (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)[2] 1. Màng. 2. Nguyên sinh chất. 3. Nhân. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 19 * Màng tế bào trứng Gồm 3 loại màng: + Màng ngoài. + Màng giữa. + Màng trong. Màng ngoài bao gồm nhiều lớp tế bào nang bao quanh trứng theo hình phóng xạ còn gọi là màng phóng xạ, các tế bào gắn liền với nhau bởi axit hyaluronilic, axit này bị phân hủy bởi men hyaluronidase có ở xoang acrosome của tinh trùng. Màng giữa ( Zona pellucida ) còn gọi là màng sáng rất bền vững đ −ợc xây dựng nên từ nhiều tế bào sinh ra từ các tế bào hình nang. Màng giữa chính là nơi tích trữ nhiều dinh d− ỡng trong nuôi d−ỡng trứng, màng giữa có men Zonalizin là men đặc hiệu chủng loại có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài vào nhân trứng trong quá trình thụ tinh. Màng trong là một lớp mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất còn gọi là màng non hay màng nguyên sinh chất. Giữa màng giữa và màng trong có khoảng trống có độ dày là 1,4 - 2mm chứa nồng độ ion cao với PH: 3 - 5, đây là màng có vai trò nuôi d−ỡng trứng sau khi đ− ợc thụ tinh, trong màng cũng chứa một loại men là Muraminidase. *Nguyên sinh chất: Nguyên sinh chất bao gồm thành phần chủ yếu là n−ớc, vật chất hữu cơ, các muối khoáng và các vật chất khác. *Nhân: Nhân tế bào non bao gồm l−ới nhiễm sắc thể và nhiều loại nhân. Với mỗi giai đoạn phát triển của non thì tế bào trứng cũng sinh tr−ởng và phát triển theo, dần thành thục. Sự phát sinh tế bào trứng bắt đầu từ tế bào trứng nguyên thủy trải Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ------------------._.----- 20 qua ba lần phân chia cuối cùng hình thành tế bào trứng chính thức. Các trứng thành thục phải đủ chất l−ợng để thụ tinh bình th−ờng không đ−ợc dị dạng, teo lại hay tr− ơng phồng, cần có màu hồng t−ơi đẹp. Hình dạng, kích th−ớc trứng Trứng có hình cầu hoặc hình trứng, có đ−ờng kính từ 60 tới 20 mcrm ở động vật có vú và cầu gai, từ 1mm đến 2mm ở cá và ếch, ở bò sát và chim, trứng có thể có đ−ờng kính tới vài centimet và cân nặng tới hàng kilogam. (Nguyễn Mộng Hùng, 1993)[7]. Bảng 2.1. Đ−ờng kính trứng của trâu, bò, lợn ( Dẫn theo Nguyễn Mộng Hùng, 1993)[7] Loài Trâu Bò Lợn Đ−ờng kính bao Graaf tr−ớc khi vỡ (mm) 12 - 19 12 - 19 8 12 Đ−ờng kính trứng chín không có màng sáng (mcrm) 120-160 120-160 120-170 2.2.4 Sự thành thục tế bào trứng Sau khi đạt tới kích th−ớc cực đại, non bào chuyển sang một giai đoạn mới, đó là giai đoạn thành thục. Sự kiện này xảy ra d−ới ảnh h−ởng của các cơ chế điều chỉnh, có vai trò quan trọng là cơ chế thần kinh - hormone trong t−ơng tác non bào với các tế bào xung quanh. Sự chuyển sang thời kỳ thành thục đ−ợc thực hiện d−ới ảnh h−ởng của các hormone kích dục tố của thùy tr−ớc tuyến yên. Vào cuối giai đoạn lớn non bào có khả năng phản ứng với các ảnh h−ởng đó. D−ới tác động của kích dục tố, biểu mô nang sinh sản ra progesteron chất này đi vào non bào và kích thích quá trình thành thục (hay quá trình chín). Quá trình thành thục đ−ợc nghiên cứu kỹ ở l−ỡng thê, cá và động vật có vú, do đó ngày nay ng−ời ta có thể gây chín non bào invitro ngoài cơ thể. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 21 Trong điều kiện tự nhiên, các hormone kích dục chỉ tiết vào máu trong những thời kỳ xác định của chu kỳ sinh sản. ở động vật sinh sản theo mùa, nó diễn ra vào tr−ớc thời kỳ đẻ trứng. Số nang chịu phản ứng phụ thuộc vào nồng độ hormone và đặc tr−ng cho từng loài. Tuy nhiên có thể tiêm thêm hormone vào cơ thể và gây chín đồng loạt nhiều trứng. Trong non hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích th−ớc rất lớn và th−ờng đ−ợc gọi là bóng phôi (germinal vesicle). Nó có vị trí khác nhau trong non bào ở các loài khác nhau: ở trung tâm, lệch về cực động vật, lệch hẳn tới giữa đĩa tế bào chất sát bề mặt trứng trên cực động vật. Sau khi tiếp nhận kích thích bởi các kích dục tố, nhân lại nhanh chóng tiếp tục các kỳ Meiose. Các l−ỡng trị hội tụ trở lại và qua giai đoạn cuối cùng của tiền kỳ là điakines. Đồng thời nhân di chuyển tới bề mặt trứng trên cực động vật, màng nhân vỡ ra, dịch nhân hòa vào tế bào chất, các l−ỡng trị sắp xếp thành tấm trung kỳ của thoi phân chia. Thoi phân chia trực giao với bề mặt trứng. Sự phân ly các l−ỡng cực xảy ra ở hậu kỳ. Sau mạt kỳ (Meiose1) hình thành nên hai tế bào. Một gồm có nhân và một chút tế bào chất tách khỏi non bào và nằm ngoài màng sinh chất nh−ng ở trong màng non hoàng. Đó là thể cực thứ nhất. Tế bào thứ hai là non bào bậc hai. Các nhiễm sắc thể trong nhân non bào ngay lập tức phân bố thành tấm trung kỳ của lần phân chia thứ hai. Sự phân chia có thể diễn biến tiếp tục và ở hậu kỳ này xảy ra sự phân ly các nhiễm sắc thể của bộ đơn bội (giống nh− phân bào nguyên nhiễm nh−ng với số nhiễm sắc thể đơn bội). Sau mạt kỳ thể cực thứ hai đ−ợc hình thành và trứng thành thục Nguyễn Mộng Hùng, (1993)[7]. Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra những biến đổi. Trứng trở nên mọng n−ớc, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất bề mặt trở nên có tính co dn và xuất hiện khả năng phân chia. Trong tế bào chất của trứng cũng xuất hiện một loạt các tác nhân có ý nghĩa quan trọng cho Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 22 sự phát triển tiếp theo. Một trong những sự kiện quan trọng trong thành thục là sự vỡ màng nhân, màng nhân bị vỡ d−ới ảnh h−ởng của tác nhân phá hủy màng nhân. Tác nhân này xuất hiện trong non bào d−ới ảnh h−ởng của hormone progesteron và không có sự tham gia của nhân (trong thí nghiệm với non bào không nhân). Hoạt tính của tác nhân này xuất hiện tr−ớc khi màng nhân vỡ. Nếu lấy tế bào chất của non bào giai đoạn này tiêm cho non bào ch−a chín thì sẽ làm nhân vỡ mà không cần kích thích hormone. Tác nhân không có tính đặc hiệu loài, có bản chất protein và có khả năng nhân lên trong tế bào chất. Sau khi vỡ màng nhân bắt đầu hoạt động một tác nhân khác, đó là nhân hội tụ nhiễm sắc thể. Tác nhân này xuất hiện chỉ khi có sự hòa lẫn dịch nhân với tế bào chất. Cơ chế xuất hiện còn ch−a rõ. Tác động của tác nhân này cũng không đặc hiệu. Nó gây hội tụ nhiễm sắc thể của bất kỳ tế bào nào, nh− của tế bào thần kinh nếu nh− nhân nó đ−ợc tiêm vào non bào đ vỡ màng nhân. Trong non bào đang chín cũng xuất hiện một loại tác nhân, nếu không có chúng, nhân tinh trùng không thể biến thành nhân nguyên đực và không có sự hoạt hóa tổng hợp ADN. Đó là các tác nhân tr−ơng nhân tinh trùng. Để xuất hiện tác nhân này phải có sự tham gia của cả nhân và tế bào chất của non bào. Trong quá trình thành thục còn xuất hiện các phân bào. Không có tác nhân này, sự phân cắt sau thụ tinh sẽ không thực hiện đ−ợc. Tác nhân này xuất hiện trong nhân ở giai đoạn sớm của tạo non và giữ trong nhân cho tới khi vỡ màng nhân (Nguyễn Mộng Hùng, 1993)[7]. Khi trứng phát triển đến độ thành thục có kèm theo những biến đổi về mặt hình thái, sinh lý và sinh hóa liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng. Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng (GVBD: Germinal Vesicle Break Down), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình nhất là sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (First Polar Body) và nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II. Trạng thái này sẽ đ−ợc duy trì cho đến khi tinh trùng xâm nhập. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 23 Các nghiên cứu đ chỉ ra rằng sự tồn tại một yếu tố thúc đẩy sự thành thục hay còn gọi là MPF (Manturation Promoting Factor). Ng−ời ta nhận thấy progesterone có vai trò kích thích sự sinh sản ra MPF, một yếu tố thúc đẩy sự phân bào, sự có mặt của yếu tố này dẫn đến sự đặc lại của nguyên sinh chất, nó tác động đến sự phát triển của nhân và góp phần làm xuất hiện các thoi phân bào. Về bản chất, MPF là một phức hợp protein bao gồm sự liên hợp của một số cycline và một protein kinase P34 (khối l−ợng phân tử là 34 kdal); đây là histone kinase H1 t−ơng tự một yếu tố men đ−ợc sản xuất bởi gen cdc2, gen này tham gia vào việc kiểm soát quá trình phân bào. Để đ−ợc hoạt hóa, protein kinase P34 phải đ−ợc khử gốc photpho bởi các cyclin. Sự lớn lên của nguyên sinh chất, sự biệt hóa của ty thể, sự tổng hợp, sự tích lũy non hoàng và các ARN thông tin, cuối cùng là sự biến mất của các hạt trung tâm, đó là những sự kiện phải đ−ợc hoàn tất tr−ớc khi xảy ra sự hồi phục phân bào ở nhân trứng. Sự tạm dừng của trứng ở trạng thái Metaphase II cho đến khi đ−ợc thụ tinh là do một sản phẩm có trong bào t−ơng có nguồn gốc từ một gen ung th− (proto - oncogen) C - mos, đ−ợc gọi là nhân tố ổn định sự phân bào MSF (Meiosis stabilizing factor). Sự hoạt hóa trứng phụ thuộc đồng thời vào các quá trình photphoryl - dephotphoryl hóa; mà quá trình này lại bị ức chế bởi 6 - DMAP (6-dimethyl - aminopurine) và các quá trình tổng hợp protein, chúng lại bị ức chế bởi puromicine. Hai chất này có thể làm dừng một cách độc lập với nhau nhờ sự đặc lại của nguyên sinh chất hay cũng chính là làm cản trở sự phục hồi khả năng phân bào của trứng. (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5] Sự thành thục của nguyên sinh chất Thành thục nguyên sinh chất của trứng đ−ợc đặc tr−ng bằng sự dịch chuyển của các hạt vỏ (Granule Corticale) theo h−ớng từ bộ máy golgi đến màng bào t−ơng của trứng. Những hạt này có chứa ovoperoxidase góp phần Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 24 vào việc giảm thiểu sự thụ tinh đa tinh trùng. Có mặt trong trứng của tất cả các loài động vật có vú, các hạt này cố định trên bề mặt màng bào t−ơng bởi một protein lạ gọi là Calpactine. (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5] Sự thành thục của màng trứng Một trong những điều liện cần thiết để màng trong suốt có thể nhận biết một cách đặc hiệu những tinh trùng đ kiện toàn năng lực thụ tinh của loài đó là sự thành thục của màng trứng. Đặc biệt phải kể đến sự có mặt của glycoprotein ZP3 trên màng trong suốt, nó chính là nhân tố chịu trách nhiệm nhận biết tr−ớc tiên các giao tử đực. Vùng trong suốt gồm 95% của 3 glycoprotein đ−ợc tổ chức thành các sợi dài hợp nhất gọi là ZP1, ZP2, ZP3 (Cù Xuân Dần, 1996). Phần ZP3 và ZP2 hợp thành các sợi, còn ZP1 làm nhiệm vụ bắc cầu liên kết các sợi với nhau. Chỉ có glycoprotein ZP3 là đ−ợc tinh trùng nhận biết và phát ra thể đỉnh; ZP2 có vai trò can thiệp khi xảy ra sự thụ tinh bằng cách cố định tạm thời đầu tinh trùng trong khi tinh trùng đi qua vùng trong suốt (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5] 2.3 Khai thác và nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm 2.3.1 Hiện trạng khai thác trứng trâu, bò, lợn 2.3.1.1 Khai thác trứng trâu, bò, lợn in vitro Ph−ơng pháp này đ có từ rất lâu và hiện nay vẫn đ−ợc xem là ph−ơng pháp chủ yếu khi tiến hành thu trứng gia súc cái phục vụ công nghệ phôi động vật trong nghiên cứu cơ bản cũng nh− ứng dụng tại hầu hết các phòng thí nghiệm trong và ngoài n−ớc. Ph−ơng pháp này cho phép cung cấp một số l−ợng trứng với chất l−ợng ổn định cho nghiên cứu. Nội dung của ph−ơng pháp này bao gồm các b−ớc nh− sau: Thu buồng trứng Buồng trứng đ−ợc thu từ các lò mổ của địa ph−ơng, ngay sau khi con vật bị giết (giết mổ). Dùng panh cố định buồng trứng và lấy kéo để cắt buồng trứng. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 25 Bảo quản và vận chuyển buồng trứng Buồng trứng sau khi đ−ợc lấy ra khỏi con vật, đem rửa trong dung dịch n−ớc muối sinh lý 3 - 4 lần có bổ sung kháng sinh (penicilline và streptomicine hoặc gentamycine) theo một tỷ lệ nhất định. Sau đó buồng trứng lại tiếp tục đ−ợc bảo quản trong dung dịch n−ớc muối sinh lý ở nhiệt độ 30 - 350 C và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 - 4 giờ. (Nguyễn Hữu Đức vcs, 1996)[3] Tiến hành thu trứng từ buồng trứng th−ờng sử dụng hai ph−ơng pháp là rạch nang và hút nang. Ph−ơng pháp hút nang là dùng bơm tiêm 5ml hoặc 10 ml, hút các nang trên bề mặt buồng trứng có kích th−ớc 2mm. Ngoài ra một số tác giả còn thu trứng bằng máy hút, dùng máy hút chuyên dụng để thu trứng. Đây là ph−ơng pháp mới gọi là ph−ơng pháp Ovum pick up (OPU), ph−ơng pháp này đ−ợc xây dựng trên cơ sở của ph−ơng pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm. Ph−ơng pháp này cũng đ đ−ợc một số nhà khoa học trên thế giới sử dụng để thu trứng trâu, bò, lợn nh− (Callesen vcs, 1987; Pieterse vcs, 1988; Brussow vcs, 1997) (Dẫn theo Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5]. Ph−ơng pháp này th−ờng thu đ−ợc số l−ợng trứng đều đặn, cho phép cung cấp một số l−ợng trứng đủ chất l−ợng phục vụ cho nghiên cứu. Ph−ơng pháp rạch nang, hiện cũng đ−ợc một số nhà nghiên cứu sử dụng nh−: T. Kolbe và Holtz, 1999, là ph−ơng pháp dùng dao chuyên dụng rạch tất cả các nang trên bề mặt buồng trứng, có kích th−ớc nang trứng từ 2mm trở lên, ph−ơng pháp rạch nang th−ờng thu đ−ợc số l−ợng trứng nhiều hơn ph−ơng pháp hút nang, tuy nhiên về chất l−ợng trứng thì không khác nhau nhiều giữa 2 ph−ơng pháp hút và rạch nang. Rửa và chọn lọc trứng Dịch nang trứng hút ra có lẫn trứng và các tế bào nang trứng đ−ợc bơm vào các đĩa Pettri. Tiến hành soi tìm trứng trên kính lúp soi nổi có độ phóng Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 26 đại 40 - 100 lần. Trứng đ−ợc hút ra bằng pipetman chuyên dùng có gắn đầu côn hoặc bằng bộ dây và kim hút thủy tinh có độ nhỏ vừa phải. Trứng sau khi đ−ợc hút ra tiến hành rửa lại từ 2 - 4 lần trong các môi tr−ờng thu trứng, sau đó lại tiến hành rửa 3 lần trong môi tr−ờng nuôi chín (thành thục) trứng tr−ớc khi đ−a vào nuôi: L.R. Abeydeera vcs, (1998)[18]. 2.3.1.2 Khai thác trứng trâu, bò, lợn bằng ph−ơng pháp in vivo (OPU) Ph−ơng pháp này gọi là ph−ơng pháp Ovum pick up (OPU), đ−ợc xây dựng trên cơ sở ph−ơng pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ở ng−ời. Ph−ơng pháp OPU cho phép hút các trứng trong nang của buồng trứng từ con vật đang sống. Con vật khai thác trứng đ−ợc đứng giữ yên trong giá cố định và ng−ời thao tác một tay đ−a vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dò, tay kia điều khiển kim hút. Những hình ảnh đó đều lần l−ợt hiện ra trên màn hình máy siêu âm, giúp chúng ta xác định đ−ợc h−ớng đi của kim, vị trí của nang trứng và vị trí đầu kim chọc vào nang. Ph−ơng pháp OPU th−ờng dùng để khai trác trứng trâu, bò từ buồng trứng phục vụ công nghệ phôi, cho phép cung cấp một số l−ợng trứng lớn với chất l−ợng tốt (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5]. Còn với trứng lợn, khai thác invivo th−ờng đ−ợc khai thác bằng cách cố định con vật trên bàn mổ, gây mê và ng−ời thao tiến hành mổ ở vị trí xác định trên hõm hông con vật hoặc trên đ−ờng trắng d−ới bụng giữa hàng vú thứ nhất và hàng vú thứ hai, rồi từ từ dùng ngón tay trỏ lôi nhẹ buồng trứng ra ngoài lần l−ợt cả hai buồng trứng rồi 1 ng−ời khác dùng xilanh với kim tiêm phù hợp vô trùng đ chuẩn bị sẵn ở ngoài từ từ chọc hút hết các nang trứng trên bề mặt buồng trứng với các nang trứng có kích th−ớc từ 2mm trở lên, rồi tiến hành thu trứng và rửa trứng nh− trên. (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5]. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 27 2.3.2 Phân loại chất l−ợng trứng Các trứng trâu, bò, lợn sau khi đ−ợc thu và rửa sạch trong các môi tr−ờng thích hợp bằng một trong hai ph−ơng pháp invitro hoặc invivo. Rồi tiến hành phân loại chất l−ợng trứng, đây là một khâu rất quan trọng, vì nó là một trong những nhân tố quyết định lên kết quả nuôi thành thục trứng sau này cũng nh− khả năng phát triển của phôi sau này. Nhiều nghiên cứu đ chỉ ra rằng giữa hình thái bên ngoài với chất l−ơng bên trong của trứng có mối liên quan rất chặt chẽ, đó là cấu trúc lớp tế bào nang (cumulus) bao quanh trứng, độ đồng đều, màu sắc của nguyên sinh chất trứng. Do vậy ng−ời ta tiến hành phân loại chất l−ợng trứng dựa trên cơ sở quan sát đánh giá hình thái bên ngoài của trứng. Dựa theo hình thái bên ngoài của trứng thì trứng đ−ợc phân loại theo 3 cấp A, B, C, hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới đều áp dụng cách phân loại trứng theo Leibfried - Rutledge vcs, (1979)[28]. Bảng 2.2. Phân loại chất l−ợng trứng theo Leibfried - Rutledge vcs, (1979)[28] Chất l−ợng trứng Hình thái A Có trên 3 lớp tế bào Cumulus bao quanh trứng, các lớp tế bào này dày, đều đặn và có sự liên kết chặt chẽ giữa các tế bào đó với nhau. Nguyên sinh chất đồng đều, toàn bộ trứng nhìn trong và đầy đặn. B Có từ 2 - 3 lớp tế bào cumulus bao quanh trứng, các lớp này không liên kết chặt chẽ, có nơi bị mất một phần tế bào. Nguyên sinh chất đồng đều nh−ng có màu hơi tối ở vùng ngoại vi của trứng. Toàn bộ trứng nhìn ít trong và không đầy đặn tròn chịa. C Có ít tế bào cumulus bao quanh, nguyên sinh chất không đồng đều hoặc có màu hơi tối, bị tan r hoặc tr−ơng to. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 28 2.3.3 Nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm - In vitro maturation (IVM) 2.4.3.1 Nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm (IVM) IVM là quá trình dùng các môi tr− ờng và điều kiện nhân tạo cần thiết giúp những trứng ban đầu ch− a thành thục, sau khi nuôi có khả năng thụ tinh. Đ ây là b−ớc đi căn bản quan trọng đầu tiên ảnh h−ởng tới chất l−ợng trứng thụ tinh và ảnh h− ởng trực tiếp tới khả năng phát triển của phôi. Những nghiên cứu của J.H. Tan vcs (2002) cho thấy trứng thu đ−ợc từ những nang có kích th−ớc lớn (nang già) luôn cho tỉ lệ thành thục cao hơn các trứng thu từ các nang non và chất l−ợng thành công trên phôi cũng cao hơn (Dẫn theo Nguyễn Hữu Đức, (2005)[5]) Cơ sở của các ph−ơng pháp nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm của các loài động vật dựa trên những hiểu biết của quá trình thành thục trong tự nhiên của chúng. Quá trình nuôi chín trứng trong ống nghiệm còn thiếu một số điều kiện cơ sở ch−a rõ nguồn gốc chính xác, hay thiếu các yếu tố tế bào chất nên quá trình phát triển của trứng không chọn vẹn. Trong môi tr−ờng nuôi vấn đề quan trọng của tín hiệu cơ thể, sự tích lũy ở những cấp bậc của các nang trứng. Hiện nay ng− ời ta còn sử dụng cả dinh d−ỡng từ mẹ tr−ớc khi nuôi chín hay tr−ớc khi thu trứng, có thể làm tăng khả năng sống của phôi in vitro, tăng khả năng phát triển của trứng trong ống nghiệm, bằng cách đoán chừng sự thay đổi của các nang trứng chín từ đó cần quan tâm đến môi tr−ờng nuôi d−ỡng trứng. Chất l−ợng trứng đ− ợc đánh giá qua khả năng thành thục và phát triển tới đời sau đó là cả quá trình phát triển một cách trọn vẹn trong ống nghiệm mà tr−ớc hết chúng ta phải hiểu biết và thực hành tốt các thao tác tìm và thu Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 29 những nang trứng chất l−ợng tốt, tiếp theo là qúa trình nuôi chín cả nhân và tế bào chất trứng trong ống nghiệm . Sự đồng nhất về chất l−ợng giữa các trứng ảnh h−ởng bởi các nhân tố nang trứng và chất l−ợng trứng đ−ợc khẳng định chắc chắn qua sự tiến bộ chủ yếu ở khả năng sống của phôi trong cơ thể động vật và các sản phẩm phôi in vitro. Khả năng thụ tinh và phát triển của trứng đ− ợc đánh giá bằng các giai đoạn sinh tr−ởng và phát triển dài. Quá trình này bao gồm cả sự biến đổi các thành phần tế bào chất và sự bố chí với sự thu nhỏ lại trong nhiễm sắc thể, cả 2 quá trình luôn ảnh h−ởng qua lại và chúng có thời gian xác định rất khắt khe để đảm bảo những sự thành thục của nhân và tế bào chất xảy ra đồng thời, sự phát triển phôi bị gián đoạn bởi các lỗi từ quá trình nuôi chín (Bùi Xuân Nguyên vcs, 2000)[31]. ở những trứng trong các nang trọn vẹn ch−a chín có lần nguyên phân đầu tiên khoảng 36 - 40 giờ sau khi Gonadotropin tăng lên tr− ớc khi rụng trứng và tới giai đoạn thứ hai bị ngăn lại nh−ng vẫn duy trì cho trứng họat động tới khi đ−ợc thụ tinh, các phân tử vi mô trong tế bào trứng chịu trách nhiệm trong qúa trình phân chia tế bào trong khi bộ gen của phôi vẫn không thay đổi. Vì còn ít hiểu biết trong quá trình phân tử tích lũy, sự phát triển rõ ràng đ chỉ ra rằng trứng phải trọn vẹn tr−ớc khi thu từ nang trứng và cũng nh− sự phát triển của trứng ở các giai đoạn khác nhau trong nang luôn ảnh h−ởng chặt chẽ tới chất l−ợng trứng, vì đó mà ảnh h− ởng tới khả năng di truyền của trứng đời sau. Sự không đồng nhất giữa các nang xuất hiện tự nhiên và quá trình sử dụng các nhân tố giúp thành thục ở trong môi tr−ờng trứng nuôi trong ống nghiệm cung cấp các thông tin về hormone và các yếu tố nang trứng nhằm điều chỉnh quá trình thành thục của trứng. Trứng đ−ợc nuôi thành thục trong ống nghiệm có thể đ−ợc thụ tinh bằng tinh trùng bởi điều kiện đặc biệt, tỷ lệ hình thành tiền nhân thấp với sự thụ tinh xảy ra bị ảnh h−ởng bởi nhiều yếu tố, tr−ớc đó khả năng phát triển đ−ợc Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 30 khẳng định bằng chất l−ợng trứng sau khi thụ tinh tỷ lệ trứng hỏng thấp. Những lý luận này cho thấy điều kiện nuôi trong ống nghiệm xấu hơn điều kiện sống trong cơ thể vật nuôi, vì vậy mà kết quả nuôi trong ống nghiệm th− - ờng không đ− ợc trọn vẹn. Trong khi những hormone quan trọng trong buồng trứng ảnh h−ởng tới sự phát triển của nang trứng và tế bào trứng, những hormone này ít đ−ợc hiểu biết hơn. Trong nhiều nghiên cứu tr−ớc đây trứng đ−ợc nuôi thành thục trong ống nghiệm chỉ với môi tr−ờng có Albumin huyết thanh bò (BSA) hay huyết thanh mà trong đó quá trình hình thành tiền nhân đực th−ờng không đ−ợc diễn ra, khi đó ng−ời ta kết luận rằng để quá trình thụ tinh diễn ra bình th−ờng trứng phải trải qua giai đoạn teo giảm của túi phôi trong cơ thể con vật và những trứng này đ−ợc nuôi thành thục mặc dù trong quá trình nuôi còn thiếu một số yếu tố tế bào chất. Hiện nay với nhiều thành tựu trên công nghệ nuôi cấy ng−ời ta đ sớm nuôi phát triển đ− ợc phôi lợn từ một tế bào tới giai đoạn phôi nang, phôi dâu và còn phát triển xa hơn nữa với các sản phẩm phôi ống nghiệm mà tiêu điểm của sự phát triển là khả năng nuôi thành thục trong ống nghiệm (IVM ) (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5]. Các trứng thu đ−ợc bằng ph−ơng pháp invitro hay in vivo đ trình bày ở trên đ−ợc đ−a vào nuôi thành thục. Do có sự liên quan chặt chẽ giữa chất l−ợng trứng và hình thái bên ngoài, ng−ời ta chọn những trứng có chất l−ợng tốt đ−a vào nuôi trong môi tr−ờng giàu chất dinh d−ỡng với sự có mặt của những tế bào granulosa (ở nồng độ 1 - 5 triệu tế bào /ml). Nhiệt độ tủ nuôi đ−ợc đặt ở 38,50C, đồng thời nồng độ khí CO2 điều chỉnh ở mức 5 % (Galli vcs, 2001)[25]. Việc nuôi trứng trong các môi trừng nuôi thích hợp nhằm mục đích là thúc đẩy chín trứng nhân tạo (thành thục). Đó là sự thành thục nhân, nguyên sinh chất, màng sáng có kèm theo những biến đổi chuyển hóa cần thiết để trứng sẵn sàng tham gia vào thụ tinh tiếp theo. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 31 Việc đánh giá chất l−ợng trứng ban đầu và ph−ơng pháp nuôi trứng thành thục cũng nh− môi tr−ờng nuôi, điều kiện nuôi,... là các yếu tố có ảnh h−ởng trực tiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm cũng nh− sự phát triển về sau của phôi trong ống nghiệm. Để đánh giá sự thành thục trứng nuôi invitro, cần phải nhuộm nhân hoặc nguyên sinh chất của trứng để quan sát. Tuy nhiên sau khi nhuộm song để quan sát thì sẽ không cho phép sử dụng trứng vào các mục đích khác nh− thụ tinh ống nghiệm đ−ợc nữa. Vì vậy ng−ời ta có thể dựa vào những dấu hiệu bên ngoài có thể quan sát đ−ợc để đánh giá sự thành thục của trứng sau khi nuôi trong ống nghiệm, đó là sự bông tơi của các tế bào cumulus bao quanh trứng hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (FPB), sau khi trứng đ tách hết cumulus (Nguyễn Hữu Đức, 2005)[5]. Tại các cơ sở nghiên cứu trong và ngoài n−ớc hiện nay, ng−ời ta th−ờng đánh giá kết quả nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm thông qua kết quả thụ tinh ống nghiệm (số hợp tử phân chia ở giai đoạn 2 tế bào) và kết quả nuôi phôi trong ống nghiệm (số phôi dâu, phôi nang) thu đ−ợc về sau (Bùi Xuân Nguyên vcs, 2006)[32]. Quá trình nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm đòi hỏi phải có môi tr−ờng thích hợp, giàu dinh d−ỡng để trứng có thể phát triển một cách bình th−ờng. Hiện nay môi tr−ờng phổ biến th−ờng đ−ợc sử dụng là TCM - 199, có bổ xung các protein, hormone (FSH, LH, Estrogen, HCG, eCG); pyruvate, Na,... là cần thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bình th−ờng và đầy đủ của trứng đến giai đoạn thành thục, đồng thời cả nhân trứng, bào t−ơng và lớp màng trong suốt (Sueo Niimura vcs, 2005)[ 37]. Đến nay đ có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến hơn nữa hiệu quả của việc nuôi trứng invitro, đó là nuôi trứng trong môi tr−ờng TCM - 199 có bổ sung thêm NaHCO3, dịch nang trứng, PMSG, hCG, Pyruvate, Cysteamine, Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 32 insuline, selen, kanamycine, theo tỷ lệ quy định (C.R.Long vcs, 1999)[30], nuôi thành thục trứng lợn trong hai môi tr−ờng là Hespes - PVA và NCSU - 23 có bổ sung insuline, theo (Ratky vcs, 2003)[36] thì nuôi thành thục trứng lợn trong môi tr−ờng DPBS bổ sung Polyvinyl Alcohol (PVA - DPBS),... kết quả cho thấy hầu hết các môi tr−ờng trên đều cho tỷ lệ trứng lợn thành thục là rất cao. Còn với trứng trâu, bò; môi tr−ờng nuôi đ−ợc bổ sung huyết thanh trâu, bò đang động dục (giàu LH, FSH, Estradiol) hoặc huyết thanh bào thai (giàu yếu tố IGF1) và song song có bổ sung thêm Estradiol - 17. Tuy nhiên để hoàn thiện quá trình thành thục trong ống nghiệm, vẫn cần bổ sung thêm LH, FSH vào môi tr−ờng nuôi trứng (Pielerse vcs, 1988; Mizushima vcs, 2000, Paloma Duque vcs, 2003) (Dẫn theo Nguyễn Hữu Đức, (2005)[5]). Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng môi tr−ờng 199 làm môi tr−ờng cơ bản để nuôi trứng thành thục và việc bổ sung các chất nh− FSH, LH, Estradiol, huyết thanh trâu, bò, lợn, pyruvate, Na,... là hết sức cần thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bình th−ờng và đầy đủ của trứng đến giai đoạn thành thục đồng thời cả nhân trứng, bào t−ơng và lớp màng trong suốt nh− trong phần trên đ đề cập. Trong quá trình nuôi trứng trâu, bò, lợn thành thục thì chỉ những trứng có chất l−ợng loại A, B mới đ−ợc dùng cho nuôi thành thục, tr−ớc khi đ−a trứng vào nuôi đều phải rửa trứng qua môi tr−ờng nuôi thành thục từ 3 - 4 lần, dùng pipet để hút trứng và đ−a vào giọt nuôi, các giọt nuôi đều đ−ợc phủ dầu khoáng vô trùng và đ−ợc nạp tr−ớc ít nhất 2h đ−a vào tủ ấm C02 ở nhiệt độ 390C tr−ớc khi chuyển trứng vào nuôi (Bùi Xuân Nguyên vcs, 1997) [10]. 2.4.3.2 Đ ánh giá sự thành thục của trứng trâu, bò, lợn Để có thể đánh giá sự thành thục của trứng trâu, bò, lợn, nuôi trong ống nghiệm cần phải nhuộm nhân hoặc nguyên sinh chất của trứng - ph−ơng pháp này Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 33 sẽ không cho phép chúng ta tiếp tục sử dụng trứng vào những mục đích tiếp theo nh− thụ tinh ống nghiệm, cấy chuyển nhân,...Vì vậy chúng ta dùng ph−ơng pháp khác đó là ph−ơng pháp quan sát những dấu hiệu bên ngoài của trứng, cũng giúp chúng ta xác định một cách chính xác sự thành thục của trứng nuôi trong ống nghiệm. Đó là các căn cứ dựa trên cơ sở sự bông tơi cumulus bao quanh trứng hoặc sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Leibfried - Rutledge vcs, 1979)[28]. Thông th−ờng để đánh giá sự thành thục của nhân trứng ng−ời ta tiến hành nhuộm nhân của lô đối chứng bằng thuốc nhuộm orcein 1%. Kết quả thu đ−ợc dùng nh− một thông số tham khảo cho lô trứng cùng nguồn gốc, cùng chất l−ợng ban đầu hoặc cùng ph−ơng pháp và điều kiện nuôi thành thục. 2.3.4 Các yếu tố ảnh h−ởng đến kết quả khai thác và nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm Quá trình nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm chịu ảnh h−ởng bởi rất nhiều các yếu tố nh−: ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi, ảnh h−ởng của thời gian nuôi, ảnh h−ởng của chất l−ợng trứng, ảnh h−ởng của việc bảo quản buồng trứng trong quá trình vận chuyển từ nơi thu mẫu về đến phòng thí nghiệm, ảnh h−ởng của thời gian từ lúc giết mổ gia súc, thu mẫu về tiến hành thu trứng tại phòng thí nghiệm,... có rất nhiều yếu tố có thể ảnh h−ởng đến quá trình nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm, một trong những yếu tố cũng gây ảnh h−ởng rất lớn đến việc nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong ống nghiệm ở miện Bắc Việt Nam đó là yếu tố mùa vụ thu trứng, vì miền bắc n−ớc ta chịu ảnh h−ởng bởi khí hậu nhiệt đới gió mùa, quanh năm có bốn mùa liên tục thay đổi xuân, hè, thu, đông. Mùa vụ thay đổi quanh năm sẽ kéo theo rất nhiều sự thay đổi với đời sống của các loài gia súc cái, trâu, bò, lợn nh− nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, thức ăn,... sẽ dẫn tới các hoạt động sinh lý trong cơ thể của gia súc cũng có những thay đổi cho phù hợp với ngoại cảnh với điều kiện sống, một trong những hoạt động sinh lý trong cơ thể có sự thay Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 34 đổi theo mùa đó là hoạt động sinh lý sinh sản. Theo tài liệu thì một số gia súc th−ờng sinh sản ở những mùa nhất định trong năm và chỉ ở những mùa đó thì những đặc điểm của chu kỳ sinh dục mới thể hiện đầy đủ hoàn toàn nh− ngựa th−ờng xuất hiện chu kỳ động dục chủ yếu vào mùa xuân, thu; cừu th−ờng xuất hiện chu kỳ động dục vào mùa đông,...Với trâu, bò, lợn thì chu kỳ sinh dục trong suốt cả năm nh−ng th−ờng khi khí hậu ấm áp thì nó xuất hiện rõ ràng và đầy đủ các đặc điểm hơn so với trong điều kiện khí hậu lạnh. Tr−ờng hợp quá lạnh thì chu kỳ sinh dục có thể ng−ng lại hoàn toàn. Trên cơ sở đó một số nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu về thay đổi mùa vụ sinh sản nhằm nâng cao tỷ lệ nuôi sống gia súc sơ sinh, tăng sản phẩm và cũng có thể thay đổi điều kiện sống thích hợp để biến gia súc ít chu kỳ thành gia súc nhiều chu kỳ sinh dục trong năm. ảnh h−ởng của mùa vụ đến khả năng