Nghiên cứu sử dụng trái Thanh Long (Hylocereus undatus) để chế biến nước uống lên men

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH LE THÒ KIEÀU OANH NGHIEÂN CÖÙU SÖÛ DUÏNG TRAÙI THANH LONG (Hylocereus undatus) ÑEÅ CHEÁ BIEÁN NÖÔÙC UOÁNG LEÂN MEN LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH - 2005 LÔØI CAÛM ÔN Em xin traân troïng baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán coâ Traàn Thò Thanh – caùn boä giaûng daïy cuûa tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ taän tình giuùp ñôõ, höôùng daãn vaø truyeàn ñaït cho em nhieàu kinh nghieäm quyù baùu trong suoát quaù trình thöïc hieän luaän vaên naøy. Em xin chaân thaønh caûm ôn quyù thaày coâ Khoa Sinh vaø caùn boä giaûng daïy lôùp cao hoïc khoùa 13 chuyeân ngaønh Vi sinh vaät ñaõ taän taâm giaûng daïy vaø truyeàn ñaït cho em nhieàu kieán thöùc quyù baùu trong suoát khoùa hoïc. Em xin baøy toû loøng bieát ôn ñeán caùc thaày coâ, caùn boä phuï traùch phoøng thí nghieäm sinh lyù-sinh hoùa- vi sinh ñaõ nhieät tình giuùp ñôõ vaø taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho em hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Caûm ôn caùc baïn cuøng khoùa ñaõ ñoùng goùp nhieàu yù kieán, giuùp ñôõ ñoäng vieân trong suoát thôøi gian qua. Con xin chaân thaønh kính toû loøng bieát ôn boá meï vaø anh Leâ Kim Nhaät ñaõ ñoäng vieân an uûi vaø laø choã döïa tinh thaàn cuõng nhö vaät chaát taïo ñieàu kieän thuaän lôïi ñeå hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Hoïc vieân Leâ Thò Kieàu Oanh MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan I Mục lục II Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI Danh mục các bảng VII Danh mục các hình X Danh mục các đồ thị XI MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 3 Chương 1: Nấm men và lên men etylic.................................................................. 3 1.1 Đặc điểm hình thái nấm men ..................................................................... 3 1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................... 3 1.3 Phân loại nấm men .................................................................................. 12 Chương 2: Ứng dụng của nấm men trong công nghiệp chế tạo đồ uống lên men 23 2.1 Đồ uống có độ rượu nhẹ ........................................................................... 23 2.2 Đồ uống có độ rượu cao ........................................................................... 32 2.3 Thực trạng chế biến thức uống lên men ở Việt Nam ............................... 33 Chương 3: Những hiểu biết về trái thanh long.................................................... 36 3.1 Đặc điểm của cây, trái thanh long ............................................................ 36 3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng trái thanh long ......................................... 37 3.3 Những khó khăn khi sử dụng trái thanh long chế biến thành nước uống lên men .......................................................................................... 39 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….40 Chương 4: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị .......................................................... 40 4.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 40 4.2 Hóa chất ................................................................................................... 41 4.3 Thiết bị...................................................................................................... 41 4.4 Các loại môi trường nghiên cứu ............................................................. 41 Chương 5: Các phương pháp nghiên cứu ............................................................ 45 5.1 Các phương pháp vi sinh vật ................................................................... 45 5.2 Các phương pháp hóa lý .......................................................................... 