Đồ án Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu

i dƣới sự hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên, bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc! TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Cao Thị Thanh Thúy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 1 3. Nhiệm vụ của nghiên cứu .............................................................................. 2 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................... 2 5. Kết cấu của đồ án .......................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............................................. 3 1.1.1. Hợp chất thứ cấp ..................................................................................... 3 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........ 3 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin ........................................................................... 5 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin ..................................................................... 5 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ................................................. 6 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin .................................................... 9 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens ..................... 10 1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens .......................................................... 14 1.3.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................ 14 1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens .................................... 15 1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens .................................................... 15 1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens ........................ 19 1.4.1. Sắc tố .................................................................................................. 19 1.4.2. Biosurfactant ...................................................................................... 20 1.4.3. Acid béo .............................................................................................. 20 1.4.4. Enzyme................................................................................................ 20 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens .......................................... 21 1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ............................................ 22 1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens 24 1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin ......................................................... 27 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 30 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ...................................... 30 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin ..................................................... 30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 33 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 34 2.1.1. Thời gian. ........................................................................................... 34 2.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 34 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị .................................................................... 34 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ................................................ 34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. ...................................................... 34 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 35 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................... 36 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 41 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. ......................................... 41 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống .................. 44 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 44 2.4.4. Phương pháp phân tích ...................................................................... 47 Mục đích ........................................................................................................... 47 Nội dung ........................................................................................................... 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 48 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất .................................................................... 48 ii Đồ án tốt nghiệp 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................ 48 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin ...................................................................... 52 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) ............ 54 3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................ 56 3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men ................................... 58 3.3.1. Thiết lập môi trường lên men ............................................................ 58 3.3.2. Thiết lập chế độ lên men .................................................................... 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 70 1. Kết luận ........................................................................................................ 70 2. Kiến nghị ...................................................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 76 A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................................................... 76 B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................ 82 C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ...................................................... 87 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại LMTL: lên men tiếp liệu PG: peptone glycerol PGTL: peptone glycerol tiếp liệu MT1: môi trƣờng 1 MT2: môi trƣờng 2 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) .......... 6 Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................... 7 Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) ............ 9 Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) ................................. 11 Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. .......... 13 Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. ....... 16 Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) ............................................................................................................ 16 Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). ......................................... 23 Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) .......... 27 Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) .......................................... 27 Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. ....................................................................................................... 37 Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. ....................................................... 38 Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 ...................................................................................................... 