Báo cáo tóm tắt đề tài - Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R - Phycoerythrin từ rong biển đỏ

nhiệm Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, 2 ThS. Trần Thị Ngọc Linh Thành viên Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, 3 ThS. Huỳnh Ngọc Bích Thành viên Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng Khoa Công nghệ Hóa Thƣ ký học – Môi trƣờng, 4 TS. Lê Thị Diệu Hƣơng khoa học Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng ii MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i MỤC LỤC ......................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH .......................................................................... iv DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................ v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................ vi THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................ vii INFORMATION ON RESEARCH RESULTS ................................ xi TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI ............................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ................................................ 2 1.1. Rong biển đỏ Gracilaria ............................................................... 2 1.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 2 1.1.2. Sự phân bố các loài Gracilaria .................................................. 2 1.1.3. Thành phần hóa học .................................................................. 2 1.2. R-Phycoerythrin .......................................................................... 3 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 4 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................. 4 2.2. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin .......................................... 4 2.3. Tinh sạch R-phycoerythrin .......................................................... 4 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................. 5 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 6 3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu R-phycoerythrin ....... 6 3.1.1. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp ngâm ............. 6 3.1.2. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp thủy phân ...... 8 3.1.3. Tối ƣu hóa điều kiện chiết xuất bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .......................................................................................... 8 3.2. Nghiên cứu tinh sạch R-phycoerythrin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion ........................................................................................ 11 3.3. Đề xuất quy trình chiết xuất R-phycoerythrin ........................... 14 3.3.1. Đề xuất quy trình chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp ngâm . 14 3.4.2. Quy trình chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp thủy phân ...... 14 3.5. Đề xuất quy trình tinh sạch R-PE .............................................. 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 16 iii DANH MỤC HÌNH SỐ HIỆU TÊN HÌNH TRANG HÌNH Hàm lƣợng protein (A), R-PE (B) từ Gracilaria 3.1 8 gracilis Biểu đồ bề mặt đáp ứng năng suất R-PE (mg/g CK) theo thời gian thủy phân, tỷ lệ E/S và nhiệt độ thủy phân. A: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa 3.2 10 thời gian và tỷ lệ E/S; B: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ E/S; C: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa nhiệt độ và thời gian thủy phân Sắc ký đồ của dung dịch chiết thô CE1 từ Gracilaria