Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp

h nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Lƣu Đại Kim Phƣợng i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ. Cám ơn bố mẹ đã không quản khó khăn nuôi dưỡng con từng ngày, dạy cho con những điều hay lẽ phải. Bố mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên to lớn cho con mỗi khi con vấp ngã và cũng là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong công việc cũng như trong cuộc sống. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn toàn thể quý Thầy Cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, cùng toàn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương – Trường bộ môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, người cô đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp thông tin cũng kiến thức thật hữu ích cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm của đồ án. Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này. TP.HCM, tháng 8 năm 2016. SVTH: Lƣu Đại Kim Phƣợng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH ................................... x MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................. 2 2.1. Ngoài nước ......................................................................................................... 2 2.2. Trong nước ......................................................................................................... 3 3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3 4. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 3 5. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 3 6. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 4 6.1. Phương pháp luận .............................................................................................. 4 6.2. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 4 7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................................... 4 8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................... 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về nấm ............................................................................................... 6 1.1.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 6 1.1.2. Độc tố nấm ...................................................................................................... 6 1.1.3. Tác hại của nấm .............................................................................................. 7 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật ...................................................7 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật ......................................................................8 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm ............................................................8 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic .............................................................................. 9 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic ................................................................................ 9 iii Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1. Giới thiệu chung ............................................................................................................9 1.2.1.2. Khái niệm ..................................................................................................................... 10 1.2.1.3. Đặc tính chung ........................................................................................................... 12 1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu .............................................. 14 1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa .......................................................................... 24 1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ............................................................. 24 1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất ............................................................................................. 26 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic ................................................................................................ 31 1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập ................... 32 1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al. 2004) ............................................................................................................................................. 32 1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004) ............... 33 1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại ............................................ 37 1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic ............................. 38 1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic ....................................................... 38 1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................. 40 1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic .......................................... 40 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 46 2.1. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 46 2.2. Thời gian thực hiện ............................................................................................ 46 2.3. Vật liệu ................................................................................................................ 46 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 46 2.3.2. Hóa chất ........................................................................................................ 46 2.3.3. Giống nấm ..................................................................................................... 50 2.4. Phƣơng pháp luận .............................................................................................. 50 2.5. Phƣơng pháp thí nghiệm ................................................................................... 53 iv Đồ án tốt nghiệp 2.5.1. Thu thập mẫu ................................................................................................. 53 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic ......................................................... 53 2.5.2.1. Tăng sinh ...................................................................................................................... 53 2.5.2.2. Phân lập ....................................................................................................................... 53 2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ...................................... 55 2.5.3.1. Nhuộm Gram ............................................................................................................... 55 Kết quả: ........................................................................................................................................ 55 2.5.3.2. Nhuộm bào tử .............................................................................................................. 