So sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)

®Æt vÊn ®Ò Berberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã trong nhiÒu lo¹i c©y thuèc ë ViÖt Nam, kho¶ng 150 loµi thuéc nhiÒu hä thùc vËt kh¸c nhau. Berberin chñ yÕu ë trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%[1]. Berberin ®­îc biÕt ®Õn víi t¸c dông næi bËt lµ k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®iÒu trÞ bÖnh lþ. Thuèc ®­îc sö dông phæ biÕn do gi¸ thµnh thÊp vµ kh¸ an toµn, kh«ng ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh th­êng cña vi khuÈn cã Ých ë ruét. HiÖn nay trªn thÞ tr­êng cã c¸c d¹ng bµo chÕ cña Berberin nh­: thuèc nhá m¾t, viªn nÐn, viªn bao…. V× vËy vÊn ®Ò kiÓm tra chÊt l­îng nguyªn liÖu lµm thuèc còng nh­ thµnh phÈm lµ rÊt quan träng. D­îc ®iÓn ViÖt Nam III (D§VN III) cã chuyªn luËn kiÓm nghiÖm nguyªn liÖu vµ chÕ phÈm viªn nÐn Berberin b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô tö ngo¹i UV- VIS, d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) ®Þnh l­îng Berberin b»ng HPLC. §Ó cã c¬ së lùa chän ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin thÝch hîp, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thùc hiÖn ®Ò tµi : “ So s¸nh hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) vµ b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo d­îc ®iÓn ViÖt Nam III” víi nh÷ng môc tiªu sau: §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III So s¸nh hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng trªn ®Ó t×m ph­¬ng ph¸p thÝch hîp cho viÖc ®Þnh l­îng berberin trong c¸c c¬ së kiÓm tra chÊt l­îng thuèc trong n­íc. PHÇN I. TæNG QUAn vµi nÐt VÒ BERBERIN: 1.1.1. CÊu tróc: Beberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã khung protoberberin[1]. Isoquinolin cßn ®­îc gäi lµ benzo[c] pyridin hay 2- benzamin lµ mét hîp chÊt h÷u c¬ th¬m heterocyclic[18] CÊu tróc cña isoquinolin C«ng thøc cÊu t¹o: C«ng thøc ph©n tö: C20H18NO4+ PTL: 336.36 Tªn khoa häc : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2. Nguån gèc: Berberin th­êng cã trong rÔ, th©n rÔ, th©n, vá c©y nh÷ng c©y thuéc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin cã nhiÒu trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%, berberin chiÕm Ýt nhÊt lµ 82% so víi alcaloid toµn phÇn [9]. Berberin th­êng cã lÉn c¸c t¹p chÊt alcaloid kh¸c nh­: palmatin, jatrorrhizin. Giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2%, jatrorrhizin kh«ng qu¸ 5 % [6],[13]. 1.1.3. TÝnh chÊt - Bét kÕt tinh mµu vµng, kh«ng mïi, cã vÞ rÊt ®¾ng. Tan trong n­íc nãng, khã tan trong ethanol vµ n­íc l¹nh, rÊt khã tan trong cloroform, kh«ng tan trong ether.[6] 1.5. T¸c dông d­îc lý: - Berberin cã t¸c dông kh¸ng vi trïng nh­: vi khuÈn ( shigella, tô cÇu vµ liªn cÇu khuÈn), thÓ protozoal, vi nÊm, candida, virus, nÊm men, kÝ sinh trïng g©y bÖnh (kÝ sinh trïng sèt rÐt, kÝ sinh trïng ®­êng ruét) [12], [17]. - Berberin cã t¸c dông k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®Æc biÖt khi dïng sÏ kh«ng ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh th­êng cña hÖ vi khuÈn cã Ých ë ruét, khi dïng phèi hîp víi mét sè thuèc kh¸ng sinh sÏ h¹n chÕ t¸c dông phô g©y ra bëi c¸c thuèc kh¸ng sinh ®èi víi hÖ sinh vËt ®­êng ruét [17]. - Berberin cã t¸c dông øc chÕ sù bµi tiÕt ion trong lßng ruét, øc chÕ co c¬, gi¶m cholesterol vµ trigycerid, chèng tiÓu ®­êng, øc chÕ c¬n nhÞp nhanh thÊt, gi¶m viªm cho ng­êi bÞ viªm khíp, t¨ng tiÓu cÇu cña bÖnh nh©n xuÊt huyÕt, gi¶m tiÓu cÇu tiªn ph¸t vµ thø ph¸t, kÝch thÝch sù bµi tiÕt mËt vµ th¶i trõ bilirubin[17]. ChØ ®Þnh: [9],[12],[17] - BÖnh lþ trùc khuÈn, héi chøng lþ, viªm ruét, tiªu ch¶y, viªm èng mËt vµ ®Æc biÖt lµ bÖnh sái mËt, vµng da, sèt, sèt rÐt, môn nhät. - §iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi( do n¾ng, giã, l¹nh, bôi, khãi…) vµ ®iÒu trÞ bÖnh ®au m¾t hét. - §iÒu trÞ bÖnh Leishmania, Trichomonas. 