51 5.3 Các phương pháp toán học ....................................................................... 55 5.4 Phương pháp đánh giá cảm quan.............................................................. 55 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 56 Chương 6: Kết quả xử lý và chế biến trái thanh long thành dịch quả làm môi trường nuôi cấy nấm men 56 6.1 Khảo sát thành phần dịch trái thanh long Bình Thuận ............................ 56 6.2 Chế biến và xử lý trái thanh long làm môi trường nuôi cấy nấm men .... 58 Chương 7: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ............................ 63 7.1 Phân lập và thuần khiết các chủng nấm men có nguồn gốc khác nhau ................................................................................................................ 63 7.2 Tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ................................................. 65 Chương 8: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT2............................................................................................. 78 8.1 Đặc điểm hình thái.................................................................................... 78 8.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT2............. 81 8.3 Khảo sát khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men LT2 ........... 85 8.4 Tìm hiểu khả năng kháng một số kháng sinh của chủng LT2 ................... 88 8.5 Định danh ................................................................................................. 90 Chương 9: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình nhân giống ................................................................................................. 93 9.1 Xác định thời gian sinh trưởng và chế độ lắc thông khí thích hợp đối với chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình nhân giống....................................................................................................... 93 9.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu ...................................................................... 95 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường............................................................ 96 9.4 Sử dụng dịch ép trái thanh long làm môi trường nhân giống................... 98 Chương 10: Khảo sát khả năng sử dụng chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long................ 105 10.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................................................................... 105 10.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................................................................... 110 Chương 11: Khảo sát động thái lên men rượu của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long ...................................................................... 115 11.1 Khảo sát giai đoạn lên men hiếu khí .................................................... 115 11.2 Khảo sát giai đoạn lên men kị khí ....................................................... 117 11.3 Khảo sát lên men kị khí ở nhiệt độ thấp ............................................... 120 11.4 Hoàn thiện sản phẩm ........................................................................... 122 11.5 Xây dựng quy trình chế tạo nước uống lên men từ trái thanh long ở quy mô phòng thí nghiệm..................................................................... 129 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 132 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C: Cacbon [C]: Nồng độ glucose CP: Centipoise N: Nitơ Pthô: Protein thô Sac: Saccharomyces cerevisiae TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TL: Thanh long TL450, TL465, TL580: lượng dịch thu được lần lượt là 450, 465, 480ml/1kg trái thanh long được trích ly bằng nhiệt độ cao. V/p: Vòng/phút DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long Bình Thuận .......... 