39 Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia marcescens SH4 ...................................................................................................... 40 Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn .................... 43 Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol ....................................................................... 46 Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ........................................................................................................................... 49 Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB ................................................................................................................................ 50 Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. .......................................................................................................................... 51 Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................... 53 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 ............................................. 54 Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 .......................................... 55 Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ................... 55 Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. ..................................................... 57 Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ....... 60 v Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 61 Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 63 Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65 Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ..................................................................................... 67 Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) ....................................... 68 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............ 4 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) . 8 Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 17 Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ..... 25 Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin ....................................................... 32 Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ..................................................................................................................... 51 Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................................................................................ 53 Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1 ......................... 56 Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian. .................................................................... 57 Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ........ 59 Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 61 Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 62 Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65 vii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber, 1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975 Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar- censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3- amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”. 2. Mục tiêu của nghiên cứu 1 Đồ án tốt nghiệp Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào protease và lipase cao nhất. Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia marcescens. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả và thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. 2 Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997. Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, 3 Đồ án tốt nghiệp Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vât. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ Ứng dụng Kiểu tác động cấp ức chế Penicillium Penicilin Ức chế tụ cầu Ức chế tạo notatum, khuẩn, nhiễm polymer vách tế Penicillium trùng kỵ khí, bào vi khuẩn, ức chrysogenum giang mai, hen chế hấp thụ suyễn. amini acid và protein, ứ chế tạo enzyme. Streptomyces Streptomycin Ức chế vi Ức chế ghép nối griceus khuẩn Gram âm một số amino và Gram acid vào dƣơng. Trị bệnh protein, tác lao, bệnh viêm động lên hệ màng não, ho enzyme cả vi gà. khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb, ... Streptomyces Chloranphenicol Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu venezuelas bệnh lỵ, sốt sinh tổng hợp 4 Đồ án tốt nghiệp cao, sốt phát protein vi khuẩn ban. liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide. Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ Ức chế tổng aureomycin rộng vi khuẩn hợp protein Gram âm, Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do Ức chế vi khuẩn erythraeus tụ cầu khuẩn Gram âm và Streptococcal Gram dƣơng gây ra Sttreptomyces Neomycin Tác dụng vi Hơi độc fradiae khuẩn Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức Tác động giống kanamycetius chế vi khuẩn nhƣ Gram âm và Streptomycin và Gram dƣơng Neomycin Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh Cản trở tổng lavendulae lao hơp vách tế bào 1.2. Giới thiệu về Prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin 5 Đồ án tốt nghiệp Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta- cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo- ride (cPrG-HCl). 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)- methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil- liamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil- liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) 6 Đồ án tốt nghiệp Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio- sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi- giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau (Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin” để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, 7 Đồ án tốt nghiệp methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự, 2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ. Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Trọng lƣợng Loài Tên sắc tố Danh pháp phân tử và công prodigiosin thức Serratia Prodigiosine 2-Methyl- 3- marcescens amyl-6-methoxy- 323,4 Da prodigiosene C20H25N3O Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl- marcescens 6-hydroxy- 309,4 Da prodigiosene C10H23N3O Serratia Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4-6- marcescens dipyrromelhenr dimethoxypy- 334,4 Da prodigiosin prodigiosene C19H18N4O2 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxy- C23H31N3O madurae prodigiosene Nocardia Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) prodigiosin melhoxy- C23H33N3O madurae prodigiosene Nocadia Methylcyclodccyl- 2,10-Nonano-6- (Actinomadura) prodigiosin Methoxy- 391,5 Da pellctieri prodigiosene C25H33N3O Streptomyces Undccyl- 2-Undecyl-6- 393,6 Da longisporusruber prodigiosin Rnethoxy- C25H35N3O và Nocardia prodigiosene 8 Đồ án tốt nghiệp (Actonomadura) pelletieri Streptomyces Metacyclo- 2,4-(9- 391,6 Da longisporusber prodigiosin Ethylnonano)-6- C25H33N3O methoxy- prodigiosene 1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 9 Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự, 2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự, 2007). 