1.1.6. Chèng chØ ®Þnh: [17] - Phô n÷ cã thai v× kh¶ n¨ng g©y co bãp tö cung cña berberin - Ng­êi dÞ øng víi berberin ( rÊt hiÕm gÆp) 1.1.7. D¹ng thuèc vµ hµm l­îng: [11] - D¹ng viªn nÐn, viªn bao, viªn nang víi hµm l­îng 10 mg, hoÆc 50-100 mg/ viªn - D¹ng thuèc nhá m¾t ®iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi (giã, n¾ng, l¹nh, bôi, khãi) 1.2. Mét sè ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin: 1.2.1. Ph­¬ng ph¸p thÓ tÝch: [5], [13] Hßa tan 0,3g chÕ phÈm (chÝnh x¸c) vµo trong cèc víi 150ml n­íc ®ang s«i. Lµm nguéi, chuyÓn dung dÞch vµo b×nh ®Þnh møc 250ml. LÊy chÝnh x¸c 50ml dung dÞch kali dicromat 0,1N råi thªm n­íc tíi v¹ch. L¾c ®Òu trong 5 phót, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 100ml dÞch läc cho vµo b×nh nãn nót mµi 250 ml, thªm 2g kali iodid, l¾c cho tan, sau ®ã thªm 10 ml dung dÞch acid hydrochloric 16%, ®Ëy kÝn, l¾c ®Òu, ®Ó vµo bãng tèi trong 10 phót. ChuÈn ®é b»ng dung dÞch natri thiosulfat 0,1N, gÇn ®iÓm t­¬ng ®­¬ng thªm 2ml dung dÞch hå tinh bét vµ tiÕp tôc chuÈn ®é cho ®Õn khi mµu xanh biÕn mÊt th× dõng. Song song tiÕn hµnh lµm mÉu tr¾ng trong cïng ®iÒu kiÖn. 1ml dung dÞch kali dicromat 0,1N t­¬ng øng víi 12,39 mg C20 H18NO4Cl. 1.2.2. Ph­¬ng ph¸p ®o UV-vis Ph­¬ng ph¸p 1:[6]. * Dung dÞch thö: C©n 0.200 g chÕ phÈm vµ hßa tan trong 200ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000ml. LÊy 10ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi n­íc ®Õn 100ml. * Dung dÞch chuÈn: C©n chÝnh x¸c kho¶ng 0,200 g Kali dicromat thuèc thö chuÈn ®· sÊy kh« ë 1100C trong 4 giê, hßa tan trong n­íc. Thªm 10ml dung dÞch acid sulfuric 1N vµ thªm n­íc võa ®ñ 1000ml. * §o ®é hÊp thô: §o At vµ As cña dunh dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn ë b­íc sãng 421 nm. * C¸ch tÝnh: L­îng ( mg) cña C20H18NO4Cl ®­îc tÝnh b»ng c«ng thøc sau: a: khèi l­îng ( mg) kali dichromat. Ph­¬ng ph¸p 2 [6] X¸c ®Þnh hµm l­îng berberin clorid trong viªn nÐn. * Dung dÞch thö: C©n 20 viªn, tÝnh khèi l­îng trung b×nh vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét l­îng bét viªn t­¬ng ®­¬ng víi kho¶ng 80 mg berberin clorid, thªm 10ml n­íc ®Ó thÊm ®Òu bét viªn, sau ®ã thªm kho¶ng 200ml n­íc s«i, khuÊy kÜ 5 phót, ®Ó nguéi råi chuyÓn vµo b×nh ®Þnh møc 500ml, thªm n­íc tíi v¹ch, l¾c ®Òu. §Ó l¾ng tù nhiªn hoÆc ®em ly t©m. LÊy chÝnh x¸c 5ml dung dÞch trong ë trªn ®em pha lo·ng víi n­íc cÊt võa ®ñ 100ml. * Dung dÞch chuÈn : pha t­¬ng tù dung dÞch thö, dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid. * MÉu tr¾ng: n­íc cÊt. * TiÕn hµnh ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i b­íc sãng cùc ®¹i 345 nm, cèc ®o dÇy 1 cm. 1.2.3. Ph­¬ng ph¸p c©n [5] ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng viªn nÐn berberin clorid, dùa trªn kh¶ n¨ng t¹o tña cña berberin víi acid picric. C©n 20 viªn vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét l­îng bét viªn t­¬ng øng víi kho¶ng 0.50g berberin clorid, cho vµo b×nh ®Þnh møc 250ml, thªm kho¶ng 200 ml methanol (TT), l¾c kü ®Ó hßa tan berberin, råi thªm methanol ®Õn ngÊn. L¾c ®Òu, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ban ®Çu. LÊy ®óng 100ml dÞch läc. Lµm bay h¬i cho ®Õn kh« trªn c¸ch thñy, thªm 150ml dung dÞch NaOH 0,1N vµ 90ml n­íc, ®un nãng. L¾c kü ®Ó hßa tan. §Ó nguéi råi läc qua giÊy läc ®· thÊm ­ít. Röa phÔu vµ giÊy läc 3 lÇn, mçi lÇn 10ml n­íc. Gép dÞch läc vµ n­íc röa, thªm 10ml dung dÞch acid hydroclorid 0,1N råi tiÕp tôc cho ngay vµ tõ tõ 30ml dung dÞch b·o hßa acid picric ( TT). L¾c ®Òu. §Ó yªn qua mét ®ªm, läc qua phÔu thñy tinh xèp cã ®­êng kÝnh lç xèp 10 – 16 mm ( ®· c©n b×) ®Ó lÊy tña. Röa tña 3 lÇn víi n­íc cÊt ë kho¶ng 150C, mçi lÇn 15ml n­íc, hót kiÖt n­íc råi sÊy kh« phÔu vµ tña ë 1000C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi. Khèi l­îng tña x¸c ®Þnh lµ P (g). 