gracilis trên cột DEAE Sepharose. Các phân đoạn rửa giải: A: AE-150/AE- 200/AE-1000; B: AE-150/AE-250/AE-1000; 3.3 C: AE-150/AE-300/AE-1000 12 Ghi chú: Sắc ký đồ đƣợc theo dõi bằng quang phổ UV-visible tại 280nm (-------), 565nm ( ), nồng độ NaCl (). Quang phổ hấp thụ, sắc ký đồ lọc gel tại phân 3.4 13 đoạn AE-200 Điện di đồ các phân đoạn nhận đƣợc sau khi 3.5 13 qua cột sắc ký trao đổi ion Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE 3.6 14 bằng phƣơng pháp ngâm Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE 3.7 14 bằng phƣơng pháp thủy phân 3.8 Sơ đồ quy trình công nghệ tinh sạch R-PE 15 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU SỐ HIỆU TÊN BẢNG TRANG BẢNG Hàm lƣợng R-PE và chỉ số độ tinh khiết PI tại 3.1 các tỷ lệ giữa nguyên liệu/dung môi nƣớc 6 đƣợc khảo sát Chất lƣợng R-PE tại các thời điểm đƣợc khảo 3.2 6 sát Hàm lƣợng R-PE, PI, protein hòa tan của 3.3 Gracilaria gracilis sau khi đƣợc chiết xuất từ 7 các dung môi khác nhau Ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế 3.4 9 phức hợp trung tâm CCD (n=3). Bảng tóm tắt kết quả hàm lƣợng R-PE, chỉ số 3.5 độ tinh khiết R-PE thu đƣợc từ rong biển sấy 10 Gracilaria gracilis Hàm lƣợng R-PE và PI của dịch chiết thô (CE) 3.6 của Gracilaria gracilis và các phân đoạn sau 13 khi tinh sạch v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT R-PE: R-phycoerythrin G.gracilis: Gracilaria gracilis G.: Gracilaria RSM: Response surface methodology CE: Crude Extract CEVA: Centre d’Étude et de Valorisation des Algues FAO: Food and Agriculture Organisation PI: Purity Index kDa: Kilo Dalton AE: Anion exchange CK: Chất khô vi ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Đơn vị: Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật ------- THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R- phycoerythrin từ rong biển đỏ - Mã số: B2018-ĐN06-14 - Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Phƣớc Trang - Tổ chức chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật - Thời gian thực hiện: 08/2018 – 07/2020 2. Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ nguồn rong biển đỏ nhằm bổ sung thêm nguồn chất màu tự nhiên cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Chất màu R- phycoerythrin tinh khiết có thể sử dụng trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học. Nghiên cứu của đề tài tập trung vào quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin bằng phƣơng pháp ngâm trong dung môi và phƣơng pháp enzyme thủy phân nhằm mục đích thu nhận R-phycoerythrin đạt năng suất cao với các thông số công nghệ tối ƣu. Ngoài ra, nghiên cứu bƣớc đầu tinh sạch chất màu này bằng các phƣơng pháp khác nhau nhằm thu nhận sản phẩm R-PE tinh khiết. 3. Tình mới và sáng tạo: Nghiên cứu này đã đƣa ra đƣợc những dẫn liệu khoa học mới về ảnh hƣởng của các phƣơng pháp chiết xuất đến quá trình chiết xuất rong biển đỏ. Đồng thời cũng bƣớc đầu tinh sạch chất màu R-PE đạt đƣợc chỉ số độ tinh khiết cao. 4. Kết quả nghiên cứu: - Tiền xử lý nguyên liệu là một trong những công đoạn quan trọng của quá trình chiết xuất R-phycoerythrin. Phƣơng pháp sấy thăng hoa vii nguyên liệu và nghiền bằng nitơ lỏng mang lại hiệu quả chiết xuất R- PE cao. - Hai phƣơng pháp chiết xuất R-PE đã đƣợc nghiên cứu: sử dụng dung môi chiết xuất (nƣớc, nƣớc cất và dung dịch đệm phosphate 20 mM, pH 7,1) và sử dụng enzyme thủy phân polysaccharide (xylanase, cellulase và β-glucanase). Năng suất thu nhận R-PE từ phƣơng pháp thủy phân đạt 12.76 mg g-1 dw. - Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng tại các điều kiện (nhiệt độ (32C), thời gian (286 phút), enzyme cellulase/rong