37 Bảng 6.1 Thành phần hóa học dịch trái thanh long Bình Thuận .............. 56 Bảng 6.2 Thành phần một số dịch quả được sử dụng trong sản xuất rượu vang.................................................................................. 57 Bảng 6.3 Dịch trái thanh long (100ml) được xử lý bằng Ca(OH)2 và lòng trắng trứng gà ................................................................... 61 Bảng 7.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men ............................. 64 Bảng 7.2 Khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men ................. 66 Bảng 7.3 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men ............................. 67 Bảng 7.4 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ..................................................................................... 69 Bảng 7.5 Khảo sát hoạt lực lên men và đánh giá cảm quan sản phẩm lên men của các chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ............................................................................... 71 Bảng 7.6 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men mạnh trên môi trường thanh long thích hợp............................. 73 Bảng 7.7 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên các loại môi trường nước trái thanh long đã xử lý ……………...…………………..........................................76 Bảng 8.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men LT2............................. 79 Bảng 8.2 Khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men LT2 ......83 Bảng 8.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm men LT2 .............................................................................................83 Bảng 8.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng của chủng nấm men LT2 84 Bảng 8.5 Khả năng chịu nồng độ cồn của chủng nấm men LT2 ..........85 Bảng 8.6 Khả năng tạo chất kháng sinh kháng các vi khuẩn kiểm định của chủng nấm men LT2 .................................................86 Bảng 8.7 Khả năng kháng một số kháng sinh của chủng nấm men LT2 .............................................................................................88 Bảng 8.8 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng nấm men LT2 và chủng Saccharomyces cerevisiae 91 Bảng 9.1 Sự thay đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ..................................... 94 Bảng 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................................................95 Bảng 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh khối của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2........................97 Bảng 9.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long.........................................99 Bảng 9.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long..............................................100 Bảng 9.6 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long..............................................101 Bảng 9.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long .............................................103 Bảng 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ...............................................106 Bảng 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................107 Bảng 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2..............................109 Bảng 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2..............................111 Bảng 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH4)2SO4 và vitamin B1 đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ...............................................113 Bảng 11.1 Quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long trong điều kiện hiếu khí ........................................... 116 Bảng 11.2 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 300C của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trên môi trường dịch trái thanh long ............................................................................. 