1 g tña t­¬ng øng víi 0,6586 g C20H18NO4Cl. 1.2.4. Ph­¬ng ph¸p HPLC Ph­¬ng ph¸p 1:[14], [15]. * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét thÐp kh«ng gØ ( 25cm x 4 mm) ®­îc nhåi bëi h¹t silicagel ®· ®­îc octadecylsilan hãa cã ®­êng kÝnh 5 mm. - NhiÖt ®é cét: 400C. - Pha ®éng: Hßa tan 3,4g kali dihydrophosphat vµ 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml hçn hîp dung m«i n­íc vµ acetonitril (1:1). - Tèc ®é dßng: §iÒu chØnh tèc ®é dßng sao cho thêi gian l­u cña berberin kho¶ng 10 phót. - Detector UV ë b­íc sãng 345 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 10 ml. - Nång ®é dung dÞch thö vµ chuÈn: 0,1mg/ml vµ c¸ch tiÕn hµnh pha 2 dung dÞch nµy gièng nhau. * TiÕn hµnh: LÇn l­ît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong c¸c dung dÞch thö , chuÈn vµ hµm l­îng dung dÞch chuÈn, tÝnh l­îng berberin trong chÕ phÈm. * C¸ch tÝnh: L­îng Wt (mg) cña berberin clorid (C20H18ClNO4). Wt = Ws x (At / As) Ws = L­îng (mg) cña berberin chuÈn, tÝnh theo l­îng khan. Ph­¬ng ph¸p 2: [13] * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét ®­îc nhåi bëi c¸c h¹t silicagel ®· ®­îc octadecylsilan hãa. - Pha ®éng: Hçn hîp dung dÞch ®Öm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat víi 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh tíi pH 3,0 b»ng acid phosphoric] vµ acetonitril (60:40). - Tèc ®é dßng: 1,5 ml/ phót. - Detector UV ë b­íc sãng 263 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 20 ml - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: 32 mg/ml * TiÕn hµnh: LÇn l­ît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong dung dÞch thö, chuÈn vµ hµm l­îng dung dÞch chuÈn, tÝnh l­îng berberin cã trong chÕ phÈm. Ph­¬ng ph¸p 3: [16] * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét Hypersil C18 ( 5 mm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha ®éng: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). - Tèc ®é dßng: 1ml/phót. - Detector UV ë b­íc sãng 349 nm. * TiÕn hµnh: T­¬ng tù nh­ 2 ph­¬ng ph¸p HPLC ®· tr×nh bµy ë trªn. 1.3. Tæng quan Ph­¬ng ph¸p hplc 1.3.1. Nguyªn t¾c Ph­¬ng ph¸p HPLC lµ 1 ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hãa lý, dïng ®Ó t¸ch vµ ®Þnh l­îng c¸c thµnh phÇn trong hçn hîp dùa trªn ¸i lùc kh¸c nhau gi÷a c¸c chÊt víi 2 pha lu«n tiÕp xóc nh­ng kh«ng hßa lÉn vµo nhau: Pha tÜnh (trong cét hiÖu n¨ng cao) vµ pha ®éng (dung m«i röa gi¶i). Khi dung dÞch cña hçn hîp c¸c chÊt cÇn ph©n tÝch ®­a vµo cét, chóng sÏ ®­îc hÊp phô hoÆc ph©n bè vµo pha tÜnh tïy thuéc vµo b¶n chÊt cña cét vµ cña chÊt cÇn ph©n tÝch. Khi ta b¬m dung m«i pha ®éng b»ng b¬m víi ¸p suÊt cao th× tïy thuéc vµo ¸i lùc cña c¸c chÊt víi hai pha, chóng sÏ di chuyÓn qua cét víi vËn tèc kh¸c nhau dÉn ®Õn sù ph©n t¸ch. C¸c chÊt sau khi ra khái cét sÏ ®­îc ph¸t hiÖn bëi bé phËn ph¸t hiÖn gäi lµ detector vµ ®­îc chuyÓn qua bé xö lý kÕt qu¶. KÕt qu¶ cuèi cïng ®­îc hiÓn thÞ trªn mµn h×nh hoÆc ®­a ra m¸y in. [8] 1.3.2. C¬ së lý thuyÕt Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch trong kü thuËt HPLC lµ do qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ ph©n bè cña c¸c chÊt tan gi÷a 2 pha kh¸c nhau. Khi pha ®éng di chuyÓn víi mét tèc ®é nhÊt ®Þnh qua cét s¾c ký sÏ ®Èy c¸c chÊt tan bÞ pha tÜnh l­u gi÷ ra khái cét. Tïy theo b¶n chÊt pha tÜnh, chÊt tan vµ dung m«i mµ qu¸ tr×nh röa gi¶i t¸ch ®­îc c¸c chÊt khi ra khái cét s¾c ký. NÕu ghi qu¸ tr×nh t¸ch s¾c ký, chóng ta cã s¾c ®å. [8], [11] 1.3.3. C¸c th«ng sè ®Æc tr­ng cña qu¸ tr×nh s¾c ký: KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh s¾c kÝ ®­îc detector ph¸t hiÖn, phãng ®¹i vµ ghi thµnh s¾c ký ®å( h×nh 1): H×nh 1: s¾c ký ®å cña 2 chÊt vµ c¸c th«ng sè ®Æc tr­ng Trong ®ã : to (thêi gian chÕt): Lµ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó pha ®éng ch¶y qua cét t¸ch tR (thêi gian l­u): thêi gian kÓ tõ khi chÊt cÇn ph©n tÝch ®­îc b¬m vµo cét cho ®Õn khi xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic chÊt cÇn ph©n tÝch. tR’ (thêi gian l­u thùc ) = tR- to. W0,5: §é réng pic ë nöa chiÒu cao Wb: §é réng ®¸y pic. 1.3.2.1. HÖ sè dung l­îng k’ [8] NÕu k' nhá th× tR còng nhá vµ sù t¸ch kÐm. Trong thùc tÕ k' n»m trong kho¶ng 2 - 5 lµ tèt nhÊt. Hai chÊt chØ ®­îc t¸ch ra khái nhau nÕu chóng cã gi¸ trÞ kh¸c nhau. 1.3.2.2 §é chän läc a (selectivity - factor) a= (k2' > k1' ) [4], [8] a kh¸c 1 cµng nhiÒu th× kh¶ n¨ng t¸ch cµng râ rµng, tèi ­u tõ 1,5 ®Õn 2. 