biển sấy (47 mg g-1), hàm lƣợng R-phycoerythrin thu nhận đƣợc đạt giá trị 15.75 mg g-1 dw. - R-phycoerythrin tinh khiết thu đƣợc với chỉ số độ tinh khiết cao (A565/A280) đạt 3.25 (chỉ số độ tinh khiết tiêu chuẩn = 3.2) sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký với cột DEAE Sepharose với phân đoạn thu nhận tại nồng độ muối NaCl 200 mM. 5. Sản phẩm: 5.1. Sản phẩm khoa học + 01 Bài báo trên Tạp chí Quốc tế thuộc danh mục SCI: Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561. + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc tế: 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018). Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red alga Mastocarpus stellatus”. Tác giả: Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine Dumay. 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578. + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc gia: Hội thảo khoa học quốc gia “Ứng dụng công nghệ mới trong công trình Xanh (AtiGB 2018). viii Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân đến quá trính thu nhận R-phycoerythrin từ Gracilaria gracilis. Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 11(132).2018, Quyển 2; Trang: 166- 170. 5.2. Sản phẩm ứng dụng + 100 ml mẫu R-phycoerythrin từ rong biển đỏ + 01 Qui trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong biển đỏ. Cung cấp đầy đủ các công đoạn và thông số kỹ thuật đƣợc Hội đồng Khoa chuyên ngành thông qua. 6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ìch mang lại của kết quả nghiên cứu: 6.1 Phƣơng thức chuyển giao Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, Đại học Đà Nẵng 6.2. Địa chỉ ứng dụng Có thể chuyển giao công nghệ cho các cơ sở chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm trong nƣớc. 6.3. Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu + Đối với lĩnh vực giáo dục và đào tạo Đề tài áp dụng công nghệ hiện đại, thiết bị tiên tiến nhƣ công nghệ nghiền nhỏ nguyên liệu bằng nitơ lỏng, thiết bị sấy thăng hoa, tinh sạch chất màu R-phycoerythrin bằng thiết bị sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel + Đối với lĩnh vực khoa học và công nghệ có liên quan - Đề tài có thể đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo về các phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin theo các phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp chiết bằng dung môi, thủy phân enzyme. - Tăng số lƣợng bài báo công bố trong nƣớc và quốc tế cho ĐHĐN. + Đối với phát triển kinh tế-xã hội - R-PE thu nhận từ rong biển có thể sử dụng thay thế chất màu tổng hợp, ứng dụng trong ngành chế biến thực phẩm, mỹ phẩm. - Đa dạng hóa sản phẩm thu nhận từ rong biển. ix x INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: Project title: Study on extraction process of R-phycoerythrin from red seaweed Code number: B2018-ĐN06-14 Coordinator: Nguyễn Hữu Phƣớc Trang Implementing institution: University of Technology and Education Duration: from 08/2018 to 07/2020 2. Objective(s): This research reports an effective procedure for the extraction of R- phycoerythrin from red seaweed. R-phycoerythrin has been used in food, cosmetics, pharmaceuticals and analytical reagents. Two different methods for the extraction of this pigment were tested: using the extraction solutions and using polysaccharide-degrading enzymes. Besides, the present research aims to purify the R- phycoerythrin by one-step anion-exchange chromatography. 