55 2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase ................................................................................................ 56 2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid ............................................................................. 56 2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động ................................................................................ 57 2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .......................... 57 2.6. Xác định hàm lƣợng acid tổng .......................................................................... 58 2.7. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán của chủng Lactobacillus sp. với nấm bệnh ............................... 59 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt . 63 2.8.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: ...................................... 63 2.8.2. Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm ...................................................................... 65 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................ 66 3.1. Kết quả phân lập ................................................................................................ 66 3.2. Định danh các chủng phân lập ......................................................................... 68 3.2.1. Thử nghiệm Catalase ..................................................................................... 68 3.2.2. Nhuộm Gram ................................................................................................. 69 3.2.3. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. .................... 76 3.2.4. Nhuộm bào tử ................................................................................................ 77 3.2.5. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. .......... 79 3.3. Xác định Hàm lƣợng acid tổng ......................................................................... 83 v Đồ án tốt nghiệp 3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp khuếch tán ........................................................................................................ 86 3.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập đƣợc trong bảo quản hạt ..................................................................................................................... 92 3.5.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng .................................................. 92 3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: ................................................... 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 104 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT FDA Fructose-bisphosphate aldolase ATP Adenosin triphosphat LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales DNA Deoxyribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic acid MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar DMSO Dimethyl sulfoxide Bacillus sb. Bacillus subtilis E. coli Escherichia coli vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus ...................................................... 14 Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)................ 17 Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus...................................................... 19 Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc ........................................................ 22 Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus ........................................................ 23 Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) ........................................................................................... 42 Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men ........................................................................................................... 43 Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) ........................................................................................ 44 Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập .......................................................................... 53 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập .................................................. 68 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 ................................................................................................................... 73 Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn ............................ 81 Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được ................................... 83 Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Nem chua .................................................................................................................. 84 Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Cơm mẻ ..................................................................................................................... 85 Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic .......................................................... 85 Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .................................... 89 Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem chua ............................................................................................................................... 90 viii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm mẻ .................................................................................................................................. 91 Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm ...................................................... 92 Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng ... 93 Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform ............... 97 ix Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) ..... 12 Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus) ...................................................................... 15 Hình 1.3: Lactobacillus salivarius ............................................................................... 15 Hình 1.4: Streptococcus ............................................................................................... 19 Hình 1.5: Leuconostoc .................................................................................................. 22 Hình 1.6: Pediococcus .................................................................................................. 24 Hình 1.7: Con đường lên men Glucose ........................................................................ 30 Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic ................................ 54 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu ..................................................................................... 54 Hình 2.3 : Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán ....................................... 