1.3.2.3. §é ph©n gi¶i (resolution) §Æc tr­ng cho møc ®é t¸ch hai chÊt ra khái nhau trªn mét ®iÒu kiÖn s¾c ký. §é ph©n gi¶i cña 2 pic ë c¹nh nhau ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [4], [8] §é ph©n gi¶i c¬ b¶n ®¹t ®­îc khi R = 1,5 1.3.2.4. HÖ sè bÊt ®èi AF Cho biÕt møc ®é c©n ®èi cña pic s¾c ký, nã ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [4], [8] Trong ®ã: W1/20: lµ chiÒu réng cña pic ®­îc ®o ë 1/20 chiÒu cao cña pic a: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng vu«ng gãc h¹ tõ ®Ønh pic ®Õn mÐp ®­êng cong phÝa tr­íc t¹i vÞ trÝ 1/20 chiÒu cao cña pic. Khi AF n»m trong kho¶ng 0,5-2,5 th× phÐp ®Þnh l­îng ®­îc chÊp nhËn, nÕu AF cµng t¨ng lªn th× hiÖn t­îng kÐo ®u«i cµng râ. HiÖn t­îng ®Ønh kÐo ®u«i (tailing peak) cã thÓ lµ do t­¬ng t¸c gi÷a chÊt cÇn ph©n tÝch vµ pha tÜnh hoÆc cét s¾c ký bÈn. §Ønh kÐo tuyÕn tr­íc (fronting peak) cã thÓ do l­îng mÉu ®­a vµo qu¸ lín so víi n¨ng lùc cét [7]. 1.3.2.5. Sè ®Üa lý thuyÕt N §Æc tr­ng cho hiÖu lùc cét. N = 16 hay N=5,54 [4], [8] NÕu gäi L lµ chiÒu cao cét s¾c ký, th× chiÒu cao cña ®Üa lý thuyÕt H ®­îc tÝnh b»ng c«ng thøc: 1.3.4. Nguyªn t¾c cÊu t¹o hÖ thèng HPLC [4],[8] HÖ thèng HPLC ®¬n gi¶n vµ ®ñ ®Ó lµm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm 6 bé phËn chÝnh sau: a/HÖ thèng b¬m §Ó b¬m pha ®éng vµo cét t¸ch. B¬m nµy ph¶i ®iÒu chØnh ®­îc ¸p suÊt (0 - 400 bar) a/ B×nh chøa dung m«i vµ hÖ thèng xö lý dung m«i B×nh chøa dung m«i th­êng b»ng thñy tinh hoÆc thÐp kh«ng gØ. Dung m«i ch¹y s¾c ký ®­îc läc qua mµng läc (th­êng mµng läc cì lç 0,45 mm ) vµ ®uæi khÝ hßa tan. c/ HÖ tiªm mÉu §Ó ®­a mÉu ph©n tÝch vµo cét. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p tiªm mÉu kh¸c nhau, ®¬n gi¶n nhÊt lµ sö dông mét van tiªm. Trong c¸c hÖ thèng s¾c ký hiÖn ®¹i lµ hÖ tiªm mÉu tù ®éng. Trong s¾c ký láng, mÉu láng cã thÓ ®­îc tiªm ngay sau khi läc lo¹i t¹p qua mµng läc 0,45 mm, cßn mÉu r¾n cÇn hßa tan trong 1 dung m«i thÝch hîp. d/ Cét s¾c ký láng HPLC Cét ®­îc chÕ t¹o b»ng thÐp ®Æc biÖt tr¬ víi hãa chÊt, chÞu ®­îc víi ¸p suÊt cao ®Õn vµi tr¨m bar. - ChiÒu dµi cét: 10, 15, hoÆc 25 cm; thÝch hîp víi c¸c tiÓu ph©n pha tÜnh cã ®­êng kÝnh rÊt nhá (3, 5, 10 mm). - §­êng kÝnh cét: 4 hoÆc 4,6 mm. e/ Detector trong HPLC Lµ bé phËn ph¸t hiÖn chÊt ph©n tÝch, tïy theo b¶n chÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch mµ sö dông detector thÝch hîp. Detector hay sö dông lµ detector hÊp thô UV - VIS. Ngoµi ra cßn cã detector khóc x¹, huúnh quang, ®iÖn hãa. f/ ThiÕt bÞ hiÓn thÞ kÕt qu¶ Cã nhiÒu lo¹i nh­ng ®¬n gi¶n vµ phæ biÕn nhÊt lµ m¸y tù ghi ®Ó tÝn hiÖu ®o d­íi d¹ng pic. S¬ ®å khèi hÖ thèng HPLC ®­îc tæng qu¸t ë h×nh 2 B¬m Van tiªm mÉu Binh chøa pha ®éng Cét Bé phËn tù ghi Detector H×nh 2: S¬ ®å khèi tæng qu¸t hÖ thèng HPLC 1.3.5. C¸ch ®¸nh gi¸ pic[7] * §¸nh gi¸ diÖn tÝch pic: DiÖn tÝch cña mét chÊt t­¬ng øng víi tæng l­îng chÊt ®ã. §Ó tÝnh diÖn tÝch pic, hiÖn nay ng­êi ta th­êng dïng m¸y tÝch ph©n ®iÖn tö g¾n víi m¸y vi tÝnh (sai sè kho¶ng 0,5 %) hoÆc m¸y ph©n tÝch c¬ häc (sai sè 1,3 %). Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ dïng cho c¸c pic kh«ng bÞ tr«i ®­êng nÒn vµ c¶ pic cã ®­êng nÒn bÞ tr«i. Ph­¬ng ph¸p nµy chØ cÇn ®iÓm ®Çu ®iÓm cuèi cña pic ®­îc nhËn ra chÝnh x¸c vµ cho kÕt qu¶ tèt víi nång ®é võa, trung b×nh vµ cao. * §¸nh gi¸ chiÒu cao pic: Khi pic cã d¹ng kh«ng ®æi th× chiÒu cao pic (kho¶ng c¸ch gi÷a ®­êng nÒn vµ ®Ønh pic) lµ mét ®¹i l­îng tû lÖ víi diÖn tÝch pic vµ nã còng cã thÓ dïng ®Ó ®¸nh gi¸ phæ. Ph­¬ng ph¸p chØ ¸p dông khi c¸c chØ sè k' lµ h»ng ®Þnh. * Víi pic cã ®­êng nÒn bÞ nhiÔu hoÆc bÞ hÑp th× viÖc x¸c ®Þnh chiÒu cao pic sÏ dÔ dµng vµ chÝnh x¸c h¬n viÖc x¸c ®Þnh diÖn tÝch pic. 1.4.Tæng quan PH¦¥NG