1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274) đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001). Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5- ca...(ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 휇m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% ace- tonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode- array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003). - Sau khi lên men S. marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v:v) đã acid hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô quay chân không. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane:ethyl acetate (2:1, v:v). Các sắc tố cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v:v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform:methanol:diethyl ether là 6:2:2) và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm). Sau đó, nó đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol:nƣớc (7:3, v:v) đã đƣợc điều chỉnh pH = 3,0 bằng HCl 0,1N với tốc độ dòng chảy là 20 ml/phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng độ của các prodigiosin sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 535 nm trong methanol đã đƣợc acid hóa (HCl 0,001N 4 ml + 96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh 29 Đồ án tốt nghiệp khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). - Các sắc tố đƣợc sản xuất bởi Serratia marcescens SM∆R đã đƣợc tinh sạch thực hiện NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005). Các sắc tố đƣợc chiết xuất từ canh trƣờng lên men bằng methanol và sau đó tinh chế bằng cách sử dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các sản phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng sự, 2000; Montaner và cộng sự, 2000). Sau đó cột đƣợc rửa với ethyl acetate 10M để giải phóng các sản phẩm hấp thụ. Màu cam sau khi rửa giải đã đƣợc thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 45oC để có đƣợc những sản phẩm tinh khiết (bột màu đỏ). Các sắc tố thu đƣợc trong nghiên cứu đã đƣợc báo cáo là undecylprodigiosin dựa trên phân tích NMR và MS, còn đƣợc gọi là prodigiosin 25-C, là một trong những sắc tố đỏ đƣợc sản xuất bởi Serratia sp. và Streptomyces sp. Nó có hoạt động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing tƣơng tự nhƣ prodigiosin, nhƣng ít đƣợc nghiên cứu hơn (Tomas và cộng sự, 2003). 1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới 1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens Brigida và Itamar (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serra- tia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marces- cens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh. Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Ser- ratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng. 1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin Sundaramoorthy và cộng sự (2009), thực hiện nghiên cứu để sàng lọc những chủng Serratia có hiệu quả sản xuất prodigiosin và đã phân lập đƣợc chủng Serratia marcescens NY1 từ đất. 30 Đồ án tốt nghiệp Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất prodigiosin bởi Ser- ratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l. Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigio- sin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigio- sin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol:hydrochloric acid (9,5:0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candi- da albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm, chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu. Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodi- giosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml. Một số bằng sáng chế về prodigiosin đƣợc liệt kê trong bảng 1.6 (Krishna, 2008). 31 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin Tên Patent Tóm tắt Tác giả Ngày công bố United States A novel use of prodigiosin Kim Hwanmook, 10/28/2003 Patent for treating diabetes mellitus Han Sangbae, 6638968 without any side effect Lee Changwoo, Lee Kihoon, Park Sehyung, Kim Youngkook. United States The prodigiosin from Kim Hwanmook, 11/11/2003 Patent Serratia marcescens is useful Kim Youngkook, 6645962 as an immunosuppressive in Han Sangbae, various fields, including the Yoo Sungak. treatment of the diseases requiring immunosuppression and the basic research for the diseases, the transplantation of the organs or tissues. and the immune cells. United States The invention relates to novel Kim Hwan- 07/01/2004 Patent use of prodigiosin for the Mook Han Sang- 4266028 treatment of Rheumatic Bac Lee Chang- m1hritis and can provide Woo Lee Ki- excellent treatment effect to Hoon Park Se- Rheumatic arthritis by Hyung Kim Hy- treating composition oung Chin including prodigiosin isolated Kim Young- from Serratia marcescens as Kook an active principle to DBA-l 32 Đồ án tốt nghiệp mouse of collageninduced Rheumatic al1hritis animal model and thereby inhibiting production of internal cytokine which is a important pathogen of Rheumatic 33 Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Thời gian. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 30/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị 2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 và SH5 đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Giống vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp của Lê Quốc Vũ, 2015 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. a. Môi trƣờng ( Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1) - Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA) - Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG) - Môi trƣờng Casein - Môi trƣờng Lipit - Môi trƣờng huyền phù Chitin 1% - Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1) - Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2) - Môi trƣờng lên men (MTLM) b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70, cồn 96 - NaCl - HCl, NaOH 34 Đồ án tốt nghiệp - Petroleum ether - Nƣớc muối bão hòa 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ - Phiễu chiết - Ống nghiệm - Đĩa petri - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml - Pipetman 100μl, 1000μl. - Đầu típ - Đũa thủy tinh - Bao hấp, giấy gói, thun - Đèn cồn, que cấy vòng - Bông không thấm, bông thấm - Chai syrum 100ml. b. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Cân phân tích - Bếp từ - Máy nƣớc cất - Autolave - Tủ hút - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy đo quang phổ - Máy cô quay - Bể điều nhiệt 35 Đồ án tốt nghiệp - Kính hiển vi 2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.3.1 Mục đích Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 2.3.2 Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại bào. Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men để thu prodigiosin nhiều nhất. 2.3.3 Phương pháp luận Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng không trễ pha với quá trình tăng trƣởng tế bào. Dịch môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đó của các tác giả trong và ngoài nƣớc để xác định môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm. 2.3.4 Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau: 36 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB) Chọn lọc chủng Thiết lập môi trƣờng nhân giống Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men Chế phẩm prodigiosin thô Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm prodigiosin thô. 37 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi sinh vật (S.marcescens SH4, SH5 và HB). Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG Thử nghiệm enzyme ngoại Trích ly thu prodigiosin bào Lipase Protease Chitinase Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. 38 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi trƣờng MT1 trƣờng MT2 trƣờng PG 0h 4h 8h 16h 20h 24h Đo độ đục (mật độ tê bào) OD = 620nm Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 39 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi trƣờng MT2 trƣờng PG Lên men Lên men Lên men trên môi Lên men trên trên môi trên môi trƣờng LMTL, môi trƣờng trƣờng trƣờng PG PGTL LMTL, PGTL PG Tiếp liệu Glycerol 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia mar- cescens SH4 40 Đồ án tốt nghiệp 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. 2.4.1.1. Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh điểm cấy. Khả năng phân giải lipid đƣợc đánh giá qua đƣờng kính vòng tủa trên đĩa thạch mm. Vòng tủa càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: 41 Đồ án tốt nghiệp Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme protesae thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease càng nhiều. Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm), với D là đƣờng lính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase càng nhiều. 2.4.1.2. Phương pháp trích ly thu prodigiosin Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 48h. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH =2 trong 4 giờ; cho 450μl HCl 1N vào trong canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vòng/phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng sau khi sử lý acid HCl trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450μl NaOH 1N để đƣa về pH =7, đem đo OD620nm và OD499nm, song song đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình: 42 Đồ án tốt nghiệp Canh trƣờng sau nuôi cấy Xử lý acid Trung hòa Đo độ đục (mật độ tế NaOH 1N bào) OD = 600 nm Đo prodigiosin OD = Ly tâm 4000 vòng/phút 499 nm trong 15 phút Ethanol: HCl 1N Dịch trong Sinh khối (95:5; v:v) Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Sắc tố thô Dịch trong Trích ly Đo prodigiosin sau trích ly lỏng lỏng OD = 535 nm Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v;v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535 nm, xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD vào phƣơng trình 43 Đồ án tốt nghiệp 2 đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Tiến hành đo mật độ tế bào OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 4h, t = 8h, t =16h, t = 20h, t = 24h. Theo dõi mật độ tế bào tổng hợp đƣợc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng của chủng vi sinh vật. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm. 2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men 2.4.3.1. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL – môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 5g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. 44 Đồ án tốt nghiệp Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) tiếp liệu với nồng độ glycerol là 5 g/l. Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.3.2. Phương pháp khảo sát thiết lập chế độ lên men Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h. Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc. Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 2.5 g/l, 5 g/l. 7.5 g/l và 10 g/l theo sơ đồ sau: 45 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH4 Tăng sinh trên môi trƣờng PG Lên men trên Lên men trên môi trƣờng môi trƣờng PG PGTL Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu Glycerol Glycerol 5 Glycerol Glycerol 2.5 g/l g/l 7.5 g/l 10 g/l 0h 9h 24h 33h 48h 57h Đo prodigiosin OD = 499nm Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol 46 Đồ án tốt nghiệp Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu. Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian: t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h. Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh vật. 2.4.4. Phương pháp phân tích 2.4.4.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin. 2.4.4.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này. 47 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và prodigiosin cao nhất Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease, chitinase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch và lipase bằng phƣơng pháp cấy điểm. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ dịch nuôi cấy bằng Ethanol:HCl 1N (95:5, vv) và xác định nồng độ nhờ phƣơng pháp đo OD535nm và xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD535nm vào 2 phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào Mục tiêu của lên men S.marcescens trong đề tài là sản xuất chế phẩm prodigi- osin thô từ đó tạo chế phẩm diệt sâu. Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng đƣợc cấu thành từ các thành phần chính gồm lipid, protein và bộ xƣơng ngoài là chitin. Ngoài việc thu nguồn prodigiosin thì chủng vi sinh vật chọn lọc cần đòi hỏi phải tổng hợp các enzyne ngoại bào có khả năng thủy phân protein, lipid và chitin Thử nghiệm hoạt tính protease Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa casein, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử trichloroacetic acid (TCA), đo vòng phân giải ca- sein. Phần còn lại là casein chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein thì tất cả các chủng đều có khả năng phân giải casein là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1). 48 Đồ án tốt nghiệp SH4 SH5 HB Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính lipase Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trƣờng đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trƣờng tạo ra các acid béo, các acid béo đƣợc giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trƣờng. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trƣờng xung quanh điểm cấy. 49 Đồ án tốt nghiệp Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. Tween 80 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả hình 3.2 và bảng 3.1 thì chủng SH4 và HB là các chủng có khả năng phân giải casein mạnh nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng tween là 27,3 A ± 1,70 và 24,7 AB ± 1,25, chủng SH5 có khả năng phân giải casein kém nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng casein là 27,3 A ± 1,70. SH4 SH5 HB Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB Thử nghiệm hoạt tính chitinase Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử lugol, đo vòng phân giải chitin. Khi chitinase có mặt trong môi trƣờng chitin nó sẽ phân giải chitin thành N- acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không băt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật. Khi bổ sung dịch vi khuẩn vào giếng thạch trên môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả hình 3.2 các chủng khảo sát đều không có hoạt tính chitinase. Kết luận các chủng vi sinh vật không có khả năng tiết enzyme chitinase phân giải chitin có trong môi trƣờng. 