60 Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch .............................................................. 62 Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ................................................................................ 63 Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic ........................................................................ 67 Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 ..................................................... 67 Hình 3.3: Chủng Bacillus sb. Có Catalase dương tính (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) ................................................................................................. 69 Hình 3.4: Mẫu đối chứng với nước cất (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) ............................................................................................................................. 69 Hình 3.5: Vi khuẩn Bacillus sb. Gram dương bắt màu tím .......................................... 70 Hình 3.6: Vi khuẩn E.Coli Gram âm bắt màu hồng ..................................................... 70 Hình 3.7: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn .............................................................. 77 Hình 3.8: Vi khuẩn Bacillus sb. sinh bào tử ................................................................. 78 Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử .............................................................. 78 Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ................................................ 79 x Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường ........................................................ 80 Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường ........................... 81 Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy ... 84 Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày ............................ 87 Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày .............................. 87 Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88 Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .......... 89 Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................ 95 Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................ 96 Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ....................................................................... 98 Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) .......................... 98 Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ................................................................. 99 Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) ............................................................................... 99 Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100 Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%) ............................................................................. 101 xi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ. Thế nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được nâng cao. Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe. Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người. Theo thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày càng phức tạp. Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm. 1 Đồ án tốt nghiệp Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe. Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm. Các phương pháp này không những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển. Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997). Và việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ. Vì các LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng minh là an toàn. Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong đó. Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.” 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Ngoài nước Phân lập các chủng Lactobacillus fermentum từ bột ngô có khả năng phân giải tinh bột (Agati et al.., 1998) Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng kháng nấm. (Lavermicocca et al.., 2000) 2 Đồ án tốt nghiệp Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003) Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al.., 2008) Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới. 2.2. Trong nước Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204 Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm rơm (Hồng Thị Hiền, 1998) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương, 2012) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô Thị Phương Dung, 2011) Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men chua (Nguyễn Văn Chương, 2008) 3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm. Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt. 4. Mục đích nghiên cứu Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu  Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống. 3 Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic.  Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic.  Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu phộng. 6. Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp luận  Chọn nguồn phân lập đại diện cho các thực phẩm lên men truyền thống từ Việt Nam như nem chua, cơm mẻ  Phân lập chủng thuần khiết, áp dụng phương pháp phân lập và định danh sơ bộ với vi khuẩn lên men lactic.  Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành.  Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri, 2011)  Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 6.2. Phương pháp xử lý số liệu  Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị  Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lý số liệu 7. Kết quả đạt đƣợc của đề tài  Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh khối và có hoạt tính kháng nấm tốt từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ 2 nguồn thực phẩm lên men truyền thống là cơm mẻ và nem chua.  Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi khuẩn lactic. 4 Đồ án tốt nghiệp  Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu phộng. 8. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 5 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. 1.1.2. Độc tố nấm Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm c... Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose), disaccharide (lactose, saccharose); pentose (arabinose, xylose, ribose) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.7).  Lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di- acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. 27 Đồ án tốt nghiệp  Lên men lactic dị hình Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6- phosphogluconate và được gọi chung là 6-phosphogluconate/phosphoketolase (6- PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6- phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình. Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R. Fennema et al. 2004). Chú thích hình 1.7 (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB) (B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) 28 Đồ án tốt nghiệp Các enzyme tham gia vào quá trình : 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase; 9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase. 29 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7: Con đường lên men Glucose 30 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.  Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men.  Yếu tố môi trường  Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC. Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995). 31 Đồ án tốt nghiệp  Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm, và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nầm giữa 5.5 và 6.0.  Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.  Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al. 2004) Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm sữa chua và sau đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là Lactococcus lactis) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo acid lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện (Orla-Jensen, 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla-Jensen vẫn phân 32 Đồ án tốt nghiệp loại dựa trên phương pháp cổ điển như : so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lên men glucose ( đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp cổ điển dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân loại LAB. Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm : Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và LactosphaeraBản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền. 1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004) Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằng phương pháp định danh cổ điển và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn. 33 Đồ án tốt nghiệp LAB được phân chia theo hình thái như sau : dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus. Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành acid lactic và lên men dị hình tạo acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để phân biệt giữa 2 nhóm (Sharpe. 1979). Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình. Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng gióp phần phân biệt một số giống thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oC nhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thể phát triển ở 45oC tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococci; Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu acid ơ kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát triển ở pH cao những không phát triển ở pH=9.6. Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của acid lactic trong quá trình len men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic acid) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo acid lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này.  Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:  Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến). 34 Đồ án tốt nghiệp  Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm.  Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm Carbolic Fuchsin.  Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo, Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)  Nhuộm thành tế bào  Nhuộm hạt dị nhiễm  Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)  Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)  Nhuộm vi khuẩn kháng acid  Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý:  Hình thái khuẩn lạc  Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt, chịu acid, chịu muối mật  Nhu cầu oxygen.  Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza. ... Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như:  API20E KIT 35 Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.  Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.  Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. 36 Đồ án tốt nghiệp  Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. 1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là:  Phân tích acid nucleic.  Phân tích protein.  Phân tích polysaccharid.  Hóa phân loại học. Việc phân loại LAB như đã mô tả trong mục 1.2.3 chủ yếu dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa . Tuy nhiên trong thực nghiệm, các đặc điểm này không đủ để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể. Ngày nay với công nghệ xác định trình tự DNA một các tự động và nhanh chóng, người ta đã trực tiếp xác định được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phân loại vi khuẩn. (Owen R. Fennema et al. 2004) Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB đã được thự hiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để định danh vi khuẩn. Việc phân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được phát triển và sử dụng đối với Lactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và phân biệt Vagococci với các LAB khác. Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của 37 Đồ án tốt nghiệp LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danh mục các đầu dò hiện có được đưa ra bởi Pot et al. 1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic  Các enzyme tiêu hóa Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase.  Proteolysis (khả năng phân giải protein): Vi sinh vật tổng hợp protease giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được.Hoạt tính này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có thể tiêu thụ dễ dàng.  Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành những hợp chất đơn giản. Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể phân hủy cholesterol.  Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme b-galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase có thể sản sinh acid lactic từ lactose. Acid lactic có những lợi ích như sau:  Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡng enzyme.  Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụ sữa.  Tăng cường việc sử dụng canxi, phospho, sắt.  Kích thích sự bài tiết.  Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày.  Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp. 38 Đồ án tốt nghiệp  Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng  Vitamin: Vi sinh vật dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K.  Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn Bacteriocin: Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm hoặc gram dương. Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau: Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome.  Tế bào chủ miễn dịch với chúng.  Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất.  Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm và vì tính an toàn của chúng. Bacteriocin được sản xuất bởi LAB được chia thành 4 lớp: Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những amino acid hiếm và một số amino acid khử nước. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa. Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của 39 Đồ án tốt nghiệp bacteriocin. Bacteriocin lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch.  Các chất khác có khả năng kháng bệnh Vi khuẩn sinh acid lactic cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác như: hydrogen peroxide, carbon dioxide và diacetyl. Quá trình biến dưỡng của vi khuẩn sinh acid lactic có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinh vật có hại và các dạng hoạt động khác của chúng. 1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic,... 1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 40 Đồ án tốt nghiệp Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu. Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010). Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.6).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.NikuPaavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005). 41 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống 4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusphantar 21B phenyllacticacid 3 –hydroxydecanoicacid 3- Lactobacillusphantarum MILAB14 hydroxydodecanoicacid 3 – hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5- cis-dodecenoicacid Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusphantarum VTTE-78076 mevalonolactone Caproic-,propionic-,buturie-,acetic- Lactibacillus sanfranciscensis CB1 ,formic- and n-valeric acid. Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996) và rau (Sathe và cộng sự, 2007). 42 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men 43 Đồ án tốt nghiệp Corsetti và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm của LAB khác được phân lập từ bột nhào chua là Lactobacillus sanfranciscensis CB1 (Corsetti và cộng sự , 1998). Họ phát hiện ra một hỗn hợp của acid hữu cơ là bổ trợ về tác dụng ức chế của dòng này (acetic , caproic , formic , propionic, butyric và acid n- valeric), trong đó acid caproic dường như quan trọng nhất. Tất cả các chất này được xác định là những hợp chất có phân tử lượng thấp, nhưng cũng có những báo cáo của các hợp chất protein không xác định với hoạt động kháng nấm rộng (Gourama và Bullerman ,1997; Magnusson và Schnurer , 2001). Một peptide giống như bacteriocin có hiệu lực kìm nấm Candida albicans đã được báo cáo bởi Okkers và cộng sự.(Okkers và cộng sự , 1999). Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, (Bảng 1.8) Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật chính Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài Acid lactic nấm Acid hữu cơ Nấm men, nấm, vi khẩun gây Acid acetic thối rữa Sinh vật gây bệnh đặc biệt H2O2 trong thức ăn giàu protein Vi khuẩn gây bệnh (sữa và Hệ thống lactoperosidase với H2O2 Enzyme các sản phẩm làm từ sữa) Isozyme Vi khuẩn gram dương 44 Đồ án tốt nghiệp Reuterin(3-OH-propionaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 1 vài loại vi khuẩn lactic, vi nisin khuẩn gram dương, các thế Bacteriocin nội bào tử 1 số loại khác Vi khuẩn gram dương Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004).  Các hợp chất kháng nấm và phƣơng thức hoạt động Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân gây bệnh của con người và động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. 45 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP HCM. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày 2.3. Vật liệu 2.3.1. Thiết bị và dụng cụ  Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)  Máy đo pH Horiba (Nhật Bản)  Autoclave (Memmmert – Đức)  Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản  Cân phân tích, cân kỹ thuật  Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức)  Pipetman 100 – 1000 µl  Bếp điện  Bông thấm nước, bông không thấm nước  Giấy lọc,...actic có lượng sinh khối lớn, acid lactic cao, có hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả hàm lượng % acid lactic của 17 chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ. Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được OD hiệu Xếp hạng Chủng %Acid tổng TB chỉnh TB chủng LN1-5 1.08 1.851 ++ LN2-19 0.567 2.507 + LN2-5 0.513 2.445 + LN2-7 0.639 2.727 + LN2-17 0.666 1.741 + LN3-5 2.205 1.792 ++ LN2-12 1.134 1.536 ++ LN2-2 1.224 2.077 ++ LN4-2 1.017 1.941 ++ LN3-2 1.935 2.581 ++ LN3-7 1.188 1.088 + LN2-3 0.423 0.372 + LC1-1 1.341 2.315 ++ LC3-3 2.277 1.976 ++ LC6-5 1.458 1.485 ++ LC3-4 0.405 0.326 + 83 Đồ án tốt nghiệp LC7-7 0.603 0.431 + OD hiệu chỉnh = OD x Số lần pha loãng 2.50 3.50 3.00 2.00 2.50 1.50 2.00 tổng, tổng, % 1.50 1.00 Acid 600nm hiệu chỉnh 1.00 0.50 OD 0.50 0.00 0.00 %Acid tổng Odhc TB Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic và sinh khối của 17 chủng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Nem chua Chủng %Acid tổng (%) OD hiệu chỉnh LN1-5 1.08DE ± 0.09 1.851CD ± 0.393 LN2-19 0.567GH ± 0.01 2.507AB ± 0.298 LN2-5 0.513HI ± 0.01 2.445AB ± 0.352 LN2-7 0.639FG ± 0.03 2.727A ± 0.246 LN2-17 0.666F ±0.07 1.741CD ± 0.200 LN3-5 2.205A ± 0.03 1.792CD ± 0.624 LN2-12 1.134CD ± 0.07 1.536DE ± 0.021 LN2-2 1.224C ± 0.07 2.077BC ± 0.084 84 Đồ án tốt nghiệp LN4-2 1.017E ± 0.05 1.941CD ± 0.204 LN3-2 1.935B ± 0.08 2.581A ± 0.216 LN3-7 1.188C ± 0.01 1.088E ± 0.236 LN2-3 0.423I ± 0.01 0.372F ± 0.149 Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Cơm mẻ Chủng %Acid tổng (%) OD hiệu chỉnh LC1-1 1.341C ± 0.05 2.315A ± 0.133 LC3-3 2.277A ± 0.09 1.976A ± 0.405 LC6-5 1.458B ± 0.02 1.485B ± 0.305 LC3-4 0.405E ± 0.04 0.326C ± 0.017 LC7-7 0.603D ± 0.02 0.431C ± 0.06 Sau khi xử lý ANOVA (phân tích phương sai) với độ tin cậy là 95%, người thực hiện đề tài phân các chủng vi khuẩn lactic phân lập được thành 4 nhóm dựa theo các bảng 3.4, 3.5, 3.6 và hình 3.13 Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic Chủng vừa sinh Chủng sinh acid Chủng sinh acid Chủng sinh acid acid mạnh vừa có mạnh nhƣng sinh yếu nhƣng có sinh yếu và có sinh khối sinh khối mạnh khối yếu khối mạnh yếu LN1-5 LN3-7 LN2-19 LN2-3 LN3-5 - LN2-5 LC3-4 LN2-12 - LN2-7 LC7-7 LN2-2 - LN2-17 - LN4-2 - LC6-5 - LN3-2 - - - 85 Đồ án tốt nghiệp LC1-1 - - - LC3-3 - - - 3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp khuếch tán Những nghiên cứu gần đây cho biết vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm nhờ sản xuất 1 số chất như acid hữu cơ và reuterin, các peptide, các enyzme để ức chế sự tăng trưởng của nấm hư hỏng trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn. Trước khi tìm hiểu bản chất của các hợp chất kháng nấm do các chủng phân lập tổng hợp được, chúng tôi tiến hành đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của các chủng này bằng phương pháp đối kháng trực tiếp sử dụng kỹ thuật đặt thạch khuếch tán. Cùng với đó, người làm đề tài chọn môi trường MRS loại bỏ citrate amon là môi trường MRS cải tiến (Đồ án tốt nghiệp, Phan Thị Ngọc Ái, 10DSH) đáp ứng yêu cầu cho thử nghiệm hoạt tính kháng nấm là sinh khối vi khuẩn đạt cực đại và thành phần môi trường cũng không làm ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm mốc do nhóm trước đã thực hiện, để tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. Khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn lactic sau 3 ngày thể hiện khác nhau và được trình bày đại diện qua chủng mạnh nhất qua các hình. Khả năng đối kháng được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc so với đối chứng và được trình bày trên hình và bảng dưới. 86 Đồ án tốt nghiệp *Chủng có khả năng kháng nấm từ nguồn phân lập Nem chua với khả năng đối kháng nấm tốt nhất: LN4-2 Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày 87 Đồ án tốt nghiệp *Chủng có khả năng kháng nấm từ nguồn phân lập Cơm mẻ với khả năng kháng nấm tốt nhất: LC1-1 Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày 88 Đồ án tốt nghiệp LC7-7 LC3-4 LC6-5 LC3-3 LC1-1 LN2-3 LN3-7 CĐP1 LN3-2 CĐP2 LN4-2 ĐN3 LN2-2 LN2-12 ĐN2 LN3-5 HCP2 LN2-17 LN2-7 LN2-5 LN2-19 LN1-5 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng đường kính vòng ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Bảng 3.8: Tổng đường kính vòng ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Tổng vòng ức chế Trung bình vòng Vi khuẩn (mm) ức chế (mm) LN1-5 66.61 13.322 LN2-19 61.62 12.324 LN2-5 67.56 13.512 LN2-7 63.82 12.764 LN2-17 70.73 14.146 LN3-5 60.76 12.152 LN2-12 56.88 11.376 LN2-2 73.73 14.746 LN4-2 79.45 15.89 LN3-2 71.27 14.254 89 Đồ án tốt nghiệp LN3-7 62.33 12.466 LN2-3 54.67 10.934 LC1-1 79.77 15.954 LC3-3 64.60 12.92 LC6-5 50.72 10.144 LC3-4 57.62 11.524 LC7-7 58.39 11.678 Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem chua Chủng CĐP1(mm) CĐP2(mm) ĐN2(mm) ĐN3(mm) HCP2(mm) LN1-5 12.28CDE±0.35 12.6BC±0.19 12.78ABC±1.06 15.61A±1.60 13.33BCD±2.29 LN2-19 12.17CDE±0.00 12.17 BC ±1.26 12.78 ABC ±1.84 13.00BCDE±0.50 11.50CD±1.17 LN2-5 11.89DE±0.77 14.50 BC ±0.87 13.56AB±0.59 14.17ABCD±0.76 13.44 BC ±0.51 LN2-7 12.22CDE±1.84 12.72 BC ±1.06 10.94CD±2.06 14.33ABC±4.19 13.61BC±0.77 LN2-17 13.78ABC±2.24 13.72 BC ±0.67 14.67A±1.45 15.06AB±0.10 13.50BC ±0.44 LN3-5 11.78DE±0.42 11.89 BC ±0.54 12.11BCD±0.25 11.87DEF±0.63 13.11BCD±1.23 LN2-12 10.83E±0.29 11.39D±0.25 11.72BCD±0.51 11.11EF±0.67 11.83CD±0.17 LN2-2 15.39A±0.54 14.17 BC ±1.48 13.39AB±1.35 15.22AB±0.10 15.56AB±1.11 LN4-2 13.28BCD±0.54 18.78A±1.50 14.67A±0.00 15.83A±0.73 16.89A±2.83 LN3-2 13.33BCD±0.17 14.83B±0.73 12.67 BC ±0.33 14.94AB±1.25 15.50AB±2.32 LN3-7 14.50AB±1.69 12.94 BC ±0.92 11.39CD±1.21 12.11CDEF±0.25 11.39CD±1.23 LN2-3 11.22E±0.67 11.50C±0.29 10.56D±0.96 10.50F±0.44 10.89D±0.77 90 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm mẻ Chủng CĐP1 CĐP2 ĐN3 ĐN2 HCP2 LC1-1 15.94A±3.38 17.22A±3.96 11.44AB±0.35 18.39A±6.83 16.78A±3.42 LC3-3 12.83B±0.44 11.61B±1.46 12.72A±1.99 13.22AB±0.25 14.22AB±0.77 LC6-5 10.00C±0.00 10.00B±0.00 10.17B±0.29 10.44B±0.77 10.11C±0.19 LC3-4 11.78BC±0.19 12.28B±1.50 11.00AB±1.15 11.06B±0.42 11.50BC±0.67 LC7-7 11.61BC±0.54 11.22B±0.25 12.11AB±0.63 11.78B±0.98 11.67BC±1.44 Sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy là 95%, người thực hiện đề tài dựa theo hình 3.18 và bảng 3.9, 3.10 tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm:  Nguồn phân lập từ Nem chua:  Mạnh nhất: LN4-2 (15.98 mm)  Yếu nhất: LN2-3 (10.934 mm)  Nguồn phân lập từ Cơm mẻ:  Mạnh nhất: LC1-1 (15.954mm)  Yếu nhất: LC6-5 (10.144 mm) Đánh giá khả năng đối kháng nấm dựa theo bảng 3.7 và hình 3.18:  Đối với các chủng phân lập từ Cơm mẻ: Acid tổng quyết định khả năng đối kháng nấm.  Đối với các chủng phân lập từ Nem chua: Sinh khối quyết định khả năng đối kháng nấm. Vì vậy các chủng này đối kháng nấm có thể dựa trên các enzyme hay các hợp chất thứ cấp. 91 Đồ án tốt nghiệp 3.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập đƣợc trong bảo quản hạt 3.5.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng Để khảo sát khả năng kháng nấm in vivo, chúng tôi chọn mô hình đậu phộng trong đó canh trường nuôi cấy của vi khuẩn lactic được sử dụng có hoặc không kết hợp với chitosan 0.4% . Chitosan là chất có khả năng kháng vi sinh vật, chúng có khả năng tạo màng bao thuận lợi với các phân tử nhỏ, khả năng này giảm với các phân tử > 100 kDa. Chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn là:  LN4-2 từ nguồn phân lập Nem chua (L11)  LC1-1 từ nguồn phân lập Cơm mẻ (L9B) Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm Mẫu Thành phần Đối chứng 1 (ĐC 1) Nước cất Đối chứng 2 (ĐC 2) Chitosan 0.4% trong dd CH3COOH 1% Đối chứng 3 (ĐC 3) Chitosan 0.4% trong dd CH3COOH 1% Nystatin 1g/50ml DMSO Nghiệm thức 1 (NT 1) Canh trường nuôi cấy Nghiệm thức 2 (NT 2) Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các chai thuỷ tinh vô trùng và được cảm nhiễm 0.1ml huyền phù nấm mốc mật độ 102. Theo dõi từng ngày ở nhiệt độ thường. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 92 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng Ngày Lần ĐCNC ĐCChitosan ĐCChitosan+Nystatin LC1-1 LN4-2 LC1-1+ LN4-2+ Chitosan Chitosan 1 - - - - - - - 1 2 - - - - - - - 3 - - - - - - - 1 - - - -* - - - 3 2 - - - -* - - - 3 - - - -* - - - 1 + + - -* +* -* + 5 2 + + - -* -* -* + 3 + + - -* -* -* - 1 + + - -* +* -* + 7 2 + + - -* -* -* + 3 + + - -* -* -* - 1 + + - +* +* +* + 9 2 + + - +* +* +* + 3 + + - +* +* +* + 1 + + - +* +* + + 13 2 + + - +* +* + + 3 + + - +* +* + + Chú thích: - không bị nhiễm + bị nhiễm -* không bị nhiễm nhưng có khuẩn 93 Đồ án tốt nghiệp +* bị nhiễm nhưng có khuẩn  Nghiệm thức 1: Canh trường nuôi cấy Trong 3 ngày đầu, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 5, tơ nấm bắt đầu mọc trong bình đối chứng 1 (nước cất), đối chứng 2 (Chitosan 0,4%). Các chai khác chưa lên tơ nấm. Ngày thứ 7, nấm tiếp tục phát triển trong bình đối chứng 1 và 2. Ngoài ra, có 1 bình của chủng LN4-2 bắt đầu xuất hiện tơ nấm. Các chai còn lại đều không lên nấm. Ngày thứ 9, ngoài các chai đối chứng 3 (nystatin), các chai còn lại đã bị nhiễm nấm.  Nghiệm thức 2: Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% Trong 3 ngày đầu, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 5, tơ nấm bắt đầu mọc trong bình đối chứng 1 (nước cất), đối chứng 2 (Chitosan 0.4%). Ngoài ra, có 2 chai của chủng LN4-2 đã nhiễm nấm. Các chai khác chưa lên tơ nấm. Ngày thứ 7, không có sự khác biệt so với ngày 5. Ngày thứ 9, ngoài các chai đối chứng 3 (nystatin), các chai còn lại đã bị nhiễm nấm.  Chủng LC1-1 bảo quản đậu phộng được 7 ngày.  Chủng LN4-2 bảo quản đậu phộng được 7 ngày. 94 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13). Từ trên xuống: ĐC 1 – Đối chứng nước cất, ĐC 2 – Đối chứng Chitosan 0.4%, ĐC 3 – Đối chứng 95 Chitosan 0.4% và Nystatin, NT1 – Canh trường nuôi cấy, NT2 – Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0.4% Đồ án tốt nghiệp Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13). Từ trên xuống: ĐC 1 – Đối chứng nước cất, ĐC 2 – Đối chứng Chitosan 0.4%, ĐC 3 – Đối chứng Chitosan 0.4% và Nystatin, NT1 – Canh trường nuôi cấy, NT2 – Canh trường nuôi cấy và Chitosan96 0.4% Đồ án tốt nghiệp 3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: Sau 7 ngày coating, các nghiệm thức không nhiễm nấm gồm: Canh trường nuôi cấy (TN1-LC1-1) và Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0,4% (TN2-LC1-1) được lấy ra và kiểm định vi sinh nhằm xem khả năng kháng khuẩn của chủng LC1-1. Do đến ngày thứ 9, các nghiệm thức của chủng LN4-2 đã bị nhiễm nấm nên chỉ tiến hành Kiểm tra vi sinh chất lượng của các nghiệm thức của chủng LC1-1. Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform Chỉ tiêu vi sinh TPC (CFU/g) Coliform (MPN/g) Canh trường nuôi cấy 104 1.5 Canh trường nuôi cấy + chitosan 104 0 0,4% Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT 104 10 Kết quả từ bảng 3.12 cho thấy, ở các nghiệm thức kiểm tra, chỉ tiêu Tổng số vi sinh vật hiếu khí không đạt và Coliform vẫn trong giới hạn cho phép. Đối với thử nghiệm Coliform trên môi trường VRB, chỉ có TN1 (Canh trường nuôi cấy )có số khuẩn lạc nằm trong giới hạn từ 15 < x < 150, vì thế chọn 5 khuẩn lạc không đặc trưng của nghiệm thức này và cấy vào môi trường EC Broth. 97 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21 : Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 98 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) Bên cạnh đó, hạt đậu phộng khi đặt trong môi trường MRS Agar, kết quả cho thấy:  Ở nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy: vi khuẩn phát triển  Ở nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy với Chitosan 0.4%: vi khuẩn phát triển và có tơ nấm. 99 Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar A: Nghiệm thức 1 – canh trường nuôi cấy B: Nghiệm thức 2 – canh trường nuôi cấy + chitosan 0.4% Thử nghiệm catalase 100 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%) 101 Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua cách bước phân lập và cấy chuyền thu khuẩn lạc riêng rẽ và khảo sát hình thái khuẩn lạc, 17 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic trong đó có 12 chủng phân lập từ nem chua Hà Nội và 5 chủng phân lập từ cơm mẻ. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa chuyên biệt của vi khuẩn lactic theo khóa phân loại của Bergey và các tiêu chuẩn do Sharpe đưa ra (1961), 17 chủng đã được xác định thuộc vi khuẩn lên men lactic, trong đó 17 chủng vi khuẩn lên men lactic hình que được phân lập. Trong số các chủng thuộc giống Lactobacillus spp., 6 chủng lên men đồng hình và 11 chủng lên men dị hình. Khả năng kháng nấm in vitro của 17 chủng được xác định bằng phương pháp đối kháng trực tiếp bằng cách đặt thạch khuếch tán, cả 17 chủng đều thể hiện khả năng đối kháng nấm Aspergillus spp. sinh aflatoxin. Trong đó:  Ở nguồn phân lập từ nem chua, Vi khuẩn LN4-2 thể hiện rõ nhất vòng ức chế đối kháng với các chủng nấm bệnh Aspergillus spp. và cho kết quả rất đông đều ở các lần lặp lại.  Ở nguồn phân lập từ cơm mẻ, Vi khuẩn LC1-1 thể hiện rõ nhất vòng ức chế đối kháng với các chủng nấm bệnh Aspergillus spp. và cho kết quả rất đông đều ở các lần lặp lại. Khả năng kháng nấm in vivo, trên mô hình đậu phộng, vi khuẩn LC1-1 đối kháng tốt hơn LN4-2. Tuy nhiên các chủng phân lập đều chưa đạt yêu cầu bảo quản đậu phộng như những nghiên cứu trước đó. 5.2. Kiến nghị Tiếp tục phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic kháng nấm từ thực phẩm lên men truyền thống 102 Đồ án tốt nghiệp Định danh các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính cao đến cấp loài. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của các chủng phân lập có khả năng sinh nhiều acid lactic như LN3-5, LN3-2 từ nem chua và LC3-3, LC6-5 từ cơm mẻ được dựa trên các vi sinh vật chỉ thị khác như E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes Mở rộng đối tượng nấm chỉ thị 103 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] Phan Thị Ngọc Ái (2014) “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn Lactic”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. [2] Nguyễn Lân Dũng, 2003, Vi sinh vật học, NXB nông nghiệp. [3] Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204. [4] Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng, Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử, 27/02/2007. [5] Văn Hương (2015) “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng bảo quả nông sản”. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM. [6] Phan Nguyễn Hương Thảo (2015) “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. [7] Nguyễn Thị Bích Thùy (2009) “Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”. Trường Đại học Công nghệ TP.HCM [8] Dương Thúy Vy (2010) “Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics”. Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Tài liệu Tiếng Anh: [9] Beijerinck, M. W. 1901. Sur les ferments lactiques de l'industrie. Arch. Neerl. Sci. Exact. Nat. Ser. 26 : 212-243 [10] Bernet-Camard, M.F, Liévin, V, Brassart, D, Neeser, J.R, Servin, A.L and Hudault, S. (1997), The human Lactobacillus acidophilus strain la1 secretes a nonbacteriocin antibacterial substance(s) active in-vitro and in-vivo, Applied and Environmental Microbiology, 63(7), pp. 2747-2753. 104 Đồ án tốt nghiệp [11] Claussen, N. H. 1903. Etudes sur les bacteriesdites sarcines et sur les maladies quelles provoquent dans la biere. C. R. Trav. Lab. Carlsberg. [12] De Man, J.C., Rogosa, M. & Sharpe, M.E. (1960). A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135. [13] Ljungh A, Wadstrom T (editors) (2009). Lactobacillus Molecular Biology: From Genomics to Probiotics. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-41-7. [14] Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda .2011. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis: 71-79. [15] Robinson, R.K., ed. (2007), "Sellars, R.L.", "Acidophilus Products (Therapeutic Properties of Fermented Milks)", Chapman & Hall, London, pp. 81-116. [16] Rosenbach 1884. Staphylococcus.p. 483-489. [17] Tubelius P, Stan V, Zachrisson A. Increasing work-place healthiness with the probiotic Lactobacillus reuteri: A randomised, double blind placebo-controlled study. (2005) Environmental Health 4:25. Entrez Pubmed 16274475 . [18] Van Tieghem, P. 1878. Sur la gomme du sucrerie (Leuconostoc mesenteroides) Ann. Sci. Nat. Bot. 7:180-203. Tài liệu Internet: [19] [20] [21] [22] [23] the-nao-a898.h 105 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật Chủng vi sinh vật Thử nghiệm di động Thử nghiệm lên men đƣờng LN1-5 LN2-19 1 Đồ án tốt nghiệp LN2-5 LN2-7 LN2-17 2 Đồ án tốt nghiệp LN2-12 LN2-2 LN4-2 3 Đồ án tốt nghiệp LC6-5 LC7-7 LC1-1 4 Đồ án tốt nghiệp LC3-3 LC3-4 LN3-7 5 Đồ án tốt nghiệp LN3-5 LN2-3 LN3-2 6 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B Hình ảnh đối kháng nấm bệnh Aspergillus sp. của đại diện các chủng vi khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán Chủng LN4-2 đối kháng nấm - Từ trái sang: CĐP1, ĐN2, HCP2 Chủng LN2-2 đối kháng nấm – Từ trái sang: CĐP1, CĐP2 7 Đồ án tốt nghiệp Chủng LN2-2 đối kháng nấm – Từ trái sang: ĐN2, ĐN3, HCP2 Chủng LN2-3 đối kháng nấm – Từ trái sang: CĐP1, CĐP2 8 Đồ án tốt nghiệp Chủng LN2-3 đối kháng nấm – Từ trái sang: ĐN2, ĐN3, HCP2 Chủng LC1-1 đối kháng nấm – Từ trái sang: CĐP1, CĐP2 9 Đồ án tốt nghiệp Chủng LC1-1 đối kháng nấm HCP2 Chủng LC3-3 đối kháng nấm CĐP1 Chủng LC3-3 đối kháng nấm CĐP2, ĐN2 Chủng LC3-3 đối kháng nấm ĐN3, HCP2 10 Đồ án tốt nghiệp Chủng LC6-5 đối kháng nấm – Từ trái sang: CĐP1, CĐP2 Chủng LC6-5 