Bài giảng PCR trong chuẩn đoán phân biệt các Subtype AIV TYPE A - Phạm Thành Thái

Thogotovirus.Tên gọiCấu tạo AIVCác kháng nguyên bên trong (proreins M1 và NP) là các proteins đặc hiệu nhóm được dùng để xác định xem virus thuộc type A, B hay C.Các kháng nguyên bên ngoài (HA và NA) đa dạng hơn và là các kháng nguyên có tính đặc hiệu subtype.Jorge Duitama et al, 2009Phân loại AIVCúm gia cầm độc lực thấp (LPAI) xảy ra tự nhiên ở các loài chim. Bệnh không biểu hiện triệu chứng hoặc rất nhỏ. Những dòng virus này ít gây nguy hiểm cho sức khỏe con người. Dòng LPAI H5 và H7 có khả năng biến chủng thành HPAI.Cúm gia cầm độc lực cao (HPAI): sau 10 ngày tiêm nhiễm cho gà, AIV phải làm chết 75-100% phôi gà thực nghiệm. Sau khi phân lập từ gà bệnh, AIV phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. Đối với chủng H5 và H7 nếu mọc tốt trên môi trường không có trypsin, trình tự acidamine trùng với trình tự acidamine của chủng độc lực cao thì được xác định là chủng độc lực cao.Tái tổ hợp gene ở AIVY. Guan, 2002Nếu 2 chủng virus cúm đồng thời xâm nhiễm cùng 1 tế bào thì có thể xảy ra hiện tượng tái tổ hợp gene (genetic recombination); khi đó sẽ tạo ra các virus mới có các kháng nguyên kết hợpSự thay đổi genotype của H5N1 từ khi phát hiện vào năm 1997 đến năm 2001. Tám đoạn gene của AIV được xếp theo thứ tự từ trên xuống PB2, PB1, PA, HA, NP, M, và NS. Các chủng virus: H9N2; H6N1; H5N1; H9N2/ Y280; và H5N11/97. (?) là genotype AIV chưa từng được phân lập từ gia cầm ở Hong Kong.Subtype AIV type AH1N1H5N1H2N2H3N2H7N2H7N3H7N7H9N2Phương pháp chuẩn đoán subtype AIV type ADennis A. SenneRT-PCRThu mẫu bệnh phẩmCơ quan hoặc mô (não, khí quản, phổi,)Các loại dịch (phổi, họng, mũi,)Huyết thanhTách chiết RNASử dụng các Kit như: NucleoSpin RNA II, Rneasy MiniKit,Chuẩn bị mẫu chạy RT-PCRPCR buffer, MgCl2, dNTP, Primer, Rtase,Chạy RT-PCRTùy theo primer sử dụng mà có chu trình nhiệt khác nhauĐọc kết quảTrên gel agrose, hoặc real time,Chuẩn đoán H5N1WHO, 2007rRT-PCRĐây là phương pháp rất nhanh, 28 mẩu bệnh phẩm đã được kiểm tra trong khoảng 3h.Giới hạn phát hiện của cặp M primer là 103 gene copies. Cả hai cặp primer H5 và H7 đều có giới hạn phát hiện là 103 đến 104 gene copiesErica Spackman et al, 2002Một nghiên cứu nhằm xác định subtype H5 và H7, tác giả đã sử dụng các cặp primer và probe saurRT-PCRMột nghiên cứu khác trên subtype H5, H7 và H9G. Cattoli, I. Monne. 2008rRT-PCRG. Cattoli, I. Monne. 2008mRT-PCRTrong nghiên cứu này, Pitirat Boonsuk và cs (2008) đã phát triển kỹ thuật Multiplex RT-PCR trong việc phát hiện các subtype H1, H3 và H5 của AIV type A.mRT-PCRA.Kết quả điện di trên gel agarose với mẫu H1, H3 và H5; Mix và chứng âm (N)B.Kết quả kiểm tra độ nhạy phương pháp.mRT-PCRKết quả kiểm tra độ chuyên biệt.Multiplex RT – nested PCRPhương pháp này được nghiên cứu để phát hiện AIV type A subtype H1N1 và subtype H3N2 và AIV type B.Multiplex RT – nested PCRĐộ nhạy của phương pháp: đối với H1N1 thì giới hạn phát hiện là 200pfu/ml, H3N2 là 14 pfu/ml và AIV type B là 4,5 pfu/ml. Trong khi đó độ nhạy của phương pháp one-step PCR là 1,1-2,1x103.Tài liệu tham khảoErica Spakman et al, 2002. Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for A Influenza Virus and the Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtupes. Journal of Clinical Microbiology, Vol. 40 (9): 3256-3260.Giovanni Cattoli, Isabella Monne, 2009. Ilaria Capua, Dennis J. Alexander(Ed). In: Avian Influenza and Newcastle Disease – A Field and Laboratory Manual. Milan, Italy. 87-112Jorge Duitama et al, 2009. PrimerHunter: a primer design tool for PCR-based virus subtype indentification. Nucleic Acids Research, Vol. 37 (8): 2483-2492.Pitirat Boonsuk et al., 2008. Detection of Influenza Virus Types A and B and Type A subtypes (H1, H3, and H5) by Multiplex Polymerase Chainzreaction. Tohoku J.Exp. Med., 215, 247-255.Patrick J Gavin, Richard B Thomson, Jr. 2003. Review of Rapid Diagnostic Tests for Influenza. Clinical and Applied Immunology Reviews, 4 (2003), 151 – 172.Song, Man Ki, Jun Chang, Yeongjin Hong, Sunghoi Hong, and Suhng Wook Kim. 2009. Direct Multiplex Reverse Transcription-Nested PCR Detection of Influenza Viruses Without RNA Purification. J. Microbiol. Biotechnol. G. Cattoli, I. Monne, 2008. Real time RT-PCR (rRT-PCR) Detection of Avian Influenza subtype H5, H7, H9. Validation Dossier. WHO. 2007. Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A (H5N1) virus in specimens from suspected human cases.Y. Guan et al, 2002. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR. PNAS. Vol 99 (3): 8950-8955.Thank You !