Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng loại vi khuẩn sinh axit lactic phục vụ sản Xuất sữa chua có chất lượng cao từ dịch sữa đậu tương

, nên nhiều nước Âu Mỹ cũng có thể trồng thuận lợi như Liên Xô (cũ); Ba Lan; Tiệp Khắc (cũ); Rumani; Pháp; Mỹ; Canađa...[5] Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 38 - 40%, lipid từ 18 - 20%, giầu nguồn sinh tố và muối khoáng. Đậu tương là một loại hạt duy nhất mà giá trị dinh dưỡng của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid, protein của đậu tương có giá trị dinh dưỡng cao nhất trong số các protein của thực vật. [4] [5] [9] Qua bảng 1.1 ta thấy: hàm lượng protein của đậu tương là khá cao hơn cả thịt và cao gấp 2 lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác. Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnh như: Methionin, sistein, sixtin... của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này trong thành phần của trứng. Hàm lượng của casein đặc biệt là lizin rất cao, gần gấp rưỡi của trứng. Vì thế mà khi giá trị protein của đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có các thành phần tạo cholesterol, không có các dạng axit uric... Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. [18] Theo báo Nông nghiệp Việt Nam số 101/755 ngày 20/12/1998 của tác giả Ngô Hữu Đoàn cho biết: Các nhà sinh hoá của Mỹ đã khám phá một chất có trong đậu tương có khả năng chống lại bệnh ung thư, chất này có tên là genistin- một protein chính trong đậu tương đóng vai trò then chốt trong việc ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Theo tiến sĩ Emili của Trường đại học South California: Chất genistin có tác dụng ngăn chặn các tín hiệu của tế bào ung thư để buộc cơ thể tạo ra những mao quản mới nuôi dưỡng chúng khiến cho các tế bào này bị tàn lụi đi. Do vậy, các nhà nghiên cứu khuyến cáo: trong khẩu phần ăn hàng ngày nên có nhiều đậu tương để tránh mắc bệnh ung thư, nhất là ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến. Ngoài ra, đậu tương còn có hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác (đặc biệt là các axit béo không thay thế như: Oleic, linoleic, arachinoic, linoleic...) nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật, đặc biệt có đầy đủ các axit béo không thay thế. Hiện nay, ở các nước có mức sống cao, người ta chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật vì: Trong dầu đậu tương hầu như không chứa cholesterol. Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm ngon. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vỡ động mạch.[4] [5] ở hạt đậu tương còn có nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng của các vitamin B1, B2. ngoài ra còn có các loại vitamin PP; A; E; K; D; C... và các loại muối khoáng khác. [4] [5] Sản phẩm từ hạt đậu tương có trên 600 chủng loại khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới dạng: tươi, nước, bột, khô, các sản phẩm lên men (như làm giá, bột, tương, đậu phụ, đậu hũ, chao, tào phớ, sữa đậu nành, xì dầu, tauco... ) đến các sản phẩm cao cấp khác như: Cafe đậu tương, chocolate đậu tương, bánh kẹo, patê, thịt nhân tạo. [4] [5] ở nước ta, từ ngàn năm nay đậu tương cũng đã cung cấp một phần nhu cầu chất đạm cho người và gia súc. Thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu tương phần nào tạo được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phần của người dân. Đậu tương có thể chế biến thành: giò, chả cho những người ăn chay hay sữa đậu cho những người bị bệnh liên quan đến hệ vận động.[4] ở nhiều nước phát triển, người ta còn sử dụng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không.... [19] Từ sau Đại chiến thế giới lần thứ II, đậu tương giữ vị trí hàng đầu trong thị trường nông sản thế giới. Bảng 1.2. Thống kê diện tích năng suất, sản lượng đậu tương trên thế giới. [19] Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (Triệu tấn) 1960 21,9 1,22 26,6 1970 29,4 1,42 41,8 1994/1995 62,5 2,18 136,5 ở nước ta, cây đậu tương đã được biết đến từ rất lâu, ngay từ khi nó còn là một cây hoang dại, sau được thuần hoá và trồng như là một cây lương thực có giá trị dinh dưỡng cao. Bảng 1.3. Diện tích, năng suất và sản lượng của 8 nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới. Nước Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (Triệu tấn) Mỹ 24,6 2,75 68,5 Brazil 11,5 2,22 25,5 Trung Quốc 10,0 1,60 16,0 Argentina 5,7 2,14 12,2 ấn Độ 4,0 0,84 3,3 Canada 0,8 2,78 2,3 Paragoay 1,1 2,0 2,2 Indonesia 1,4 1,11 1,6` Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, sản lượng của một số giống đậu đỗ ở Việt Nam. Hạt Năm 1981 - 1984 Năm 1985 - 1990 Năm 1991 - 1994 DT (1000 ha) NS (Tấn/ha) SL (1000 tấn) DT (1000 ha) NS (Tấn/ha) SL (1000 tấn) DT (1000 ha) NS (Tấn/ha) SL (1000 tấn) Lạc 150 0,85 145 230 70,90 220 300 1,0 300 Đậu tương 80 0,65 70 110 0,8 20 120 0,9 108 Các loại đậu khác 150 0,55 90 162 0,6 95 180 640 115 DT: Diện tích NS: Năng suất SL: Sản lượng Vai trò của cây đậu tương ở nước ta hiện nay cũng như những năm tới chủ yếu là nhằm giải quyết vấn đề đạm cho người và gia súc, thay thế một phần thịt cá và thoả mãn một phần cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Về mặt diện tích, năng suất và sản lượng của một số giống đậu đỗ ở Việt Nam (từ 1981 - 1994) được thể hiện qua bảng 1.4. [19] Qua bảng 1.4 chúng ta nhận thấy: ở Việt Nam, đậu tương là nguồn nguyên liệu lớn về protein thực vật. Tính từ 1985 trở lại đây, sản lượng đậu tương tăng lên đáng kể. Qua đó có thể thấy những năm qua và trong tương lai Nhà nước có chủ trương phát triển đậu tương thành mặt hàng chiến lược cho xuất khẩu và sử dụng trong nước. Tóm lại, hiện nay ở Việt Nam nhu cầu sử dụng sản phẩm về đậu tương là rất cao. Ngoài một số sản phẩm đã được nhân dân ưa chuộng và quen thuộc như: Đậu phụ, tào phớ, sữa đậu tương , nước chấm lên men... thì việc chế biến đậu tương còn nhiều hạn chế cả về quy mô và chủng loại. Vì vậy cần phải đẩy mạnh sản xuất, chế biến đậu tương thành nhiều loại sản phẩm. Hiện nay có một sản phẩm đang được người tiêu dùng trên toàn thế giới rất ưa chuộng đó là sữa chua làm từ đậu tương - đây là một sản phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều đặc tính ưu việt khác. Đã có rất nhiều người, nhiều đề tài nghiên cứu về sản phẩm này. Song đó là sữa chua lên men từ sữa bò. Tuy nhiên, sữa và những sản phẩm từ sữa bò ngày nay không còn giữ địa vị độc tôn, bởi người tiêu dùng luôn e ngại về các bệnh dịch có thể gây nguy hại cho chính loài người đang lan tràn ở các loài gia súc lấy sữa như: bệnh lở mồm long móng, bệnh bò điên... Ngoài ra có không ít người bị “dị ứng với sữa”. Vậy sản xuất sữa chua từ nguyên liệu thay thế là sữa đậu tương thì sao? Đây là một lĩnh vực hoàn toàn mới, chưa có một đề tài nào đề cập một cách sâu sắc tới quy trình sản xuất sữa chua từ sữa đậu tương , đặc biệt là xem chủng nào lên men tốt nhất cho sản phẩm sữa chua từ sữa đậu nành mang hương vị đặc trưng nhất. Xuất phát từ thực tế trên và để phần nào đáp ứng nhu cầu hiện nay của người dân về sữa, về protein, về giải pháp đầu ra cho cây đậu tương. Được sự đồng ý của Bộ môn Hoá sinh - Bảo quản - Chế biến nông sản- Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng loại vi khuẩn sinh axit lactic phục vụ sản xuất sữa chua có chất lượng cao từ dịch sữa đậu tương .” 1.2. Mục đích, yêu cầu của đề tài: 1.2.1. Mục đích: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn tốt nhất cho lên men sữa chua từ sữa đậu nành. 1.2.2. Yêu cầu: - Phân lập được chủng vi khuẩn sinh axit lactic. - Tuyển chọn được chủng vi khuẩn tốt nhất để lên men sữa chua từ sữa đậu tương . - Tối ưu hoá chủng đã tuyển chọn. - Đề xuất quy trình sản xuất sữa chua từ sữa đậu tương . Phần thứ HAI Tổng quan tài liệu 2.1. Vi khuẩn Lactic: [7] [22] 2.1.1. Khái quát về lịch sử nghiên cứu vi khuẩn lactic:[22] - Năm 1780 nhà hoá học Thuỵ Điển Scheele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bò lên men sữa chua, gọi là axit sữa. - Năm 1837 Pasteur chứng minh rằng việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. - Năm 1878: Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic mà hiện nay gọi là Streptococcus lactic. Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau. Có thể nói việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic được hình thành từ năm 1881. - Năm 1959 Prescott và Dun đã thành công trong khi sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic ở quy mô công nghiệp. Ngày nay, các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loại vi khuẩn lactic thuần khiết và có hoạt tính cao. 2.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic: 2.1.2.1. Hình thái vi khuẩn: Các vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất: - Tất cả là vi khuẩn gram dương. - Không tạo bào tử. - Không di động, không có tiên mao. Kích thước và hình dạng các vi khuẩn lactic đều khác nhau ở các giống khác nhau. Sự thay đổi hình dạng và kích thước tế bào thường xảy ra trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy hình thái tế bào còn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. [8] 2.1.2.2. Đặc tính sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic: Vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt cả ở điều kiện yếm khí và hiếu khí. Khả năng hô hấp của chúng bị giới hạn vì chúng thiếu xitocrom là yếu tố cần thiết cho sự hô hấp, chúng là những vi khuẩn yếm khí không bắt buộc. Năng lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển thu từ sự phân giải hyđratcacbon. Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất sinh trưởng phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể sống được trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và N. Đa số các vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: riboflavin, tiamin, axit pantotenic, axit folic, biotin, axit nicotinic và các nhóm axit amin... Vì vậy, người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp có chứa dịch cà chua, cao nấm men và muối khoáng. 