119 Bảng 11.3 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 100C của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trên môi trường dịch trái thanh long ............................................................................... 121 Bảng 11.4 Kết quả phân tích các chỉ tiêu về chất lượng sản phẩm đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ........................... 123 Bảng 11.5 Một số chỉ tiêu chất lượng nước thanh long lên men sau thời gian bảo quản .................................................................. 124 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Trái thanh long ruột trắng Bình Thuận ...................................... 40 Hình 8.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm men LT2 ............................ 78 Hình 8.2 Hình thái tế bào nấm men LT2 (×100) ....................................... 79 Hình 8.3 Nang bào tử của nấm men LT2 (×100)....................................... 80 Hình 8.4 Khuẩn ty của chủng nấm men LT2 (×40) ................................... 81 Hình 8.5 Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ của chủng nấm men LT2 ................................................................................... 82 Hình 8.6 Chủng nấm men LT2 kháng E. coli và Bacillus pimitilis ........... 87 Hình 8.7 Chủng nấm men LT2 kháng Salmonella typhimurium và Klebsiella ................................................................................. 87 Hình 8.8 Chủng nấm men LT2 kháng Serratia sp. và Streptococcus sp………………………………………………………………………87 Hình 8.9 Khả năng kháng chloramphenicol và ceftazidime ..................... 89 Hình 8.10 Khả năng kháng gentamycin và kanamycin ............................ 89 Hình 8.11 Khả năng kháng neomycin và acid nalidixic ........................... 89 Hình 11.1 Sản phẩm nước thanh long lên men..................................... ..127 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 7.1 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men .......................... 67 Biểu đồ 7.2 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ................................................................... 69 Biểu đồ 7.3 Hoạt lực lên men của chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ........................................................... 72 Biểu đồ 7.4 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) và môi trường dịch trái thanh long không lọc (MT14)................... 74 Biểu đồ 7.5 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên các loại môi trường nước trái thanh long đã xử lý ........................... 76 Biểu đồ 9.1 Động thái sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae LT2 ......................................................................................... 94 Biểu đồ 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối Saccharomyces cerevisiae LT2 .............................................. 96 Biểu đồ 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh khối của Saccharomyces cerevisiae LT2 ........................ 97 Biểu đồ 9.4 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long ........................................... 102 Biểu đồ 9.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long .......................................... 103 Biểu đồ 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2.................................. 106 Biểu đồ 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2.................................. 108 Biểu đồ 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................... 109 Biểu đồ 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................... 111 Biểu đồ 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH4)2SO4 và vitamin B1 đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ........................................... 