Đồ án Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp

Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, trường Đại Học Công Nghệ TPHCM, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá, là bước đầu tiên cho em bước vào sự nghiệp sau này trong tương lai. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô TS. Nguyễn Thị Hai người đã hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, động viên và tận tình quan tâm em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Bên cạnh đó em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, người đã tạo điều kiện tốt nhất về máy móc, trang thiết bị, hóa chất cho em trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn đến các bạn những người đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ những kiến thức vô cùng bổ ích cho tôi để tôi có thể hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp ý của quý Thầy, Cô để kiến thức của em ngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập và làm việc sau này. Và lời nói cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, anh chị và những người thân trong gia đình đã luôn sát cánh, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt quá trình học tập cũng như là hành trang trong tương lai. Kính chúc quý Thầy, Cô và mọi người luôn vui vẻ, hạnh phúc, dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Trần Quang Huy b Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. a 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 3 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật ............................................................. 3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật ................................................ 3 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật ........................................................... 3 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật ............................................................... 5 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật ........ 6 1.1.4.1 Về hình thái ......................................................................................... 6 1.1.4.2 Về cấu tạo ............................................................................................ 7 1.1.4.3 Hình thức sinh sản ............................................................................... 9 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ........................................................ 9 1.2.1 Phân loại ................................................................................................. 9 1.2.2 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 10 1.2.3 Đặc điểm sinh học ................................................................................. 11 1.2.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ............................. 11 1.2.5 Tình hình gây hại của tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số loại cây trồng ............................................................................................................. 12 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây lúa ......................... 12 1.2.5.2 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà rốt ..................... 13 1.2.5.3 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây tiêu ........................ 13 1.2.5.4 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua.................. 13 1.3 Một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng thực vật ................................. 14 1.3.1 Chọn giống ............................................................................................ 14 1.3.2 Ngăn ngừa ............................................................................................. 14 1.3.3 Luân canh ............................................................................................. 14 1.3.4 Biện pháp canh tác ............................................................................... 15 1.3.5 Biện pháp hóa học ................................................................................ 15 1.3.6 Biện pháp vật lý .................................................................................... 15 1.3.7 Biện pháp sinh học ................................................................................ 16 1.4 Giới thiệu về nấm kí sinh Paecilomyces sp. ............................................. 16 1.4.1 Vị trí phân loại và phân bố của nấm Paecilomyces sp. ........................ 16 1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Paecilomyces sp. ..................... 17 1.4.3 Độc tố của nấm Paecilomyces sp. ........................................................ 18 1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ... ............................................................................................................... 19 1.4.4.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng ........................................................... 19 1.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng .................................... 19 1.4.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường.......................................................... 20 1.4.4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí ........................................................... 20 1.4.5 Cơ chế tác động của chủng nấm Paecilomyces sp. lên tuyến trùng .... 20 ii Đồ án tốt nghiệp 1.4.6 Một số sản phẩm trị tuyến trùng của nấm Paecilomyces sp. vào thực tiễn đời sống ....................................................................................................... 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 24 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 24 2.2 Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ................................................. 24 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 24 2.2.2 Thiết bị .................................................................................................. 24 2.2.3 Hóa chất ................................................................................................ 25 2.3 Các môi trƣờng đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính, nuôi cấy ............ 25 2.3.1 Môi trường PDA (Potato D - Glucose Agar) ...................................... 25 2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 - 2001) .......................... 25 2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất ................................................ 