2.1.2.3. Phân loại vi khuẩn lactic: [35] Các vi khuẩn lactic được chia làm 5 nhóm: * Lactobacterium: Là trực khuẩn lên men lactic đồng hình có thể xếp đôi, kết chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Nhiệt độ thích hợp từ 40 - 500C. Các đường lên men được là: galactoza, fructoza, sarcharoza, glucoza. Lactobacterium là vi khuẩn hiếu khí, có 3 chủng đặc trưng: - L. bulgaricus - L. breris - L. casei * Leunocostoc: Là cầu khuẩn lên men lactic dị hình có hình ovan và hình trứng. Chúng có khả năng lên men đường thành dextran, lên men được đường trioza, sản phẩm tạo thành axit D . lactic; etanol, CO2. Có 2 chủng đặc trưng: - L. mensenteroides - L. lactic * Pediococcus: Là cầu khuẩn lên men lactic đồng hình tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn và tụ cầu khuẩn; chúng lên men glucoza theo chu trình EMP (Embden - Meyerthoff - Panass), axit lactic tạo thành có dạng D.L, D(-) hoặc (+). Có 3 chủng đặc trưng: - P. acidilactici - P. dextranicium - P. halophilus * Streptococcus: Là cầu khuẩn lên men lactic đồng hình, chúng có thể xếp đôi hoặc chuỗi. Có khả năng lên men đương hexoza tạo thành axit lactic. Có 3 chủng rất quan trọng được sử dụng trong công nghiệp sữa là: - S. lactis - S. cremoris - S. thermophilus * Bifidobacterium:Là vi khuẩn lên men dị hình có hình dạng biến đổi, đôi khi hình tròn lúc lại hình que. Lên men đường lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic. Có 3 chủng đặc trưng: - B. bifidum - B. longum - B. infantis 2.1.3. Các kiểu lên men của vi khuẩn lactic: [2] [7] 2.1.3.1. Lên men lactic đồng hình: Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải glucoza theo con đường EMP. Chúng chứa các enzim cần thiết cho sự phân giải này (kể cả enzim aldolaza).Hydro xuất hiện trong phản ứng loại hydro của triophosphat sẽ được truyền cho pyruvic và tuỳ thuộc tính đặc hiệu lập thể của enzim lactat dehydrogennaza và tuỳ thuộc vào sự tồn tại của enzim lactat raxemaza mà có thể xuất hiện dạng D(-); D(+) hay D.L. Chỉ có một phần nhỏ pyruvic được decacboxyl hoá và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2 cũng như tạo thành axeton .... Mức độ sự tạo thành các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào sự có mặt của oxy. Vi khuẩn lactic đồng hình được dùng vào sản xuất các sản phẩm từ sữa như: L. bulgaricus và S. thermophilus trong sản xuất sữa chua; dùng S. lactic và các loài khác trong sản xuất phomat Harzer. 2.1.3.2. Lên men lactic dị hình: Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzim chủ yếu của con đường EMP - đó là aldolaza và triophotphat izomeraza. Vì vậy, giai đoạn đầu của sự phân giải glucoza xảy ra theo con đường pentozophotphat tức là qua glucozo 6 photphat; 6 photphat gluconat và ribuloza 6 photphat. Chất này nhờ một enzim epimaraza được chuyển thành xyluloza 5 photphat và sau đó trong một phản ứng phụ thuộc tiamin pyrophotphat được enzim pentozophotphoxetolaza phân giải thành glyxeraldelut photphat và axetyl photphat. Sự oxi hoá trioza thành axit lactic xảy ra giống như trong sự lên men lactic động hình. Còn axetyl photphat có thể được chuyển hoá thành etanol và axit axetic. Các kiểu lên men của vi khuẩn lactic ta có thể biểu diễn theo sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Các con đường trao đổi glucoza của vi khuẩn lactic. GlucozA Fructoza- 1,6P Fructoza- 6P Glucoza-6P Acetyi-P + Erythoza-4P 6P-Gluconat Heptoza-P Xyluloza 5P + CO2 + Pentopza-P Photphoketoza Trioza-3P acetyl-P+Trioza-3P Trioza-3P+acetyl-P ADP ADP ADP ATP ATP ATP Pruvat Pruvat Pruvat Lactat Acetat Lactat Lactat Acetat Lên men đồng hình Lên men dị hình Bảng 2.1. Vi khuẩn lactic xếp theo hình thái và kiểu lên men. [7] Hình cầu Hình que Lên men đồng hình: C6H12O6 đ 2CH3 - CHOH - COOH Streptococcus lactic Streptococcus faecalis Streptococcusáalivarius Streptococcus pyogenes Streptococcus cremoris Streptococcus thermophilus Streptococcus diaxetylactic Periococcus cerevisiae Vi khuẩn ưa nhiệt (nhiệt độ tối thích 400C, không sinh trưởng ở 150C) Lactobacillus lactis Lactobacillus helveticus Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus delbrukii Liên cầu khuẩn (nhiệt độ tối thích 30 - 370C, sinh trưởng được ở 150C) Lactobacillus casei Lactobacillus platarum Suporolacto baccillu mulinus Lên men dị hình: C6H12O6 đ CH3 - CHO - COOH + OH - CH2 - COOH + CH3 - CH2OH + CO2 Leuconostoc mesentoroides (Betacoccus) Leuconostoc cremioris Betabacterium Lactobacillus brevis Lactobacillus fermentum Lactobacillus viridescens Bifidobacterium bifidum 2.1.4. Môi trường sống của vi khuẩn lactic:[20] Vi khuẩn lactic phát triển tốt trong các môi trường có nhiều cacbonhydrat hoà tan, protein, vitamin và rất ít oxy. Chúng ưa axit hoặc không. Các loài khác nhau thích nghi sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau. Lượng axit lactic tạo ra nhiều trong môi trường làm giảm độ pH, do đó ngăn chặn được nhiều sự phát triển của các vi khuẩn khác. Vi khuẩn lactic thường sống kí sinh trên các loại động thực vật, điều đó được thấy rõ trên nhiều môi trường sống khác nhau của vi khuẩn lactic. ở người, trong khoang miệng có nhiều vi khuẩn kị khí gram âm và Streptococcus. Streptococcus chiếm ưu thế trong quần thể vi sinh vật ở mọi vị trí trong khoang miệng người; khoảng 0,1% ở nước bọt và khe lợi (Marsh và Martin, 1984). Trong miệng trẻ em từ 2 - 5 tuổi chủ yếu có các loài L . casein; thỉnh thoảng có L . acidophilus và L . fermentum. Trong cao răng có chủ yếu là L . casein (Kneist và cộng sự, 1998). Trong diều gà có chủ yếu là các loài L . alivarius và L . acidophilus, chúng hầu như là lên men đồng hình (Kvasnikov và cộng sự, 1982). Trong dạ dày của bê, Sharpe (1981) quan sát được các chủng: L .lactis; L . fermentum; các nghiên cứu trên hồi trang, manh tràng, các mô biểu bì, thành tá tràng của chó săn (Davis và cộng sự, 1977) cho thấy có nhiều loại Lactobacillus: L . acidophilus; L . leichmanii; L . plantarum; L . fermentum [20]. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn sống tập trung trên các loại rau quả, các loại ngũ cốc ở những vùng bị thương. Các loài phân lập được: L . plantarum; L . fermentum; một lượng nhỏ L . brevis; L . casein; L . viridescens; L .cellobiosus; L . salivalus. Vi khuẩn lactic biến đổi theo vùng khí hậu, theo mùa, theo độ chín hoa quả [20]. 2.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic: [6] 2.1.5.1. Dinh dưỡng: Trong quá trình sinh sản và phát triển vi khuẩn lactic đòi hỏi phải có nguồn thức ăn với tỷ lệ tương đối cao so với trọng lượng cơ thể. ở người chỉ cần một lượng thức ăn bằng 1% so với trọng lượng cơ thể còn vi khuẩn cần một lượng thức ăn bằng trọng lượng cơ thể nó. Vi khuẩn sinh sản và phát triển nhanh, chúng cần thức ăn để tạo ra năng lượng và những thức ăn để tổng hợp. Những thức ăn này bao gồm cacbon, nitơ, muối khoáng, vitamin, muối vô cơ... [6]. Cơ chế dinh dưỡng: vi khuẩn lactic là một đơn bào, không có bộ máy tiêu hoá. Chúng sống và phát triển được là do tính thẩm thấu của màng nguyên trương, màng này cho một số chất từ ngoài vào được trong tế bào và cho một số chất thoát ra khỏi tế bào. Tính thẩm thấu liên quan đến những yếu tố: + Chủng vi khuẩn: mỗi loài có tính thẩm thấu khác nhau. + Tuổi của vi khuẩn: Vi khuẩn non có tính thẩm thấu mạnh hơn vi khuẩn già. + Nồng độ thức ăn: môi trường có nồng độ thức ăn cao hơn trong tế bào vi khuẩn thì tính thẩm thấu càng mạnh. + Độ hoà tan của thức ăn: những thức ăn không hoà tan thì vi khuẩn không thẩm thấu được, mà nó phải dùng enzim của mình để hoà tan rồi mới hấp thu. * Dinh dưỡng cacbon: Nguồn cacbon tốt nhất là các loại glucoza; fructoza; maltoza; galactoza; sarcharoza; lactoza, cho đến các polysacharit (tinh bột, dextrin). Nguồn dinh dưỡng quan trọng cho vi khuẩn lactic là monosarcharit và disarcharit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, pyruvic, fumaric, aketic. Tuỳ từng loại vi khuẩn lên men lactic đồng hình hay dị hình mà có các sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men khác nhau khi chúng sử dụng các axit gluconic tạo thành CO2, axit axetic, axit lactic. Khi sử dụng axit amin như axit glutamic. arginin, tirozin thì xảy ra quá trình đề cacbonxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì sử dụng các nguồn cacbon khác nhau, chẳng hạn: Streptococcus lactic sử dụng tốt glucoza, lactoza; maltoza, Lactobacillus bulgaricus. Sử dụng glucoza, maltoza, galactoza, sarcharoza, dextrin nhưng không sử dụng được lactoza... *Dinh dưỡng nitơ: Hầu hết các vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của chúng thì chúng ta phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trươngf, chỉ có một số ít loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Bảng 2.2. Nhu cầu axit amin của một số loài vi khuẩn lactic (Theo Tittsler và cộng sự, 1952; Snell, 1954) Vi khuẩn lactic Axit amin Nồng độ mg/ml Leuconostoc citrivocum Lactobacillus cassei Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus arabinosus Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc menenteroides Lactobacillus delbrueckii Streptococcus faecalis Lactobacillus pentosus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus arabinosus Alanin Arginin Asparagin Xistein (xistin) Axit glutamic Glyxin Histidin Isolơxin Lơxin Lyzin Metionin Phenylalanin (prolin) Serin Treonin Tryptophan Tyrozin Valin 0 - 10 0 - 10 0 - 40 0 - 10 0 - 50 0 - 10 0 - 6 0 - 10 0 - 10 0 - 20 0 - 10 0 - 15 0 - 6 0 - 20 0 - 10 0 - 3 0 - 6 0 - 10 Để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ thịt, casein, pepton... * Dinh dưỡng vitamin: Các vitamin có vai trò là coenzim trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được vitamin, hầu hết các vi khuẩn lactic đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitamin cho sự phát triển bình thường, do đó người ta phải bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác. Nhu cầu vitamin của của vi khuẩn lactic còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiêt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế ôxy hoá khử của môi trường. Chẳng hạn: khi thay đổi nhiệt độ khoảng 3 - 40C thì nhu cầu riboflavin của Lactobaccillus helveticus từ ngoài môi trường thay đổi khoảng 25%. Nhu cầu vitamin cũng bị ảnh hưởng bởi thành phần môi trường. Điều này có liên quan chặt chẽ tới sự có mặt của các axit amin, axit hữu cơ dezoxoribozit... vi khuẩn lactic sẽ không cần vitamin B1, nếu trong môi trường đã có dezoxyribozit. Tương tự nhyư vậy bazơ purin cũng ảnh hưởng tới nhu cầu axit D - aminobenzoic của vi khuẩn lactic.[3] Bảng 2.3: Nhu cầu vitamin của một số loại vi khuẩn lactic (theo Tittsler và cộng sự 1952, Snell, 1954). Loài vi khuẩn Vitamin Nồng độ mg/ml Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus axit D-aminobenzoic 0 - 0,20 Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Biotin 0 - 0,20 Lactobacillus casei Streptococcus faecalis axit folic 0 - 0,15 Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis axit nicotic (vitamin pp) 0,40 Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis axit pantotenic (vitamin B3) 0 - 0,20 Lactobacillus casei Streptococcus lactic Riboflavin 0 - 0,40 0 -1 Lactobacillus fermenti Streptococcus lactis thiamin 0 - 5 Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus debrueckii Vitamin B6 0 - 0,70 0 - 0,4 Lactobacillus lactic Lactobacillus leichmanii Vitamin B12 0 - 0,05 0 - 0,05 * Dinh dưỡng khoáng chất: Các hợp chất vô cơ: đồng, sắt, natri, mangan, magiê... đặc biệt là magan rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Đối với Lactobaccillus thì Mg2+, Mn2+, Fe2+ có tác dụng tích cực tới sự phát triển và sản sinh axit lactic. Nhìn chung mangan và magiê có vai trò chủ yếu: + Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzim. + Giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của ôxy. Mn2+ thay thế cho dioxyt dimustaza để thải các gốc O2-. + ổn định cấu trúc tế bào. + Mg2+ là chất họat động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn sử dụng tốt hơn các loại đường. Bảng 2.4: Nồng độ cần thiết về các muối khoáng đối với vi khuẩn lactic [7] Muối khoáng Nồng độ cần thiết g/l K2HPO4 0,2 - 0,5 KH2PO4 0,2 - 0,5 MgSO4 . 