PH¸P QUANG PHæ HÊP THô UV-VIS 1.4.1. C¬ së lý thuyÕt[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. §Þnh luËt Lambert-Beer ChiÕu mét chïm tia s¸ng ®¬n s¾c cã b­íc sãng λ vµ c­êng ®é Io qua dung dÞch ®ång nhÊt cã nång ®é C, bÒ dµy líp dung dÞch lµ l. Khi ®i qua dung dÞch ,mét phÇn ¸nh s¸ng bÞ hÊp thô, mét phÇn bÞ ph¶n x¹, phÇn cßn l¹i (I) th× ®i qua dung dÞch . Mèi quan hÖ gi÷a I vµ Io ®­îc thÓ hiÖn b»ng ®Þnh luËt Lambert-Beer. I = Io 10 -εCl Víi ε lµ hÖ sè hÊp thô riªng cña dung dÞch. HÖ sè nµy kh«ng phô thuéc vµo nång ®é, chØ phô thuéc vµo b¶n chÊt chÊt tan, vµo b­íc sãng cña ¸nh s¸ng chiÕu vµo dung dÞch. 1.4.1.2. §iÒu kiÖn øng dông ®Þnh luËt Lambert – beer + Chïm tia s¸ng ph¶i ®¬n s¾c + Dung dÞch ph¶i lo·ng (n»m trong kho¶ng nång ®é thÝch hîp) + Dung dÞch ph¶i trong suèt (trõ chuÈn ®é ®o quang). + ChÊt thö ph¶i bÒn trong dung dÞch vµ ph¶i bÒn duíi t¸c dông cña ¸nh s¸ng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sù sai lÖch ®èi víi ®Þnh lËt Lambert-beer + Sù sai lÖch do m¸y:(do bé phËn ®¬n s¾c ,bé phËn khuÕch ®¹i kÐm) nh­ do tÕ bµo quang ®iÖn, nh©n quang qu¸ giµ, ®é nh¹y kÐm. + Sai lÖch do ho¸ häc: - Do sù ph©n ly (ion ho¸): th­êng gÆp khi pha lo·ng dung dÞch, ph©n tö chÊt tan bÞ ph©n ly, mµ ®é hÊp thô cña d¹ng ph©n tö vµ d¹ng ion ph©n ly kh«ng nh­ nhau. - Do t¹o dimer, trimer: s¶n phÈm trïng hîp nµy l¹i cã ®é hÊp thô kh¸c d¹ng ®¬n ph©n tö. + Do ph¶n øng c¸c chÊt l¹: - ChÊt l¹ cã thÓ t¹o phøc víi c¸c ion trong dung dÞch: ®Ó ®Ò phßng hiÖn t­îng nµy x¶y ra, ng­êi ta dïng mÉu tr¾ng cã thµnh phÇn nh­ dung dÞch, chØ thiÕu chÊt cÇn ®Þnh l­îng. - Sù hÊp thô cña chÊt l¹, thuèc thö còng cã thÓ ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng. V× vËy trong qu¸ tr×nh lµm ph¶n øng ²t¹o mµu², ph¶i chó ý tíi ®iÒu kiÖn ph¶n øng vµ c¸c thµnh phÇn tham gia ph¶n øng. 1.4.1.4. Mét sè ®¹i l­îng th«ng dông[ a/ §é truyÒn qua (T-Transmittance): §é truyÒn qua (hay cßn gäi lµ ®é thÊu quang) ®Æc tr­ng cho ®é trong suèt (vÒ mÆt quang häc) cña dung dÞch, ®­îc ®Þnh nghÜa: T = = 10-εCl Th­êng T tÝnh ra phÇn tr¨m (%). Mét chÊt cã T=1(hay100%), nghÜa lµ hoµn toµn kh«ng cã hÊp thô ¸nh s¸ng, ng­êi ta nãi chÊt ®ã hoµn toµn trong suèt. b/ §é hÊp thô (A-Absorbance): §é hÊp thô (hay cßn gäi lµ mËt ®é quang) ®­îc ®Þnh nghÜa : A = lg = ε.C.l §èi víi mét chÊt x¸c ®Þnh (cã ε x¸c ®Þnh), th­êng ®o trªn mét lo¹i cèc ®o (cã bÒ dµy th«ng th­êng lµ l=1 cm), nh­ vËy ®é hÊp thô tû lÖ thuËn víi nång ®é dung dÞch: A=K.C (K=ε.l) c/ HÖ sè h©p thô phÇn tr¨m (): Theo c«ng thøc A =ε.C.l, nÕu l=1 cm, C=1% th× : A = ε = VËy chÝnh lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1%, dïng cèc ®o cã bÒ dµy 1cm. Víi mét chÊt tan x¸c ®Þnh, t¹i mét λ x¸c ®Þnh, lµ mét h»ng sè. d/ HÖ sè hÊp thô ph©n tö (εμ): HÖ sè hÊp thô ph©n tö, hay cßn gäi lµ hÖ sè t¾t mol lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1M/l, dïng cèc ®o cã bÒ dµy1cm. Còng nh­ , víi mét chÊt x¸c ®Þnh, trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®o x¸c ®Þnh (λ, dung m«i, nhiÖt ®é,...) εμ lµ mét h»ng sè. Gi÷a vµ εμ cã mèi liªn hÖ εμ = M ë ®©y M lµ ph©n tö gam cña chÊt tan. 1.4.2. Mét sè kü thuËt ®Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p quang phæ UV-VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Ph­¬ng ph¸p ®o phæ trùc tiÕp: §o ®é hÊp thô cña dung dÞch, tÝnh nång ®é C cña dung dÞch dùa vµo gi¸ trÞ biÕt tr­íc (tra cøu). A = .C.l → C = (víi l =1 cm) Trong ph­¬ng ph¸p nµy, ph¶i chó ý kiÓm tra m¸y ®o vÒ b­íc sãng (λ) vµ mËt ®é quang A b»ng c¸ch: Dïng ®Ìn thuû ng©n, ®Ìn D2 (cho mét v¹ch s¸ng cã b­íc sãng x¸c ®Þnh). Dïng mét mÉu chuÈn, ®o vµ ®iÒu chØnh ®Ó t×m sai sè. Dïng mét kÝnh läc Holmium (cã c¸c gi¸ trÞ λmax x¸c ®Þnh cho trong tµi liÖu )®Ó kiÓm tra l¹i m¸y. Dïng dung dÞch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiÕt quang phæ pha thµnh dung dÞch cã nång ®é chÝnh x¸c. §o phæ t×m c¸c gi¸ trÞ λmax vµ t×m Amax . 