113 Biểu đồ 11.1 Động thái quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long trong điều kiện hiếu khí............................... 116 Biểu đồ 11.2 Hàm lượng chất khô trong giai đoạn lên men kị khí......... 119 1 MÔÛ ÑAÀU Ñoà uoáng leân men ñaõ ñöôïc con ngöôøi bieát ñeán vaø söû duïng caùch ñaây vaøi theá kyû. Daàn daàn söï tieán boä cuûa khoa hoïc kyõ thuaät, ñaëc bieät khi ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm vaø coâng ngheä vi sinh ngaøy caøng phaùt trieån thì caùc saûn phaåm veà ñoà uoáng ñöôïc caûi tieán khoâng ngöøng veà chaát löôïng vaø caû veà chuûng loaïi nhaèm ñaùp öùng thò hieáu ngöôøi tieâu duøng. Hôn nöõa, con ngöôøi ngaøy caøng hieåu roõ hôn giaù trò dinh döôõng vaø hieäu quaû kinh teá lôùn lao cuûa caùc saûn phaåm veà ñoà uoáng maø giôø ñaây chuùng coù maët ôû haàu heát caùc nöôùc treân theá giôùi. Ñoà uoáng leân men thöôøng söû duïng nguoàn nguyeân lieäu tinh boät hoaëc töø caùc loaïi traùi caây. Trong taát caû caùc loaïi ñoà uoáng, ñoà uoáng leân men töø traùi caây raát ñöôïc quan taâm bôûi ngoaøi höông vò thôm ngon töï nhieân noù coøn chöùa caùc chaát dinh döôõng nhö caùc loaïi muoái khoaùng, ñöôøng, vitamin…chöùa saün trong traùi caây. Vieät Nam vôùi ñaëc ñieåm laø nöôùc noâng nghieäp nhieät ñôùi thích hôïp cho vieäc troàng caùc loaïi caây aên quaû neân coù nguoàn nguyeân lieäu raát phong phuù thuaän lôïi cho vieäc saûn xuaát caùc loaïi ñoà uoáng leân men. Trong caùc loaïi quaû hieän coù cuûa Vieät Nam, traùi thanh long ôû caùc tænh cuûa mieàn Nam coù saûn löôïng lôùn vaø chaát löôïng cao nhöng hieän nay traùi thanh long chæ môùi ñöôïc söû duïng laøm thöùc aên traùng mieäng, cheá bieán coctail, thôø cuùng vaø xuaát khaåu traùi töôi [17] [20]. Ñeå goùp phaàn laøm ña daïng hoùa caùc saûn phaåm ñoà uoáng leân men vaø söû duïng coù hieäu quaû hôn nguoàn ñaëc saûn doài daøo laø traùi thanh long ôû caùc ñòa phöông, chuùng toâi ñeà xuaát moät höôùng môùi nghieân cöùu söû duïng traùi thanh long vôùi ñeà taøi “Nghieân Cöùu Söû Duïng Traùi Thanh Long (Hylocereus undatus) Ñeå Cheá Bieán Nöôùc Uoáng Leân Men”. Muïc tieâu cuûa ñeà taøi: cheá bieán traùi thanh long laøm nöôùc uoáng leân men nhaèm laøm ña daïng hoùa caùc saûn phaåm töø traùi thanh long vöøa coù giaù trò giaûi khaùt, boå sung dinh döôõng vöøa coù taùc duïng trò lieäu. 2 Nhieäm vuï cuûa ñeà taøi: 1. Phaân laäp caùc chuûng naám men ñeå laøm nguoàn gioáng naám men cho quaù trình tuyeån choïn. 2. Tuyeån choïn caùc chuûng naám men thích hôïp vôùi yeâu caàu leân men dòch traùi thanh long. 3. Nghieân cöùu moät soá ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng naám men choïn ñöôïc, treân cô sôû ñoù tieán haønh ñònh danh. 4. Nghieân cöùu moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh tröôûng, phaùt trieån vaø leân men cuûa chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long ñeå taïo nöôùc giaûi khaùt leân men ñaït chaát löôïng cao. 5. ÖÙng duïng chuûng naám men choïn ñöôïc ñeå leân men taïo nöôùc giaûi khaùt treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long. 3 PHAÀN I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU CHÖÔNG 1: NAÁM MEN VAØ LEÂN MEN ETYLIC 1.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi naám men Teá baøo naám men coù nhieàu hình daïng khaùc nhau: hình troøn, hình tröùng nhö Saccharomyces cerevisiae, hình elip nhö Saccharomyces ellipsoideus, hình quaû chanh nhö Saccharomyces apiculatus, ñoâi khi coù hình chai nhö Saccharomyces Ludwigu hoaëc hình oáng daøi nhö Pichia. Moät soá teá baøo naám men coù hình daøi, noái tieáp nhau taïo thaønh daïng sôïi goïi laø khuaån ty giaû nhö Endomyces, Endomycopsis, Candida… Nhieàu loaøi naám men chæ taïo khuaån ty giaû khi soáng trong moâi tröôøng thieáu oxy [32]. Noùi chung hình daùng cuûa teá baøo naám men ôû caùc loaøi khaùc nhau thì khaùc nhau, trong cuøng moät loaøi hình daùng cuûa teá baøo coù theå thay ñoåi tuøy thuoäc vaøo ñieàu kieän moâi tröôøng, ñieàu kieän