7H2O 0,1 - 0,2 MnSO4 . 4H2O 0,005 - 0,01 FeSO4 . 7H2O 0,005 - 0,01 Na2Mo O4 0,001 - 0,005 ZnSO4 . 7H2O 0,001 - 0,0050 CaCl2 0,01 - 0,03 CaCl2 0,01 - 0,03 CaSO4 . 5H2O 0,001 - 0,005 * Chất sinh trưởng [6]: Trong dinh dưỡng của vi sinh vật, cần phải bảo đảm cung cấp cho chúng một lượng nhất định các chất sinh trưởng như: Vitamin, purin, pirimidin... Bảng 2.5. Nồng độ của một số chất sinh trưởng có thể ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Chất sinh trưởng Nồng độ ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của vi sinh vật (mg/l) ít nhất Thích hợp nhất Axit polic 0,00001 0,001 Axit paranino benzoic 0,00001 0,001 Biotin 0,00001 0,001 - 0,01 Tiamin 0,0001 0,01 - 0,1 Pinidoxin 0,0001 0,01 - 1 Pantotenat Ca 0,005 0,05 - 1 Riboflavin 0,05 0,05 - 1 Niaxin 0,01 0,1 - 1 b-alanin 0,1 0,5 - 1 Colin 0,1 1 - 2 Inozet 1 3 - 6 Các gốc kiềm purin và pinimidin 1 5 - 10 Các loại vi sinh vật khác nhau có mối quan hệ khác nhau đối với chất sinh trưởng, một số có thể tự tổng hợp được chất sinh trưởng gọi là vi sinh vật “tự dưỡng” . Ngược lại một số vi sinh vật không phát triển được khi thiếu chất sinh trưởng gọi chúng là vi sinh vật “dị dưỡng”. Vi sinh vật lactic thuộc loại vi sinh vật “dị dưỡng” chất sinh trưởng. Còn có một số vi sinh vật tuy không nhất thiết đòi hỏi phải có chất sinh trưởng, nhưng nếu có chất sinh trưởng chúng sẽ sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Các môi trường thiên nhiên (sữa, máu, khoai tây, nước thịt) thường đã có đủ các axit amin không thay thế và các chất sinh trưởng cần thiết đối với vi sinh vật. Khi chế tạo các môi trường tổng hợp (cả môi trường bán tổng hợp), nếu không đưa thêm chất sinh trưởng và axit amin không thay thế vào thì nhiều loại vi sinh vật không phát triển được, hoặc phát triển được nhưng rất yếu. Để bổ sung các chất này, người ta thường sử dụng cao ngô, nước chiết cam, nước chiết hoa quả, nước chiết đất, dịch tự phân nấm men, nước chiết nấm men. 2.1.5.2. Qúa trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic. * Trao đổi cacbon: Quá trình này xảy ra tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn. Nếu là chủng vi khuẩn lactic lên men đồng thời thì nguồn cacbon là các loại đường (như: glucoza, lactoza, maltoza, galactoza, sarcharoza...). Thông qua quá trình lên men tạo ra sản phẩm chính là axit lactic. Phương trình tổng quát: C6H12O6 đ 2 CH3.CHOH COOH. (Sơ đồ minh hoạ và giải thích đã được trình bày ở phần phân loại vi khuẩn lactic). Nếu là vi khuẩn lactic lên men dị hình cũng từ nguồn cơ chất như trên thông qua quá trình lên men ngoài axitlactic, sản phẩm còn có axit axetic, etanol, CO2... Phương trình tổng quát: C6H12O6 đ CH3 CHOHCOOH + CH3 COOH + CH3 CH2OH axit lactic axetic etylic + CH2OH CHOH CH2OH + CO2 glyxerin Việc tạo thành đồng thời CO2, axetic, lactic, etylic có thể biểu diễn theo sơ đồ 2.2. * Trao đổi nitơ: Như trên đã nói vi khuẩn lactic sias tổng hợp các axit amin rất khó khăn mà Nitơ dưới dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho quá trình phát triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy, lên men bằng vi khuẩn lactic cần phải bổ sung vào môi trường nguồn dinh dưỡng nitơ. CHO OH CH2 H C CH C C HO H H OH OH O COOH OH CH2 H C CH C C HO H OH OH O P P NAD NADH2 1 NAD NADH2 2 H CO2 OH CH2 CH2 C C C H H OH OH O P O Glucoza 6 - p 6 - p Glucorat Ributozo 5 - p OH CH2 CH2 C C C H H OH OH O P O 3 NTP NDP Lactobacillus brevis CH3 COOH axetic Xilulozo 5 - P CH3 CH2 - O ~ P Leuconostoc mesenteroides CoA Pi CH3 CH2OH CH3 CHO NADH2 NAD NADH2 NAD CoA Etanol Axetyl - P Pi + Pi H2O CH2 CHO C H OH O P Pi ATP ATP 2 2 NADH2 NAD COOH C C CH3 O NADH2 NAD CH3 COOH C H OH Lactic 4 Glixeraldelut - 3 - P Piruvic Sơ đồ 2.2. Con đường chuyển hoá đường glucoza thành axit lactic và các sản phẩm phụ khác 2.1.6. ứng dụng của vi khuẩn lactic: Đã từ lâu, con người đã biết sử dụng vi khuẩn lactic để tạo ra những sản phẩm có giá trị cả về mặt kinh tế lẫn giá trị dinh dưỡng để phục vụ cho nhu cầu của mình như: sữa đóng, sữa đóng cục, kefia, kumic, format, kem, bơ, bột nhào chua, muối dưa, ủ chua, thức ăn gia súc... 2.1.6.1. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong công nghiệp thực phẩm: Đây có thể coi là ứng dụng đầu tiên của vi khuẩn lactic. Vì ngay từ khi mới tìm ra, người ta đã biết sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua. Các nguyên liệu thực vật tươi sống, sau thu hoạch trong thành phần có đường, nếu sự tiếp xúc của ôxy ít thì vẫn xảy ra quá trình lên men lactic, ở rau, quả, lên men lactic là quá trình cơ bản để tránh hư hỏng. Quá trình này thường thấy rõ ở các sản phẩm muối chua như: bắp cải muối chua, rau, quả giầm, ôliu và các sản phẩm kinh tế quan trọng ở phương Tây. Tuy nhiên các sản phẩm lên men này chỉ có ý nghĩa đối với từng vùng, khu vực [20]. Trong sản xuất bánh mỳ, ngoài sử dụng men bột chua người ta còn thấy một số chủng: L. fermentum, L. plantamin, L. delbrucki, L. adophillus, L. sanfrancisco, L. vinidescens, ngoài tác dụng cho lên men bột chua chúng còn làm tăng độ ngon và kéo dài thời gian sử dụng của bánh mỳ. Vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lên men tạo ra các sản phẩm từ sữa như: sữa chua, kefia, các sản phẩm ăn kiêng... Các sản phẩm này được sản xuất nhờ cấy chủng vi khuẩn L. adophillus là chủ yếu. Trong sản xuất sữa chua chủng vi khuẩn Streptococcus salioarius, S. thermophillus, L. delbruckii, L. bulgaricus kết hợp với nhau phát triển rất nhanh ở nhiệt độ 40 - 420C. Loài Lactobacillus phân giải protein mạnh, các axit amin và peptit do nó phân giải ra thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển của Streptococcus. Ngược lại, Streptococcus làm giảm khả năng ôxy hoá khử và tạo axit formic có tác dụng hoạt hóa các tế bào Lactobacillus. Vì vậy, hương vị chính của sữa chua là axetaldehyt, chất này được tạo ra từ thronine do L. bulgaricus và L. delbrueckii, bên cạnh đó sữa chua còn có mùi của diaxetyl, axetoin [20]. Trong sản xuất phormat thường dùng vi khuẩn Lactobacillus với các chủng: L. helveticus, L. delbrueckii. Ngoài ra còn kết hợp với một số chủng L. casei, L. plantarum, L. brevis, L. buchneri. [20] Trong lên men sản xuất xuc xic, vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hoá đường thành axit lactic làm giảm pH, ngăn chặn các chất gây độc, gây thối. Chủng vi khuẩn thường dùng là: L. sake, L. curvatus, L. plantarum, L. alimentarius, L. farciminis. Việc kết hợp các chủng trên với Pediocuccus hoặc Mycrococcus hoặc Staphylococcus được áp dụng rộng rãi (Hamvies và cộng sự, 1985). Sự có mặt của vi khuẩn lactic trong lên men rượu vang có tác dụng rất lớn tới chất lượng rượu vang. Chúng có khả năng chuyển hoá axit malic từ vị nặng gắt, khó chịu thành axit lactic có vị chua dễ chịu hơn, đây là một bí quyết quan trọng để có chất lượng rượu vang cao. Bên cạnh Leuconostoc, Pediococcus, còn có các loại vi khuẩn có thể tham gia vào việc lên men rượu vang như: L. plantarum, L. casei, L. brevis, L. buchneri, L. bilgardii, L. tuchodes, L. fructivaraus... ở Đức trong các nhà máy sản xuất bia lên men từ lúa mạch, người ta sử dụng vi khuẩn la._.ctic lên men ở nhiệt độ 48 - 500C để làm giảm độ pH, tạo điều kiện cho các enzim hoạt động mạnh hơn, protein phân giải tốt hơn, quá trình lên men nhanh hơn. Chất lượng cảm quan bia được cải thiện, nó trở nên êm, dịu khi uống, màu sáng hơn, tăng tính ổn định của bọt. Các loài sử dụng gồm: L. delbrueckii, L. lactis, L. anylovorus, L. fermentumi, L. rhamnosus, L. helveticus. Trong các món ăn cổ truyền của Việt Nam như: nem chua, tôm chua... vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng như một chất tạo vị đồng thời là chất bảo quản. 2.1.6.2. ứng dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp: Trong nông nghiệp vi khuẩn lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn gia súc cho mục đích sử dụng lâu dài và làm tăng giá trị dinh dưỡng. ở Việt Nam, gần đây người ta không chỉ thành công trong lên men lactic để bảo quản thức ăn cỏ xanh cho trâu, bò mà còn thành công trong việc bảo quản cá, tôm và sản phẩm phụ, phế phẩm gây ra khi thiếu hoặc không có phương tiện bảo quản chuyên chở, chế biến kịp thời. Do đó đã hạn chế được các sản phẩm phụ, phế phẩm của các xí nghiệp chế biến thuỷ hải sản, các lò mổ... [3]. Vi khuẩn lactic còn có tác dụng kháng khuẩn gây hỏng trong bảo quản rau tươi, do lượng axit lactic gây ra làm ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [29]. 2.1.6.3. ứng dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp: Vi khuẩn lactic qua quá trình lên men tạo ra axit lactic. Gần đây, axit lactic được sử dụng nhiều trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt và đặc biệt là được sử dụng trong việc sản xuất axit polylactic (PLA), chất dẻo dễ phân huỷ sinh học dùng trong y tế (chỉ khâu vết thương hoặc thiết bị giả thay thế các bộ phận trong cơ thể) [28]. 2.1.6.4. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y dược: Một ứng dụng quan trọng của vi khuẩn lactic là dùng trong điều trị học (một sản phẩm lên men như: Sữa chua...) lactatcanxi là loại dược phẩm để bổ sung canxi dưới dạng dễ hấp thụ cho cơ thể. Lactat sắt dùng để chữa bệnh thiếu máu... [29]. Ngoài ra, người ta còn dùng vi khuẩn lactic cho lên men; qua quá trình tinh chế cho ra axit lactic có độ tinh khiết cao (trên 90%). Axit này- sau đó được dùng vào nhiều ngành, nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, công nghiệp chất dẻo, y dược và cả trong nông nghiệp. Sử dụng chung vi khuẩn lactic làm chất bảo quản thức ăn tự nhiên với mục đích làm tăng độ an toàn và bảo đảm được chất lượng thực phẩm. Việc tăng nồng độ axit lactic trong sản phẩm thức ăn bảo quản có tác dụng chống lại sự hoạt động của các vi sinh vật gây hư hỏng. Vấn đề này được quan tâm đã được loại bỏ việc sử dụng những chất bảo quản nhân tạo mà thường xuyên gây nên nhiều mối lo ngại từ phía người tiêu dùng. (an toàn thực phẩm tốt nhất) [29]. Bên cạnh những ứng dụng của vi khuẩn lactic có lợi còn có những vi khuẩn lactic gây hại. Với thực phẩm có độ pH < 4,1 thường không được tiệt trùng để bảo quản mà nó thường được bảo quản bằng tinh dầu hay axit benzoic. Trong trường hợp bảo quản bị rò rỉ hoặc không đúng cách thì các vi khuẩn lactic sinh trưởng sẽ gây hiện tượng nhớt tạo khí, mất hương vị... loài chính là: Leuconostoc; L. confusus; L. casei; L. plantarum. Đối với các sản phẩm muối chua như: dưa cải muối, loài L. brevis phát triển gây ra mầu đỏ và hiện tượng tạo khí CO2 làm phồng hộp. Trong phomat L. casei sử dụng cotrate, lên men dị hình tạo nhiều CO2 làm tăng các túi khí trong phomat đóng gói. L. plantarum tạo nhớt ở phomat bảo quản trong muối, gây hiện tượng dinh khi lên men rượu vang, vi khuẩn lactic gây hỏng axit tartanic làm thối rữa rượu vang. Việc bảo quản thịt và các sản phẩm thịt bằng đóng gói chân không hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật gây thối nhưng tạo điều kiện cho vi khuẩn Lactobacillus phát triển mạnh. Kết quả là sản phẩm bị nhớt, chua, mất mùi thơm, có mầu xanh. Mầu xanh này là do vi khuẩn lactic tạo H2O2 phản ứng với sắc tố sulymyoglobin là một sắc tố xanh quan trọng được hình thành do phản ứng giữa myoglobin với H2S (Vi khuẩn lactic tạo H2S trong thịt đóng gói chân không) [20]. Tóm lại, việc tìm ra vi khuẩn lactic có một ý nghĩa rất quan trọng. Với tính chất đa dạng của chúng, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng vào rất nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống làm đa dạng cho những sản phẩm lên men, đặc biệt là lên men lactic. 2.2. Vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua: 2.2.1. Sữa chua: Theo truyền thuyết, vào thế kỷ thứ 8, sữa chua (yoghurt) và Kefir bắt nguồn từ vùng núi Elbrus là đặc sản kỳ diệu của dẫy núi Cancasus; đã nhanh chóng phát triển rộng khắp ra các vùng Tây Âu và Trung Âu. Ngày nay sữa chua được tiêu thụ nhiều nhất ở các quốc gia vùng Địa Trung Hải, Trung Âu và Châu á. Sữa chua có nhiều loại như: ymer, yoghurt, kefir, filmjolk, komis... Các sản phẩm này được thu nhận nhờ quá trình lên men 1 phần đường lactoza trong sữa thành axit lactic. Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao và có hương vị thơm ngon nên được nhiều người ưa thích. Vì có hàm lượng axit lactic cao trong thành phần nên protein sữa không bị tiếp tục phân giải, đồng thời kiềm chế được sự phát triển của trực khuẩn đường ruột và trực khuẩn gây thối rữa. Điều đó đảm bảo sự ổn định về số lượng cũng như tỷ lệ các loài vi khuẩn này trong đường ruột. Mặt khác, trong quá trình lên men còn tạo ra một số sản phẩm phụ như: axetic, diaxetyl, axetaldehyt, CO2... làm cho sữa chua có hương vị thơm ngon và tươi mát. Hiện nay các nhà sản xuất còn phối trộn một số thịt quả và sữa như mơ, dâu... để tạo ra nhiều sản phẩm phong phú và đa dạng. Các thành phần dinh dưỡng của sữa chua được cơ thể hấp thụ dễ dàng và đặc biệt nó giúp cho một số người thiếu enzim lactaza trong hệ thống tiêu hoá sữa một cách dễ dàng. Nhà bác học người Nga Elic Metchrikof đã cho thấy những người tiêu thụ nhiều sữa chua có thể kéo dài tuổi thọ (L.P. grafiska, Dry processing hand book). Năm 1993, ở Thuỵ Điển cho ra đời một sản phẩm mới từ sữa có tên gọi BRA thành phần của nó gồm các vi khuẩn lactic như: vi khuẩn bifindo, renteni, L. adophillus. Nhìn chung khi sử dụng sữa chua, ngoài việc cung cấp chất dinh dưỡng cho cơ thể nó còn có tác dụng: [29] + Bảo vệ ruột khỏi những kích thích rối loạn. + Loại trừ nhiễm trùng ruột. + ức chế sự phát triển của những khối u tế bào làm giảm số enzim gây ung thư. + Chống Cholesterol. + Chống ôxy hoá và miễn dịch. + Tăng khả năng hấp thụ thức ăn. 2.2.2. Vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua: 2.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua; Cũng giống như nhiều loại vi khuẩn lactic khác, vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua cũng cần có nguồn dinh dưỡng rất phức tạp cho sự sinh sản, sinh trưởng và phát triển của mình. Nhu cầu đó được thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.7. Nhu càu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua (Rasic, 1978). STT Nhu cầu dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng 1 Năng lượng Lactoza hoặc các đường có khả năng lên men 2 Cacbon Lactoza khác các hyđratcacbon khác có khả năng lên men 3 Nitơ Protein của sữa, peptit và axit amin như: lysin, lơsin, histidin, valin, cystein, axit aspantic; axit: isolơsin, glicin, tyzozin, methionin....... 4 Khoáng chất Các loại khoáng có mặt trong sữa. Mangan ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của các loại Leuconostoc, Bacteria, nhưng không ảnh hưởng đến Thermo Bacteria và Streptococcus. 5 Vitamin và các nhân tố phát triển liên quan Tất cả các vi khuẩn lactic đều đòi hỏi biotin, niacin, axit pantothenic, thianin, pyridoxin, axit folic, vitamin B12. 2.2.2.2. Một số chủng vi khuẩn lactic trong len men sữa chua: Lactobacillus bulgaricus: là trực khuẩn hình que dài và nhọn 5 - 20mm, không chuyển động, lên men glucoza và lactoza. Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của nó là: 40 - 450C, nhiệt độ tối thiểu là 200C. Khả năng tạo thành axit lactic cao (nó có thể tích tụ tới 3,7% axit lactic trong sữa). Trên môi trường thạch - huyết thanh sữa vi khuẩn của chủng này mọc giống như những sợi bông rối.[21] - Streptococcus thermophillus: cầu khuẩn, tế bào nhỏ, xếp thành chuỗi, không chuyển động. Vùng nhiệt độ phát triển được 20 - 500C, phát triển tốt trong môi trường sữa. Số lượng tế bào không giảm trước khi đông tụ, khả năng sinh axit trong sữa bò khoảng 0,8 - 1%. Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn, trơn, nhẵn, không có khả năng phát triển trong môi trường nước thịt - muối mật lactoza. [21]. - Streptococcus lactic: Đây là những trực khuẩn rất ngắn, nhỏ (1 -1,5)x(0,5 - 1,0)mm, gây chua sữa tự nhiên. Trên môi trường thạch nó mọc thành những khuẩn lạc có mép nhẵn, đều, sống kỵ khí tuỳ tiện, lên men tốt glucoza, maltoza, lactoza và có thể tạo được 0,8 - 1% axit lactic. Streptococcus lactic có thể phát triển được ở khoảng 10 - 450C (tối thích ở 30 - 350C). ở nhiệt độ tối thích vi khuẩn này gây đông tụ sữa sau 10 - 12h. Nguồn nitơ cho loài này là peptôn, casein và gelatin bị thuỷ phân nhẹ nên ít người sử dụng. - Lactobaccillus acidophillus: Là trực khuẩn có trong ruột động vật, dễ dàng phân lập từ ruột trẻ con và bê. Trực khuẩn dài có kích thước (0,6 - 0,9)x(1,5 - 6)mm, đứng riêng lẻ, hoặc thành đôi hay kết thành chuỗi ngắn. Lactobacillus acidophillus khi còn non thì gram dương, khi về già lại là gram âm, không sinh bào tử, có thể di động, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 37 - 400C. Có thể dùng chủng này để chống lại bệnh đường ruột. Nó có thể lên men được glucoza, mantoza, sarcharoza, lactoza và tích tụ tới 2,2% axit lactic trong môi trường. 2.2.3. Cơ chế đông tụ sữa: Sự đông tụ sữa trong quá trình lên men nhờ 2 quá trình: - Quá trình hoá lý: Trong quá trình lên men, dưới tác dụng của vi khuẩn lactic, đường lactoza chuyển thành axit lactic làm cho pH của sữa giảm. Khi pH = 4,6 là điểm đẳng điện của casein, làm tăng lực hút tĩnh điện trong cùng một phân tử và giữa các phân tử protein mà chung quy là khử bền phần khoáng của mixen. Casein đẳng điện và đã khử khoáng này sẽ trở nên không tan. - Quá trình enzim: Độ bền của mixen phụ thuộc vào tỷ lệ casein K. Do đó khi những enzim như chimozin, pepxin tấn công đặc hiệu lên casein sẽ dẫn đến khử bền các mixen. Para casein K không tan liên kết với mixen Caseino glucopeptit hoà tan Phemet H2N COOH 105 106 Vị trí tấn công của chimozin Khi cắt liên kết phe 105 - Met 106 của casein K thì sẽ phải phóng ra một glucopeptit hoà tan và một para casein K không tan liên kết ngay với các mixen gốc và tạo ra sự đông tụ. Sự đông tụ có thể được giải thích là do loại bỏ phần mixen đi gần một phần ba và do đó làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các mixen. Bề mặt của các mixen trở nên rất ưa béo do sự chiến ưu thế của para casein K và do đó các mixen liên hợp lại một cách dễ dàng hơn. Các tương tác ion cũng có thể xảy ra giữa phần tích điện dương của paracassein K và phần tích điện âm của casein a và b. Các cầu canxi phospho cũng có thể được thiết lập giữa các mixen. 2.2.4. Cơ chế tạo chất thơm trong quá trình lên men sữa: Trong quá trình lên men, các vi khuẩn lên men lactic ngoài tạo axit lactic còn một số loài như Streptococcus diaxetylactic tạo ra chất thơm diaxetyl, axetonin, axit bay hơi... Có nhiều giả thiết về sự tạo thành diaxetyl. Diaxetyl có thể được tạo thành từ lactoza hoặc từ axit xitric và butylen glycol của vi khuẩn (Jonsson & Petterson, 1977) [23] CH2 COOH COOH COOH CH2 HO C CH3COOH CH2 - COOH O = C - COOH CO2 CH3 COOH C CO2 Axit xitric Axit oxaloaxetic Axit piruvic O Lactoza TTP CH3 - CHO/TTP Acetyl - CoA HS - CoA TTP CH3 - C - C - CH3 OH COOH O Axit a oxetoaxetic O2 CO2 CH3 - C - C - CH3 O O CH3 - CH - CH - CH3 OH OH NAD NADH2 CH3 - C - CH - CH3 O OH CO2 NAD NADH2 Butylen glycol axetoin NAD + diaxetyl reductaza NADH2 Diaxetyl Sơ đồ 2.4: Phản ứng sinh tổng hợp diaxetyl, axtoin và butilen glycol của vi khuẩn (Jonsson và Petterson, 1977) [23]. Maximora cho rằng diaxetyl được tạo thành khi trong môi trường có một thế oxy hoá nhất định. Trong môi trường khử mạnh và thế oxy hoá khử giảm thì diaxetyl chuyển thành axetoin [24]. Trong môi trường có thể oxi hoá khử mạnh (rH2 = 6,0) và có tính khử yếu thì Streptococcus diaxetylactic sẽ tạo được nhiều diaxetyl. Trong khi đó Streptococcus citrovorus, Streptococcus paracitrovorus chỉ tạo được axetoin. Bảng 2.8. Hàm lượng chất thơm trong sữa chua (Tamime và Robinson, 1985) [23]. Vi khuẩn Axetaldehid (ppm) Axeton (ppm) Axetoin (ppm) Diaxetyl (ppm) - Streptococcus thermophilus 1,0 - 8,3 07,3 - 5,2 1,5 - 7,0 0,1 - 13,0 - Lactobacillus bulgaricus 1,4 - 12,2 0,3 - 3,2 2,0 0,5 - 13,0 - Hỗn hợp Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus 2,0 - 41,0 1,3 - 4,0 2,2 - 5,7 0,4 - 0,9 2.2.5. Sản xuất sữa chua trong công nghiệp: Trong công nghiệp, tuỳ thuộc vào quá trình lên men chủnh vi sinh vật và kiểu sản phẩm mà sữa chua được sản xuất và phân loại theo các sơ đồ sau [27]. Sữa tươi Thu gom Nhà máy Lọc Làm lạnh Gia nhiệt Tách bơ Tiêu chuẩn hoá Thanh trùng Đồng hoá Làm nguội Stirred youghurt Men giống Dringking youghurt Set youghurt Tạo hương Lên men Lên men Đóng hộp Làm lạnh Phối trộn Đường Hoa quả Đồng hoá Thanh Trùng Xử lý UHT Lên men Tạo hương Làm lạnh Đồng hoá Đóng hộp Đóng hộp Đóng hộp Làm lạnh Đóng hộp Bảo quản lạnh Chất ổn định Sữa chua ướp lạnh Sữa chua đặc Sữa Sữa Lên men Lên men Làm lạnh nhanh Ly tâm Đóng hộp Phối trộn Đóng hộp Nước sữa Cream Men giống Phần thứ ba Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 3. 