sinh sản của trâu, bò Việt Nam thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ không khí bình quân trong năm ở miền Bắc khoảng 23,50C, l−ợng m−a trong năm trung bình ở miền Bắc 1500mm, l−ợng m−a này th−ờng tập trung vào mùa nóng ở miền Bắc (từ tháng 4 trong năm đến tháng 10 trong năm). Yếu tố này quyết định đến sự phát triển các loại cỏ trong năm. Cỏ th−ờng sinh tr−ởng mạnh từ đầu mùa m−a tháng 4,5, nh− vậy trong năm có 6 - 7 tháng trâu, bò thừa cỏ ăn và 5 - 6 tháng thiếu trầm trọng, nhân dân ta chủ yếu vẫn chăn nuôi trâu, bò theo h−ớng tận dụng nhỏ lẻ, rất ít cơ sở chăn nuôi theo h−ớng công nghiệp, bán công nghiệp, dự trữ, chế biến và chủ động thức ăn cho trâu, bò. Vì vậy cho nên hàng năm vào thời gian từ tháng 11 năm tr−ớc - tháng 3 năm sau bê, nghé đang lớn hầu nh− ngừng phát triển, trâu, bò tr−ởng thành thì gầy sút, ảnh h−ởng rõ rệt đến sức sinh sản, sức sản xuất của gia súc (Nguyễn Đức Thạc vcs, 2006)[13]. Ngoài ra đặc điểm nhiệt đới, cây nhiều cỏ ít, cùng với quá trình sử dụng đất không hợp lý làm cho đất ngày một xấu đi, trong đất thiếu canxi, photpho, Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 35 chính vì vậy mà đồng cỏ chủ yếu gồm các loài hòa thảo, rất ít loài họ đậu. Những yếu tố khí hậu và địa hình của m._.c trong hai mùa xuân, hè (bảng 4.14). Bảng 4.14. Phân loại chất l−ợng trứng bò thu đ−ợc theo mùa Nhìn vào kết quả ở bảng 4.14 cho thấy, trong mùa xuân tổng số buồng trứng thí nghiệm là 60 buồng, số trứng thu đ−ợc là 559 trứng, trong đó số trứng loại A là 310 chiếm tỷ lệ 55, 46 0,06%, số trứng loại B là 101 trứng chiếm tỷ lệ 18, 07 0,03%, số trứng loại C là 148 trứng chiếm tỷ lệ 26, 47 0,06%. Tỷ lệ trứng loại A, B là 73,53% trong tổng trứng thu đ−ợc. Còn ở mùa hè, tổng số buồng trứng thí nghiệm là 182 buồng, thu đ−ợc tổng 1996 trứng, trong đó tổng số trứng loại A là 1092, chiếm tỷ lệ 54, 71 0, 04%, tổng số trứng loại B là 292 trứng chiếm tỷ lệ 14, 63 0,03%, số trứng loại C là 612, chiếm tỷ lệ 30, 66 0,04%, tổng trứng loại A, B là 1384, chiếm tỷ lệ 69,34%. Đối chiếu kết quả thu đ−ợc trong hai mùa xuân, hè cho thấy tỷ lệ các trứng loại A, B, C thu đ−ợc trong hai mùa, không có sự sai khác có ý nghĩa đ−ợc tìm thấy giữa hai mùa xuân, hè. Phân loại trứng thu đ−ợc theo chất l−ợng Loại A Loại B Loại C Mùa Tổng số lần lấy mẫu Tổng số buồng trứng Tổng trứng thu đ−ợc n % n % n % Xuân 14 60 559 310 55,46 ± 0,06 101 18,07 ± 0,03 148 26,47 ± 0,06 Hè 16 182 1996 1092 54,71 ± 0,04 292 14,63 ± 0,03 612 30,66 ± 0,04 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 62 Theo Nguyễn Hữu Đức vcs, (1996) [3], tiến trình phân loại 237 trứng thu đ−ợc từ 54 buồng trứng, kết quả thu đ−ợc trứng loại A là 103 trứng chiếm tỷ lệ 43,46%, tổng trứng loại B là 109 trứng, chiếm tỷ lệ 45,99%, tổng trứng loại C là 25 trứng, chiếm tỷ lệ 10,55%, kết quả của chúng tôi thu đ−ợc trứng loại A có cao hơn của tác giả, nh−ng trứng loại B lại thấp hơn rất nhiều, trứng loại C cũng cao hơn rất nhiều. Tổng trứng A, B của tác giả là 88,45% cao hơn hẳn của chúng tôi chỉ dao động trong khoảng 69,34% đến 73,53%. Kết quả của chúng tôi thu đ−ợc thấp hơn của tác giả trên, kết quả này là hoàn toàn phù hợp với tình hình chăn nuôi bò nội ở n−ớc ta, chăn nuôi ch−a ở mức công nghiệp, chỉ là bán công nghiệp hoặc quảng canh nên sự dao động giữa các mùa và giữa các vùng chăn nuôi trong n−ớc nên tỷ lệ thu đ−ợc có sự chênh lệch, nh−ng kết quả thu đ−ợc cho thấy tỷ lệ trứng loại A, B đ−a vào nuôi thành thục để thực hiện các b−ớc tiếp theo của công nghệ phôi là rất dồi dào và chủ động. 4.5.3 Đối với lợn Kết quả phân loại chất l−ợng trứng lợn thu đ−ợc trong hai mùa xuân, hè (bảng 4.15). Bảng 4.15. Phân loại chất l−ợng trứng lợn thu đ−ợc theo mùa Trong mùa xuân tổng số trứng thu đ−ợc trong tổng 90 buồng trứng là 689 trứng, trong đó trứng loại A thu đ−ợc là 440 trứng chiếm tỷ lệ 63, 86 Phân loại trứng thu đ−ợc theo chất l−ợng Loại A Loại B Loại C Mùa Tổng số lần lấy mẫu Tổng số buồng trứng Tổng trứng thu đ−ợc n % n % n % Xuân 14 90 689 440 63,86 ± 0,03 110 15,97 ± 0,03 139 20,17 ± 0,03 Hè 28 244 2953 1695 57,40 ± 0,02 379 12,83 ± 0,02 879 29,77 ± 0,02 Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 63 0,03%, trứng loại B thu đ−ợc là 110 trứng, chiếm tỷ lệ 15,97 %, trứng loại C thu đ−ợc là 139 trứng, chiếm tỷ lệ 20,17 %. Còn trong mùa hè, tổng số trứng thu đ−ợc là 2953 trứng, trên tổng số 244 buồng trứng, số trứng loại A thu đ−ợc là 1695 trứng chiếm tỷ lệ 57,40 %, trứng loại B thu đ−ợc là 397 trứng, chiếm tỷ lệ 12,83%, trứng loại C thu đ−ợc là 879 trứng, chiếm tỷ lệ 29,77 %. Kết quả cho thấy, khi hút trứng từ các nang trứng có kích th−ớc 2 mm, thu đ−ợc trứng loại A, B cao hơn trứng loại C. Chúng tôi chỉ quan tâm đến trứng loại A và B vì hai loại trứng này mới đủ tiêu chuẩn cho nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm, chúng tôi không quan tâm đến trứng loại C vì chất l−ợng trứng loại C không đủ tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo của công nghệ sinh sản nh− nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm. Đối chiếu kết quả thu đ−ợc ở hai mùa xuân, hè cho thấy số liệu có sự chênh lệch giữa hai mùa, nh−ng do số mẫu nghiên cứu giữa hai mùa có sự chênh lệch khá lớn, nên sự sai khác này là không có ý nghĩa trong thống kê. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc chủ động cung cấp và sử dụng trứng thành thục ở cả hai mùa trong các tổ hợp tiếp theo của công nghệ sinh học sinh sản. 34,62 47,76 55,46 54,71 63,86 57,4 0 10 20 30 40 50 60 70 Xuõn Hố Mựa Tỷ lệ trứ ng loạ i A thu ủư ợc (% ) Trõu Bũ Lợn Biểu đồ 4.4. Kết quả thu trứng loại A trên trâu, bò, lợn theo mùa Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 64 19,23 18,13 14,63 18,07 12,83 15,97 0 5 10 15 20 25 Xuõn Hố Mựa Tỷ lệ t rứ ng loạ i B thu ủư ợc (%) Trõu Bũ Lợn Biểu đồ 4.5. Kết quả thu trứng loại B trên trâu, bò, lợn theo mùa 46,15 34,11 30,66 26,47 29,77 20,17 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Xuõn Hố Mựa Tỷ lệ trứ ng loạ i C th u ủư ợc (% ) Trõu Bũ Lợn Biểu đồ 4.6. Kết quả thu trứng loại C trên trâu, bò, lợn theo mùa 4.6 Kết quả nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn trong hai mùa xuân, hè Kết quả nuôi thành thục trứng là cơ sở cho các b−ớc tiếp theo của công nghệ phôi nh− công nghệ thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, sản xuất tế bào gốc,... Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 65 C ông nghệ sinh sản phải đ−ợc tiến hành từ các trứng đ đ−ợc nuôi thành thục, tỷ lệ các trứng ch−a thành thục khi khai thác chiếm một tỷ lệ rất cao 87,02% (Nguyễn Thị Ước vcs, 2003)[17] vì vậy kết quả nuôi thành thục trong ống nghiệm quyết định một phần tất yếu đến sự thành bại của công nghệ phôi. Chính vì vậy chúng tôi đ tiến hành nuôi thành thục trứng của 3 loài vật nuôi phổ biến ở n−ớc ta. 4.6.1 Đối với trâu Trứng trâu sau khi nuôi 24h trong các môi tr−ờng tổng hợp (MAT) tiến hành tách bỏ hết lớp cumulus nhờ sự tác động của men Hyaluronidaza và lực hút đẩy của pipet có gắn đầu côn thuỷ tinh chuyên dụng. Mức độ thành thục của trứng d−ới kính hiểm vi soi nổi với độ phóng đại 100 - 400 lần. Chỉ tiêu ghi nhận là số trứng thành thục (thông qua sự xuất hiện của thể cực thứ nhất - first polar body). Trong thí nghiệm này chúng tôi đ tiến hành nuôi thành thục trứng trâu ở hai mùa xuân, hè (bảng 4.16). Bảng 4.16. Kết quả nuôi thành thục trứng trâu theo mùa Tổng số trứng A +B đem vào nuôi thành thục Tổng số trứng chín Mùa Tổng số lần lấy mẫu Tổng số buồng trứng n % n % Xuân 20 79 150 (52,45 ± 0,05)b 89 (59,33 ± 0,04)b Hè 30 126 338 (65,89 ± 0,04)a 243 (71,89 ± 0,02)a Các kí hiệu a, b theo cột chỉ sự sai khác rõ rệt (p<0,05) ở mùa xuân số trứng đ−a vào nuôi thành thục là 150 trứng trong tổng số 79 lần lấy mẫu, tổng số trứng chín là 89 trứng, chiếm tỷ lệ 59,33 %. Còn ở mùa hè, số trứng đ−a vào nuôi thành thục là 284 trứng, trong tổng số 126 lần lấy mẫu, thu đ−ợc số trứng chín là 243 trứng, chiếm tỷ lệ 71,89%. Đối chiếu Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 66 hai mùa nuôi trứng cho thấy mùa hè tỷ lệ trứng đ−ợc nuôi thành thục trong ống nghiệm cao hơn tỷ lệ này ở mùa xuân có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Theo Nguyễn Thị Ước vcs, (1996)[15], khi tiến hành nuôi thành thục 62 trứng trâu đầm lầy in vitro trong môi tr−ờng T - 199 có bổ sung FSH và estradiol - 17 B*, sau 24h, tỷ lệ trứng chín đạt hơn 87,09%. Qua đó cho thấy kết quả của chúng tôi là thấp hơn rất nhiều so với các tác giả trên, mới chỉ đạt dao động từ 59,33 - 71,83%. Kết quả thu đ−ợc của chúng tôi là hoàn toàn hợp lý vì kết quả nuôi trứng thành thục còn chịu bởi rất nhiều yếu tố nh− giống trâu khai thác trứng, mùa vụ khai thác trứng, vùng khai thác trứng,... thời tiết khí hậu, thức ăn, n−ớc uống cũng ảnh h−ởng nên kết quả nuôi thành thục trứng trâu rất nhiều. Kết quả của chúng tôi thu đ−ợc có sự chênh lệch lớn về kết quả nuôi thành thục ở hai mùa xuân, hè là hoàn toàn hợp lý vì mùa hè ấm áp hơn là mùa mà chu kỳ sinh dục của trâu biểu hiện đầy đủ các đặc tính của mình, trứng thu đ−ợc có chất l−ợng hơn mùa xuân. 4.6.2 Đối với bò Trứng bò sau khi nuôi 24h trong các môi tr−ờng tổng hợp (MAT) tiến hành tách bỏ hết lớp cumulus nhờ sự tác động của men Hyaluronidaza và lực hút đẩy nhẹ nhàng của pipet thuỷ tinh. Sự thành thục của trứng đ−ợc xác định d−ới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 100 - 400 lần. Chỉ tiêu ghi nhận là số trứng thành thục (thông qua sự xuất hiện của thể cự thứ nhất - first polar body). Trong thí nghiệm này chúng tôi đ tiến hành nuôi thành thục trứng trâu ở hai mùa xuân và hè. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 4.17. Qua bảng 4.17 cho thấy, ở mùa xuân, số trứng đ−a vào nuôi là 411 trứng trong tổng số 60 lần lấy mẫu, tổng số trứng chín là 264 trứng, chiếm tỷ lệ 64,23 %. Còn ở mùa hè, số trứng đ−a vào nuôi thành thục là 1384 trứng, trong tổng số 182 lần lấy mẫu, thu đ−ợc số trứng chín là 1072 trứng, chiếm tỷ Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 67 lệ 77,46 %. Đối chiếu hai mùa nuôi trứng cho thấy mùa hè tỷ lệ nuôi trứng thành thục cao hơn mùa xuân với p <0,05. Bảng 4.17. Kết quả nuôi thành thục trứng bò theo mùa Tổng số trứng A +B đem vào nuôi thành thục Tổng số trứng chín Mùa Tổng số lần lấy mẫu Tổng số buồng trứng n % n % Xuân 14 60 411 73,52 ± 0,06 264 (64,23 ± 0,03)b Hè 16 182 1384 69,34 ± 0,04 1072 (77,46 ± 0,02)a Các kí hiệu a, b theo cột chỉ sự sai khác rõ rệt (p<0,05) Theo Feketa vcs, (1988) [23], tỷ lệ trứng bò thành thục sau khi nuôi là 92%. Kết quả của chúng tôi thu đ−ợc thấp hơn của tác giả trên rất nhiều, mới chỉ đạt dao động từ 64,23 - 77,46%. Kết quả thu đ−ợc là hoàn toàn phù hợp với thực tế chăn nuôi bò ở n−ớc ta, các giống bò không phải là giống bò cao sản, mà chỉ là bò thịt. Hơn nữa tình hình chăn sóc nuôi d−ỡng các con bò ở n−ớc ta vẫn ch−a đ−ợc quan tâm, bò th−ờng chịu tác động của ngoại cảnh, nhất là sự thay đổi của các mùa trong năm ở miền Bắc n−ớc ta, mùa nhiều cỏ thì bò no, mùa ít cỏ thì bò đói, mùa lạnh thì bò bị rét, mùa nóng thì bò lại bị nóng. Chình vì vậy đ ảnh h−ởng đến sinh lý cũng nh− chất l−ợng của hai buồng trứng rất nhiều. Mùa hè cho kết quả nuôi trứng thành thục cao hơn mùa xuân là hoàn toàn hợp lý vì mùa hè là mùa mà chu kỳ sinh dục của bò thể hiện đủ các đặc điểm hơn mùa lạnh, bò không phải chịu những trận rét làm ảnh h−ởng đến sức khoẻ cũng nh− chức năng sinh lý sinh dục của bò. Và môt điều khá quan trọng trong thao tác phòng thí nghiệm đó là trứng phải luôn đ−ợc giữ trong nhiệt độ 30 - 35oC, khi đ−a về phòng thí nghiệm và khi thao tác trứng để nuôi thành thục, ở mùa hè sẽ đảm bảo đạt đ−ợc điều kiện này dễ dàng hơn mùa xuân nên tỷ lệ nuôi thành thục trứng bò ở mùa xuân thấp hơn mùa hè. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 68 4.6.3 Đối với lợn Trứng lợn sau khi nuôi 36 - 72h trong các môi tr−ờng tổng hợp (MAT) có bổ sung Hormone (MAT I) và không bổ sung Hormone (MAT II), tiến hành tách bỏ hết lớp cumulus nhờ sự tác động của men Hyaluronidaza và lực hút đẩy của pipet thuỷ tinh. Sự thành thục của trứng đ−ợc quan sát d−ới kính hiểm vi soi nổi với độ phóng đại 100 - 400 lần. Chỉ tiêu ghi nhận là số trứng thành thục (thông qua sự xuất hiện của thể cực thứ nhất - first polar body). Trong thí nghiệm này chúng tôi đ tiến hành nuôi thành thục trứng trâu ở hai mùa xuân, hè (bảng 4.18). Bảng 4.18. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn theo mùa Tổng số trứng A +B đem vào nuôi thành thục Tổng số trứng chín Mùa Tổng số lần lấy mẫu Tổng số buồng trứng n % n % Xuân 14 90 550 79,83 ± 0,03 319 58,00 ± 0,06 Hè 28 244 2074 70,23 ± 0,02 1371 66,10 ± 0,02 ở mùa xuân, số trứng đ−a vào nuôi thành thục là 550 trứng trong tổng số 90 lần lấy mẫu, tổng số trứng chín là 319 trứng, chiếm tỷ lệ 58, 00 0,06%. Còn ở mùa hè, số trứng đ−a vào nuôi là 2074 trứng, trong tổng số 244 buồng trứng, số trứng thành thục sau khi nuôi là 1371 trứng, chiếm tỷ lệ 66, 10 0,02%. Đối chiếu kết quả nuôi trứng thành thục ở hai mùa xuân, hè tuy có sự chênh lệch về số liệu ở hai mùa, nh−ng do mẫu thí nghiệm khác nhau, nên tổng trứng chín thu đ−ợc trong hai mùa là không có sự sai khác có ý nghĩa đ−ợc tìm thấy về tỷ lệ phần trăm trứng thu đ−ợc giữa hai mùa xuân, hè. Đó là một điều thuận lợi cho việc khai thác trứng lợn, đ−a vào nuôi thành thục, phục vụ cho các công nghệ phôi sau này. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 69 Kết quả của chúng tôi tuy có thấp hơn so với một số tác giả ngoài n−ớc nh− của (Ratky vcs, 2003)[36] là 88,02%. Nh−ng hoàn toàn hợp lý với thực tế chăn nuôi lợn ở n−ớc ta, do tuổi và khối l−ợng lợn khai thác, ch−a đạt ở mức thành thục về tính và thể vóc, mới chỉ tập trung vào tháng tuổi 5 - 6 và khối l−ợng đạt 50 -75 kg, trong khi đó tuổi thành thục của lợn ở tháng tuổi 6 - 8 và đạt khối l−ợng từ 80 - 100 kg. Hơn nữa hình thức, tập quán chăn nuôi lợn của n−ớc ta còn ch−a đồng bộ và đảm bảo nh− ở n−ớc ngoài, các n−ớc có nền chăn nuôi lợn công nghiệp. 