50 Đồ án tốt nghiệp SH4 SH5 HB Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Stt Chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng khảo sát tƣơng ứng Casein agar Tween 80 agar Chitin agar 1 SH4 37,0A ± 4,32 24,7 AB ± 1,25 0 2 SH5 32,0A ± 6,68 24,0 B ± 0,82 0 3 HB 37,7A ± 4,11 27,3 A ± 1,70 0 Nhƣ vậy dịch nuôi cấy các chủng S.marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN trên môi trƣờng peptone glycerol chứa enzyme protease và lipase, trong khi đó không thể hiện hoạt tính chitinase. Theo Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng sự, 2007 và nhiều tác giả khác thì S. marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinnase. Điều này cho thấy hoạt tính chitinase của các chủng trên là có thể là không ổn định hoặc trong thời gian bảo quản đã mất hoạt tính của enzyme chitinase. Trong 3 hoạt tính enzyme ngoại bào liên quan đến khả năng diệt sâu của các chủng Serratia marcescens thì còn giữ đƣợc 2 trong 3 hoạt tính, điều này cho thấy quá trình giữ giống gốc vô cùng quan trọng đối vi sinh công nghiệp. Theo K Ishii et al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm lar- 51 Đồ án tốt nghiệp vae). Kết quả của thí nghiệm cho thấy hai chủng SH4 và HB có khả năng tổng hợp protease cao nhất, góp phần vào hoạt tinh diệt sâu của các chủng S.marcescens. 3.1.2. Trích ly thu prodigiosin Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đỏ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn S. mercescens, và đƣợc nghiên cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nhƣ hoạt động ức chế miễn dịch, kháng ung thƣ, kháng khuẩn và một số nấm mốc cũng nhƣ có khả năng diệt sâu...Những nghiên cứu trƣớc đó cho thấy prodigiosin thể hiện hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exigua. Để sản xuất chế phẩm diệt sâu chứa prodigiosin ta có có hai cách là sử dụng trực tiếp dịch canh trƣờng vi khuẩn sau lên men hoặc trích ly thu hồi prodigiosin. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp prodigiosin từ các chủng SH4, SH5 và HB trong môi trƣờng peptone glycerol. Với mục đích tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhằm đảm bảo an toàn sinh học ngƣời thực hiện đề tài tiến hành xử lý dịch canh trƣờng bằng acid HCl 1N và trung hòa bằng NaOH về pH trung tính. Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp prodigiosin của các chủng nghiên cứu ngƣời thực hiện đề tài đo OD499nm và OD620nm dịch canh trƣờng sau xử lý acid (Mekhael và Yuosif, 2009) và song song đó tiến hành trích ly thu prodigiosin bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v:v) để thu sắc tố đỏ. Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng 100 lần mỗi mẫu bằng dung môi Ethanol:HCL 1N (95:5, v:v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535nm, xác định nồng độ prodigiosin thu đƣợc sau trích ly bằng cách thay giá trị OD vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigi- 2 osin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013). 52 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. STT Chủng vi OD499nm OD620nm hiệu OD535nm hiệu khuẩn hiệu chỉnh chỉnh chỉnh 1 SH4 9,739A±0,25 4,004B±0,06 12,42A±0,49 2 SH5 8,461B±0,5 3,383C±0,04 7,617C±0,14 3 HB 10,21A±0,51 4,480A±0,11 11,13B±0,51 14 12,42 a 11,13 b 12 9,739 a 10,21 a 10 8,461 b 7,617 c 8 OD499nm 6 4,004 b 4,480 a OD620nm 3,383 c OD hiệu chỉnh OD hiệu 4 OD535nm 2 0 SH4 SH5 HB Chủng vi khuẩn Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng các chủng có khả năng sinh prodigiosin cao nhất là chủng SH4 và HB thể hiện qua giá trị OD499nm (đo prodigiosin trực tiếp trong canh trƣờng) và kết quả OD535nm (đo pro- digiosin sau trích ly). 53 Đồ án tốt nghiệp Tóm lại hai chủng SH4 và HB vừa có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme protease, lipase nhƣ nhau; cao hơn chủng SH5 trong cùng một điều kiện khảo sát. Trong khuôn khổ của đồ án tốt nghiệp ngƣời thực hiện đề tài sẽ sử dụng chủng S.marcescens SH4 để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. Dựa vào đƣờng chuẩn thì chủng SH4 khi tổng hợp prodigiosin thì nồng độ cực đại thu đƣợc sau trích ly là 13,67 mg/ml trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm. 3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) Hình thái khuẩn lạc A C B D Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 A. Khuẩn lạc của chủng SH4 trên môi trƣờng PGA. B. Khuẩn lạc của chủng SH4 soi nghiêng trên môi trƣờng PGA. Dựa vào kết quả soi khuẩn lạc hình 3.5 thì ch...arcescens. Microbiology and Immunology 35: 607- 614. Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashii Hara, Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa Sekimizu. (2014). Identification of a Serratia marcescens virulence factor that promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, J In- vertebr Pathol 117, 61-67. Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotech- nology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India. Lawanson A.O. and Sholeye F.O. (1975). Inhibition of prodigiosin for- mation in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439- 440. Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from ma- rine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17. Lynch, D. L., T. E. Worthy, and G. C. Kresheck (1968) Chromatographic separation of the pigment fractions from a Serratia marcescensstrain. Appl. Microbiol. 16: 13-20. Mandarville R.A. (2001). Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218. Matsuyama, T., Murakami, T., Fujita, M., Fujita, S.and Yano, T. (1986). Extracellular vesicle formation and biosurfactant production by Serratia marcescens. Journal of General Microbiology 132: 865-875. Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal of Duhok University12: 268-274. Maeda, H., and K. Morihara. 1995. Serralysin and related bacterial proteinases. Methods Enzymol. 248 :395-413. 74 Đồ án tốt nghiệp Nakashima, Tamura, Kurachi, M., Yamaguchi, K. and Oda, T. (2005).Apoptosis-mediated cytotoxicity of prodigiosin-like red pigment produced by gammaProteobacterium and its multiple bioactivities. Biological and Pharmaceutical Bulletin 28: 2289–2295. Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosyn- thesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709. Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268-274. Rosenberg, M., Y. Blumberger, H. Judes, R. Barness, E. Rubinstein, and Y. Mazor (1986) Cell surface hydrophobicity of pigmented and nonpigmented clinical Serratia marcescensstains. Infect. Immun.51: 932-935. Rokem, J. S. and P. Weitzman (1987) Prodigiosin formation by Serratia marcescensin a chemostat. Enzyme Microb. Technol. 9: 53-155 Sole, M., A. Francia, N. Rius, and J. G. Loren (1997). The role of pH in the glucose effect on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia mar- cescens. Lett. Appl. Microbiol. 25: 81-84. Sole, M., Francia, A., Rius, N. and Loren, J.G. (1997).The role of pH in the ‘glucose effect’ on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia marcescens. Letters in Applied Microbiology 25: 81–84. Yutaka Kida, Hiroyoshi Inoue, Koichi Kuwano, 2007; Serratia marcescens Serralysin Indues Inflammatory responses through protease. 