1: Vật liệu: 3. 1. 1: Chủng giống vi sinh vật: Chủng giống vi sinh vật được phân lập tại phòng vi sinh, bộ môn Hoá sinh – Bảo quản chế biến nông sản – Trường ĐHNN I Hà Nội, từ các nguồn: P1: Nem chua - Thanh Hóa P2: Xúc xích lợn - Việt Nam P3: Tôm chua - Huế P4: Phomat - New Zealand P5: Mẻ P6: Sữa chua Vinamilk P7: Sữa chua Nestle’ P8: Sữa tươi - Phù Đổng - Gia Lâm - Hà Nội P9: Dưa cải bắp muối 3. 1. 2. Hóa chất: Pepton Axetat narti CH3COO Na, (Liên Xô cũ) Dipotassium Hyđrogen phosphate KH2PO4(Trung Quốc) Diamonium Citrat (Trung Quốc) Sulphat Magie MgSO4. 7H2O (Trung Quốc) Tween 80 (Trung Quốc) Cao nấm men (Việt Nam) Cao thịt bò (Việt Nam) Aga (Việt Nam) Giấy quỳ (Trung Quốc) Bicacbonat natri NaHCO3 (Trung Quốc) Axit axetic (Trung Quốc) Axit Clohyđric (Trung Quốc) Natri Hyđroxit NaOH (Trung Quốc) Sulfat sắt FeSO4 (Trung Quốc) Canxi Cacbonat CaCO3 (Trung Quốc) KI (Trung Quốc) ZnSO4 (Trung Quốc) CuSO4 (Trung Quốc) K3FeCN6 (Trung Quốc) Na2S2O3 (Trung Quốc) K2SO4 (Việt Nam) H3PO4 (Trung Quốc) Taxiro Formaldehit (Việt Nam) Cồn (Việt Nam) Lactoza (Trung Quốc) Natri Clorua (Việt Nam) Sarcharoza (Việt Nam) Axit Sulphuric (Trung Quốc) Phenol phtalein (Liên Xô cũ) 3.1.3. Nguyên liệu dùng lên men: - Dịch sữa dùng để lên men sữa chua được thu nhận theo sơ đồ sau : Đậu tương (khô) Làm sạch Chần nước sôi(1-2 phút) Nước Ngâm nước(4-5 giờ ; 90 % tỉ lệ nước / đậu tương = 2.5/ 1) Dung dịch NaCl 1g/l + NaOH 1,65 g/100l (pH = 8- 8,5) có tỷ lệ so với đậu tương là 8/1 Xay ướt 10% Dịch sữa thô Lọc Dịch lọc Đun sôi(20 phút) Bã thô Bổ sung lactôza(4%) Lọc rửa bã Dịch sữa loãng Dịch sữa đậu tương Bã Sơ đồ 3.1. Quy trình công nghệ sản xuất sữa đậu tương. Với quy trình như vậy dịch sữa đậu tương có một số chỉ tiêu ơnhư sau: Chỉ tiêu Hàm lượng pH axít lactic(%) đường khử lactoza(g/l) axit amin dạng formol(g/l) NaHCO3 8,50 - 8,60 0 40 0 5 3.1.4. Thiết bị và máy móc: Tủ ấm (Nhật) Tủ cấy vô trùng (Việt nam) Tủ lạnh(Liên xô cũ) Tủ sấy vô trùng (Trung quốc) Cân kỹ thuật (Nhật) Máy đo mật độ quang (Nhật) pHmet (Nhật) Nồi tiệt trùng (Nhật ) Kính hiển vi quang học (Nhật) Ngoài ra còn có một số dụng cụ thí nghiệm khác như : bìnhtam giác(250ml, 500ml, 1000ml ), ống đong (50ml), cốc thuỷ tinh (100ml, 250ml, 1000ml ), bình định mức (100ml, 250ml), pipet (0,1ml, 1ml, 2ml, 5ml, 10ml), phễu, đũa thuỷ tinh, bàn trang , hộp petri, ống nghiệm, cốc nhựa .... 3.1.5. Môi trường nghiên cứu: * Môi trường phân lập vi khuẩn lactic MRS (MT1) (MAN; ROGOSA; SHARPE). Thành phần Hàm lượng(g/l) Cao thịt bò 10 Pepton 10 Cao nấm men 5 Glucôza 20 Tween 80 1ml KH2PO4 2 CH3COONa 5 Diamonium 2 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.4H2O 0,8 Aga 20 Nước cất 1000ml Thanh trùng ở 121oC trong 20 phút, pH= 5,8 - 6,2 * Môi trường nhân giống vi khuẩn lactic (MT2): Chúng tôi lựa chọn 1 trong 4 môi trường tốt nhất do trung tâm vi sinh vật ứng dụng - Đại học quốc gia Hà nội nghiên cứu để nhân giống vi khuẩn lactic. Môi trường nước ép cà chua - giá đỗ: Thành phần Hàm lượng(g/l) Nước ép cà chua 100 Nước ép giá đỗ 100 Glucôza 10 Dung dịch A 5 Dung dịch B 5 CaCO3 10 Dung dịch A: thành phầ n hàm lượng(g/l) KH2PO4 25 K2HPO4 25 Nước cất 250 ml Dung dịch b: thành phần hàm lượng(g/l) MgSO4 10 FeSO4 0,5 NaCl 0,5 Nước cất 250 ml Thanh trùng môi trường MT2 ở 121oC trong 10 phút, pH=6,9 3.2. Nội dung nghiên cứu: 3.2.1. Phân lập chủng giống vi sinh vật sản sinh a xít lactic từ các nguồn: P1; P2; P3; P4; P5; P6 ; P7; P8; P9 3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính tốt để lên men sữa chua có chất lượng cao 3.2.3. Tối ưu hoá điều kiện lên men của chủng vi khuẩn lactic tốt vừa tìm được 3.2.4. So sánh chất lượng sữa chua lên men từ chủng vi khuẩn lacticvừa tuyển chọn với sữa chua Vinamilk 3.2.5. Đề xuất quy trình sản xuất sữa chua từ sữa đậu tương 3.3. Phương pháp nghiên cứu: 3.3.1. Phân lập vi khuẩn lactic: [8] - Chuẩn bị dẫy pha loãng: Từ mỗi nguồn phân lập ta lấy một ít mẫu hoà vào nước vô trùng lấy 1(ml) dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 (ml) nước vô trùng, lắc đều ta được dãy pha loãng từ 10- 1 - 10- 9. - Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 (ml) dịch pha loãng nhỏ vào môi trường thạch MRS, trang đều và nuôi cấy ở 37 - 40oC trong 48 giờ. - Tách riêng các khuẩn lạc có hình thái khác nhau rồi dựa vào đặc điểm sinh lý, hoá sinh của từng chủng để xác định tên của chúng. - Dùng que cấy vô trùng tách các khuẩn lạc riêng rẽ, to cấy vào ống thạch nghiêng chứa môi trường MT1, rồi nuôi cấy ở 37 - 40oC trong 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy lấy ra bỏ vào tủ lạnh để giữ giống. 3.3.2. Lên men sữa chua: - Chuẩn bị giống: chủng vi khuẩn lactic được lấy từ ống thạch nghiêng cấy vào ống nghiệm chứa môi lỏng MT2, sau thời gian nhân giống ở 37 - 40oC dịch nhân giống được chuyển sang nhân giống trong bình tam giác (tỷ lệ giống cấy truyền là 5%). - Lên men sữa chua: Sau khi nhân giống tiến hành tiếp giống vào dịch sữa đậu tương và cho lên men theo sơ đồ sau: Dịch sữa đậu tương Để nguội (37 – 40oC) Giống 5% Rót hộp (100ml) Lên men (37 – 40oC, trong 5giờ ) Làm lạnh Sơ đồ 3.2. Quy trình lên men sữa chua từ sữa đậu tương. 3.3.3: Các phương pháp phân tích: 3.3.3.1. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic: Tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic được đánh giá thông qua chỉ tiêu mật độ vi khuẩn. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD (Optical density). Các thí nghiệm được đo ở bước sóng 600 nm (kí hiệu OD600 ). 3.3.3.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào (Theo phương pháp Koch): [8] - Cấy một thể tích xác định dịch huyền phù vi khuẩn cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa petri, nuôi và đếm số lượng các khuẩn lạc mọc. Mỗi nồng độ pha loãng cấy lặp lại 3 lần. Coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào, số lượng tế bào vi khuẩn được tinh theo công thức: CFU = a.b.c Trong đó: CFU: là đơn vị hình thành khuẩn lạc a: số khuẩn lạc đếm được b: thể tích cấy c: hệ số pha loãng Dịch pha loãng được coi là tốt nhất khi từ dịch này cấy lên môi trường mọc từ 50- 100 khuẩn lạc. 3.3.3.3. Phương pháp xác định axit lactic: [16] a. Xác định định tính axit lactic: - Do axit lactic làm mất màu thuốc thử Ufenmen (Chứa 10ml dung dịch phenol 5%, 2ml FeCl3 5%, 25 ml nước cất ). Vì vậy, dùng thuốc thử này có thể xác định tính axit lactic. -Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch nhân giống thêm vào đó vài giọt thuốc thử Ufenmen, nếu có mặt của axit lactic thuốc thử này sẽ chuyển từ màu xanh tím sang vàng chanh. b. Xác định định lượng axit lactic: [25] [30] - Nguyên tắc: Vì axit lactic có thể kết hợp với NaOH theo phương trình: NaOH + CH3CHOH - COOH = CH3CHOH - COONa + H2O Do vậy, có thể dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ axit lactic. - Tiến hành: lấy 10ml sữa hoặc sữa chua cho vào cốc thủy tinh, thêm 20ml nước cất, 1-3 giọt phenolphtalein rồi dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ vừa nhỏ vừa lắc đều cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Đọc số ml NaOH 0,1N. - Tính toán kết quả: Ta có: 0T = v.10 v: số ml NaOH 0,1N tiêu hao khi chuẩn độ. ở nước ta, độ axit của sữa được biểu thị bằng % axit lactic có trong sữa. Vì vậy kết quả sẽ được tính như sau: Từ khái niệm của độ Tecnơ (0T): là số ml NaOH 0,1N cần thiết để trung hoà các axit béo tự do có trong 100ml sữa với chất chỉ thị là phênolphtalein 1%. Ta có hàm lượng axit lactic của 10T trong 1lít sữa là: L1 = = = 0,009 (g/l) Trong đó: MaxL: Khối lượng phân tử của axit lactic (g) V1 : Thể tích của 1lít sữa (ml) N: Nồng độ dung dịch NaOH 0,1N Như vậy: Hàm lượng axit lactic của dung dịch sữa là: L2 = *100 (%) Trong đó: L2: Hàm lượng axit lactic của dịch sữa (%) v: lượng NaOH 0,1N dùng chuẩn độ (ml) V2 : Thể tích dịch sữa (ml) 3.3.3.4. Xác định độ pH: pH của dịch sữa và sữa chua được xác định bằng máy pHmettre. 3.3.3.5. Xác định đường khử theo phương pháp IXEKutz : [16] - Nguyên tắc: Do đường khử dễ bị oxi hoá, mặt khác nó có khả năng khử Fe+++ (trong ferixanua Kali) thành Fe++ (trong feroxianua Kali ) OH - Đường khử + K3Fe(CN)6 sản phẩm oxi hoá của đường + K4Fe(CN)6 Để phản ứng xảy ra hoàn toàn K4Fe(CN)6 được kết tủa bằng ZnSO4. 2K4Fe(CN)6 dư + 2KI = 2K4Fe(CN)6 + I2 I2 sinh ra được chuẩn độ bằng Na2S2O3 I2 + 2 Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6 Căn cứ vào lượng Na2S2O3 tiêu tốn suy ra lượng K3Fe(CN)6 đã tác dụng với đường khử. Từ đó tính được hàm lượng đường có trong mẫu. - Cách tiến hành : Cân 1- 4 gam mẫu; chuyển vào bình định mức 100 ml; thêm nước tơí vạch. Lắc đều ta được dịch chứa đường khử. Lấy 10ml dịch mẫu cho vào bình tam giác 250ml thêm 15ml nước cất + 10ml K3Fe(CN)6 0,05N. Đun sôi một phút (hoặc để trên bếp cách thủy 20 phút). Để nguội cho thêm vào 10ml dung dịch hỗn hợp KI +ZnSO4 , 10ml CH3COOH 9%. Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,05N, đến khi xuất hiện màu vàng rơm, cho vài giọt tinh bột, chuẩn tiếp cho đến khi màu xanh chuyển thành màu trắng sữa hoàn toàn . song song tiến hành một bình đối chứng, ở đó dịch mẫu được thay bằng nước cất, các hoá chất sử dụng như bình thí nghiệm. - Tính toán kết quả: Giả sử mẫu trắng chuẩn hết v1ml Na2S2O3 thì tỉ số = Chuẩn độ ở bình thí nghiệm hết: v2ml Na2S2O3 thì lượng K3Fe(CN)6 dư [x(ml)] được xác định như sau: = => x= (ml) như vậy lượng K3Fe(CN)6 đã tác dụng với đường là : (10 - x)ml. Từ lượng K3Fe(CN)6 đã tác dụng với đường ta biết được hàm lượng đường khử có trong dịch mẫu (tra bảng phụ lục 3). 