26 2.3.4 Môi trường cảm ứng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase: ............................................................................................................ 26 2.3.5 Môi trường Czapeck - Dox ................................................................... 26 2.3.6 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) ............................. 27 2.3.7 Môi trường WA khảo sát khả năng kí sinh tuyến trùng trên đĩa petri .. 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 27 2.4.1 Phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy để quan sát của J.T.Dunean .... 27 2.4.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. ....................................................................................................... 28 2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces sp. .................................................................................................... ............................................................................................................... 28 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.1 Xác định khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải ............................................................................................ 28 2.4.3.2 Xác định khả năng tổng hợp enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải .................................................................................................... 29 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cảm ứng sinh enzyme chitinase ................................................................................................. 29 2.4.5 Xác định hoạt độ enzyme chitinase bằng phương pháp DNS ............... 29 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .................................................................................. 32 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ........................................................................................................... 32 2.4.6.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường khác nhau ............................................................................................ 33 2.4.7 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .................................................................................. 34 2.4.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) ............................................................................................................... 35 2.4.9 Đánh giá khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. trên đĩa petri ................................................................................................ 35 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 36 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của chủng Paecilomyces sp. phân lập được . 36 3.2 Tốc độ tăng trưởng của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy ....... 37 3.3 Khả năng sinh enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch ........................................................................................................... 38 3.4 Hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. .. 39 iv Đồ án tốt nghiệp 3.5 Khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch. .......................................................................................................... 40 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ..................................................................................................................... 42 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .................................................................................................... 44 3.8 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đối với nấm Paecilomyces sp. .................................................................................................... 47 3.9 Khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. của chủng nấm Paecilomyces sp. đã chọn .............................................................................. 49 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 52 4.1 Kết luận ...................................................................................................... 52 4.2 Kiến nghị .................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 53 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PDA: Potato D – Glucose Agar TCA: Trichloacetic Acid WA: Water Agar vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số hình dạng của tuyến trùng thực vật ................................................. 7 Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật ................................................................. 8 Hình 1.3 Con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. ...................................... 10 Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ ............................................................... 12 Hình 1.5 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Paecilomyces sp .............................. 18 Hình 1.6 Sản phẩm Bio- Nematon có khả năng phòng trừ tuyến trùng .................. 21 Hình 1.7 Chế phẩm TKS – NEMA trị tuyến trùng ................................................. 22 Hình 1.8 Chế phẩm sinh học BIO PEST phòng trừ tuyến trùng ............................. 22 Hình 1.9 Chế phẩm sinh học Palila 500 WP ........................................................... 23 Hình 2.1 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. dưới kính hiển vi soi nổi 40X ...... 24 Hình 2.2 Phản ứng hóa học thuốc thử DNS ........................................................... 30 Hình 2.3 Xác định hoạt tính enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomyces sp ... 32 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces sp. phân lập được ................. 36 Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy .................................................................................................................................. 37 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy ................................................................................................ 39 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy ................................................................................................ 41 Hình 3.5 Nấm Paecilomyces sp. phát triển ở các pH 5, 6, 7, 8 sau 14 ngày ........... 43 Hình 3.6 Nấm Paecilomyces sp. phát triển trên các môi trường khác nhau sau 14 ngày .......................................................................................................................... 