3. Creativeness and innovativeness: This research presented different methods for the extraction and purification of R-phycoerythrin from red seaweed. The purity of the R-phycoerythrin obtained from G. gracilis reached 3.25 by anion- exchange chromatography after a three-step increasin gradient of salt concentration. This method reduced the number of processing steps for purification of R-PE and the processing time. 4. Research results: - The algae pretreatment is an important stage, and the highly effective extraction of R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis was carried out with freeze-dried seaweed and grinding with liquid nitrogen. - Two different methods for the extraction of this pigment were tested: using the extraction solutions (tap water, pure water and phosphate buffer 20 mM, pH 7,1) and using polysaccharide-degrading enzymes (xylanase, cellulase and β-glucanase). The latter, especially cellulase, enhanced the extraction yield of R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis (12.76 mg g-1 dw). Finally, under the optimal hydrolysis xi conditions obtained for the enzyme cellulase according to a response surface methodology study (temperature (32C), hydrolysis time (286 min), enzyme/dry seaweed ratio (47 mg/g CK dw), the maximum yield of R-phycoerythrin reached 15.75 mg/g CK dw. - Native R-phycoerythrin was achieved with a high purity index (A565/A280 ratio) of 3.25 (3.2 = standard R-phycoerythrin purity) after purification on DEAE Sepharose fast flow chromatography with the obtained fraction at 200 mM NaCl. 5. Products: 5.1. Scientific products + A research paper was published in SCI journal: Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561. + A research paper was published in the 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018). Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red alga Mastocarpus stellatus”(2018). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine Dumay. 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578. + A research paper was published in the 4th National Scientific Conference on Applying New Technology in Green Buildings (AtiGB 2018). Optimization of hydrolysis conditions to obtain R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis (2018). Nguyễn Hữu Phƣớc Trang. Journal of Science and Technology, 11(132), 166-170. 5.2. Other products + 100 ml R-phycoerythrin + An extraction process of R-phycoerythrin from red seaweed. 6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results: xii 6.1 Transfer alternatives The Faculty of Chemical Technology – Environment, University of Technology and Education, University of Danang. 6.2. Application institutions The research results are able to be transfered to the food processing facility, cosmetics and pharmaceuticals. 6.3. Impacts and benifits of research results + Educational and training efficiency This research was applied the modern equipements and methods: freeze-dried, grinding with liquid nitrogen, anion-exchange chromatography, gel filtration,... + Field of science and technology - The information from research results is valuable references resource for extraction process of R-phycoerythrin by different methods. - Increasing the research paper for University of Danang + Economic and social efficiency - R-PE from red seaweed could be used in food and cosmetic - Diversify products from red seaweed - The research results are able to be transfered to the food processing facility, cosmetics and pharmaceuticals. + University of Technology and Education, University of Danang - Increasing the research paper for University of Technology and Education, University of Danang. -The information from research results is valuable references resource for teaching theory as well as the practice