59,33 71,6 58 64,23 77,46 66,1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Xuõn Hố Mựa Tỷ lệ tr ứ n g th àn h th ụ c (% ) Trõu Bũ Lợn Biểu đồ 4.7. Tỷ lệ nuôi trứng trâu, bò, lợn thành thục theo mùa Từ những kết quả thu đ−ợc ta thấy, với trứng trâu thu đ−ợc trong hai mùa có sự logic giữa các chỉ tiêu, khối l−ợng trung bình của buồng trứng, t−ơng ứng với nó là kích th−ớc trung bình của buồng trứng thu đ−ợc trong mùa xuân cao hơn mùa hè. Tuy khối l−ợng và kích th−ớc trung bình của buồng trứng ở mùa xuân cao hơn mùa hè, nh−ng không nhất thiết số nang trứng 2mm thu đ−ợc trên bề mặt buồng trứng cũng cao hơn, vì số nang trứng 2mm trên bề mặt buồng trứng lại phụ thuộc vào chu kỳ sinh dục, mùa sinh sản của gia súc. Mùa hè ấm áp, đặc điểm sinh dục của gia súc thể hiện đầy đủ đặc Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 70 điểm hơn nên số nang trứng 2mm thu đ−ợc trung bình trên bề mặt buồng trứng ở mùa hè cao hơn mùa xuân. Nang trứng 2mm có mối quan hệ tỷ lệ thuận với số trứng thu đ−ợc, vì vậy khi chúng ta thu đ−ợc số nang trứng 2mm ở mùa hè cao hơn mùa xuân thì th−ờng số trứng thu đ−ợc ở mùa hè cũng cao hơn mùa xuân, nên kết quả của chúng tôi thu đ−ợc là hoàn toàn hợp lý với quy luật. Những nang trứng có kích th−ớc 2mm, th−ờng cho kết quả thu trứng có chất l−ợng, chính vì vậy mà trứng A, B thu đ−ợc cũng tỷ lệ thuận với nó, mùa hè thu đ−ợc cũng cao hơn mùa xuân. Còn tỷ lệ nuôi trứng thành thục thì th−ờng nó không nhất thiết phải tỷ lệ thuận với bất kỳ chỉ tiêu nào bên trên mà nó lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố. ở đây kết quả chúng tôi thu đ−ợc tỷ lệ trứng thành thục ở mùa hè cao hơn mùa xuân, nh−ng khi tiến hành làm các b−ớc tiếp theo trong tổ hợp cnss thì kết quả thu đ−ợc với trứng thành thục ở mùa hè lại không cao hơn mùa xuân. Điều này cho thấy các nghiên cứu về trứng không thể chỉ dừng lại ở nuôi thành thục mà còn cần làm các nghiên cứu khác về trứng thì mới có đ−ợc những nhân định chính xác về trứng thành thục ở các mùa trong năm. Khác với trứng trâu, các chỉ tiêu sinh học có sự chênh lệch ở trứng bò, ở trứng bò khối l−ợng và kích th−ớc trung bình của buồng trứng thu đ−ợc cũng tỷ lệ thuận với nhau, nh−ng ở mùa hè lại cao hơn mùa xuân. Còn số nang trứng có kích th−ớc 2mm, số trứng thu đ−ợc và số trứng A, B cũng có tỷ lệ thuận với nhau, đó là ở hai mùa đều không có sự khác nhau có ý nghĩa. Điều này càng khẳng định một lần nữa đó là khối l−ợng và kích th−ớc của buồng trứng không có mối quan hệ t−ơng quan nào với nang trứng 2mm trên bề mặt buồng trứng, số trứng thu đ−ợc và số trứng A, B đem vào nuôi thành thục. Mà ba chỉ tiêu này lại phụ thuộc vào chu kỳ sinh dục, mùa sinh sản của gia súc, mùa nào thuận lợi cho sinh sản của gia súc thì th−ờng cho kết quả cao hơn. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 71 Mặt khác cũng cho thấy kết quả nuôi thành thục trứng bò ở đây lại không phụ thuộc vào số trứng A, B đem vào nuôi, ở đây số trứng A, B đem vào nuôi thành thục giữa hai mùa không có sự khác nhau có ý nghĩa, nh−ng khi tiến hành nuôi thành thục thì kết quả nuôi thành thục lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nh− mùa sinh sản của gia súc, điều kiện chăm sóc nuôi d−ỡng gia súc, môi tr−ờng sống của gia súc, nên kết quả nuôi thành thục trứng bò ở mùa hè lại cho tỷ lệ cao hơn mùa xuân. Khác với hai loài đại gia súc trâu, bò, thì ở loài tiểu gia súc là lợn, các chỉ tiêu sinh học lại có những kết quả thu đ−ợc khác nhau, nh− khối l−ợng và kích th−ớc trung bình của buồng trứng vẫn tỷ lệ thuận với nhau và ở mùa hè kết quả thu đ−ợc thấp hơn mùa xuân. Nh−ng số nang trứng 2mm, số trứng thu đ−ợc, tỷ lệ trứng trứng A, B chọn vào nuôi thành thục và kết quả nuôi thành thục trứng ở đây lại đều không có sự khác nhau có ý nghĩa giữa hai mùa xuân, hè. Qua đó ta thấy, giữa ba loài vật nuôi tiến hành thí nghiệm ở đây, các chỉ tiêu sinh học thu đ−ợc có một số t−ơng quan có tính quy chung giữa hai mùa: Biến động giữa khối l−ợng và kích th−ớc ở hai mùa đối với từng loài có tính quy luật, biến động giữa số nang trứng 2mm và số trứng loại A, B thu đ−ợc với từng loài có tính quy luật. Tuy nhiên nếu chỉ quan tâm đến khả năng nuôi thành thục, thì kết quả nuôi thành thục ở loài bò trong ba loài vật nuôi tiến hành thí nghiệm là cho tỷ lệ cao hơn cả, tuy nhiên số mẫu thu đ−ợc lại không dồi dào nh− trứng lợn, tỷ lệ nuôi thành thục của trứng lợn cũng cao, vì vậy đây là nguồn nguyên liệu tốt cho công nghệ sinh sản. Trong công nghệ sinh sản hiện nay thì có thể dùng trứng đ thành thục của loài này cho nhiều loài khác nhau. Vì vậy rất thuận lợi cho tổ hợp các nghiên cứu của công nghệ sinh sản và trong một t−ơng lai không xa việc sử dụng rộng ri các ứng dụng của công nghệ sinh sản vào trong đời sống của loài ng−ời sẽ đem lại rất nhiều lợi ích khác nhau. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 72 5. KếT LUậN Và Đề NGHị 5.1. Kết luận 5.1.1 Với trứng trâu thu đ−ợc ở miền bắc n−ớc ta, các chỉ tiêu thu đ−ợc nh− sau: khối l−ợng và kích th−ớc của buồng trứng thu đ−ợc ở mùa xuân cao hơn mùa hè, còn số nang trứng có kích th−ớc 2mm, tỷ lệ thu trứng, phân loại trứng A, B, và tỷ lệ nuôi thành thục, ở mùa hè cao hơn mùa xuân, với p < (0,001 - 0,05). 5.1.2 Với trứng bò thu đ−ợc ở miền bắc n−ớc ta, các chỉ tiêu thu đ−ợc nh− sau: khối l−ợng và kích th−ớc của buồng trứng thu đ−ợc ở mùa hè cao hơn mùa xuân, còn số nang trứng có kích th−ớc 2mm, tỷ lệ thu trứng, phân loại trứng A, B, ở mùa hè và mùa xuân không có sự sai khác có ý nghĩa, nh−ng tỷ lệ nuôi trứng thành thục ở mùa hè lại cao hơn mùa xuân, với p < (0,001 - 0,05). 5.1.3 Với trứng lợn thu đ−ợc từ một số lò mổ ở Hà Nội, các chỉ tiêu thu đ−ợc nh− sau: khối l−ợng và kích th−ớc của buồng trứng thu đ−ợc ở mùa xuân cao hơn mùa hè; còn số nang trứng có kích th−ớc 2mm, tỷ lệ thu trứng, ở mùa hè cao hơn mùa xuân, với p < 0,05; tỷ lệ phân loại trứng A, B, và tỷ lệ nuôi thành thục, ở hai mùa xuân hè không có sự sai khác có ý nghĩa. 5.1.4 So sánh giữa ba loài cho thấy, các chỉ tiêu thu đ−ợc, ở ba loài đều có sự đặc tr−ng riêng biệt, song nhìn chung đều hợp với quy luật và có tính lôgic giữa hai mùa xuân, hè. Đ−ợc thể hiện ở các chỉ tiêu có mối quan hệ tỷ lệ thuận nh−: trong l−ợng và kích th−ớc, số nang trứng 2mm, số trứng thu đ−ợc và tỷ lệ trứng A, B thu đ−ợc. Kết quả nuôi thành thục thì trứng trâu và bò cho kết quả ở mùa xuân đều thấp hơn mùa hè, còn ở lợn thì giữa hai mùa không có sự Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 73 khác nhau có ý nghĩa. Tuy vậy tiềm năng phát triển của các trứng trong quá trình tạo phôi nhân tạo bằng công nghệ sinh sản (thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính,…) vẫn đang cần đ−ợc khảo sát để có kết luận đầy đủ hơn. 5.2 Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu về ảnh h−ởng của hai mùa còn lại trong năm, đó là mùa thu và mùa đông, lên kết quả nuôi thành thục trứng trâu, bò, lợn. Để có sự chủ động trong các nghiên cứu, ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản, trong một năm ở miền Bắc, Việt Nam. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 74 TàI LIệU THAM KHảO TàI LIệU THAM KHảO TIếNG VIệT 1. Bùi Linh Chi, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Xuân Nguyên (1999) ”ứng dụng kỹ thuật PCR trong sản xuất phôi bò có giới tính chọn lọc ”, Tài liệu hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, 12/1999, Hà Nội, NXB khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 1185 - 1190 2. Trần Tiến Dũng, D−ơng Đ ình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002) Giáo trình sinh sản gia súc, NXB N ông nghiệp - 2002: 232 - 234. 3. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Bùi Xuân Nguyên (1996) “Trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bò nội Việt Nam”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật: 279 - 284. 4. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên, (2003) “Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò Laisind”, Tài liệu hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Hà Nội, NXB khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 699 - 702. 5. Nguyễn Hữu Đức (2005) ”Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam, Luận án tiến sỹ N ông nghiệp: 20 - 43. 