46 Hình 3.7 Nấm Paecilomyces sp. bị ức chế khi xử lý các loại thuốc sau 15 ngày .................................................................................................................................. 48 Hình 3.8 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi .................................................................................. 50 Hình 3.9 Túi trứng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi ......................................................................... 51 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 2.1 Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine .......................................... 30 Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA qua các ngày sau cấy ...................................................................................................................... 37 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. ...... 38 Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp ....................................................................................................... 40 Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. ..... 40 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ............................................................................................................. 42 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nám Paecilomyces sp. qua các ngày ........................................................................ 44 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của 5 loại thuốc đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua 10 NSC, 15 NSC ................................................................... 47 Bảng 3.8 Hiệu lực kí sinh con cái và trứng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp ....................................................................................................... 49 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ....................................................................................................... 42 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ................................................................................ 44 viii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tuyến trùng thực vật là nhóm sinh vật gây hại rất nguy hiểm cho các loại cây trồng. Hàng năm chúng làm giảm 10 – 20% năng suất cây trồng trên thế giới. Powell (1984) cho biết: chỉ tính riêng tuyến trùng sần rễ gây hại trên cây thuốc lá năm 1982 vùng Bắc Carolina đã làm giảm 0,77% sản lượng, gây thiệt hại 8 ngàn 932 USD. Ở Việt Nam mức độ gây hại của tuyến trùng đã ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Các loại bệnh do tuyến trùng gây ra và lây lan trong môi trường đất gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng của cây và ảnh hưởng đến giá trị của sản phẩm. Chúng gây hại cho nhiều loại cây trồng như cà rốt, khoai tây, bầu bí, chanh, hành, cà chua, tiêu, cà phê, các loại cây cảnh, cây dược liệu. Tuyến trùng gây hại trên các bộ phận khác nhau của thực vật có thể là thân, lá hoặc rễ do chúng có kích thước hiển vi, khả năng di chuyển cao. Tuyến trùng có phổ kí chủ rộng nhất được biết đến cho đến nay là Meloidogyne, chúng gây ra tổn thất kinh tế lớn cho các cây trồng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bên cạnh đó, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hay thuốc hóa học diệt tuyến trùng ngày càng nhiều không những làm tăng tính kháng thuốc, mà còn tiêu diệt hệ thiên địch, gây ra những dịch hại mới, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Từ thực tế đó, các biện pháp quản lý dịch hại theo hướng sinh học ngày càng được phát triển. Trong những năm gần đây, một loạt các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh côn trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng gây hại mang lại hiệu quả cao (Burges H.D.,1998; Butt T.M and Copping L.,2000). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này vẫn còn khá hạn chế. 1 Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài : “Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp.”. 2. Mục đích nghiên cứu Chọn ra được chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Paecilomyces sp. thu nhận được. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện in vitro. Đánh giá khả năng gây chết tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp. 2 Đồ án tốt nghiệp 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật đã được tìm thấy từ giữa thế kỷ 18. Lần đầu tiên Needham (1743) đã phát hiện ra tuyến trùng thực vật trên bông lúa mì, khi quan sát những hạt lúa mì bị dị tật, teo lại ông đã phát hiện ra hàng loạt các động vật dạng sợi di chuyển xoắn vặn trong nước, mà ông cho rằng chúng là những động vật nước và chúng có thể được gọi là giun hoặc lươn giống như những con lươn giấm được quan sát khoảng 90 năm trước đó. Đến năm 1945, những công bố của ông đã giúp con người biết đến tuyến trùng như là một loài động vật đa dạng nhất trên hành tinh. Từ những năm 1960 tại Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới, tuyến trùng học nói chung và tuyến trùng thực vật nói riêng đã trở thành môn khoa học nghiên cứu các quy luật sinh thái học, phát triển của tuyến trùng, nhất là các loài tuyến trùng ký sinh thực vật. Sự đa đạng về chủng loài, số lượng cá thể cũng như đặc điểm môi trường sống đã góp phần phong phú thêm cho ngành tuyến trùng học trên thế giới. Ở Việt Nam công trình nghiên cứu đầu tiên về tuyến trùng thực vật do nhà khoa học người Hungary – Tiến Sỹ Andrassy công bố năm 1970 về hơn 30 loài tuyến trùng ký sinh thực vật và tuyến trùng sống tự do trong đất quanh rễ cây trồng thuộc hai bộ Tylenchida và Dorylaimida. Mặc dù nghiên cứu tuyến trùng chỉ mới bắt đầu từ những năm 1970 trở lại đây nhưng đã khẳng định được vai trò to lớn của tuyến trùng về cả phương diện tuyến trùng gây hại (tuyến trùng thực vật) và có lợi (tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng, tuyến trùng sống tự do trong đất, nước) trong nông nghiệp và sinh thái môi trường ở nước ta. 