nuoâi caáy vaø tuoåi cuûa teá baøo. Teá baøo naám men coù kích thöôùc trung bình 3-5× 5-10μm, kích thöôùc cuûa teá baøo naám men thay ñoåi nhieàu tuøy thuoäc vaøo loaøi, gioáng vaø ñieàu kieän cuûa moâi tröôøng soáng …[64]. Trong moâi tröôøng loûng coù nhieàu loaøi naám men coù khaû naêng sinh ra moät lôùp maøng bao boïc nhö taám voan moûng nhö ôû Saccharomyces hoaëc daøy ôû Drojdiile micodermice. Treân moâi tröôøng ñaëc, khuaån laïc naám men coù nhieàu hình daïng khaùc nhau, maøu traéng ñuïc, vaøng hoaëc hoàng nhaït. Teá baøo naám men trong töï nhieân coù theå ñöùng rieâng leû hoaëc sau khi naûy choài vaãn dính vôùi nhau taïo thaønh chuoãi [32]. 1.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa Naám men laø nhoùm vi sinh vaät coù caáu taïo ñôn baøo, khoâng di ñoäng vaø sinh saûn chuû yeáu baèng caùch naûy choài [34], soáng dò döôõng [54]. Naám men coù khaû naêng sinh saûn raát nhanh vaø taïo ñöôïc löôïng lôùn sinh khoái trong thôøi gian ngaén. Sinh khoái naám men raát giaøu protein, vitamin vaø lipid. 4 Ñeå quan saùt hình thaùi vaø ño kích thöôùc teá baøo naám men ngöôøi ta thöôøng söû duïng moâi tröôøng maïch nha dòch theå nuoâi trong 3 ngaøy ôû 25-300C. Moät soá teá baøo naám men coù hình daøi, noái tieáp nhau taïo thaønh daïng sôïi goïi laø khuaån ty giaû. Nhieàu loaøi naám men chæ taïo khuaån ty giaû khi soáng trong moâi tröôøng thieáu O2. Muoán quan saùt khuaån ty giaû, ngöôøi ta caáy nhöõng ñöôøng ngaén naám men treân moâi tröôøng thaïch ñóa sau ñoù ñaäy laù kính noåi leân ñöôøng caáy vaø nuoâi ôû 25-300C trong 3-4 ngaøy. Nhieàu loaøi naám men coù khaû naêng sinh baøo töû tuùi. Naám men thöôøng taïo baøo töû tuùi sau 5-7 ngaøy nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch-maïch nha [6]. 1.2.1 Leân men etylic [31] [32] Leân men röôïu laø quaù trình hoâ haáp kò khí, trong ñoù ñöôøng bò phaân giaûi thaønh röôïu (C2H5OH) vaø CO2 döôùi taùc duïng cuûa vi sinh vaät, ñaëc bieät naám men. Phöông trình phaûn öùng toång quaùt: C6H12O6 n a ám m e n 2 C2H5OH + 2 CO2 + 113,4 KJ Glucose etylic 1.2.1.1 Caùc giai ñoaïn leân men röôïu Coù theå chia quaù trình leân men röôïu thaønh 2 giai ñoaïn: Giai ñoaïn taêng sinh khoái naám men: Giai ñoaïn naøy naám men naûy choài vaø phaùt trieån maïnh ñeå taêng sinh khoái vì trong moâi tröôøng ñaày ñuû chaát dinh döôõng vaø O2. Giai ñoaïn leân men: Khi thieáu O2, naám men baét ñaàu bieán ñoåi ñöôøng thaønh röôïu vaø CO2 . Quaù trình naøy thöïc chaát raát phöùc taïp, goàm nhieàu phaûn öùng hoaù hoïc lieân tieáp ñeå taïo thaønh etanol. Coù theå chia thaønh 5 giai ñoaïn chính: ™ Giai ñoaïn phosphorin hoùa D-glucose + ATP Mg2+ D-glucose 6 phosphat + ADP hexokinase D-glucose 6 phosphat phosphohexoizomerase D-fructose 6 phosphat 5 D-fructose 6 phosphat + ATP phosphofructokinase D-fructose 1,6 diphosphat ™ Giai ñoaïn caét ñoâi maïch : D-fructose 1,6 diphosphat aldolase dioxyacetophosphat + D-glyceraldehyd 3 phosphat Trong teá baøo dioxyacetophosphat coù theå bieán ñoåi hoaøn toaøn thaønh glyceraldehyd 3 phosphat Dioxyacetophosphat D-glyceraldehyd 3 phosphat ™ Giai ñoaïn oxy hoùa: D-glyceraldehyd 3 phosphat + NAD dehydrogenase 1,3-diphosphoglycerat + NADH2 1,3-diphosphoglycerat + ADP 3-phosphoglycerat + ATP 3-phosphoglycerat phosphoglyceromatase 2-phosphoglycerat 2-phosphoglycerat enolase phosphoenol pyruvat + H2O ™ Giai ñoaïn taïo piruvat: Phosphoenol pyruvat + ADP pyruvatkinase pyruvat + ATP ™ Giai ñoaïn piruvat taïo thaønh etanol Pyruvat pyruvatdecacboxylase acetaldehyd + CO2 Acetaldehyd + NADH2 alcoldehydrogenase etanol + NAD Keát thuùc quaù trình treân ta thu ñöôïc röôïu etylic, ngoaøi ra coøn thu ñöôïc hoãn hôïp caùc saûn phaåm phuï khaùc (nguoàn goác laø amin vaø caùc chaát khaùc). Do ñoù caùc ñoà uoáng leân men coù giaù trò dinh döôõng cao. 1.2.1.2 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men etylic 6 Naám men ñoøi hoûi phaûi coù nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh môùi coù theå leân men. Trong saûn xuaát röôïu, ngoaøi vieäc löïa choïn chuûng naám men, coøn phaûi nghieân cöùu taïo ñieàu kieän thích hôïp ñeå ñaït hieäu suaát leân men cao. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä laø yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn. Moãi vi sinh vaät coù moät yeâu caàu veà nhieät ñoä thích hôïp cho söï phaùt trieån cuûa mình. Nhieät ñoä caøng cao leân men caøng sôùm baét ñaàu, toác ñoä nhanh vaø keát thuùc sôùm, nhöng haøm löôïng ñöôøng coøn laïi vôùi moät löôïng khaù lôùn. Ñieàu naøy coù theå laø nguy hieåm, vì haøm löôïng ñöôøng soùt coù theå ñöôïc vi khuaån lactic söû duïng ñeå taïo thaønh acid lactic aûnh höôûng nhieàu ñeán chaát löôïng cuûa saûn phaåm. Ngoaøi ra nhieät ñoä coøn aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc saûn phaåm thöù caáp vaø caùc saûn phaåm phuï. Nhieät ñoä caøng cao caøng deã sinh vaø tích tuï caùc saûn phaåm phuï ngaøy caøng nhieàu. Ñieàu naøy khoâng coù lôïi cho saûn phaåm chính [22]. Trong coâng nghieäp röôïu coàn ngöôøi ta thöôøng duøng caùc chuûng naám men thích hôïp cho leân men ôû 30-35°C, leân men röôïu vang 20-30°C vaø döôùi 10°C trong thôøi gian taøng tröõ (leân men phuï). AÛnh höôûng pH cuûa moâi tröôøng pH moâi tröôøng coù yù nghóa quan troïng trong quaù trình leân men röôïu. Ñoái vôùi men röôïu vang khoaûng pH thích hôïp laø 2,8-3,8, Saccharomyces vini pH=3,5. So vôùi men röôïu (Saccharomyces cerevisiae) vaø men bia (Saccharomyces carbergensis) thì men röôïu vang chòu ñöôïc acid cao hôn. Caùc loaøi khuaån laøm hoûng röôïu hoaït ñoäng ôû pH cao hôn 3,5 nhöng yeáu hôn ôû pH thaáp hôn 3,5. Do ñoù giöõ pH trong giôùi haïn 3-3,5 laø ñeå öùc cheá hoaït ñoäng cuûa khuaån haïi [22]. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng 7 Haøm löôïng ñöôøng coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán naêng löïc leân men. Haøm löôïng ñöôøng thích hôïp nhaát laø 13-15% töông ñöông vôùi noàng ñoä chaát khoâ töø 16-18%. Neáu haøm löôïng ñöôøng quaù cao seõ laøm taêng aùp suaát thaåm thaáu vaø laøm maát caân baèng traïng thaùi sinh lyù cuûa naám men. Neáu haøm löôïng ñöôøng thaáp seõ khoâng taïo ñieàu kieän cho quaù trình leân men. Trong thöïc teá, ôû haøm löôïng ñöôøng 30-35% thì söï leân men bò ñình chæ cho duø coù loaïi naám men coù khaû naêng leân men ñöôïc ôû haøm löôïng ñöôøng leân ñeán 60% [34]. O2 Naám men laø vi sinh vaät hieáu khí tuøy tieän vaø chæ trong ñieàu kieän kò khí noù môùi tieán haønh leân men röôïu, do ñoù khi muoán coù röôïu ta phaûi taïo ñieàu kieän kò khí. Tuy vaäy, duø trong tröôøng hôïp coù ñaày ñuû O2 vaãn coù moät löôïng röôïu ñöôïc taïo thaønh [34]. Noàng ñoä röôïu vaø khí CO2 Ña soá naám men chæ leân men ñöôïc tôùi noàng ñoä röôïu 13-14%, chæ coù moät soá ít leân men ôû noàng ñoä röôïu 17-20%. Tuy khí CO2 öùc cheá söï leân men nhöng vieäc thoaùt khí CO2 laïi coù taùc duïng toát ñeán quaù trình leân men. Söï thoaùt khí CO2 seõ laøm cho moâi tröôøng luoân bò khuaáy ñoäng, keùo daøi ñöôïc traïng thaùi lô löõng cuûa naám men do ñoù laøm taêng nhanh söï leân men. Qua ñoù ta thaáy moät ñieàu phoå bieán chính saûn phaåm cuûa söï trao ñoåi chaát khi ñaït tôùi moät noàng ñoä naøo ñoù seõ coù taùc duïng öùc cheá ñoái vôùi baûn thaân vi sinh vaät ñoù [34]. 1.2.2 Khaû naêng söû duïng caùc hôïp chaát cao phaân töû [32] 1.2.2.1 Hydratcacbon Ñoái vôùi naám men nguoàn cacbon thích hôïp nhaát laø caùc loaïi ñöôøng nhö glucose, fructose, sacarose, maltose, rafinose, lactose, dextrin. Ñoái vôùi caùc chuûng thuoäc loaøi Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng ñoàng hoaù ñöôïc caùc loaïi ñöôøng hexose vaø noùi chung khoâng ñoàng hoaù ñöôïc ñöôøng pentose. 