6. Hoàng Kim Giao, Đỗ Kim Tuyên, Nguyễn Thanh D−ơng, L−u C ông Khánh, Nguyễn Văn Lý, 1994, “Cấy truyền phôi, một ph−ơng pháp l−u giữ quỹ gen, Kết quả nghiên cứu bảo tồn quỹ gen vật nuôi, NXB N ông nghiệp Hà Nội, 146 - 153. 7. Nguyễn Mộng Hùng, ”Bài giảng sinh học phát triển, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật,Hà Nội - 1993:16 - 83. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 75 8. Nguyễn Việt Linh, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Bùi Xuân Nguyên, 2003, “Sử dụng kỹ thuật vi phẫu thuật miễn dịch phân lập tế bào nút phôi làm nguyên liệu tạo tế bào gốc phôi ”, Hội nghệ C ông nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003, 695-698. 9. Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, L−u C ông Khánh, Phan Lê Sơn, Đặng Vũ Hoà, Chu Thị Yến, Hoàng Kim Giao, Đỗ Kim Tuyên, 2003, “Nghiên cứu tạo đàn bê bằng phôi thụ tinh ống nghiệm ”, Hội nghị công nghệ Sinh học toàn quốc, 598 - 602. 10. Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, lê Văn Ty, Nguyễn Thị −ớc, 1997, “Khảo sát khả năng cung cấp trứng để thụ tinh in vitro: nghiên cứu so sánh ở trâu, bò nội. Kỷ yếu Viện công nghệ sinh học, 1997: 510 517 11. Bùi Xuân Nguyên, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Nguyễn Hữu Đức, Đỗ Quỳnh Sơn, Nguyễn Thuỳ Anh, Nguyễn Thị Ước, 2000, “Nhân bản phôi bò Hà - ấn bằng cấy nhân tế bào sinh d−ỡng, Tạp chí Sinh Học, ISSN 0866- 7160, tập 22, số 1, 16 - 20. 12. Bùi Xuân Nguyên (2003) “Phát triển công nghệ phôi và tế bào phôi ở Việt Nam”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật: 411 - 417. 13. Nguyễn Đức Thạc vcs, 2006, Con trâu Việt Nam, Nhà xuất bản lao động x hội - 2006:12 - 21;110 - 130. 14. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Ph−ơng Thảo, 2005, Giáo trình công nghệ sinh học N ông nghiệp, Ch−ơng IV, Nhà xuất bản N ông nghiệp - Hà Nội 2005. 15. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Xuân Nguyên, (1996) “Sự chín nhân ở tế bào trứng trâu đầm lầy nuôi in - vitro trong môi tr−ờng T 199 có bổ xung FSH và Estradiol - 17 B”, Kỷ yếu viện công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật: 274 - 278. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 76 16 Nguyễn Thị Ước (1996)”Nghiên cứu gây rụng trứng nhiều và gây động dục đồng pha trong cấy phôi trâu bò, Luận án phó tiến sỹ khoa học N ông nghiệp, 5 - 40 17. Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Thùy Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, D−ơng Đình Long, Bùi Xuân Nguyên, 2003, “Ngiên cứu sản xuất bò sữa giống th−ơng phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính, Hội nghệ C ông nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003, 717 - 719. TàI LIệU THAM KHảO TIếNG ANH 18. Abeydeera L.R., Wang W.H., Cantley T.C., Rieke A., Prather R.S. and Day B. N., 1998, “Presence of epidermal growth factor during in vitro maturation of pig oocytes and embryo culture can modulate blastocyst development after in vitro fertilization, Mol. Report. Dev. 51(4), 395 - 401. 19. Ali A.A., Bilodeauu J.F., Sirard M.A., 2003, “Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in-vitro maturation, fertilization and development, Theriogenology, 59: 939 - 949. 20. Beker A.R.C.L., Colenbrander B., Bevers M.M., 2002, “Effect of 17β- Estradiol on the in-vitro maturationof bovine oocytes, Theriogenology, 58: 1663 - 1673. 21. Dang Nguyen Quang Thanh, Nguyen Huu Duc, Nguyen Viet Linh, Nguyen Thi Uoc, Takashi Nagai, Kazuhiro Kikuchi, M. Ozawa, Nguyen Van Hanh, Nguyen Trung Thanh, Bui Linh Chi, Quan Xuan Huu and Bui Xuan Nguyen, 2006, “Conservation of genetic resources of Ban minipig using intracytoplasmic sperm injection, Asian Reproductive Biotecnology, 2006, 161. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 77 22. Dominko T, Mitalipova M, Haley B, Beyhan Z, Memili E, McKusick B, First NL (1999), “Bovine oocyte cytoplasm supports development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species, Biol Report .60(6): 14961502. 23. Feketa M.L., Funahashi H., Aoyagi Y., Takeda T.and Onihara T., 1988. “Maturation of bovine oocytes collected from ovaries of individual heifers and fertilized in vitro. Theriogenology.VOL.36,No.3,p.427 - 434. 24. Fukui Y., Fukushima M., and Ono H., 1983, “Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures, Theriogenology, 20, 651 - 660. 25. Galli C., Crotti G., Notari C., Turini P., Duchi R., Lazzani G., 2001, “Embryo production by Ovum Pick Up from live donors, Theriogenology, 55: 1341 - 1357. 26. Jainudeen M.R,1991. In vitro maturation and in vitro fertilization of buffalo oocytes. Proceedings of FAO Workshop on Biotechnology of reproduction in bufalo,Varna,24 - 27. 27. Krisher R.L., 2004, “The effect of oocyte quatily on development, J. Anim. Sci. 82: 14 - 23. 28. Leibfried - Rutledge M.L va First N.L 1979. Characterization of bovine follocular oocytes and their ability in vitro. J.Anin.Sci.48,p.76 - 86. 29. Leibfried - Rutledge M.L., Critser E.SS.,Eyestone W.H., Northey D.L & First N.L., 1986. Development potential of bovine oocytes matured in vitro, Congress proceedings, p.342. 30. Long C.R., Dobrinsky J.R., Johnson L.A., 1999, “In vitro production of pig embryo: Comparision of culture media and boars, Theriogenology, vol 51: 1375 - 1388. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 78 31. Nguyen B.X, Chi B.L, Duc N.H, Ty L.V, Uoc. N.T. (2000). Comparison between the efficiencies of using bovine and buffalo oocytes as host ooplasts or embryo production by adult cell nuclear transfer. Theriogenology, V.53 (1), 235. 32. Nguyen B.X, (2006). “Current status and trends of animal reproductive biotechnology in Vietnam. Embryo Transfer Newsletter, V 24, No 2: 5-10 33. Nguyen B. X, T. Nagai, K. Kukuchi, N. T. Uoc, M. Ozawa, N. V. Linh, N. H. Duc, D. N. Q. Thanh, N. V. Hanh, and Q. X. Huu, 2007, “Effect of gonadotropin treatment on oocyte collection and in vitro fertilization in the Ban minipig, IETS, Kyoto, Japan, 6 - 10 January 2007, Volume 19 (1): 269 - 270. 34. Ocampo, Lucyna katska & Zdzislaw Smorag, 1996. “Maturation of bovine oocytes and influence of culture temperature on in vitro maturation of bovine oocytes. Amin.Repord.Sci., 9, 205 -212. 35. Oyamada T., Iwayama H., Fukui Y., 2004, “Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium, Zygote, 12 (2), 143 - 150. 36. Ratky, Katiyar P.K, Raminder Singh.,2003, “Maturation of porcine oocytes in vitro and developmental competence of porcine oocytes, Gamete Biology, Biology of reproduction, 11: 299 - 305. 37. Sueo Niimura, Yohko Yoshihisa and Hiroko Takano, 2005, “Effect of Steroids on maturation of denuded porcine oocytes, Bull. Facul. Niigata Univ., 57 (2):95 - 102. Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 79 PHụ LụC Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 80 Ảnh thu trứng trâu Ảnh trứng trâu loại A Ảnh trứng trâu loại B Ảnh trứng trâu loại C Ảnh ủộ bụng tơi lớp cumulus khi trứng thành thục Ảnh trứng trâu thành thục Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 81 Ảnh thu trứng bò Ảnh trứng bò loại A Ảnh trứng bò loại B Ảnh trứng bò loại C Ảnh ủộ bụng tơi lớp cumulus khi trứng thành thục Ảnh trứng bò thành thục Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ----------------------- 82 Ảnh thu trứng lợn Ảnh trứng lợn loại A Ảnh trứng lợn loại B Ảnh trứng lợn loại C Ảnh ủộ bụng tơi lớp cumulus khi trứng thành thục Ảnh trứng lợn thành thục ._.