3.3.3.6. Xác định đường tổng số: [12] [16] - Nguyên tắc : Đường tổng số = Đường khử + Đường không khử. Do đường không khử không thể xác định được bằng phương pháp Iod, và các phương pháp khác như đường khử. Vì vậy, để xác định đường tổng số có trong mẫu (từ đó tính ra lượng đường sarcharoza) bằng phương pháp Iod ta phải thuỷ phân trước đường sảrcharoza. HCl C12H22O11 + H2O 2 C6H12O6 (Glucôza + Fructôza) Sarcharoza - Tiến hành : Cân 1 - 3g mẫu; chuyển hoàn toàn vào bình đựng mức.Do dịch sữa có chứa protein; nên ta phải kết tủa nó trước khi thuỷ ngân bằng axit cho 10 ml dung dịch Felin I và 4ml dung dịch NaOH 0,1N trộn đều; dùng nước lên tới vạch; để yên 30 phút ở 20oC; lọc qua giấy lọc xốp và bỏ đi 20 ml dịch lọc ban đấu. Lấy 10 ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 100 ml khác thêm vào đó 2ml HCl 5%, đặt trên bếp cách thuỷ 20 phút(nhiệt độ trung bình 60- 70oC ). Sau đó cho vào bình vài giọt phenolphtalein. Trung hoà bằng NaOH 10% cho đến khi xuất hiện mầu hồng; làm chua lại bằng CH3COOH 9% cho đến khi mất mầu hồng. Dùng nước cất lên thể tích tới vạch ta được mẫu chứa đường tổng số trong tất cả các dạng đường không khử đã dịch chuyển toàn bộ về dạng đường khử. Tiếp theo xác định đường khử trong sữa theo phương pháp đã nêu ở trên. 3.3.3.7. Xác định đạm toàn phần theo phương pháp Kjeldhal : [12], [16]. - Nguyên tắc: Các hợp chất hữu cơ có trong sữa được vô cơ hoá bằng cách đun nóng trong dung dịch H2SO4 đậm đặc.Khi đó các hợp chất hữu cơ bị phân giải và oxi hoá thành CO2 và H2O. Nitơ trong sữa giải phóng ra dưới dạng NH3 và kết hợp với axít H2SO4 tạo thành muối sunfat amon trong dung dịch . xt , tO R-CH-COOH +H2SO4 CO2 + NH3 + SO2 + H2O NH2 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Giải phóng NH3ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời chưng cất và thu nó bằng một lượng dư axít bôric. (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O NH4OH + 4H3BO4 = (NH4)2B4O7 + H2O Ta xác định tetrabonat amon tạo thành bằng dung dịch axit HCl chuẩn ; qua đó xác định được lượng nitơ có trong mẫu . (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O = 2 NH4Cl + 4 H3BO3 Cũng có thể hấp thụ NH3 bằng 1 lượng dư axit H2SO4 hay HCl chuẩn. Sau đó điện phân lượng axit dư không phản ứng với NH3 bằng dung dịch NaOH chuẩn. Từ đó tính được lượng H2SO4 hay HCl tham gia phản ứng với NH3. 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O. - Tiến hành : Cân 1 gam sữa cho vào ống vô cơ hoá sạch đã sấy khô. Thêm vào đó 5ml axit H2SO4 đậm đặc. Cho vào ống vô cơ hoá một đến hai giọt thuỷ ngân, một đến hai gam K2SO4 (Có thể thay thuỷ ngân bằng CuSO4) tỉ lệ CuSO4/K2SO4 = 1/3. Đặt ống vô cơ hoá trên hệ thống vô cơ hoá Kjeldal ở nhiệt độ 2500C vô cơ hoá đến khi nào dung dịch trong ống vô cơ hoá hoàn toàn trắng. Dùng pipet hút 20ml dung dịch H3BO3 2,5% và thêm vài giọt taxiro cho vào bình tam giác rồi lắp vào hệ thống cất NH3, bơm dung dịch NaOH 30% vào ống vô cơ hoá cho đén khi nào dung dịch trong ống vô cơ hoá chuyển thành màu xanh rồi tiến hành cất tiếp (khoảng 5 phút). Cắt 1 mẫu trắng để kiểm chứng với thuốc thử và thao tác như trên nhưng thay dịch mẫu bằng nước cất. - Tính toán kết quả: Hàm lượng Nitơ tổng số trong sữa được tính như sau: Nt/s = *100 Trong đó: Nt/s : hàm lượng nitơ tổng số (%) a : Số ml dung dịch HCl dùng chuẩn độ màu thí nghiệm. b : Số ml dung dịch HCl dùng chuẩn độ màu đối chứng. Hàm lượng protein tổng số trong sữa được tính như sau: Pt/s = Nt/s *6,38 Trong đó: Pt/s : Hàm lượng protein tổng số (%) Nt/s : Hàm lượng nitơ tổng số (%) 6,38 : Hệ số chuyển 3.3.3.8. Xác định đạm amin bằng phương pháp chuẩn độ phormol: [14] - Nguyên tắc: Khi cho thêm formalđehit vào dung dịch chứa axit amin, các nhóm amin sẽ bị methyl hoá mà mất tính kiềm. Nhờ đó axit amin trở axit mạnh hơn và có thể tác dụng được với kiềm (NaOH). Căn cứ vào lượng NaOH tiêu hao ta tính được lượng axit và do đó biết được lượng đạm amin. R-CH-COOH + HCHO -> R- CH – COOH + H2O | | NH2 N=CH2 R- CH – COOH + NaOH -> R- CH – COOHNa + H2O | | N=CH2 N=CH2 Vì phản ứng xảy ra ở pH=9-9,5 nên khi dùng chỉ thị là phenolphtalin phải chuẩn dung dịch tới đỏ sẫm. - Tiến hành: Lấy 10ml dung dịch sữa cho vào bình định mức 100ml, thêm vào đó mảnh giấy quỳ rồi trung hoà đến môi trường kiềm yếu. Tiếp theo cho vào 10ml dung dịch axetat chì trung tính rồi cho thêm nước tới ngấn bình. Lắc đều, đem lọc và lấy 20ml cho vào bình định mức khác dung tích 100ml thêm vào đó 10ml dung dịch Na2SO4 trung hoà để khử lượng chì dư rồi đổ nước cất tới ngấn bình, lắc đều và đem lọc. Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình tam giác 250ml, nhỏ vài giọt phenolphtalein trung hoà bằng NaOH 0,1N đến xuất hiện màu hồng nhạt. Tiếp theo cho vào 5ml hỗn hợp formol, lắc đều rồi để yên cho phản ứng. Sau 2 phút đem chuẩn hỗn hợp bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu đỏ đậm (có thể xanh tím) - Tính toán kết quả: Hàm lượng đạm amin được tính theo công thức: Namin= *1000 = (g/l) Trong đó: a: Số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao. Khi chuẩn độ n: Số ml dung dịch sữa tham gia trong mẫu phân tích. 0,0014: Số gam nitơ ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N 3.3.3.9. Xác định độ làm đông tụ sữa: [14] - Nguyên tắc: Dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ dịch sữa có nồng độ xác định. Để so sánh độ làm đông tụ sữa của các chủng vi khuẩn lactic khác nhau ta dùng tích số giữa lượng giống dùng lên men (Et) và thời gian lên men (t). Nếu tích số Et càng lớn tì độ làm đông tụ sữa của các chủng vi khuẩn lactic càng yếu. E tính bằng ml, t tính bằng phút . - Tiến hành: cho 3ml dung dịch giống vi khuẩn lactic vào ống nghiệm 25ml thêm 10ml dung dịch sữa. Cho lên men ở 37- 400C . Ghi thơì gian tạo thành kết tủa protein của sữa. 3.3.3.10. Đánh giá chất lượng sản phẩm bằng phương pháp cảm quan :[14] Sữa chua là một khối đồng chất, đồng đều có một màng mỏng trên bề mặt, dùng dao cắt hoặc thìa sắt ra thành vết cắt rõ nét, không được chảy nước, mùi vị chua ngon đặc biệt của từng loại. Chất lượng cảm quan của sản phẩm sữa chua được chúng tôi đánh giá cho điểm thị hiếu, với thang điểm từ 0 – 5. phương pháp cụ thể được chúng tôi trình bày ở phần phụ lục 2. 3.3.4. Tối ưu hoá điều kiện lên men để sản xuất sữa chua có chất lượng cao: Chủng vi khuẩn lactic sau khi đã tuyển chọn đã mang nhiều đặc tính tốt, song các điều kiện thích hợp nhất cho lên men thì chúng ta hoàn toàn chưa biết. Vì vậy cần phải xác lập nó để kiểm soát tốt các khâu của quá trình lên men sữa chua, chúng tôi tiến hành hàng loạt các thí nghiệm, trong đó 1 cấu tử của môi trường được thay đổi trong khoảng giới hạn còn các cấu tử khác giữ nguyên. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Thí nghiệm 1 : Xác định thời gian nhân giống. Thí nghiệm 2 : Nồng độ đường lactoza khác nhau Thí nghiệm 3 : Nồng độ NaHCO3 khác nhau Thí nghiệm 4 : Nồng độ đường sarcharoza bổ sung khác nhau Thí nghiệm 5 : Tỷ lệ tiếp giống khác nhau Thí nghiệm 6 : Nồng độ dịch sữa đậu nành khác nhau Thí nghiệm 7 : Nhiệt độ lên men khác nhau Thí nghiệm 8 : Thời gian lên men khác nhau Sau mỗi thí nghiệm tiến hành phân tích các tính chất của sản phẩm để xác lập giá trị tối ưu. kết quả của thí nghiệm trước sẽ được áp dụng cho thí nghiệm tiếp theo, cuối cùng ta sẽ được đi._.h vật học(tập 2,3). NXB KH-KT.1972 7. Nguyễn Lân Dũng - Nguyễn Đình Quyến- Phạm Văn Ty: Vi sinh vật học. NXB. Giáo dục Hà nội 1997. 8. Nguyễn Lân Dũng(người dịch): Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học và THCN Hà nội 1983. 9. Lương Đức Huyến (dịch): Tài nguyên thực vật Đông Nam á ,Tập 1: Các cây họ đậu ăn hạt. NXB KH-KT.1996. 10. Lương Đức Phẩm: Công nghệ vi sinh vật . NXB Nông nghiệp. 1998. 11. Phạm Văn Sở - Bùi như Thuận: Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm. NXB KH-KT.1975. 12. Đặng Thị Thu - Nguyễn Thị Xuân Sâm - Tô Kim Anh: Giáo trình thí nghiệm hoá sinh công nghiệp. Đại học Bách Khoa. 1997. 13. Lê Ngọc Tú (Chủ biên): Hoá sinh Công nghiệp . NXB KH –KT. 1997. 14. Hà Duyên Tư (Chủ biên) Quản lý và kiểm tra chất lượng thực phẩm. Đại học bách khoa Hà Nội , 1996 15. Nguyễn Văn Việt - Nguyễn Thị Chính - Nguyễn Thu Hà: Báo cáo khoa học: Nghiên cứu sản xuất đồ uống giàu dinh dưỡng bằng men lactic. 16. Lâm Thanh Xuân - Trần Thế Truyền: Giáo trình thí nghiệm sữa. Đại học Bách khoa Hà Nội, 1982 17. Trần Thế Xuân: Luận văn tốt nghiệp đại học: Điều tra tình hình sản xuất đậu phụ quy mô hộ gia đình ở 1 vài địa phương trên miền bắc và bước đầu nghiên cứu cải tiến để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. 18. Tạp chí sức khoẻ và đời sống số 110 (9/2/2001) 19. Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm thực phẩm vi sinh Hà Nội Đề tài khoa học: Nghiên cứu chọn lọc 1 số chủng loại vi sinh vật có hoạt lực cao để thuỷ phân protein thực vật đa dạng hoá sản phẩm. Hà Nội 1999 20. ALTERP.HAMMES Chapter 70 - The Grener Lactobacllies and Carnobacterien the prokaryotes 21. E. WAAGNER NIELSEN AND JEANS A. ULLUM. Dairy Technology 1. Danish.Turukey Dairies Ltd1989 22. E.WAAGNER NIELSEN AND JEANS A. ULLUM. Dairy Technology 2. Danish.Turukey Dairies Ltd1989 23. F.M. DRIESSEN, E. SPEAR ATAL Fernented milks, science and technology Bulletin of the international dairy Federation No227.1988 24. H.L.M. LEDIEVELD Continuous yermentation in yoghurt manufacture 25. J.KEIN, F.WAGNER Methods for immobilization of microbial cell - Applied Biochemistry and Bioengineering. Chap 4 26. K. NILSON, S. BIRUBANM A General methol for immobilization with preserved viability. European Jourmal of Applied. Microbiology and Biotechnology . vol 17.1983 27. L.P GRAFISKA Dairy processing hand book AB, SWEDEN 1995 28. L.M.D Goncalves, A.M.R.B Xavier and J.S.Almeida Concomitant substrate and product inhbition Kinetics in Lactic acid production 29. Lactic acid Bacteria Biotechnology Biogical fundamental vol 1 Phụ lục 1: ảnh khuẩn lạc của 1 số chủng vi khuẩn lactic có đặc tính tốt: Khuẩn lạc chủng H9 sau 48h nuôi Khuẩn lạc chủng H17 sau 24h nuôi Khuẩn lạc chủng H28 sau 48h nuôi 2. Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm (Phép thử cho điểm thị hiếu): Cách tiến hành: - Bước 1: Chuẩn bị phiếu trả lời: Phiếu phân tích cảm quan Phép thử : Cho điểm thị hiếu Tên sản phẩm : Sữa chua Họ tên người thử : ........................... Ngày thử:.............................. Tuổi :............................ Giới tính:.............................. Có hai mẫu sữa chua: M1, M2 được giới thiệu. Hãy thử nếm và định hướng(màu sắc, hương thơm, vị, độ bền vững của hai mẫu sữa chua đó) theo thang điểm từ 0-5. Kết quả: Mẫu: M1 M2 Điểm: - Bước 2: Giới thiệu mẫu cho các thành viên và cho họ thử: Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 6 thành viên thuộc lớp BQCBK42, trong đó có thư ký và chủ tịch hội đồng. Mỗi thành viên được nhận một phiếu cho điểm, một số dụng cụ để thử cảm quan. Các thành viên làm việc độc lập với nhau, lần lượt và cho điểm theo trình tự mẫu thử. Sản phẩm sữa chua được đánh giá cảm quan qua 4 chỉ tiêu: màu sắc, hương, vị, độ bền vững với thang điểm từ 0-5. - Bước3: Thu phiếu và xử lý kết quả: Sau khi đánh giá xong thư ký thu phiếu cho điểm của các thành viên, tính điểm trung bình của các thành viên theo bảng sau: Thành viên Mẫu Tổng M2 M1 1 2 3 4 5 6 Tổng Trung bình Xử lý kết quả: + giá trị hiệu chỉnh(HC) HC= Bình phương tổng chia cho số câu trả lời + Tổng bình phương(TBF) TBFMẫu= - HC TBFThành viên= - HC TBFToàn phần = Tổng bình phương của mỗi điểm nhận được – HC TBFSai số = TBFToàn phần - (TBFMẫu +TBFThành viên). + Bậc tự do(BTD): BTDMẫu=Tổng số mẫu - 1 . BTDThành viên =Tổng số thành viên - 1 BTDToàn phần = Tổng số câu trả lời – 1 BTDSai số = BTDToàn phần -(BTDMẫu + BTDThành viên ) + Tổng bình phương trung bình (TBFTB): TBFMẫu TBFThành viên TBFSai số TBFTBMẫu = ắắắ ; TBFTBThành viên = ắắắắ ; TBFTBSai số = ắắắắ BTDMẫu BTDThành viên BTDSai số + Tương quan phương sai (F): TBFTBMẫu TBFTBThành viên FMẫu = ắắắắ ; FThành viên = ắắắắắắ TBFTBSai số TBFTBSai số FTiêu chuẩn mẫu ; FTiêu chuẩn thành viên :Tra bảng phụ lục 4 Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Mẫu Thành viên Sai số Toàn phần Nếu FTính toán > FTiêu chuẩn thì mẫu (hoặc thành viên cho điểm) khác nhau ở mức đã lựa chọn. Khi đó cần tính giá trị khác nhau nhỏ nhất có nghĩa (LSD): LSD = tb* tb:tra bảngphụ lục 5. n: Số câu trả lời với 1 mẫu. Nếu hiệu của hai giá trị trung bình của 2 mẫu > LSD thì 2 mẫu đó khác nhau ở mức đã lựa chọn. Nếu FTính toán < FTiêu chuẩn thì mẫu (hoặc thành viên cho điểm) không khác nhau ở mức lựa chọn. 3. Bảng tra hàm lượng đường khử: 0 ml 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1,510 3,100 4,720 6,370 8,060 9,720 11,46 13,28 14,99 1,670 3,260 4,880 6,510 8,220 9,890 11,64 13,46 - 1,830 3,420 5,040 6,710 8,390 10,06 11,82 13,63 - 2,000 3,580 5,200 6,880 8,560 10,23 12,00 13,80 - 2,160 3,740 5,360 7,050 8,720 10,41 12,18 13,97 - 0,725 2,310 3,900 5,530 7,220 8,890 10,58 12,36 14,14 - 0,870 2,470 4,060 5,700 7,390 9,060 10,72 12,54 14,31 - 1,015 2,620 4,222 5,860 7,550 9,220 10,92 12,73 14,49 - 1,180 2,780 4,380 6,030 7,720 9,390 11,10 12,91 14,66 - 1,340 2,940 4,540 6,200 7,890 9,550 11,28 13,10 14,83 - 4. Giá trị FTiêu chuẩn ở mức ý nghĩa a=5%: n2 n1 1 2 3 4 5 6 8 12 1 2 3 4 5 6 8 10 12 14 16 18 20 22 25 30 Ơ 161,4 18,51 10,13 7,71 6,61 5,99 5,32 4,96 4,75 4,60 4,49 4,41 4,35 4,30 4,24 4,17 3,81 199,5 19,00 9,55 6,94 5,70 5,14 4,46 4,10 3,88 3,74 3,63 3,55 3,49 3,44 3,38 3,32 2,99 215,7 19,16 9,28 6,59 5,31 4,76 4,67 3,71 3,49 3,34 3,24 3,16 3,10 3,05 2,99 2,92 2,60 224,6 19,25 9,12 6,39 5,19 4,53 3,84 3,48 3,26 3,11 3,01 2,93 2,87 2,82 2,76 2,69 2,37 230,2 19,3 9,01 6,26 5,05 4,39 3,69 3,33 3,11 2,96 2,85 2,77 2,71 2,66 2,60 2,53 2,21 234,0 19,33 8,94 6,16 4,95 4,22 3,58 3,32 3,06 2,85 2,71 2,66 2,60 2,55 2,49 2,42 2,09 238,9 19,37 8,84 6,04 4,82 4,15 3,44 3,07 2,85 2,70 2,59 2,51 2,45 2,40 2,34 2,27 1,94 238,9 14,41 8,74 5,91 4,68 4,00 3,28 2,91 2,69 2,53 2,42 2,34 2,28 2,23 2,16 2,09 1,75  5. Khoảng có ý nghĩa của t student ở mức ý nghĩa a=5%: Số bậc tự do Số lượng mầu 2 3 4 5 6 8 10 1 2 3 4 5 6 8 10 12 14 16 20 24 30 Ơ 18,0 6,09 4,50 3,93 3,61 3,46 3,26 3,15 3,08 3,03 3,00 2,95 2,92 2,89 2,77 26,7 8,28 5,88 5,00 4,54 4,34 4,04 3,88 3,77 3,70 3,65 3,58 3,53 3,48 3,32 32,3 9,80 6,82 5,76 5,18 4,90 4,53 4,33 4,20 4,11 4,05 3,96 3,90 3,84 3,63 37,2 10,89 7,51 6,31 5,64 5,31 4,89 4,66 4,51 4,44 4,34 4,24 4,17 4,14 3,86 40,5 11,73 8,04 6,73 5,99 5,63 5,17 4,91 4,75 4,64 4,56 4,15 4,37 4,30 4,03 45,4 13,03 8,85 7,35 6,52 6,12 5,60 5,30 5,12 4,98 4,89 4,77 4,68 4,60 4,29 49,1 13,99 9,46 7,83 6,93 6,49 5,92 5,60 5,40 5,25 5,15 5,01 4,92 4,83 4,47  6. Kết quả phân tích chất lượng cảm quan sản phẩm (chỉ tiêu Mầu sắc) Thành viên Mẫu Tổng Thí nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 3 4 4 5 4 3 5 4 5 5 5 4 8 8 9 10 9 7 Tổng 23 28 51 Trung bình 3,667 4,667 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Mẫu Thành viên Sai số Toàn phần 1 5 5 11 2.0833 1,75 2,4167 6,25 2,0833 0,35 0,4833 4,31 0,724 6,61 5,05 Đối với mẫu FTính toán < FTiêu chuẩn nên các mẫu không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với thành viên FTính toán < FTiêu chuẩn nên các thành viên cho điểm không khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 7. Kết quả phân tích chất lượng cảm quan sản phẩm (chỉ tiêu Hương) Thành viên Mẫu Tổng Thí nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 4 3 4 3 3 4 4 4 5 4 5 4 8 7 9 7 8 8 Tổng 21 26 47 Trung bình 3,5 4,33 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Mẫu Thành viên Sai số Toàn phần 1 5 5 11 2.0834 0,4167 2,4166 4,9167 2,0834 0,0833 0,4833 4,31 0,1724 6,61 5,05 Đối với mẫu FTính toán < FTiêu chuẩn nên giữa các mẫu không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với thành viên FTính toán < FTiêu chuẩn nên các thành viên cho điểm giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 8. Kết quả phân tích chất lượng cảm quan sản phẩm (chỉ tiêu Vị) Thành viên Mẫu Tổng Thí nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 4 4 3 4 4 4 5 4 5 4 4 5 9 8 8 8 8 9 Tổng 23 27 50 Trung bình 3,833 4,5 - Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Mẫu Thành viên Sai số Toàn phần 1 5 5 11 1,3333 0,6667 1,6667 3,6667 1,3333 0,1333 0,3333 3,999 0,4 6,61 5,05 Đối với mẫu FTính toán < FTiêu chuẩn nên giữa các mẫu không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với thành viên FTính toán < FTiêu chuẩn nên các thành viên cho điểm giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 9. Kết quả phân tích chất lượng cảm quan sản phẩm (chỉ tiêu Độ bền vững) Thành viên Mẫu Tổng Thí nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 5 4 4 4 5 4 5 5 5 5 5 4 10 9 9 9 10 8 Tổng 26 29 55 Trung bình 4,33 4,83 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Mẫu Thành viên Sai số Toàn phần 1 5 5 11 0,7500 1,4167 0,7500 2,9167 0,7500 0,2833 0,1500 5,000 1,889 6,61 5,05 Đối với mẫu FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy giữa các mẫu không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với thành viên FTính toán < FTiêu chuẩn nên các thành viên cho điểm giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 10. Kết quả xác định độ làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 1. Số lần lặp Thời gian (phút ) Tổng H3 H9 H14 H15 H18 H20 1 2 240 265 175 150 220 255 295 260 210 180 280 255 1420 1365 Tổng 505 325 475 555 390 535 2785 Trung bình 252,5 162,5 237,5 277,5 195 267,5 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 19960,4166 252,0833 2360,4166 22572,9166 3992,0833 252,0833 472,0833 8,4563 0,5339 5,05 6,61 LSD0,05=49,58442 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn do vậy các thời gian làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 1 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H3 H9 H14 H15 H18 H20 252,5 162,5 237,5 277,5 195 267,5 3 6 4 1 5 2 a b a c a b c a Đối với số lần lặp FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 lần theo dõi là giống nhau. 11. Kết quả xác định axit lactic của sữa chua lên men đợt 1 Số lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H3 H9 H14 H15 H18 H20 1 2 3 9,67 9,28 9,05 10,83 10,77 10,65 10,28 9,73 9,92 8,87 8,63 9,00 10,12 10,55 10,33 8,98 8,40 8,65 58,75 57,36 57,6 Tổng 28 32,25 29,93 26,5 31 26,03 173,71 Trung bình 9,33 10,75 9,98 8,83 10,33 8,68 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 10,4948 0,1840 0,5175 11,1963 2,0989 0,0920 0,0517 40,5577 1,7778 3,33 4,10 LSD0,05=0,456 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn do vậy các phép chuẩn độ axit lactic của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 1 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủng vi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H3 H9 H14 H15 H18 H20 9,33 10,75 9,98 8,83 10,33 8,68 4 1 3 5 2 6 a b c c d c e d Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 12. Kết quả xác định pH của sữa chua lên men đợt 1: Số lần lặp pH Tổng H3 H9 H14 H15 H18 H20 1 2 4,58 4,60 4,43 4,35 4,45 4,52 4,67 4,62 4,42 4,48 4,69 4,64 27,24 27,21 Tổng 9,18 8,78 8,97 9,29 8,9 9,33 54,45 Trung bình 4,59 4,39 4,485 4,645 4,45 4,665 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 0,1255 7,5*10-5 0,0101 0,1356 0,0251 7,5*10-5 2,015*10-3 12,4541 0,0372 5,05 6,61 LSD0,05=0,102441 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn nên pH của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 1 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H3 H9 H14 H15 H18 H20 4,59 4,39 4,485 4,645 4,45 4,665 3 6 4 2 5 1 a b b a b a Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 13. Kết quả xác định axít amin tự do các sữa chua lên men đợt 1. Sô lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H3 H9 H14 H15 H18 H20 1 2 3 0,145 0,147 0,135 0,135 0,123 0,128 0,120 0,117 0,113 0,123 0,117 0,125 0,125 0,128 0,130 0,130 0,140 0,133 0,778 0,772 0,764 Tổng 0,427 0,386 0,35 0,365 0,383 0,403 2,314 Trung bình 0,142 0,129 0,117 0,122 0,128 0,134 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 1,2384.10- 3 1,6445.10-5 5,4998.10-5 1,5184.10-5 2,4769.10-4 8,2225.10-6 5,4998.10-5 4,5036 0,1495 3,33 4,10 LSD0,05= 0,014865 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ axit amintự do của sữa phẩm sữa chua lên men đợt 1 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H3 H9 H14 H15 H18 H20 0,142 0,129 0,117 0,129 0,128 0,134 1 3 6 5 4 2 a ab b b ab a Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 1là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 14. Kết quả xác định độ làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 2. Sô lần lặp Thời gian (phút) Tổng H4 H13 H16 H17 H24 H25 1 2 200 215 220 235 235 210 135 155 270 255 170 180 1230 1250 Tổng 415 455 445 290 525 350 2480 Trung bình 207,5 227,5 222,5 145 262,5 175 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 17216,6667 33,3333 866,6667 18116,6666 3443,3333 33,3333 137,3333 19,8654 0,1923 5,05 6,61 LSD0,05= 30,0453 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy thời gian làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 2 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H4 H13 H16 H17 H24 H25 207,5 227,5 222,5 140,0 262,5 175,0 5 3 4 6 2 1 a a a b c b Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 1là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 15. kết quả xác định đường khử của sữa chua lên men đợt 2: Sô lần lặp Thời gian (phút) Tổng H4 H13 H16 H17 H24 H25 1 2 3 7,58 7,03 7,25 7,27 7,73 7,60 7,17 7,45 6,87 8,25 7,97 7,75 7,62 8,07 8,33 7,57 7,40 7,83 45,46 45,65 45,63 Tổng 21,86 22,60 21,49 23,97 24,02 22,80 136,74 Trung bình 7,29 7,53 7,16 7,99 8,01 7,60 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 1,8321 0,0036 0,9078 2,7436 0,3664 0,0018 0,0908 4,0636 0,020 3,33 4,10 LSD0,05= 0,0640 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ đường khử của sữa chua lên men đợt 2 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H4 H13 H16 H17 H24 H25 207,5 227,5 222,5 140,0 262,5 175,0 5 3 4 6 2 1 a a a b c b Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ đường khử trong sữa chua lên men đợt 2là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 16. Kết quả xác định axít amin