of relevant modules in Food Technology. xiii TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI Rong biển chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng tốt cho cơ thể và giá trị dinh dƣỡng cao hơn. Rong biển là nguồn giàu khoáng chất cần thiết nhƣ magie, canxi, đồng, kali, selen, kẽm, iốt, sắt và chứa lƣợng rất thấp các chất béo. Rong biển cũng chứa nhiều chất chống oxy hóa, protein thực vật và hàm lƣợng chất xơ phong phú cần thiết cho cơ thể. Vitamin có trong rong biển là vitamin A, B, C, E và K. Rong biển cũng có chứa các axit béo omega-3 và tất cả các axit amin quan trọng cần thiết cho cơ thể con ngƣời. Ở Việt Nam, rong biển hiện nay chủ yếu khai thác từ nguồn lợi tự nhiên, sản lƣợng nuôi trồng không nhiều, chủ yếu tập trung vào nhóm rong đỏ chiết xuất agar, carrageenan nhƣ Gracilaria (Rhodophyta, Gigartinales), Kappaphycus alvarezzi (Rhodophyta, Gigartinales) và Kappaphycus striatum (Rhodophyta, Gigartinales). Gracilaria gracilis đã đƣợc nghiên cứu và báo cáo là nguồn nguyên liệu chứa nhiều hợp chất có giá trị với các ứng dụng nhƣ: polyme agar đƣợc sử dụng làm vật liệu mao quản và mẫu sinh học trong sản xuất hạt nano, sản xuất protein cho công nghiệp thực phẩm . R-phycoerythrin (R-PE) là phycobiliprotein chính trong rong biển đỏ. Cấu trúc tiểu đơn vị của R-PE phổ biến nhất là (αβ)6γ, khối lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da. R-PE hiện đang đƣợc sử dụng trong sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm nhƣ chất tạo màu tự nhiên. Nó cũng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một phần trong chuyển giao năng lƣợng huỳnh quang, trong miễn dịch học và lƣu lƣợng tế bào. R-PE có thể đƣợc chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp ngâm nguyên liệu trong dung môi hay chiết xuất bằng phƣơng pháp thủy phân nhờ các enzyme polysaccharides. Nghiên cứu chiết xuất R-PE từ rong biển đỏ Gracilaria gracilis là đề tài với mục đích nghiên cứu các phƣơng pháp chiết xuất R-PE nhằm nâng cao năng suất thu hồi R-PE đồng thời bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch chất màu này nhằm tăng giá trị sử dụng. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1. Rong biển đỏ Gracilaria 1.1.1. Giới thiệu chung Gracilaria là một trong những chi lớn của rong biển đỏ Rhodophyta, với hơn 150 loài đã đƣợc công bố (Byrne et al. 2002), có giá trị kinh tế quan trọng nhƣ nguồn cung cấp agar, nguồn thức ăn cho con ngƣời và các loài động vật giáp xác (Armisen 1995). Chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ, tuy nhiên các loài của chi này lại tồn tại nhiều màu sắc khác nhau bao gồm: đen, vàng, xanh và đỏ. Những loài rong biển này có thể thay đổi màu sắc phụ thuộc vào thành phần sắc tố của chúng, do chịu ảnh hƣởng từ nguồn ảnh sáng (Ramus et al. 1983), thời gian trong năm, vị trí địa lý (Paul et al. 2014), sự phối hợp giữa các loài rong biển có màu sắc khác nhau (Plastino et al. 1999) hay màu sắc của chúng bị biến tính (Marevita 2013). 1.1.2. Sự phân bố các loài Gracilaria Các loài rong biển đỏ Gracilaria hầu nhƣ phân bố trên toàn thế giới vì nó có khả năng chịu đƣợc sự biến đổi sinh thái lớn (Hình 1.8) (Perez et Barbaroux 2016). Chúng có thể đƣợc tìm thấy tại các vùng biển từ vĩ độ 600 bắc, 400 nam và vùng nƣớc lạnh (Kling 1978). Theo FAO, tổng thu hoạch các loài Gracilaria vào năm 2011 trên thế giới đạt khoảng 2.257.919 tấn, đạt 3.538.655 tấn vào năm 2014. Các loài Gracilaria thƣờng đƣợc nuôi trồng phổ biến tại Trung quốc (1.513.590 tấn) và Đài Loan (khoảng 4.865 tấn). Các loài này 94,2% (khoảng 697.240 tấn) đƣợc thu hoạch từ nuôi trồng, phần còn lại (42.224 tấn) từ nguồn tự nhiên. Các nƣớc nuôi trồng các loài Gracilaria hiện nay tại châu Mỹ nhƣ Chilê, Peru, Argentine, tại châu Á bao gồm Trung quốc, Đài loan, Indonesia, Vietnam, Philipin, Hàn quốc. 1.1.3. Thành phần hóa học Gracilaria có khoảng hơn 300 loài, trong đó 160 loài đã đƣợc định danh (Francavilla et al. 2013). Các loài này mang lại giá trị kinh tế quan trọng trong công nghiệp và công nghệ sinh học (Capo et 2 al. 1999). Qua các tài liệu tham khảo cho thấy, hàm lƣợng protein của các loài Gracilaria dao động từ 5,2% đến 45% tùy theo loài. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tƣợng là loài Gracilaria gracilis. Hàm lƣợng lipid của các loài Gracilaria thấp (nhỏ hơn 4%). Đây là lí do các loài tảo biển đƣợc sử dụng nhƣ thực phẩm năng lƣợng thấp (Chey et al. 2017). Ngoài ra, rong biển đỏ là nguồn khoáng cao. Hàm lƣợng tro từ 9 % - 43 %. Hàm lƣợng carbohydrate từ các loài này đạt hàm lƣợng cao (10,2% - 46,6 %). 1.2. R-Phycoerythrin R-phycoerythrin (R-PE) là một protein oligomaric có khối lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da, bao gồm 6 đơn vị α (20 kDa), 6 đơn vị β (20 kDa) và 1 đơn vị γ (khoảng 30 kDa). Quang phổ hấp thụ R-PE thể hiện ở ba đỉnh, đỉnh cao nhất là 565 nm (Munier et al. 2015). R-phycoerythrin mang màu hồng tím và là một chất màu quan trọng trong công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm, chẩn đoán miễn dịch, trị liệu, mỹ phẩm, đánh dấu tế bào trong quá trình phân tích (Dumay et al. 2014). Do đặc tính quang học của nó, phycoerythrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật sinh hóa và chẩn đoán lâm sàng . Gần đây, khả năng chống ung thƣ của R-PE và ba tiểu đơn vị α, β, γ đã đƣợc tìm thấy khi thử nghiệm trên mô hình tế bào (các tế bào khối u của chuột, các tế bào ung thƣ biểu mô gan của ngƣời). R-PE có tác dụng làm tắc các mạch máu của khối u với sự cảm ứng của tế bào chết đƣợc lập trình dƣờng nhƣ là cơ chế chủ yếu của các tiểu đơn vị R-PE (Denis et al. 2009). R-Phycoerythrin mang hai loại phycobilins (phycoerythrobilin và phycourobilin). Theo các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng: R-PE có thể mang các cấu trúc khác nhau tùy thuộc vào loại rong biển: (αβ)3 γ (αβ) 3γ'(260 kDa) (Glazer 1994 ; Munier et al. 2015) và γ (αβ) 3 γ'(αβ) 3 γ (Wang et al. 2015). 3 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Rong biển đỏ Gracilaria gracilis Rong biển đƣợc thu hoạch từ vùng biển Batz-sur-Mer, Pháp. Rong biển Gracilaria gracilis đƣợc xử lý và bảo quản, cấp đông (- 20OC). 2.1.1. R-phycoerythrin R-phycoerythrin sau khi đƣợc nghiên cứu và chiết xuất từ rong biển Gracilaria gracilis sẽ đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion. 2.2. Quy trính chiết xuất R-phycoerythrin 2.2.1. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin bằng phương pháp ngâm chiết rút Nguyên liệu đƣợc ngâm cùng dung môi ở 4oC, không ánh sáng. Dịch chiết thô sẽ đƣợc thu nhận sau khi tiến hành ly tâm. 2.2.2. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin bằng phương pháp thủy phân enzyme Nguyên liệu đƣợc cho vào bộ phản ứng cùng đệm acetat 50 mM, pH 6. Tiếp đó, enzyme đƣợc bổ sung vào, khuấy đều với tốc độ khuấy 150 rpm, trong thời gian 6 giờ, 35°C (Dumay et al. 2013). Dịch chiết thô sẽ đƣợc thu nhận sau khi tiến hành ly tâm. 2.3. Tinh sạch R-phycoerythrin 2.3.1. Tinh sạch R-phycoerythrin bằng sắc ký trao đổi ion Dịch chiết thô đƣợc nạp vào cột trao đổi ion âm DEAE- Sepharose Fast Flow (26 mm x 100 mm) và đƣợc rửa giải gradient. Các cƣờng độ ion khác nhau đƣợc nghiên cứu bao gồm: 0 - 150, 150 - 200 và 200 - 1000 mM; 0 - 150, 150 - 250 và 250 - 1000 mM và 0 - 150, 150 - 300 và 