1.4.2.2. Ph­¬ng ph¸p so s¸nh §o ®é hÊp thô Ax, Ac cña dung dÞch thö cã nång ®é Cx (ch­a biÕt) vµ cña dung dÞch chuÈn cã nång ®é Ac (®· biÕt). Ta cã: = → Cx = x Cc Chó ý: nång ®é cña dung dÞch thö Cx vµ cña dung dÞch chuÈn Cc kh«ng ®­îc chªnh lÖch nhau qu¸ nhiÒu. Nång ®é dung dÞch nµy cµng gÇn nhau, kÕt qu¶ cµng chÝnh x¸c. Ngoµi ra cßn cã c¸c kü thuËt ®Þnh l­îng kh¸c nh­: ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn, ph­¬ng ph¸p thªm ®­êng chuÈn, ph­¬ng ph¸p chuÈn ®é ®o quang, ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng hçn hîp theo nguyªn t¾c céng phæ . PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.1. Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1.1. Nguyªn liÖu, ho¸ chÊt, thuèc thö: 2.1.1.1. §èi t­îng nghiªn cøu: . Berberin clorid: ChÊt chuÈn hµm l­îng 83,3% do ViÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp . Berberin clorid d¹ng nguyªn liÖu do bé m«n Ho¸ D­îc cung cÊp . Palmatin: do viÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp 2.1.1.2. Ho¸ chÊt, thuèc thö: . Muèi potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dïng cho HPLC (Merk) . N­íc cÊt 2 lÇn (cÊt trùc tiÕp t¹i Bé m«n Hãa v« c¬ tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi) dïng cho m¸y HPLC . Mét vµi hãa chÊt kh¸c 2.1.1.3. ThiÕt bÞ: + M¸y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + C©n ph©n tÝch AY 220 , Max = 220 g, ®é chÝnh x¸c 0,1 mg + M¸y ®o pH JENWAY cña Anh + M¸y cÊt n­íc 2 lÇn + M¸y l¾c siªu ©m EBRO ARMATUREN cña §øc + M¸y läc hót ch©n kh«ng Satorius + B×nh ®Þnh møc c¸c lo¹i: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ... + Cèc cã má: c¸c lo¹i 100; 200; 500 + Pipet chÝnh x¸c, pipet th­êng, ®òa thñy tinh. + B¬m tiªm, lä ®ùng mÉu, mµng läc 0,45 mm... 2.1.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu: 2.1.2.1. ChØ tiªu nghiªn cøu: . Ph©n tÝch mÉu thö b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC vµ ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV- VIS . §¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c, tÝnh ®óng, tÝnh tuyÕn tÝnh, tÝnh ®Æc hiÖu cña hai ph­¬ng ph¸p trªn . So s¸nh 2 ph­¬ng ph¸p trªn 2.1.2.2. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh c¸c chØ tiªu nghiªn cøu: Nghiªn cøu trªn lý thuyÕt vµ tµi liÖu tham kh¶o ®Ó lùa chän ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch B»ng thùc nghiÖm, dùa vµo kÕt qu¶ thu ®­îc, xö lý thèng kª vµ rót ra kÕt luËn Ph­¬ng ph¸p sö dông trong thùc nghiÖm: HPLC, §o quang phæ hÊp thô UV-VIS 2.1.2.3.Ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu thèng kª: . D÷ liÖu thu ®­îc ®­îc xö lý b»ng ph­¬ng ph¸p thèng kª - sö dông c«ng cô hç trî lµ phÇn mÒm Microsoft Excel . Mét sè ®Æc tr­ng thèng kª ®­îc sö dông: - Gi¸ trÞ trung b×nh: - §é lÖch chuÈn: - §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi (RSD): RSD% = 100 - Sai sè chuÈn : - Sai sè t­¬ng ®èi: - Kho¶ng tin cËy: = ± taSx Trong ®ã : xi lµ kÕt qu¶ x¸c ®Þnh lÇn thø i ; n lµ sè lÇn x¸c ®Þnh + Tiªu chuÈn Fischer ®Ó ®¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña 2 ph­¬ng ph¸p thÝ nghiÖm kh¸c nhau : Ftn = ; trong ®ã S1 > S2 Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª Ftn<Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª Flt tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n – 1 + Test T ®Ó so s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau : T = () víi = T < : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª T > : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n1+n2-2 2.2. KÕt qu¶ thùc nghiÖm : 2.2.1. §Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III * Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn. C¸ch tiÕn hµnh : + Dung dÞch thö : C©n 0,200 g chÕ phÈm vµ hoµ tan trong 200 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi n­íc ®Õn 100 ml (C = 20g/ml) + Dung dÞch chuÈn ®­îc pha t­¬ng tù dung dÞch thö , dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid + §o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i b­íc sãng cùc ®¹i 421 