75 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ, PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Môi trƣờng Peptone glycerone agar Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít Môi trƣờng Peptone glycerone broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase (gram/lit) Glucose 1,00 Yeast extract 3,6 Tween 80 30,00 ml NH4Cl 5,00 K2HPO4 0,10 MgCl2 0,01 CaCl2 0.444 pH cuối ở 250C là 7,0 ± 0,2 Thành phần môi trƣờng casein (gram/lít) Casein 10,00 Agar 15,00 Thảnh phần môi trƣờng thạch huyền phù chitin Dịch huyền phù chitin 1% 100ml Agar 1,50g Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1) Meat 3,00 gram/lít 76 Đồ án tốt nghiệp Yeast extract 5.33 gram/lít Sucrose 11,72 gram/lít Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2) Glycerol 10,00 gram/lít Tryptone 2,00 gram/lít Yeast extract 1,00 gram/lít (NH4)2SO4 6,00 gram/lít K2HPO4 10,00 gram/lít NaCl 0.5 gram/lít MgSO4 0.5 gram/lít Môi trƣờng lên men (MTLM) Glycerol 10,00 gram/lít Tryptone 10,00 gram/lít Yeast extract 10,00 gram/lít Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phƣơng pháp của Dai et al., (2011) Do đặc tính của chitin không tan trong nƣớc nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin. - Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở 40C qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. - Dịch huyền phù đƣợc thu lại bằng cách lọc hoặc ly tâm (4000 vòng/phút trong 20 phút). Huyền phù này đƣợc đƣợc rửa với nƣớc cất nhiều lần cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nƣớc cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù. Chuẩn bị hóa chất nhuộm Gram - Dung dịch Drystal violet 2g crystal violet hòa tan trong 20ml ethanol 96% 0,8g ammon oxalat hòa tan trong 80ml nƣớc cất 77 Đồ án tốt nghiệp Trộn hai dung dịch nói trên với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng đƣợc vài tháng. - Dung dịch Iodine Hòa tan 1g iodine trong 3 – 5ml nƣớc cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nƣớc cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối. - Dung dịch tẩy màu: Ethanol 96% - Dung dịch nhuộm bổ sung 0,3g fuchsin kiềm hòa tan trong 10ml ethanol 96% 5g phenol hòa tan trong 95ml nƣớc cất Trộn hai dung dịch nói trên rồi pha loãng 5 lần. Bảo quản trong lọ tối. Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý, sinh hóa Soi khuẩn lạc Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng PGA. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dƣới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X. Nhuộm Gram: Nguyên tắc nhuộm Gram: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau: Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này là vi khuẩn Gram dƣơng. Loại phức chất thứ hai không giữ đƣợc màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này là vi khuẩn Gram âm. Các bƣớc tiến hành: Tăng sinh chủng vi khuẩn vứa chọn lọc với chủng vi khuẩn đối chứng là Serratia marcescens SH1 trong môi trƣờng PG 24 giờ, lắc 150 vòng/phút trong tối ờ nhiệt độ phòng.  Làm tiêu bản 78 Đồ án tốt nghiệp - Chọn lame sạch và khô. Dùng que cây vô trùng lấy một chút sinh khối vi sinh vật làm vết bôi trên lame. - Dùng kẹp gỗ ho nhẹ mặt dƣới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi.  Nhuộm tiêu bản - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 1 phút, rửa nƣớc, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iodine trong 1 phút, rửa nƣớc, thấm khô. - Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu, rửa nƣớc, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin 30 giây, rửa nƣớc, thấm khô. - Quan sát vi sinh vật dƣới kính vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ bắt màu tím. Bảng 1. Giá thành phần môi trƣờng: STT Hóa chất Đơn vị Giá (Đồng) Giá (1gram, 1ml/đồng) 1 Tryptone 500g/chai 880000 1760 2 Glycerol 1 lít 121000 121 3 Meat extract 250g/chai 530000 2120 4 Yeast extract 500g/chai 660000 1320 5 Sucrose 1kg 18000 18 6 (NH4)2SO4 1kg 100000 100 7 K2HPO4 1kg 154000 154 8 NaCl 1kg 66000 66 9 MgSO4 1kg 77000 77 79 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. Bảng giá môi trƣờng 1 (môi trƣờng thu sinh khối cực đại - ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010) STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng) 1 Meat extract 3 6360 2 Yeast extract 5,33 7035.6 3 Sucrose 11.72 210.96 Tổng tiền 13606.56 Bảng 3. Bảng giá môi trƣờng 2 (môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng) 1 Glycerol 10 1210 2 Tryptone 2 3520 3 NaCl 0.5 33 4 MgSO4 0.5 38.5 5 K2HPO4 10 1540 6 (NH4)2SO4 6 600 7 Yeast extract 1 1320 Tổng tiền 8261.5 Bảng 4. Bảng giá môi trƣờng lên men (môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng) 1 Tryptone 10 17600 2 Yeast extract 10 13200 3 Glycerol 10 1210 Tổng tiền 32010 80 Đồ án tốt nghiệp Bảng 5. Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. Stt Thời OD 499nm hiệu chỉnh gian ĐC 2.5 g/l 5 g/l 7.5 g/l 10 g/l (h) 1 0 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004 2 9 1,183I±0,059 1,205I±0,016 1,092G±0,051 1,183I±0,091 1,169I±0,022 3 24 2,836GH±0,06 7,593CD±0,27 3,094G±0,137 2,462GH±0,107 2,570GH±0,098 3 1 4 33 3,261EF±0,10 7,841C±0,241 6,903DE±0,17 2,955GH±0,368 2,433GH±0,144 5 9 5 48 3,858F±0,285 10,69A±0,696 6,965DE±0,41 2,265H±0,049 2,475GH±0,107 3 6 57 3,258FG±0,20 9,473B±0,548 6,5E±0,498 2.223H±0,066 2,217H±0,042 7 81 Đồ án tốt nghiệp B. PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH SH4 SH5 HB Hình 1 Dịch canh trƣờng của các chủng vi khuẩn Serratia marcescens sau khi xử lý acid SH4 SH5 HB Hình 2 Dịch canh trƣờng của các chủng vi khuẩn Serratia maecescens sau khi ly tâm. 82 Đồ án tốt nghiệp Hình 3 Sau quá trình trích ly lỏng- lỏng với hệ dung môi petroleum ether: nƣớc muồi bảo hòa (2:3, v:v). SH4 SH5 HB Hình 4 H ợp chất prodigiosin sau khi trích ly bằng bỗn hợp dung môi Ethanol:HCl (95:5). 83 Đồ án tốt nghiệp MT1 MT2 PG 0H 4H 8H 16H 20H 24H Hình 5 Tốc độ tăng trƣởng của vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên các môi trƣờng nhân giống theo thời gian 84 Đồ án tốt nghiệp ĐC PG LM 0H 9H 24H 33 H 48 H 57H Hình 6 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. 85 Đồ án tốt nghiệp ĐC PG LM 0H 9H 24H 33H 48H 57H Hình 7 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. 86 Đồ án tốt nghiệp ĐC 2,5 G/L 5 G/L 7,5 G/L 10 G/L 0h 0H 9H 24H 33H 48H 57H Hình 8 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên môi trƣờng PG theo thời gian. 87 Đồ án tốt nghiệp 12 Môi trường PG đối 10 chứng 8 Môi Trường PG tiếp liệu glycerol 2.5 g/l 6 Môi Trường PG tiếp liệu glycerol 5 g/l 4 Môi Trường PG tiếp OD 499nm hiệu chỉnh499nmhiệuOD 2 liệu glycerol 7.5 g/l Môi Trường PG tiếp 0 liệu glycerol 10 g/l 0 20 40 60 Thời gian (h) Hình 9. Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. 88 Đồ án tốt nghiệp C. PHỤ LỤC C. SỐ LIỆU THỐNG KÊ 1. Thí nghiệm chọn chủng vi sinh A. Thí nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Serratia marcescens SH4, SH5 và HB Hoạt tính protease Class Level Information Class Levels Values CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5 Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 Dependent Variable: PRODI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 57.5555556 28.7777778 0.72 0.5256 Error 6 240.6666667 40.1111111 Corrected Total 8 298.2222222 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.192996 17.81250 6.333333 35.55556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 2 57.55555556 28.77777778 0.72 0.5256 t Tests (LSD) for PRODI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 40.11111 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 12.653 89 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 37.667 3 Hb A 37.000 3 Sh4 A 32.000 3 Sh5 Hoạt tính lipasease Class Level Information Class Levels Values CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5 Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 Dependent Variable: PRODI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 18.66666667 9.33333333 3.65 0.0917 Error 6 15.33333333 2.55555556 Corrected Total 8 34.