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác như: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, tạo ra các vết thương bề mặt và bên trong thân, rễ 3 Đồ án tốt nghiệp thực vật, kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trải qua quá trình tiến hóa tuyến trùng đã thích nghi và có mặt trong hầu hết các bộ phận của thực vật như: rễ, thân, lá, hoa, quả, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác xâm nhập vào các mô sâu hơn, một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, khả năng quang hợp bị biến đổi hoặc bị phá hủy, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện do quá trình di chuyển, châm chích và hút dinh dưỡng trên cơ thể thực vật. Ngoài tác hại trực tiếp như trên, tuyến trùng còn tạo điều kiện, liên kết, hoặc tương hỗ với các tác nhân gây bệnh khác như nấm, vi khuẩn và virus, gây nên các bệnh khác nhau cho thực vật. Người ta thấy rằng khi cây bị tuyến trùng xâm nhiễm thì dễ dàng bị héo Fusarium hơn so với cây không bị tuyến trùng xâm nhiễm (Roberts và cộng sự, 1985; Porter và Powell, 1967). Ảnh hưởng của tuyến trùng bướu rễ lên mức độ bệnh thối rễ do tác nhân gây bệnh như Phytophthora parasitica (Powell và Nusbaum, 1960), Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia solani (Brodie và Cooper, 1964) và Thielaviopsis basicola (Fichter và cộng sự, 2005) thì thấy rằng khi có sự hiện diện của tuyến trùng M. incognita làm gia tăng mức độ mẫn cảm của cây trồng với tất cả các nấm gây bệnh này.  Quá trình gây bệnh bên trong rễ của tuyến trùng trải qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1: Khi tuyến trùng mới bắt đầu xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, rễ vẫn còn màu sáng, chức năng của rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều.  Giai đoạn 2: Rễ chuyển sang màu nâu, chức năng dinh dưỡng và vận chuyển nước của rễ đã bị ảnh hưởng, xảy ra quá trình hoại sinh, tạo điều kiện cho nấm, vi khuẩn xâm nhập và có thể gây thêm các bệnh khác cho cây.  Giai đoạn 3: Rễ chuyển thành màu đen, chức năng của rễ bị phá hủy hoàn toàn. 4 Đồ án tốt nghiệp Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây vàng lá, còi cọc mà còn ở những cây còn xanh tốt do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, chức năng của rễ chưa bị hủy hoại (Nguyễn Ngọc Châu và 14 ctv., 1990) Tuyến trùng thực vật có mặt ở khắp nơi trên các tầng đất canh tác đối với các loại cây hoa màu, trong vườn ươm và trên đồng ruộng. Mật độ tuyến trùng cao ở độ sau từ 6 – 15 cm, nhiệt độ thích hợp cho tuyến trùng phát triển là ở 25 – 280C, ẩm độ khoảng 60%, trong điều kiện khô hạn hoặc ngập nước lâu dài tuyến trùng kém phát triển. Ngoài ra các yếu tố như địa hình, tác nhân sinh học hay các hoạt động của con người cũng ảnh hưởng đến cấu trúc quần xã tuyến trùng. 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật Theo động vật chí Việt Nam, dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ khác nhau:  Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật, là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng ngành sản xuất nông nghiệp.  Bộ Aphelenchida: gồm khoảng 500 loài, các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa, hạt.  Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus.  Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể chia làm 3 nhóm: + Ngoại ký sinh: sử dụng kim chích để lấy dinh dưỡng còn cơ thể nằm ngoài mô thực vật, không xâm nhập vào bên trong. + Bán nội ký sinh: chỉ phần trước cơ thể tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài rễ, phình to ra. 5 Đồ án tốt nghiệp + Nội ký sinh: đã xác định 17 loài ký sinh gây bệnh tổn thương rễ (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 2000), toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nhóm này được chia 2 nhóm nhỏ:  Nội ký sinh di động: tuyến trùng di chuyển từ mô này đến mô khác bên trong để châm chích, hút dinh dưỡng, tạo thành các khối u sưng, điển hình là giống Meloidogyne spp.  Nội ký sinh cố định: không có khả năng di chuyển, chúng dinh dưỡng tại một nơi cố định bên trong mô rễ và trở nên phình to (con cái). 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật 1.1.4.1 Về hình thái Tuyến trùng thực vật có kích thước thân nhỏ, dạng giun, dài 0,2 – 2,5 mm, nhỏ nhất là loài Greeffiella minutum, cơ thể dài 82 µm, nhưng đa số nhỏ hơn 2 mm. Hình dáng của chúng rất đa dạng và có liên quan chặt chẽ với đặc tính sinh sống của cây. Ví dụ như loài Tylenchulus (hình quả lê), Helicotylenchus (dạng giun/xoắn), Pratylenchus (dạng giun), Heterodera (hình quả chanh), Hirschmanniella (hình giun/dài), Meloidogyne (hình cầu/bầu). Các loài tuyến trùng sống trên lá có hình sợi chỉ nằm trong các gian bào của tế bào thực vật. Loại phá hủy mô tế bào thì có dạng là hình trụ, hình thoi sống ở trong rễ hoặc trong đất 6 Đồ án tốt nghiệp Tylenchulus (hình quả lê) Meloidogyne (hình cầu/bầu) (Nguồn: plpnemweb.ucdavis.edu) Pratylenchus (hình giun) Heterodera (hình quả chanh) (Nguồn: nematode.unl.edu) (Nguồn:pest.ceris.purdue.edu) Hình 1.1 Một số hình dạng tuyến trùng thực vật 1.1.4.2 Về cấu tạo Theo Eoshenko và Nguyễn Vũ Thanh (1981) cơ thể tuyến trùng được chia làm 3 phần:  Phần đầu: còn gọi là vùng môi, gồm đầu và chính giữa có miệng chích hút, xung quanh là các cơ quan xúc giác. Hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt.  Phần giữa: từ eo thắt ở phần đầu đến lỗ hậu môn con cái hoặc đến huyệt sinh dục ở con đực.  Phần đuôi: bắt đầu từ hậu môn. Hình dáng của đuôi là một đặc điểm quan trọng để phân loại tuyến trùng. Có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. 7 Đồ án tốt nghiệp Bao bọc toàn bộ cơ thể tuyến trùng là lớp vỏ cutin tương đối bền vững và có thể co giãn, trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, sinh dục, bài tiết, một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Hệ thống thần kinh trung ương cũng liên quan rất chặt chẽ với vách thân. Hệ thần kinh của tuyến trùng gồm các bó thần kinh chạy dọc dưới da và được các vòng dây thần kinh nối liền với nhau. Bộ máy tiêu hóa của tuyến trùng thực vật gồm ống ruột, bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn nằm về phía bụng. Hệ sinh sản của con cái và đực rất khác nhau:  Con cái: gồm có buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung, lỗ giao phối ở giữa thân.  Con đực: gồm tinh hoàn duy nhất, ống dẫn tinh và gai giao phối ở ruột dưới. Ở một số loài, con đực có vây đuôi giúp cho quá trình giao phối. Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật (Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com) 8 Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Hình thức sinh sản Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu. Tỷ lệ đực cái phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ ...10C trong 15 phút. Cho môi trường vào các đĩa petri vô trùng khoảng 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm (PDA) rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng chitin, ủ ở nhiệt độ phòng và khảo sát trong 1, 2, 3, 4 ngày liên tục. Đĩa khảo sát cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch, tiến hành đo lần lượt đường kính vòng phân giải và đường kính nấm qua các ngày. 28 Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.2 Xác định khả năng tổng hợp enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1% , nấm sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng cho vào mỗi đĩa khoảng 2/3 môi trường. Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng casein, ủ ở nhiệt độ phòng và khảo sát trong 4 ngày liên tiếp. Đĩa khảo sát cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. Đánh giá khả năng tạo enzyme như mục trên qua các ngày. 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cảm ứng sinh enzyme chitinase Phối vào mỗi erlen 50 ml môi trường cảm ứng như mục 3.3.4, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội khoảng 300C. Đĩa PDA nuôi cấy Paecilomyces sp. 7 ngày, ta cho 20 ml nước muối sinh lý vô trùng vào rồi lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối trên bề mặt thạch. Sau đó dùng micropipet hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa môi trường đã hấp sao cho mật độ bào tử đạt 106/ml. Tiến hành ủ trên máy lắc với 150 vòng/phút. Sau khi nuôi cấy trong điều kiện 3 hoặc 5 ngày. Ta tiến hành lọc môi trường bằng cách li tâm 4000 vòng/10 phút, thu dịch nổi và đem xác định hoạt tính chitinase. 2.4.5 Xác định hoạt độ enzyme chitinase bằng phương pháp DNS Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử Dinitrosalicylic acid (DNS). Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở 29 Đồ án tốt nghiệp bước sóng 535 nm. Dựa vào biểu đồ đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid: Hình 2.2 Phản ứng hóa học thuốc thử DNS Thực hiện: Bảng 2.1 Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine: Đối Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 chứng N-acetyl-D- glucosamine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 10 mg/ml (ml) Nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 (ml) Nồng độ N- acetyl-D- 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 glucosamine (mg/ml) OD540nm - Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 10 ống nghiệm đã được rửa và làm khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS. - Đun sôi các ống test 10 phút (có đậy nắp hay nút bông không thấm nước). 30 Đồ án tốt nghiệp - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm. Đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng. - Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vễ đường chuẩn glucose với trục hoành là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD). Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y = ax + b và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.  Xác định hoạt độ enzyme chitinase: Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng N-acetyl-D-glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lượng N- acetyl-D-glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan. Thực hiện: Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khô. Ống phản ứng: - Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp được ủ ở 300C trong 60 phút. - Ngưng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút. - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi - Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng. - Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535 nm. Ống không phản ứng: - Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin vào rồi làm tương tự như cách bước của ống phản ứng. 31 Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 2.3 Xác định hoạt tính enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomyces sp.; (A: dựng đường chuẩn Glucosamine; B: dịch enzyme thu được sau 3 ngày nuôi cấy; C: định lượng enzyme chitinase) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần thiết thủy phân 1 µmol cơ chất là chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định. Đơn vị hoạt tính = (UI/ml) Trong đó: a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn. n: hệ số pha loãng. v: thể tích hỗn hợp phản ứng. t: thời gian phản ứng (phút). V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml) 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Sự thay đổi pH môi trường ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định, làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào, làm giảm mật độ sinh bào tử. Vì vậy, xác định pH tối ưu cho nấm Paecilomyces sp. phát triển là điều cần thiết. Do đó, thí nghiệm được tiến hành theo 4 công thức tương ứng với 4 mức pH khác nhau: 32 Đồ án tốt nghiệp  Công thức 1: pH 5  Công thức 2: pH 6  Công thức 3: pH 7  Công thức 4: pH 8 Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa trên môi trường PDA. Điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy nấm bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M hoặc NaOH nồng độ 0,1 M vào môi trường. Sử dụng pH kế để xác định và điều chỉnh độ pH của môi trường ứng với các công thức thí nghiệm, sau đó đặt môi trường đã chuẩn pH vào nồi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút rồi tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5 mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C. Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo công thức: d = Trong đó: d1, d2 là độ dài hai đường trục vuông góc phần khuẩn lạc phân bố trên đĩa petri. Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày sau khi cấy. Xác định xem nấm phát triển trên môi trường pH nào là tốt nhất. 2.4.6.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường khác nhau Thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy nấm thích hợp được bố trí với 4 công thức tương ứng với 4 loại môi trường đang được dùng phổ biến:  Công thức 1: Môi trường SABOURAUD  Công thức 2: Môi trường PDA  Công thức 3: Môi trường MALT - AGAR  Công thức 4: Môi trường CZAPEK-DOX Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc là 1 đĩa petri. 33 Đồ án tốt nghiệp Môi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như trên. Sau đó so sánh và nhận xét ở môi trường nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt nhất. 2.4.7 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Rachappa, (2006) và Amutha et al. (2010). Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại tương ứng với 3 đĩa petri. Các nghiệm thức gồm 5 loại thuốc trừ nấm được tính toán pha theo đúng tỉ lệ trên môi trường PDA: Hexaconazole (Saizole 5SC), Carbendazim (Carbenzim 500FL), Mancozeb (Dipomate 80WP), propineb (Antracol Zinc++), Nano đồng (Cup 2.9SL), pha theo đúng nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không bổ sung thuốc. Các chỉ tiêu theo dõi: Đường kính khuẩn lạc (cm) và tính phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo công thức: U = [(Đ-X)]/Đ]*100 Trong đó: U: % khuẩn lạc bị ức chế. Đ: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989):  Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )  Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)  Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)  Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%) 34 Đồ án tốt nghiệp 2.4.