300 - 1000 mM. 2.3.2. Phương pháp điện di Dung dịch thu nhận sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE đƣợc tiếp tục phân tích bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 4 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp hóa sinh 2.4.1.1. Xác định chất lƣợng R-phycoerythrin - Hàm lƣợng R-phycoerythrin [R-PE] (mg/ml) = [(A565-A592) - (A455-A592) × 0.20] × 0.12 - Chỉ số độ tinh khiết của R-phycoerythrin (Galland-Irmouli et al. 2000): PI= A565/A280 (PI standard = 3,2) 2.4.1.2. Xác định protein hòa tan Protein hòa tan đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford (Bradford 1976). 2.4.1.3. Xác định đƣờng hòa tan Hàm lƣợng đƣờng hòa tan đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Dubois (Dubois et al. 1965). 2.4.2. Phương pháp toán học Thiết kế ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế ma trận phức hợp trung tâm (central composite design, CCD) (Homayoonfal et al. 2015). Theo phƣơng pháp này, 19 thí nghiệm đƣợc thực hiện bao gồm 8 thí nghiệm nhân tố, 5 thí nghiệm tại tâm và 6 thí nghiệm xung quanh trục. Phần mềm Statgraphics Plus v.5 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này. Ngoài ra, phần mềm Minitab 16 phân tích phƣơng sai ANOVA (p<0,05) đƣợc sử dụng để thực hiện các tính toán thống kê trong các thí nghiệm nghiên cứu. 5 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nghiên cứu quy trính chiết xuất chất màu R-phycoerythrin 3.1.1. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phương pháp ngâm 3.1.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi Nguyên liệu đƣợc sử dụng là rong biển Gracilaria gracilis sấy thăng hoa và nghiền mịn bằng nitơ lỏng. Dung môi đƣợc sử dụng cho quá trình ngâm, chiết rút là nƣớc. Các tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi đƣợc khảo sát bao gồm: 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40 (m/V). Bảng 3.1. Hàm lƣợng R-PE và chỉ số độ tinh khiết PI tại các tỷ lệ giữa nguyên liệu/dung môi nƣớc đƣợc khảo sát Tỷ lệ (m/V) Hàm lƣợng R-PE (mg/g CK) PI 1/5 nd nd 1/10 2,49±0,02* 0,14±0,01 1/20 3,20±0,05 0,12±0,01 1/30 3,26±0,03 0,12±0,01 1/40 3,35±0,07 0,14±0,01 Chú thích: nd = no data (không thu đƣợc dữ liệu) *: kết quả có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P<0,05 Năng suất chiết R-PE đạt giá trị cao khi thực hiện chiết xuất theo các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20, 1/30 và 1/40. Tuy nhiên, kết quả thu đƣợc giữa các mẫu này không có sự khác biệt đáng kể.Trong nghiên cứu này, kết quả của mẫu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nƣớc 1/20 (m/V) đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết xuất Từ các tài liệu tham khảo (Denis et al 2009, Fleurence 2013, Munier et al. 2013) chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết xuất đến quá trình ngâm, chiết rút R-PE tại các thời điểm: 20 phút, 360 phút (6h) và 960 phút (16h). Bảng 3.2. Chất lƣợng R-PE tại các thời điểm đƣợc khảo sát Thời gian (phút) Hàm lƣợng R-PE (mg/g CK) PI 20 3,21 ± 0,03 0,11 ± 0,02 360 3,13 ± 0,07 0,10 ± 0,01 960 2,67 ± 0,02* 0,07 ± 0,01 Chú thích: *: kết quả có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P<0,05 6 Hàm lƣợng R-PE giảm dần khi thời gian chiết xuất tăng, đặc biệt kết quả có sự sai khác đáng kể khi thực hiện quy trình chiết xuất kéo dài 960 phút. Kết quả thu đƣợc đạt giá tốt khi tiến hành chiết xuất tại thời gian 20 phút, nồng độ R-PE đạt 3,21 ± 0,03 mg/g CK. 3.1.