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.549020 6.310305 1.598611 25.33333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 2 18.66666667 9.33333333 3.65 0.0917 t Tests (LSD) for PRODI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 2.555556 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 3.1939 90 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 27.333 3 Hb B A 24.667 3 Sh4 B 24.000 3 Sh5 B. Thí nghiệm trích ly thu prodigiosin từ các chủng Serratia marcescens SH4, SH5 và SH1 OD 499nm hiệu chỉnh sau xử lý acid Class Level Information Class Levels Values CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5 Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 Dependent Variable: PRODI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 4.91372356 2.45686178 8.50 0.0178 Error 6 1.73431200 0.28905200 Corrected Total 8 6.64803556 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.739124 5.677383 0.537636 9.469778 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 2 4.91372356 2.45686178 8.50 0.0178 t Tests (LSD) for PRODI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.289052 91 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.0741 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 10.2093 3 Hb A 9.7393 3 Sh4 B 8.4607 3 Sh5 OD 620 nm hiệu chỉnh sau xử lý acid Class Level Information Class Levels Values CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5 Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 Dependent Variable: PRODI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 1.81448089 0.90724044 103.37 <.0001 Error 6 0.05265867 0.00877644 Corrected Total 8 1.86713956 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.971797 2.368249 0.093683 3.955778 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 2 1.81448089 0.90724044 103.37 <.0001 t Tests (LSD) for PRODI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.008776 92 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.1872 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 4.48000 3 Hb B 4.00400 3 Sh4 C 3.38333 3 Sh5 OD 535 nm hiệu chỉnh sau trích ly Class Level Information Class Levels Values CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5 Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 Dependent Variable: PRODI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 37.03012356 18.51506178 71.62 <.0001 Error 6 1.55117511 0.25852919 Corrected Total 8 38.58129867 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.959795 4.895082 0.508458 10.38711 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 2 37.03012356 18.51506178 71.62 <.0001 t Tests (LSD) for PRODI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.258529 93 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.0158 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 12.4167 3 Sh4 B 11.1280 3 Hb C 7.6167 3 Sh5 C. So sánh hoạt tính enzyme của chủng SH4 với SH1 Hoạt tính enzyme protease Class Level Information Class Levels Values CHUNG 2 Sh1 Sh4 Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 Dependent Variable: PRODI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.28166667 0.28166667 3.60 0.1308 Error 4 0.31333333 0.07833333 Corrected Total 5 0.59500000 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 94 Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.473389 10.17749 0.279881 2.750000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 1 0.28166667 0.28166667 3.60 0.1308 t Tests (LSD) for PRODI Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.078333 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.6345 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 2.9667 3 Sh4 A 2.5333 3 Sh1 Hoạt tính enzyme lipase Class Level Information Class Levels Values 95 Đồ án tốt nghiệp Class Level Information Class Levels Values CHUNG 2 Sh1 Sh4 Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 Dependent Variable: PRODI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.32666667 0.32666667 4.90 0.0913 Error 4 0.26666667 0.06666667 Corrected Total 5 0.59333333 R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean 0.550562 4.666245 0.258199 5.533333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 1 0.32666667 0.32666667 4.90 0.0913 t Tests (LSD) for PRODI Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 96 Đồ án tốt nghiệp Error Mean Square 0.066667 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.5853 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 5.7667 3 Sh4 A 5.3000 3 Sh1 2. Thí nghiệm thiết lập môi trƣờng nhân giống Class Level Information Class Levels Values moitruong 4 20h MT1 MT2 PG thoigian 8 0h 16h 20h 24h 4h 8h MT2 PG moitruongthoigian 20 20h PG MT1 0h MT1 16h MT1 20h MT1 24h MT1 4h MT1 8h MT1 MT2 MT2 0h MT2 16h MT2 20h MT2 24h MT2 4h MT2 8h PG 0h PG 16h PG 20h PG 24h PG 4h PG 8h Number of Observations Read 81 Number of Observations Used 50 Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 97 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16 552.9292253 34.5580766 123.94 <.0001 Error 33 9.2016907 0.2788391 Corrected Total 49 562.1309159 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.983631 13.07694 0.528052 4.038040 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F moitruong 2 178.8852946 89.4426473 320.77 <.0001 thoigian 5 322.0413832 64.4082766 230.99 <.0001 moitruongthoigian 9 52.0025474 5.7780608 20.72 <.0001 Duncan's Multiple Range Test for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 33 Error Mean Square 0.278839 Harmonic Mean of Cell Sizes 2.914286 Note: Cell sizes are not equal. 98 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N moitruongthoigian A 9.3210 3 MT1 24h A 8.6600 3 MT1 20h A 8.6407 3 MT2 24h A 8.6000 3 MT2 20h B 7.2033 3 MT1 16h B 6.6100 MT2 16h C 6.0213 3 MT1 8h C 5.1840 3 MT2 8h D 2.9020 3 PG 20h D 2.7510 3 MT1 4h D 2.7480 2 PG 24h D 2.0890 3 MT2 4h D 1.9360 3 PG 16h E 1.0060 3 PG 8h E 0.4440 3 MT1 0h E 0.3890 3 PG 4h E 0.2253 3 MT2 0h E 0.0960 3 PG 0h 99 Đồ án tốt nghiệp 3. Thí nghiệm hiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men A. Thiết lập môi trƣờng lên men B. OD 499 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống MT2 C. Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 3 LM PG PGTL THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h MOITRUONGTHOIGIAN 18 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM 57h LM 9h PG 0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG 9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL 9h Number of Observations Read 54 Number of Observations Used 54 Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 17 99.4524468 5.8501439 36.52 <.0001 Error 36 5.7666000 0.1601833 Corrected Total 53 105.2190468 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.945194 16.60740 0.400229 2.409944 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F 100 Đồ án tốt nghiệp Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 2 20.20880044 10.10440022 63.08 <.0001 THOIGIAN 5 69.83413306 13.96682661 87.19 <.0001 MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.40951333 0.94095133 5.87 <.0001 Duncan's Multiple Range Test for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experi- mentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.160183 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN A 5.0833 3 LM 57h B 4.3280 3 LM 48h C B 3.7580 3 LM 33h C 3.4880 3 PG 48h C D 3.3880 3 LM 24h C D E 3.0433 3 PG 33h F D E 2.7333 3 PG 24h F D E 2.6907 3 LM 9h 101 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN F E 2.5200 3 PGTL 48h F E 2.3817 3 PGTL 33h F G E 2.3147 3 PGTL 24h F G 2.2820 3 PGTL 57h F G 2.2480 3 PG 57h H G 1.6060 3 PG 9h H 1.0410 3 PGTL 9h I 0.1843 3 LM 0h I 0.1443 3 PG 0h I 0.1443 3 PGTL 0h OD 499 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống peptone glycerol Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 2 PGDC PGTL THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h MOITRUONGTHOIGIAN 12 PGDC 0h PGDC 24h PGDC 33h PGDC 48h PGDC 57h PGDC 9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL 9h Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 Dependent Variable: Y 102 Đồ án tốt nghiệp Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 11 32.07697156 2.91608832 178.14 <.0001 Error 24 0.39287533 0.01636981 Corrected Total 35 32.46984689 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.987900 7.047129 0.127945 1.815556 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 1 3.35134044 3.35134044 204.73 <.0001 THOIGIAN 5 24.50947689 4.90189538 299.45 <.0001 MOITRUONGTHOIGIAN 5 4.21615422 0.84323084 51.51 <.0001 Duncan's Multiple Range Test for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 24 Error Mean Square 0.01637 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN A 3.6040 3 PGTL 48h B 3.3640 3 PGTL 57h C 2.4220 3 PGTL 33h C 2.3507 3 PGDC 48h D 1.9800 3 PGDC 33h E 1.6613 3 PGTL 24h E 1.5600 3 PGDC 57h E 1.5053 3 PGDC 24h F 1.1470 3 PGTL 9h 103 Đồ án tốt nghiệp F 1.1410 3 PGDC 9h G 0.5257 3 PGDC 0h G 0.5257 3 PGTL 0h OD 620 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống peptone glycerol Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 3 LM PG PGTL THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h MOITRUONGTHOIGIAN 8 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM 57h LM 9h PG 0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG 9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL 9h Number of Observations Read 54 Number of Observations Used 54 Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 17 70.23312565 4.13136033 84.86 <.0001 Error 36 1.75256667 0.04868241 Corrected Total 53 71.98569231 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.975654 13.08162 0.220641 1.686648 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 2 36.27666515 18.13833257 372.58 <.0001 THOIGIAN 5 24.05226254 4.81045251 98.81 <.0001 MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.90419796 0.99041980 20.34 <.0001 Duncan's Multiple Range Test for Y 104 Đồ án tốt nghiệp NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.048682 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN A 3.5920 3 LM 57h A 3.5580 3 LM 33h A 3.4767 3 LM 24h A 3.2617 3 LM 48h B 2.7360 3 LM 9h C 1.9860 3 PGTL 48h C 1.9800 3 PGTL 57h D 1.5693 3 PGDC 48h E D 1.4600 3 PGTL 33h E D 1.3483 3 PGDC 33h E F 1.1587 3 PGDC 24h E F 1.1467 3 PGTL 24h G F 0.8200 3 PGDC 9h G F 0.8190 3 PGTL 9h G H 0.5320 3 PGDC 57h H 0.3573 3 LM 0h H 0.2790 3 PGTL 0h H 0.2790 3 PGDC 0h D. Thiết lập chế độ lên men OD 499 nm hiệu chỉnh 105 Đồ án tốt nghiệp Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 11 PG0h PG24h PG48h PG57h PG9h PGTL0h PGTL24h PGTL33h PGTL48h PGTL57h PGTL9h THOIGIAN 5 10g 2.5g 5g 7.5g DC MOITRUONGTHOIGIAN 29 PG0h DC PG24h DC PG48h DC PG57h DC PG9h DC PGTL0h 10g PGTL0h 2.5g PGTL0h 5g PGTL0h 7.5g PGTL24h 10g PGTL24h 2.5g PGTL24h 5g PGTL24h 7.5g PGTL33h 10g PGTL33h 2.5g PGTL33h 5g PGTL33h 7.5g PGTL48h 10g PGTL48h 2.5g PGTL48h 5g PGTL48h 7.5g PGTL57h 10g PGTL57h 2.5g PGTL57h 5g PGTL57h 7.5g PGTL9h 10g PGTL9h 2.5g PGTL9h 5g PGTL9h 7.5g Number of Observations Read 90 Number of Observations Used 90 Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 28 740.0586983 26.4306678 136.02 <.0001 Error 61 11.8529948 0.1943114 Corrected Total 89 751.9116931 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 106 Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.984236 13.46695 0.440808 3.273256 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 10 359.3172470 35.9317247 184.92 <.0001 THOIGIAN 3 231.5961649 77.1987216 397.29 <.0001 MOITRUONGTHOIGIAN 15 149.1452864 9.9430191 51.17 <.0001 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 61 Error Mean Square 0.194311 Harmonic Mean of Cell Sizes 3.052632 Note: Cell sizes are not equal. Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN A 10.6890 3 PGTL48h 2.5g B 9.4733 3 PGTL57h 2.5g C 7.8407 3 PGTL33h 2.5g D C 7.5933 3 PGTL24h 2.5g 107 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN D E 6.9650 3 PGTL48h 5g D E 6.9033 3 PGTL33h 5g E 6.5000 3 PGTL57h 5g F 3.8580 3 PG48h DC G F 3.2580 3 PG57h DC G 3.0940 3 PGTL24h 5g G H 2.9550 3 PGTL33h 7.5g G H 2.8355 6 PG24h DC G H 2.5700 3 PGTL24h 10g G H 2.4750 3 PGTL48h 10g G H 2.4620 3 PGTL24h 7.5g G H 2.4330 3 PGTL33h 10g H 2.2650 3 PGTL48h 7.5g H 2.2230 3 PGTL57h 7.5g H 2.2170 3 PGTL57h 10g I 1.2053 3 PGTL9h 2.5g I 1.1827 3 PG9h DC I 1.1827 3 PGTL9h 7.5g I 1.1693 3 PGTL9h 10g 108 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN I 1.0920 3 PGTL9h 5g J 0.1840 3 PG0h DC J 0.1840 3 PGTL0h 10g J 0.1840 3 PGTL0h 2.5g J 0.1840 3 PGTL0h 5g J 0.1840 3 PGTL0h 7.5g OD 620 nm hiệu chỉnh Class Level Information Class Levels Values MOITRUONG 3 LM PG PGTL THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h MOITRUONGTHOIGIAN 18 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM 57h LM 9h PG 0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG 9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL 9h Number of Observations Read 54 Number of Observations Used 54 Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 17 99.4524468 5.8501439 36.52 <.0001 109 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Error 36 5.7666000 0.1601833 Corrected Total 53 105.2190468 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.945194 16.60740 0.400229 2.409944 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F MOITRUONG 2 20.20880044 10.10440022 63.08 <.0001 THOIGIAN 5 69.83413306 13.96682661 87.19 <.0001 MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.40951333 0.94095133 5.87 <.0001 Duncan's Multiple Range Test for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 36 Error Mean Square 0.160183 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN A 5.0833 3 LM 57h B 4.3280 3 LM 48h B C B 3.7580 3 LM 33h C 3.4880 3 PG 48h 110 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN C D 3.3880 3 LM 24h C D E 3.0433 3 PG 33h F D E 2.7333 3 PG 24h F D E 2.6907 3 LM 9h F E 2.5200 3 PGTL 48h F E 2.3817 3 PGTL 33h F G E 2.3147 3 PGTL 24h F G 2.2820 3 PGTL 57h F G 2.2480 3 PG 57h H G 1.6060 3 PG 9h H 1.0410 3 PGTL 9h I 0.1843 3 LM 0h I 0.1443 3 PG 0h I 0.1443 3 PGTL 0h 111