nm víi mÉu tr¾ng lµ n­íc cÊt, cèc ®o dµy 1 cm. * C¸ch tÝnh kÕt qu¶ : Theo ph­¬ng ph¸p so s¸nh, hµm l­îng phÇn tr¨m ®­îc tÝnh theo c«ng thøc : C% = C Trong ®ã : C% : Hµm l­îng % Berberin clorid cã trong mÉu thö. C : Hµm l­îng % Berberin clorid cã trong mÉu chuÈn At : §é hÊp thô cña dung dÞch thö. Ac : §é hÊp thô cña dung dÞch chuÈn. mt : Khèi l­îng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu ®· c©n ®Ó pha dung dÞch thö. mc : Khèi l­îng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid chuÈn ®· c©n ®Ó pha dung dÞch chuÈn. TiÕn hµnh ®Þnh l­îng 5 mÉu. KÕt qu¶ ghi trong b¶ng 1 . B¶ng1 : KÕt qu¶ ®Þnh l­îng Beberin clorid trong nguyªn liÖu STT Khèi l­îng c©n(g) §é hÊp thô(A) C% 1 0,1971 0,269 86,50 2 0,2010 0,272 85,76 3 0,2062 0,280 86,06 4 0,2090 0,285 86,42 5 0,2030 0,277 86,48 ChuÈn 0,2001 0,263 83,30 Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 1, ta cã: Gi¸ trÞ trung b×nh: = 86,24% §é lÖch chuÈn : S = 0,324 Kho¶ng tin cËy cña gi¸ trÞ trung b×nh (ë møc tin cËy 95%): ∆X(%) = 0,40 §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi: RSD = 0,37% KÕt luËn: Hµm l­îng Beberin clorid trong bét nguyªn liÖu lµ 86,24%0,40%. 2.2.2. §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III 2.2.2.1./TÝnh chÝnh x¸c : Nguyªn t¾c: §é chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c phÐp thö song song. C¸ch tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy nh­ trong phÇn 2.2.1.1 KÕt qu¶ thö ®é chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p cho thÊy ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c kÕt qu¶ (RSD = 0,37% < 2%). Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p lµ chÝnh x¸c 2.2.2.2 TÝnh tuyÕn tÝnh: TiÕn hµnh kh¶o s¸t sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é vµ ®é hÊp thô trªn chÊt chuÈn Berberin. C©n 5 mÉu chÊt chuÈn Berberin clorid cã khèi l­îng tõ 0,1600g→ 0,2400g ( t¹i c¸c ®iÓm 80%,90%,100%,110%,120% nång ®é dïng khi ®Þnh l­îng) C¸ch tiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.1 B¶ng 2: Sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo nång ®é dung dÞch STT 1 2 3 4 5 C (mg/ml) 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240 A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 H×nh 6 .§å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo nång ®é dung dÞch - Ph­¬ng tr×nh håi quy biÓu thÞ mèi t­¬ng quan gi÷a mËt ®é quang vµ nång ®é dung dÞch lµ: y = 12,5 x + 0,013; - HÖ sè t­¬ng quan: 0,998 - §é lÖch chuÈn cña y_ intercept: Sb = 0,009 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy hÖ sè t­¬ng quan cña ®­êng håi quy v­ît qu¸ 0,99…TÊt c¶ c¸c gi¸ trÞ n»m trªn ®­êng håi quy hoÆc ph©n bè ®ång ®Òu c¶ hai phÝa cña ®­êng håi quy. Kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. VËy ph­¬ng ph¸p lµ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng nång ®é tõ 80% ®Õn 120% nång ®é lµm viÖc. 2.2.2.3. §é ®óng: . C©n 3 mÉu chÊt ®èi chiÕu Beberin clorid ( hµm l­îng 83,3%) víi khèi l­îng tõ 0,1600g → 0,2400g (t¹i c¸c ®iÓm 80, 100, 120% so víi l­îng c©n dïng khi ®Þnh l­îng) . TiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.1. Mçi mÉu ®o 3 lÇn, lÊy kÕt qu¶ trung b×nh . TÝnh to¸n kÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng dùa vµo ®é hÊp thô cña mÉu chuÈn lµ 0,263 øng víi khèi l­îng c©n 0,2001g KÕt qu¶ thu ®­îc ghi ë b¶ng 3 B¶ng 3: KÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng cña ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS STT Khèi l­îng c©n (g) L­îng ho¹t chÊt cã thùc a (g) §é hÊp thô trung b×nh (A) L­îng t×m l¹i trung b×nh b (g) PhÇn tr¨m t×m l¹i (b/a.100%) 1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88 2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77 3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86 Tõ kÕt qu¶ b¶ng 3 ta cã: - Trung b×nh % t×m l¹i: 100,17% - Ph­¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt ban ®Çu vµ l­îng ho¹t chÊt t×m l¹i lµ: y = 1,052x – 0,008 - HÖ sè t­¬ng quan: r = 0,999 - §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,003 - §é lÖch chuÈn cña ®é dèc: Sa = 0,019 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã: Kho¶ng tin cËy cña ®é dèc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112 Kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009 hay - 0,017 < y_intercept < 0,001 H×nh 7: §å thÞ biÓu diÔn ph­¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt t×m l¹i vµ l­îng ho¹t chÊt cã thùc KÕt luËn: - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng h»ng ®Þnh v× kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng tû lÖ v× kho¶ng tin cËy ®é dèc chøa 1. - Gi¸ trÞ trung b×nh cña tû lÖ thu l¹i lµ 100,17% nghÜa lµ n»m trong kho¶ng tõ 98% ®Õn 102%. Nh­ vËy, ph­¬ng ph¸p ®­a ra lµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t. 2.2.2.4. TÝnh ®Æc hiÖu: Nh­ trong phÇn 1.1.2 ®· tr×nh bµy, c¸c t¹p chÊt cÇn x¸c ®Þnh trong Berberin nguyªn liÖu lµ Palmatin vµ Jatrorrhizin. Nh­ng trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt chuÈn Jatrorrhizin, chóng t«i chØ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt Palmatin ®èi víi ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng TiÕn hµnh: + C©n 0,200 g chÊt chuÈn berberin clorid vµ hßa tan trong 200 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000 ml, thu ®­îc dunhg dÞch berberin chuÈn 0,2 mg/ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo 4 b×nh ®Þnh møc 100 ml. + Pha dung dÞch Palmatin 10%, 5% vµ 2,5% so víi nång ®é cña berberin clorid ®em ®o . C©n 0,02 g Palmatin chuÈn vµ hßa tan trong 20 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 100 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ®­îc dung dÞch palmatin chuÈn 0,02 mg/ml . LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ta ®­îc dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml. . LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ®­îc dugn dÞch palmatin 0,005 mg/ml. . LÇn l­ît thªm 10 ml dung dÞch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vµo 3 b×nh ®Þnh møc 100 ml ®· chøa berberin clorid chuÈn trªn vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch. Mét b×nh ®Þnh møc 100 ml kh«ng thªm palmatin vµ thªm n­íc tíi v¹ch. §em ®o ®é hÊp thô quang cña dung dÞch 4 b×nh nµy t¹i b­íc sãng 421 nm B¶ng 4: KÕt qu¶ thu ®­îc vÒ sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt palmatin tíi ®é hÊp thô quang cña berberin clorid B×nh 1 B×nh 2 B×nh 3 B×nh 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml) 10 10 10 10 Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10 §é hÊp thô A 0,263 0,282 0,271 0.266 NhËn xÐt: Tõ kÕt qu¶ b¶ng trªn, ta thÊy ®é hÊp thô quang cña dung dÞch t¨ng theo sù t¨ng cña nång ®é dung dÞch palmatin. Khi thªm 2,5% palmatin, hµm l­îng berberin trong bét nguyªn liÖu ®Þnh l­îng theo ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS cña D§VN III t¨ng 1,14%. NÕu cã 2% palmatin nh­ trong giíi h¹n vÒ palmatin mµ D§VN III yªu cÇu th× kÕt qu¶ ®Þnh l­îng t¨ng 0,91% VËy ph­¬ng ph¸p kh«ng cã tÝnh ®Æc hiÖu. 2.2.3. §Þnh l­îng berberin clorid nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005): §iÒu kiÖn s¾c ký ®Ó ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu - Cét s¾c ký: h¹t nhåi silicagel ®­îc octadecylsilan hãa - Detector UV: 263 nm - Pha ®éng: ®Öm phosphate [ hçn hîp KH2PO4 0,05M vµ heptan Na sulfonate(1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh pH=3,0 b»ng H3PO4] – acetonitril (60:40). - NhiÖt ®é cét: nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm - ThÓ tÝch tiªm: 20μl - Tèc ®é dßng: 1,5 ml/phót * TiÕn hµnh: + Dung dÞch thö: C©n 0,04 g berberin clorid hßa tan trong n­íc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml.Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc tíi v¹ch. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 2 ml dÞch läc trªn cho vµo b×nh ®Þnh møc 25 ml , thªm n­íc tíi v¹ch. + Dung dÞch chuÈn : pha t._.