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của quá trình tiền xử lý nguyên liệu và dung môi chiết xuất đến quá trình chiết xuất R-PE. Qúa trình tiến xử lý rong biển Gracilaria gracilis nhƣ sau: + Rong tƣơi: rong biển lạnh đông đƣợc tan giá và làm nhỏ (< 1cm). + Rong sấy: rong biển lạnh đông đƣợc sấy thăng hoa, sau đó đƣợc nghiền nhỏ bằng nitơ lỏng. Các dung môi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: nƣớc, nƣớc cất và đệm phosphat pH 7,1, 20 mM (Denis et al. 2009) . Bảng 3.3. Hàm lƣợng R-PE, PI, protein hòa tan của Gracilaria gracilis sau khi đƣợc chiết xuất từ các dung môi khác nhau Rong R-PE Protein Dung môi chiết PI biển (mg/g CK) (mg/g CK) Nƣớc 1,20 ± 0,01* 0,02 ± 0,00 4,33 ± 0,18 Rong * * tƣơi Nƣớc cất 1,65 ± 0,01 0,04 ± 0,00 4,86 ± 0,06 Đệm phosphate 1,33 ± 0,00* 0,02 ± 0,00 4,51 ± 0,13 Nƣớc 3,21 ± 0,08 0,11 ± 0,01 7,75 ± 0,20 Rong Nƣớc cất 3,15 ± 0,07 0,10 ± 0,01 7,25 ± 0,31 sấy Đệm phosphate 3,54 ± 0,09* 0,12 ± 0,01 8,12 ± 0,30* Chú thích: Sự sai khác có ý nghĩa giữa các kết quả với p<5% đƣợc ký hiệu bằng dấu * giữa mẫu rong tƣơi và rong sấy. Khi chiết xuất bằng bất kỳ dung môi nào thì hàm lƣợng R-PE và protein hòa tan thu đƣợc từ mẫu rong sấy đều cho kết quả cao. Hàm lƣợng R-PE và protein hòa tan đạt giá trị trung bình tƣơng ứng 3,27 mg/g CK và 7,71 mg/g CK. Kết quả thu đƣợc cao nhất khi chiết xuất mẫu rong sấy thăng hoa và nghiền nitơ lỏng bằng dung dịch đệm 7 phosphate 20 mM, pH 7,1. Hàm lƣợng R-PE đạt 3,54 ± 0,09 mg/g CK và protein hòa tan thu nhận đƣợc 8,12 ± 0,30 mg/g CK. 3.1.2. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phương pháp thủy phân Quy trình chiết xuất bằng phƣơng pháp thủy phân enzym đƣợc sử dụng để nghiên cứu hai mẫu: rong tƣơi và rong sấy. Sau 6 giờ thủy phân, tiến hành ly tâm mẫu và thu dịch chiết thô.. Mẫu đối chứng không bổ sung enzym (mẫu control) tiến hành song song. 40 20 Control Enzyme PE Control Enzyme - R rotein 30 15 g) g) / 20 g/ 10 (m (mg 10 5 Hàm lƣợng lƣợng Hàm Hàm lƣợng P lƣợng Hàm 0 0 A Ce Xy Glu Ce Xy Glu B Ce Xy Glu Ce Xy Glu Hình 3.1. Hàm lƣợng protein (A), R-PE (B) từ Gracilaria gracilis Hàm lƣợng protein đƣợc chiết xuất từ rong sấy cho năng suất cao Rong tƣơi Rong sấy Rong hơn so với các thí nghiệm đƣợc thực hiện cùng điềuRong ki tƣơiện nhƣng sử sấy dụng nguyên liệu tảo tƣơi. Kết quả thu đƣợc đạt tốt nhất khi thủy phân bằng enzyme cellulase đối với rong sấy (27,53 mg/g CK).Tƣơng tự với kết quả xác đinh R-PE, tất cả các thí nghiệm thủy phân đều cho thấy giá trị R-PE của rong sấy cao hơn đáng kể so với Wet algae Dry algae rong tƣơi. Hơn thế nữa, đối với mẫu tảo sấy, hàm lƣợng R-PE thu khi thủy phân bằng cellulase (12,76 mg/g CK) tốt hơn so với xử lý bằng xylanase (7,92 mg/g CK) hoặc β-glucanase (9,44 mg/g CK). Nghiên cứu này cho thấy quá trình thủy phân bằng enzyme rõ ràng rất phù hợp để làm suy thoái và phá vỡ thành tế bào của Gracilaria gracilis và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất protein cũng nhƣ R-phycoerythrin. 3.1.3. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Sau khi nghiên cứu phƣơng pháp thủy phân, các điều kiện chiết xuất R-PE từ tảo Gracilaria gracilis đƣợc tối ƣu hóa bằng 8 phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM). Bố trí ma trận nhƣ bảng 3.4, chúng tôi thu kết quả nhƣ hình 3.5. Bảng 3.4. Ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế phức hợp trung tâm CCD (n=3). Điều kiện thủy phân STT E/S (No) t (oC) T (phút) (mg/g CK) 1 20,0 40,0 360,0 2 20,0 20,0 360,0 3 35,0 30,0 240,0 4 60,0 30,0 240,0 5 50,0 40,0 120,0 6 50,0 20,0 120,0 7 50,0 40,0 360,0 8 35,0 46,82 240,0 9 35,0 30,0 240,0 10 35,0 30,0 38,19 11 50,0 20,0 360,0 12 35,0 13,18 240,0 13 35,0 30,0 240,0 14 35,0 30,0 240,0 15 20,0 40,0 120,0 16 35,0 30,0 240,0 17 35,0 30,0 441,82 18 20,0 20,0 120,0 19 10,0 30,0 240,0 Phân tích các