tự do các sữa chua lên men đợt 2 Sô lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H4 H13 H16 H17 H24 H25 1 2 3 0,130 0,135 0,127 0,110 0,115 0,110 0,133 0,130 0,125 0,145 0,127 0,125 0,150 0,140 0,148 0,125 0,120 0,130 0,793 0,767 0,765 Tổng 0,392 0,335 0,388 0,397 0,438 0,375 2,325 Trung bình 0,131 0,112 0,129 0,132 0,146 0,125 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phươngsai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 1,2384.10- 3 1,6445.10-5 5,4998.10-5 1,5184.10-5 2,4769.10-4 8,2225.10-6 5,4998.10-5 4,5036 0,1495 3,33 4,10 LSD0,05= 0,02077 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ axit amin tự do của sữa phẩm sữa chua lên men đợt 2 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H4 H13 H16 H17 H24 H25 0,131 0,112 0,129 0,132 0,146 0,125 3 6 4 2 1 5 ab a ab ab b a Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 2là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 17. Kết quả xác định axit lactic của sữa chua lên men đợt 2 Số lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H4 H13 H16 H17 H24 H25 1 2 3 9,77 9,63 9,95 10,35 10,58 10,12 9,48 9,27 9,05 11,67 11,83 11,75 7,98 7,80 7,63 10,44 9,77 10,15 59,69 58,88 58,65 Tổng 29,35 31,05 27,8 35,25 23,41 30,36 177,22 Trung bình 9,78 10,35 9,27 11,75 7,80 10,12 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 25,3990 0,0995 0,4501 25,9486 5,0798 0,0497 0,0450 112,854 1,105 3,33 4,10 LSD0,05=0,42522 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn do vậy các phép chuẩn độ axit lactic của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 2 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H4 H13 H16 H17 H24 H25 9,78 10,35 9,27 11,75 7,80 10,12 4 2 5 1 6 3 a b c d e ab Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 18. Kết quả xác định pH của sữa chua lên men đợt 2: Số lần lặp pH Tổng H4 H13 H16 H17 H24 H25 1 2 4,50 4,55 4,47 4,41 4,56 4,61 4,30 4,23 4,67 4,82 4,50 4,46 27,09 27,08 Tổng 9,05 8,88 9,17 8,53 9,58 8,96 54,17 Trung bình 4,525 4,44 4,58 4,26 4,79 4,48 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 0,2999 8,367*10-6 9,3416*10-3 0,3092 0,0599 8,367*10-6 1,8683*10-3 32,1088 4,4783*10-3 5,05 6,61 LSD0,05=0,0986 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn nên pH của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 2 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H4 H13 H16 H17 H24 H25 4,525 4,440 4,580 4,260 4,790 4,480 3 5 2 6 1 4 a b a b c d a Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn nên số lần lặp lại ở mỗi lần đo pH của sữa chua lên men từ các chủng đợt 2 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 19. Kết quả xác định pH của sữa chua lên men đợt 3: Số lần lặp PH Tổng H1 H5 H7 H19 H23 H28 1 2 4,54 4,60 4,56 4,51 4,55 4,56 4,69 4,65 4,59 4,64 4,41 4,43 27,34 27,39 Tổng 9,14 9,07 9,11 9,34 9,23 8,84 54,73 Trung bình 4,57 4,535 4,555 4,67 4,615 4,42 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 0,0713 6,16*10-4 4,73*10-3 0,0767 0,043 6,16*10-4 9,4667*10-4 15,074 0,6514 5,05 6,61 LSD0,05=0,0702 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn nên pH của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 3 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H1 H5 H7 H19 H23 H28 4,57 4,535 4,555 4,67 4,615 4,42 3 5 4 1 2 6 a b a a b b b c Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn nên số lần lặp lại ở mỗi lần đo pH của sữa chua lên men từ các chủng đợt 2 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 20. Kết quả xác định axít amin tự do trong sữa chua lên men đợt 3: Sô lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H1 H5 H7 H19 H23 H28 1 2 3 0,140 0,135 0,132 0,127 0,120 0,125 0,129 0,125 0,127 0,137 0,137 0,128 0,138 0,135 0,142 0,133 0,128 0,135 0,804 0,780 0,789 Tổng 0,407 0,372 0,381 0,402 0,415 0,396 2,373 Trung bình 0,136 0,124 0,127 0,134 0,138 0,132 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 4,3917*10-4 4,9*10-5 1,2233*10-4 6,105*104 8,7833*10-4 2,45*105 1.2233*10-5 7,18 2,00 3,33 4,10 LSD0,05= 0,0099 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ axit amin tự do của sữa phẩm sữa chua lên men đợt 3 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H1 H5 H7 H19 H23 H28 0,136 0,124 0,127 0,134 0,138 0,132 2 6 5 3 1 4 a b b c a c a a b Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 3 là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 21. Kết quả xác định axit lactic của sữa chua lên men đợt 3: Số lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H1 H5 H7 H19 H23 H28 1 2 3 9,88 9,45 10,17 9,93 9,68 9,4 9,74 9,42 9,58 8,32 8,77 8,5 8,75 9,17 9,44 10,75 10,38 10,46 57,37 56,87 57,55 Tổng 29,5 29,01 28,74 25,59 27,36 31,59 171,79 Trung bình 9,83 9,67 9,58 8,53 9,12 10,53 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 6,8432 0,0414 0,8331 7,7176 1,3686 0,0207 0,0833 16,428 0,248 3,33 4,10 LSD0,05=0,06587 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn do vậy các phép chuẩn độ axit lactic của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 3 là khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H1 H5 H7 H19 H23 H28 9,83 9,67 9,58 8,53 9,12 10,53 2 3 4 6 5 1 a c a a b b c Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 22. kết quả xác định đường khử của sữa chua lên men đợt 3: Sô lần lặp Thời gian (phút) Tổng H1 H5 H7 H19 H23 H28 1 2 3 7,17 7,63 7,28 7,63 7,18 7,33 6,97 7,50 7,08 7,25 7,90 7,45 7,25 7,03 7,87 7,85 7,23 7,60 44,12 44,47 44,67 Tổng 22,08 22,14 21,55 22,60 22,15 22,68 133,2 Trung bình 7,36 7,38 7,17 7,53 7,38 7,56 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 2 10 17 0,2778 0,0212 1,1510 1,4504 0,0556 0,0106 0,1151 0,4827 0,0922 3,33 4,10 Đối với chủng lên men FTính toán < FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ đường khử của sữa chua lên men đợt 3 là không khác nhau ở mức a= 0,05. Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ đường khử trong sữa chua lên men đợt 3 là giống nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. 23. Kết quả xác định độ làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 3: Sô lần lặp Thời gian (phút) Tổng H1 H5 H7 H19 H23 H28 1 2 230 240 240 240 240 255 175 185 260 270 180 165 1325 1355 Tổng 470 480 495 360 530 345 2680 Trung bình 235 240 247,5 180 265 172,5 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 5 1 5 11 1439191,667 75 300 14766,667 2878,333 75 60 47,972 1,250 5,05 6,61 LSD0,05= 17,677 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy thời gian làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 3 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H1 H5 H7 H19 H23 H28 235 240 247,5 180 265 172,8 3 4 5 2 6 1 a a b a c b c Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 3 là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 24. Kết quả xác định pH của sữa chua lên men đợt 4: Số lần lặp pH Tổng H9 H17 H28 1 2 4,32 4,36 4,27 4,30 4,45 4,43 13,04 13,00 Tổng 8,68 8,57 8,79 26,04 Trung bình 4,34 4,285 4,395 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 2 1 2 5 0,0121 2,6667*10-4 7,0333*10-3 0,0194 6,05*10-3 2,6667*10-3 3,5167*10-3 1,7204 0,0758 19,00 18,51 Đối với chủng lên men FTính toán < FTiêu chuẩn nên pH của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 4 là không khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với chủng lên men FTính toán < FTiêu chuẩn nên số lần lặp lại ở mỗi lần đo pH của sữa chua lên men từ các chủng đợt 2 là không khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 25. Kết quả xác định axít lactic trong sữa chua lên men đợt 4: Sô lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H9 H17 H28 1 2 3 11,27 11,14 11,18 11,53 11,62 11,58 10,70 10,78 10,75 33,50 33,54 33,51 Tổng 33,59 34,73 32,23 100,55 Trung bình 11,20 11,57 10,74 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 2 2 4 8 1,0443 2,8933*10-4 0,0159 1,0605 0,5222 1,4466*10-4 3,9776*10-3 131,277 0,0363 6,94 6,94 LSD0,05= 0,2140 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ axit lactic tự do của sữa phẩm sữa chua lên men đợt 4 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H9 H17 H28 11,20 11,57 10,74 2 1 3 a b c Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ axit lactic trong sữa chua lên men đợt 3 là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 26. Kết quả xác định đường của sữa chua lên men đợt 4: Số lần lặp ml Na2S2O3 0,05N Tổng H5 H17 H28 1 2 3 7,67 7,98 7,93 7,84 8,17 7,73 8,02 7,30 7,87 23,53 23,45 23,53 Tổng 23,58 23,74 23,19 70,51 Trung bình 7,86 7,91 7,73 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 2 2 4 8 0,0533 1,422 *10-3 0,4474 0,5022 0,0267 7,111*10-4 0,1119 0,238 6,356*10-3 6,94 6,94 Đối với chủng lên men FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy các phép chuẩn độ axit lactic của sản phẩm sữa chua lên men từ các chủng đợt 4 là không khác nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 27. kết quả xác định hàm lượng axit amin tự do của sữa chua lên men đợt 4 Số lần lặp ml NaOH 0,1N Tổng H9 H17 H28 1 2 3 0,132 0,128 0,145 0,165 0,157 0,152 0,115 0,126 0,125 0,412 0,411 0,426 Tổng 0,405 0,474 0,370 1,249 Trung bình 0,135 0,158 0,123 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 2 2 4 8 1,8659*10-3 4,6889*10-5 3,0677*10-4 2,2195*10-3 9,3294*10-4 2,2344*10-5 7,6693*10-5 12,1646 0,3056 6,94 6,94 LSD0,05=0,0283 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy phép chuẩn độ đường khử của sữa chua lên men đợt 4 là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủngvi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H9 H17 H28 0,135 0,158 0,123 2 1 3 a a b b Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của phép chuẩn độ đường khử trong sữa chua lên men đợt 4 là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. 28. Kết quả xác định độ làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt 4: Sô lần lặp Thời gian (phút) Tổng H9 H17 H28 1 2 150 135 115 125 175 160 440 420 Tổng 285 240 335 860 Trung bình 142,5 120 167,5 Bảng phân tích phương sai Nguồn gốc phương sai BTD TBF TBFTB FTính toán FTiêu chuẩn Số chủng lên men Số lần lặp Sai số Toàn phần 2 1 2 5 2358,3333 66,6666 108,3334 2533,3333 1179,1665 66,6666 54,1666 21,769 1,2307 19,00 18,51 LSD0,05= 43,090 Đối với chủng lên men FTính toán > FTiêu chuẩn Do vậy thời gian làm đông tụ sữa của các chủng lên men đợt là khác nhau ở mức a= 0,05. Chủng vi khuẩn lactic Trung bình Thứ tự Sai khác H9 H17 H28 142,5 120 167,5 2 3 1 a a b Đối với số lần lặp lại FTính toán < FTiêu chuẩn do vậy số lần lặp lại của 1 phép chuẩn độ axit amin tự do trong sữa chua lên men đợt 4 là giống nhau ở mức ý nghĩa a= 0,05. ._.