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây tiêu thu ở tỉnh Đăk Lăk. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thắm khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 0,6 – 0,7 mm, rộng 0,4 – 0,5 mm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái. 2.4.9 Đánh giá khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. trên đĩa petri Chuẩn bị môi trường WA có bổ sung 0,1 g/l chloramphenicol, hấp khử trùng rồi phân phối đều ra các đĩa petri vô trùng. Cấy nấm vào giữa đĩa petri môi trường, dung kim gấp đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách tâm đĩa 1 cm, sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi sự xâm nhập của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày cấy nấm (Khan và cộng sự, 2009). 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphic và Exel để xử lý số liệu. Hiệu lực phòng trừ của nấm Paecilomyces sp. được tính theo công thức Abbot (1925): M (%) = x 100 Trong đó: X là số tuyến trùng sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm. Y là số tuyến trùng sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm. 35 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của chủng Paecilomyces sp. phân lập đƣợc  Đặc điểm đại thể: Tản nấm có hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Ban đầu sợi tơ nấm có màu trắng, mềm, mịn. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu hồng nhạt và chuyển sang màu tím ở 14 ngày nuôi cấy.  Đặc điểm vi thể: Khi quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy cuốn bào tử dài, cong mọc phân nhánh từ các sợi nấm, các thể bình có dạng hình chai nước ở gốc phồng to, ở cổ thì nhỏ dần và mộc vương thẳng. Các bào tử hình oval không màu, dài khoảng 1,5 – 2,5 µm, mọc thưa thớt trên các thể bình liên kết với nhau thành chuỗi dài, hay bị đứt đoạn. Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces sp. phân lập được 36 Đồ án tốt nghiệp 3.2 Tốc độ tăng trƣởng của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA qua các ngày sau cấy Ngày theo dõi Đƣờng kính tản nấm (cm) 2 NSC 1,29 ± 0,01 4 NSC 2,40 ± 0,03 6 NSC 3,27 ± 0,08 8 NSC 4,20 ± 0,13 10 NSC 5,11 ± 0,26 12 NSC 6,02 ± 0,28 14 NSC 6,83 ± 0,25 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD A B C Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. sau các ngày nuôi cấy; (A: 4 ngày thí nghiệm; B: 6 ngày thí nghiệm; C: 10 ngày thí nghiệm) Qua bảng 3.1 cho thấy, so với các loài nấm kí sinh côn trùng, nấm Paecilomyces sp. phát triển tốt trên môi trường PDA. Sau 14 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm đạt 6,83 cm, điều này là phù hợp với nghiên cứu trước đó của Bharati và cộng cự (2007). Tác giả cho rằng môi trường PDA chứa hàm lượng lớn dịch chiết khoai tây (đa dạng về dinh dưỡng, vitamin), hơn nữa còn chứa nguồn cơ chất là glucose rất thích hợp cho nấm phát triển. Ban đầu khi mới tiếp xúc với môi trường, nấm cần có thời gian thích nghi nên ở 2 ngày đầu tốc độ phát triển của nấm 37 Đồ án tốt nghiệp chưa cao, nhưng sau các ngày tiếp theo tốc độ lại phát triển rất nhanh đặc biệt ở ngày thứ 4 khuẩn lạc tăng cao nhất, nấm lúc này đã dần thích nghi với môi trường nên khả năng sinh tổng hợp mạnh, các sợi tơ nấm phát triển mọc nhanh, hình thành bào tử làm cho nấm lúc đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu tím nhạt. Ở ngày thứ 14 trở đi, khuẩn lạc của nấm bắt đầu xuất hiện một ít màu xám đen, nguyên nhân là do các tơ nấm đã già, sinh trưởng kém, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, nên khả năng sinh trường giảm hằn. 3.3 Khả năng sinh enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trƣờng thạch Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. Đƣờng kính vòng phân giải D (cm); đƣờng kính tản nấm d (cm) Chỉ tiêu của nấm Paecilomyces sp. ở các ngày sau cấy theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D 1,13a ± 0,06 1,63b ± 0,06 2,80c ± 0,10 3,10d ± 0,10 d 0,50a ± 0,00 0,75b ± 0,03 1,37c ± 0,03 1,65d ± 0,05 D/d 2,27 ± 0.12 2,18 ± 0,16 2,04 ± 0,03 1,88 ± 0,10 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, trong cùng một hàng các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD. Dựa vào bảng số liệu 3.2, có thể thấy rằng chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường cảm ứng chứa chitin. Kết quả theo dõi cũng cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về đường kính vòng phân giải qua các ngày nuôi cấy. Ở ngày thứ nhất, đường kính vòng phân giải chỉ 1,13 cm nhưng đến 4 ngày sau nuôi cấy, đường kính vòng phân giải đã đạt đến 3,1 cm. Xét về tỷ lệ đường kính vòng phân giải và đường kính tản nấm. Số liệu ở bảng 3.2 cũng cho thấy, ở ngày thứ nhất sau cấy tỷ lệ D/d là cao nhất (2,27) và sau thời gian 2, 3, 4 ngày nuôi cấy thì tỷ lệ D/d lại giảm dần. Vì do ban đầu nấm tiếp xúc với môi trường mới là chitin, không có nguồn đường phù hợp, nên nấm phải thủy phân cơ chất (chitin) để tạo ra đường cung cấp cho cơ thể. Chính vì vậy, tỷ lệ D/d lúc này 38 Đồ án tốt nghiệp đạt cao nhất. Sau ngày thứ 2 tỷ lệ D/d giảm thấp còn 2,18 chứng tỏ nấm đã dần thích nghi với môi trường hơn lúc đầu, khuẩn lạc bắt đầu lớn dần, nấm vẫn tiết chitinase để thủy phân chitin môi trường, cung cấp nguồn năng lượng cho hoạt động cơ thể. Càng về sau tỷ lệ D/d giảm mạnh, cụ thể là ngày 3 giảm còn 2,04, ngày 4 còn 1,88; nguyên nhân là do khi đã quen với nguồn cơ chất mới thì nấm cũng sẽ tiết ra enzyme vừa đủ để phát triển và nuôi sống bản thân, vì vậy ở ngày 3 và 4 tỷ lệ D/d thấp hơn so với 2 ngày đầu. Tóm lại, chủng nấm Paecilomyces sp. phân lập được có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase, là cơ sở để tấn công phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 1 2 3 4 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy 3.4 Hoạt tính chitinase trên môi trƣờng cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. Việc bổ sung nguồn cơ chất tự nhiên như pepton, glucose, maltvào môi trường nuôi cấy sẽ giúp cho nấm phát triển tốt hơn (Trần Văn Mão, 2002). Vì vậy cần khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trên môi trường có bổ sung nguồn cơ chất tự nhiên sẽ giúp xác định chính xác hơn hoạt tính của nấm Paecilomyces sp. Để định tính khả năng sinh enzyme chitinase của nấm Paecilomyces sp., sinh viên tiến 39 Đồ án tốt nghiệp hành nuôi cấy trên môi trường lỏng có bổ sung huyền phù chitin. Kết quả trình bày như sau: Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. Ngày theo dõi Hoạt tính enzyme (UI/ml) 3 ngày 3,726 ± 0,166 5 ngày 3,958 ± 0,144 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD, ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Dựa vào bảng 3.4 cho thấy, hoạt độ enzyme chitinase tăng trưởng cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy đạt 3,726 UI/ml, còn sau 5 ngày thì tương đối thấp chỉ tăng 0,232 UI/ml. Đối với khả năng tổng hợp enzyme trên môi trường cảm ứng thì hoạt tính enzyme là tương đối cao. Hoạt tính enzyme chitinase trong nghiên cứu này bằng hoặc cao hơn so với các nghiên cứu của các tác giả khác. 3.5 Khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trƣờng PDA. Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. Chỉ Đƣờng kính vòng phân giải D (cm); đƣờng kính tản nấm d (cm) tiêu của nấm Paecilomyces sp. ở các ngày sau cấy theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D 1,30a ± 0,10 1,90b ± 0,00 2,40c ± 0,10 2,97d ± 0,06 D 0,73a ± 0,06 1,20b ± 0,00 1,67c ± 0,03 2,08d ± 0,03 D/d 1,77 ± 0,07 1,58 ± 0,00 1,44 ± 0,04 1,42 ± 0,01 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, trong cùng một hàng các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD. 40 Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả ở bảng 3.3, thấy rằng chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng phân giải casein trên môi trường cảm ứng. Đường kính vòng phân giải (D) tăng dần qua các ngày, cho thấy nấm đã tiết ra một lượng enzyme protease cần thiết để phân giải casein, sinh ra các amino acid không phản ứng với thuốc thử TCA 5%. Tương tự như cơ chất chitin, ban đầu nấm cũng cần có thời gian thích nghi khi tiếp xúc với nguồn cơ chất mới là casein. Tỷ lệ D/d đạt cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1,77; giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng và thấp nhất sau 4 ngày nuôi cấy (D/d là 1,42). Kích thước vòng phân giải casein biểu thị cho khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của chủng nấm, kích thước càng lớn thì khả năng phân hủy cơ chất càng mạnh. Tóm lại, chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh enzyme protease. 1 2 3 4 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. qua 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy 41 Đồ án tốt nghiệp 3.6 Khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày Môi trƣờng Đƣờng kính tản nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy pH 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14 NSC pH 5 1,05a ± 0,05 2,68a ± 0,08 4,27a ± 0,12 6,03a ± 0,08 pH 6 1,20b± 0,00 2,88b ± 0,03 4,53b ± 0,06 6,10ab ± 0,05 pH 7 1,18b ± 0,03 2,98b± 0,10 4,52b ± 0,10 6,25b ± 0,13 pH8 1,20b ± 0,00 2,90b± 0,00 4,53b ± 0,08 6,12ab ± 0,08 Mức ý nghĩa * * * * Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; Các giá trị được biểu diễn ở dạng TB ± SD, trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD; (*) khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng DKN (cm) 7.000 6.000 5.000 pH 5 4.000 pH 6 3.000 pH 7 2.000 pH8 1.000 NSC 0 2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy 42 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Nấm Paecilomyces sp. phát triển ở các pH 5, 6, 7, 8 sau 14 ngày Dựa vào bảng số liệu 3.5 và biểu đồ 3.1, có thể thấy rằng nấm Paecilomyces sp. có thể phát triển tốt ở pH 5 – pH 8 với đường kính khuẩn lạc 6,03 – 6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, đường kính tản nấm có xu hướng nhỏ nhất ở pH 5. Kết quả này cũng khá phù hợp với các kết quả của tác giả khác. Theo Sung Mi Shim et al. (2003) pH phù hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh côn trùng Paecilomyces fumosoroseus là từ 5 đến 9, nhưng tốt nhất là ở pH 6. Còn Choi et al. (1999) cho rằng sợi nấm của P. japonica phát triển tốt nhất ở pH 7. Ngoài ra Shim et al. (2003) đề cập rằng P.sinclairii phát triển tốt nhất ở môi trường PDA pH 8. Như vậy, nấm Paecilomyces sp. đều phát triển trong môi trường có phổ pH rộng với pH từ 5 – 8. Tuy nhiên, sự phát triển còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa. cụ thể như sau: 43 Đồ án tốt nghiệp 3.7 Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày Môi trƣờng Đƣờng kính nấm qua các ngày nuôi cấy (cm) 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14 NSC PDA 1,28b ± 0,03 3,43bc ± 0,12 5,20b ± 0,21 6,97c ± 0,17 Malt agar 1,33b ± 0,06 3,60c ± 0,10 5,93c ± 0,15 7,70d ± 0,12 Czapek – Dox 1,02a ± 0,03 2,67a ± 0,03 4,15a ± 0,05 5,35a ± 0,05 Sabouraud 1,24b ± 0,03 3,40b ± 0,13 5,13b ± 0,31 6,35b ± 0,31 Mức ý nghĩa * * * * Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; Các giá trị được biểu diễn ở dạng TB ± SD, trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD; (*) khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Ảnh Hƣởng Của Môi Trƣờng DKN (cm) 9 8 7 6 PDA 5 Malt agar 4 Czapek – Dox 3 Sabouraud 2 1 0 NSC 2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày 44 Đồ án tốt nghiệp Kết quả theo dõi dựa vào bảng 3.6 và biểu đồ 3.2 cho thấy trong số 4 loại môi trường thử nghiệm để nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. thì môi trường Malt là môi trường nấm phát triển tốt nhất, khuẩn lạc đạt 7,7 cm sau 14 ngày nuôi cấy, tiếp đến là môi trường PDA với đường kính là 6,97 cm, Sauboraud là 6,35 cm, và thấp nhất là môi trường Czapek-Dox, khuẩn lạc chỉ đạt 5,35 cm, mặc dù ở 2 ngày đầu đường kính khuẩn lạc có kích thước tương đương nhau. Điều này cũng dễ hiểu vì ở giai đoạn đầu kích thước khuẩn lạc nhỏ, hệ sợi nấm ít nên nhu cầu dinh dưỡng thích hợp còn chưa cao, nhưng ở các ngày tiếp theo khuẩn lạc lớn lên đòi hỏi nhu cầu về các nguồn dinh dưỡng (Carbon, vitamin) tăng cao, làm cho khả năng sinh trưởng của nấm trong các môi trường sẽ khác nhau. Nấm Paecilomyces sp. mọc chậm trên môi trường Czapek-Dox điều này là phù hợp với nghiên cứu của Sung Mi Shim (2003) cho rằng sự chênh lệch khác nhau giữa 2 môi trường nuôi cấy PDA (đạt 6,73 cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapek-Dox (đạt 6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy). Nguyên nhân là do trong môi trường Czapek-Dox hàm lượng đường rất thấp (glucose chiếm 1%) nên khả năng sinh tổng hợp của nấm còn hạn chế, ảnh hưởng đế sự phát triển của tơ nấm (nấm mọc yếu, mỏng), còn đối với môi trường Sabouraud hàm lượng đường chiếm 4% cùng với nguồn protein như pepton giúp nấm phát triển tốt hơn, hệ sợi tơ nấm mọc nhanh hơn, nhưng khi quan sát khuẩn lạc lại có màu trắng, không giống với các môi trường còn lại (khuẩn lạc màu tím), điều này có thể là do nấm sinh bào tử ít vì màu tím là màu của bào tử. Đối với môi trường PDA, nấm phát triển tốt hơn 2 môi trường trên, do nguồn dinh dưỡng dồi dào trong dịch chiết khoai tây cộng với việc bổ sung nguồn glucose 2% nên đáp ứng được dinh dưỡng cho nấm Paecilomyces sp. phát triển. Theo Nguyễn Hoài Hương (2009) cho rằng thành phần amino acid và peptide có trong dịch malt chiếm 5 – 7% chất hòa tan, lượng đường chiếm 60 – 63% cùng với nhiều khoáng chất, vitamin, vì vậy nấm sẽ phát triển trên môi trường Malt là tốt nhất. Điều này phù hợp với các nghiên cứu về các loại nấm kí sinh tuyến trùng. 45 Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.6 Nấm Paecilomyces sp. phát triển trên các môi trường khác nhau sau 14 ngày; (A: môi trường Malt; B: môi trường PDA; C: môi trường Sabouraud; D: môi trường Czapek-Dox). 46 Đồ án tốt nghiệp 3.8 Ảnh hƣởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đối với nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của 5 loại thuốc đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua 10 NSC, 15 NSC. Tỉ lệ (%) ức chế nấm của các loại thuốc ở các ngày sau cấy Công thức 10 NSC 15 NSC Liều sử dụng ĐKKL Tỉ lệ bị Cấp độ ĐKKL Tỉ lệ bị Cấp độ (cm) ức chế ảnh (cm) ức chế ảnh (%) hƣởng (%) hƣởng Haxaconazole (Saizole 5SC) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Carbendazim (Carbenzim 500FL) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Mancozeb (Dipomate 80WP) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Nano đồng (Cup 2.9SL) 0,25 % 4,86 3,95 1 6,48 8,69 1 Propineb (Antracol Zinc++) 2,5 % 0,5 100 4 0,5 100 4 NSC: Ngày sau cấy ; DKKL: Đường kính khuẩn lạc; Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% khuẩn lạc bị ức chế), Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 - 79%), Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 - 90%), Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%). (Hassan,1989) 47 Đồ án tốt nghiệp Kết quả bảng 3.7 cho thấy trong 5 loại thuốc trừ bệnh cây trồng khảo sát thì có 4 loại thuốc ức chế hoàn toàn 100% sự phát triển của nấm là Haxaconazol, Carbendazim, Mancozeb và Propineb, riêng đối với loại thuốc trừ bệnh Nano đồng (Cup 2,9SL) thì khả năng ức chế không cao nên không ảnh hưởng nhiều, tỷ lệ chỉ chiếm 3,95% ở 10 ngày sau cấy. Đến 15 ngày sau cấy, cấp độ ảnh hưởng vẫn không thay đổi, tỷ lệ ức chế của 4 loại thuốc nói trên vẫn đạt 100%, Cup 2,9SL vẫn không ảnh hưởng nhiều đến khả năng phát triển của nấm. Tóm lại, có 4 loại thuốc ức chế hoàn toàn nấm Paecilomyces sp. là Haxaconazol, Carbendazim, Macozeb, Propineb, còn Nano đồng không ức chế. A B C D E F Hình 3.7 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ở các công thức xử lý thuốc hóa học (sau 15 ngày nuôi cấy) (A: Haxaconazol; B: Carbendazim; C: Propineb; D: Macozeb; E: Nano đồng; F: Môi trường PDA đối chứng không bổ sung thuốc) 48 Đồ án tốt nghiệp 3.9 Khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của chủng nấm Paecilomyces sp. đã chọn Việc đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào chỉ mới là những cơ sở bước đầu để lựa chọn chủng Paecilomyces sp. Chỉ tiêu quan trọng để kết luận đây có phải là chủng nấm ký sinh tuyến trùng hay không thì cần phải khảo sát chúng trên cơ thể ký chủ. Tuyến trùng Meloidogyne spp. đã được phân lập từ rễ và đất cây hồ tiêu bị hại tại Đăk Lăk và chủng nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng được ghi nhận như sau: Bảng 3.8 Tỉ lệ (%) tuyến trùng cái và trứng bị ký sinh bởi Paecilomyces sp. theo công thức Abbot (1925) Số lƣợng con chết sau 3 lần lặp lại Tỷ lệ ký sinh (%) Tuyến trùng bởi nấm Mẫu đối Mẫu có cấy nấm Paecilomyces sp. chứng Paecilomyces sp. Con cái Meloidogyne spp. 2,67 ± 1,52 7,33 ± 0,57 86,9% ± 12,5% Trứng 1,33 ± 0,57 3,67 ± 0,57 34,92% ± 7,27% Meloidogyne spp. Ghi chú: Số lượng tuyến trùng chết là các giá trị trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD Dựa vào kết quả bảng 3.8 cho thấy chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. Điều này chứng tỏ nấm đã tiết một lượng enzyme ngoại bào chitinase, protease phá hủy lớp vỏ tế bào và xâm nhiễm vào tuyến trùng (Khan et al.,2004). Trong thí nghiệm này, khả năng ký sinh trứng của chủng nấm Paecilomyces sp. yếu hơn so với ký sinh con cái, cụ thể là sau 11 ngày cấy phần trăm con cái bị ký sinh là 86,9 %, còn khối trứng là 34,92 %. Như vậy, chủng nấm Paecilomyces sp. khảo sát có khả năng ký sinh rất cao. Tỷ lệ tuyến 49 Đồ án tốt nghiệp trùng cái bị nấm ký sinh trong nghiên cứu này là cao hơn so với nhiều nghiên cứu khác. Đối với con cái thì sau 3 ngày nuôi cấy, thấy xuất hiện ít sợi nấm phân nhánh đã bắt đầu phát triển xung quanh tuyến trùng. Qua các ngày tiếp theo các sợi nấm vẫn tiếp tục phát triển xuyên qua màng tế bào, bám kín cả tuyến trùng. Kết quả này tương tự như trong nghiên cứu của Pau và cộng sự (2012) khi thử nghiệm khả năng ký sinh con cái của các dòng P.lilacinus, sau 6 ngày khuẩn ty nấm bắt đầu xâm nhập vào con cái Meloidogyne incognita. Hơn nữa, tuyến trùng cái bị biến dạng hoàn toàn sau 11 ngày nuôi cấy, điều này khằng định khả năng kí sinh con cái tương đối mạnh của chủng nấm Paecilomyces sp. A B C D Hình 3.8. Con cái Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi; (A: sau 3 ngày thí nghiệm; B: sau 5 ngày thí nghiệm; C: sau 7 ngày thí nghiệm; D: sau 11 ngày thí nghiệm). 50 Đồ án tốt nghiệp Đối với ký sinh trứng tuyến trùng thì sau các ngày nuôi cấy các sợi tơ nấm phát triển chậm hơn, khả năng ký sinh trứng tuyến trùng kém hơn con cái. Điều này dễ hiểu vì trứng tuyến trùng có lớp vỏ dày hơn con cái nên khả năng phân hủy đòi hỏi cần thời gian để nấm có thể tiết enzyme chitinase, protease cần thiết mới có thể xâm nhập tuyến trùng. Tuy nhiên, mặc dù tỷ lệ ký sinh gây chết trên trứng không cao nhưng khi tuyến trùng J2 phát tán ra khỏi trứng thì bị nấm ký sinh. A B C D Hình 3.9 Túi trứng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi; (A: khối trứng chưa cấy nấm; B: sau 3 ngày thí nghiệm, C: sau 11 ngày thí nghiệm; D: ấu trùng J2 bị nấm quấn quanh). Do không quan sát được tỷ lệ chết của tuyến trùng J2 nên sinh viên không trình bày trong luận văn này. Như vậy, kết quả khảo sát này có thể kết luận được rằng, nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh cả trứng và tuyến trùng trưởng thành của loài Meloidogyne spp.. Đây là những tiền đề cho các nghiên cứu về sau. 51 Đồ án tốt nghiệp 3 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh enzyme chitinase và protease mạnh và sinh trưởng tố