đối kháng nấm – Từ trái sang: ĐN2, ĐN3, HCP2 PHỤ LỤC C 11 Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 12 Đồ án tốt nghiệp Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 13 Đồ án tốt nghiệp Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 14 Đồ án tốt nghiệp Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D Xử lí số liệu theo phần mềm SAS 9.1 Tỉ lệ kháng của nhóm VK Lactic phân lập từ Nem chua với 5 nấm: DN3: VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN3 12 LN1-5 LN2-12 LN2-17 LN2-19 LN2-2 LN2-3 LN2-5 LN2-7 LN3-2 LN3-5 LN3-7 LN4-2 Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 114.5545333 10.4140485 5.16 0.0004 Error 24 48.4678667 2.0194944 Corrected Total 35 163.0224000 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.702692 10.41854 1.421089 13.64000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F DN3 11 114.5545333 10.4140485 5.16 0.0004 16 Đồ án tốt nghiệp VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 2.019494 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Difference 2.3948 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DN3 A 15.833 3 LN4-2 A A 15.610 3 LN1-5 A B A 15.223 3 LN2-2 B A B A 15.057 3 LN2-17 B A B A 14.957 3 LN3-2 B A B A C 14.337 3 LN2-7 B A C B D A C 14.167 3 LN2-5 B D C B D E C 13.000 3 LN2-19 D E C 17 Đồ án tốt nghiệp F D E C 12.110 3 LN3-7 F D E F D E 11.777 3 LN3-5 F E F E 11.110 3 LN2-12 F F 10.500 3 LN2-3 Tiến hành chạy phần mền SAS 9.1 với 4 chủng nấm còn lại là CĐP1, CĐP2, ĐN2, HCP2. Tỉ lệ kháng của nhóm VK Lactic phân lập từ Cơm mẻ với 5 nấm: CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 37 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CDP1 5 LC1-1 LC3-3 LC3-4 LC6-5 LC7-7 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 38 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 58.58802667 14.64700667 6.15 0.0092 Error 10 23.81893333 2.38189333 Corrected Total 14 82.40696000 R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean 0.710960 12.41224 1.543338 12.43400 18 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CDP1 4 58.58802667 14.64700667 6.15 0.0092 VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 39 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 2.381893 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.8077 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CDP1 A 15.947 3 LC1-1 B 12.833 3 LC3-3 B C B 11.780 3 LC3-4 C B C B 11.610 3 LC7-7 C C 10.000 3 LC6-5 Tiến hành chạy phần mền SAS 9.1 với 4 chủng nấm còn lại là CĐP2, ĐN2, ĐN3, HCP2. 19 Đồ án tốt nghiệp %Acid lactic 17 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân lập Nem chua HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 9 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNGVIKHUAN 12 LN1-5 LN2-12 LN2-17 LN2-19 LN2-2 LN2-3 LN2-5 LN2-7 LN3-2 LN3-5 LN3-7 LN4-2 Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: ACIDLACTIC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 10.17026325 0.92456939 315.24 <.0001 Error 24 0.07038900 0.00293287 Corrected Total 35 10.24065225 R-Square Coeff Var Root MSE ACIDLACTIC Mean 0.993127 5.158945 0.054156 1.049750 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNGVIKHUAN 11 10.17026325 0.92456939 315.24 <.0001 HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 11 The ANOVA Procedure 20 Đồ án tốt nghiệp t Tests (LSD) for ACIDLACTIC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.002933 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Difference 0.0913 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNGVIKHUAN A 2.20200 3 LN3-5 B 1.93200 3 LN3-2 C 1.22400 3 LN2-2 C C 1.18800 3 LN3-7 C D C 1.13700 3 LN2-12 D D E 1.08300 3 LN1-5 E E 1.02000 3 LN4-2 F 0.66450 3 LN2-17 F G F 0.63450 3 LN2-7 G G H 0.57000 3 LN2-19 21 Đồ án tốt nghiệp H I H 0.51600 3 LN2-5 I I 0.42600 3 LN2-3 OD hiệu chỉnh 17 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân lập Nem chua XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 13 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNGVIKHUAN 12 LN1-5 LN2-12 LN2-17 LN2-19 LN2-2 LN2-3 LN2-5 LN2-7 LN3-2 LN3-5 LN3-7 LN4-2 Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: OD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 15.03124089 1.36647644 15.91 <.0001 Error 24 2.06072533 0.08586356 Corrected Total 35 17.09196622 R-Square Coeff Var Root MSE OD Mean 0.879433 15.51856 0.293025 1.888222 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 22 Đồ án tốt nghiệp CHUNGVIKHUAN 11 15.03124089 1.36647644 15.91 <.0001 XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 15 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for OD NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.085864 Critical Value of t 2.06390 Least Significant Difference 0.4938 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNGVIKHUAN A 2.7267 3 LN2-7 A A 2.5813 3 LN3-2 A B A 2.5067 3 LN2-19 B A B A 2.4453 3 LN2-5 B B C 2.0773 3 LN2-2 C D C 1.9413 3 LN4-2 D C D C 1.8507 3 LN1-5 D C D C 1.7920 3 LN3-5 23 Đồ án tốt nghiệp D C D C 1.7413 3 LN2-17 D D E 1.5360 3 LN2-12 E E 1.0880 3 LN3-7 F 0.3720 3 LN2-3 %Acid lactic 5 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân lập Cơm mẻ HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNGVIKHUAN 5 LC1-1 LC3-3 LC3-4 LC6-5 LC7-7 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: ACIDLACTIC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 6.71277240 1.67819310 639.46 <.0001 Error 10 0.02624400 0.00262440 Corrected Total 14 6.73901640 R-Square Coeff Var Root MSE ACIDLACTIC Mean 0.996106 4.212210 0.051229 1.216200 24 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNGVIKHUAN 4 6.71277240 1.67819310 639.46 <.0001 HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for ACIDLACTIC NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.002624 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.0932 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNGVIKHUAN A 2.27700 3 LC3-3 B 1.45500 3 LC6-5 C 1.34400 3 LC1-1 D 0.60300 3 LC7-7 E 0.40200 3 LC3-4 OD hiệu chỉnh của 5 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân lập Cơm mẻ 25 Đồ án tốt nghiệp XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNGVIKHUAN 5 LC1-1 LC3-3 LC3-4 LC6-5 LC7-7 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: OD Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 9.67522773 2.41880693 43.36 <.0001 Error 10 0.55786400 0.05578640 Corrected Total 14 10.23309173 R-Square Coeff Var Root MSE OD Mean 0.945484 18.07772 0.236191 1.306533 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNGVIKHUAN 4 9.67522773 2.41880693 43.36 <.0001 XEP HANG OD 19:54 Thursday, August 2, 2016 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for OD NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 26 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.055786 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.4297 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNGVIKHUAN A 2.3147 3 LC1-1 A A 1.9760 3 LC3-3 B 1.4853 3 LC6-5 C 0.4307 3 LC7-7 C C 0.3260 3 LC3-4 27 Đồ án tốt nghiệp 1