8 Caùc chuûng naám men rieâng bieät söû duïng caùc nguoàn ñöôøng raát khaùc nhau. Ví duï: caùc chuûng naám men röôïu söû duïng nguoàn ñöôøng glucose; vôùi caùc gioáng men bia, söû duïng ñöôøng maltose. Caùc teá baøo naám men tröôùc khi söû duïng caùc loaïi ñöôøng coù trong moâi tröôøng ñeàu phaûi thöïc hieän moät trong hai quaù trình sau: ™ Haáp thuï hoaøn toaøn caùc loaïi ñöôøng ñoù qua maøng nhö maltose vaø maltotriose coù khaû naêng thaám thaáu tröïc tieáp qua maøng teá baøo. ™ Thuyû phaân trong moâi tröôøng roài môùi haáp thuï nhö sacarose caàn phaûi thuyû phaân tröôùc bôûi enzim ngoaïi baøo roài sau ñoù caùc saûn phaåm thuyû phaân naøy môùi ñöôïc haáp thu. Nhö vaäy naám men chæ söû duïng caùc loaïi ñöôøng coù trong moâi tröôøng maø khoâng coù khaû naêng phaân giaûi nguoàn nguyeân lieäu tinh boät baèng enzim. Do ñoù caàn giai ñoaïn ñöôøng hoùa caùc nguyeân lieäu tröôùc khi tieán haønh caùc quaù trình leân men. 1.2.2.2 Protein Söï phaùt trieån cuûa naám men lieân quan ñeán söï haáp thu nitô, chuû yeáu laø caùc loaïi acid amin. Chuùng ñöôïc teá baøo söû duïng ñeå toång hôïp protein vaø caùc hôïp chaát chöùa nitô khaùc. Naám men tieâu hoaù toát caùc acid amin, keùm hôn laø pepton vaø hoaøn toaøn khoâng tieâu thuï ñöôïc protein töï nhieân. Ñoái vôùi naám men röôïu khoâng phaûi taát caû caùc acid amin ñeàu söû duïng ñöôïc. Ngöôøi ta chia caùc acid amin thaønh caùc nhoùm: ™ Nhoùm haáp thu nhanh: izolôxin, triptophan, arginin, valin, histidin, asparatic acid. ™ Nhoùm haáp thu chaäm: trionin, phenylalanin, tirozin, metionin, serin, glyxin, acid glutamic, lôxin. ™ Nhoùm khoâng haáp thu: prolin [32]. 1.2.2.3 Lipid 9 Trong suoát quaù trình leân._. men, naám men haáp thuï caùc acid beùo töï do, phaàn lôùn chuùng ñöôïc keát hôïp laïi thaønh caùc lipid caáu truùc trong thaønh teá baøo naám men. Naám men Saccharomyces cerevisiae vaø nhöõng loaøi gaàn vôùi chuùng coù nhu caàu acid beùo khoâng no trong quaù trình phaùt trieån ôû ñieàu kieän hieáu khí vaø kò khí, thì trong quaù trình hoâ haáp naám men coù nhu caàu tieâu thuï acid beùo khoâng no gaáp 4 laàn so vôùi bình thöôøng do tham gia vaøo quaù trình phosphoryl hoaù ñeå toång hôïp ATP [32]. 1.2.3 Khaû naêng taïo chaát khaùng sinh cuûa chuûng naám men 1.2.3.1 Khaùng sinh vaø caùc con ñöôøng toång hôïp Theo Waksman ñònh nghóa raèng: Khaùng sinh laø nhöõng chaát hoùa hoïc coù nguoàn goác töø cô theå soáng coù taùc duïng öùc cheá söï sinh tröôûng hay tieâu dieät moät soá vi sinh vaät khaùc moät caùch moät choïn loïc ngay khi ôû noàng ñoä thaáp [59]. Coù nhieàu quan ñieåm khaùc nhau veà khaû naêng hình thaønh chaát khaùng sinh töø vi sinh vaät: 9 Söï hình thaønh chaát khaùng sinh laø cô cheá giuùp vi sinh vaät toàn taïi. 9 Söï hình thaønh chaát khaùng sinh laø do söï caïnh tranh moâi tröôøng dinh döôõng, thöôøng chaát khaùng sinh khoâng coù moät vai troø roõ reät ñoái vôùi teá baøo sinh ra chuùng. 9 Chaát khaùng sinh chæ laø saûn phaåm thaûi ra moâi tröôøng cuûa quaù trình trao ñoåi chaát, do ñoù maø söï maát khaû naêng hình thaønh chaát khaùng sinh khoâng laøm maát khaû naêng sinh tröôûng. Chaát khaùng sinh coù caáu truùc khaùc nhau vaø vi sinh vaät sinh ra chuùng cuõng ña daïng nhö: vi khuaån Staphylococcus aureus 209 P hoaëc Bac. mycoides HB (loaïi nhaün) vaø naám Penicillium notatum cho chaát khaùng sinh penicilline, khaùng sinh streptomycine thu nhaän töø xaï khuaån Streptomyces griseus, khaùng sinh kanamycin thu nhaän töø xaï khuaån Streptomyces fradie [59]. 10 Maëc duø chaát khaùng sinh coù caáu truùc khaùc nhau nhöng quaù trình toång hôïp gaàn nhö theo moät soá con ñöôøng nhaát ñònh. Cô cheá sinh toång hôïp chaát khaùng sinh töø vi sinh vaät coù theå qua moät soá con ñöôøng sau: 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc toång hôïp töø moät chaát trao ñoåi chaát sô caáp duy nhaát. Ví duï chloramphenicol, chaát khaùng sinh thuoäc nhoùm nucleozit. 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc hình thaønh töø 2, 3 chaát trao ñoåi baäc 1 khaùc nhau, ví duï lincomycin. 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc toång hôïp baèng caùch polymer hoùa caùc chaát trao ñoåi chaát baäc moät sau ñoù coù theå tieáp tuïc bieán ñoåi qua caùc phaûn öùng enzym khaùc; coù theå phaân bieät thaønh boán daïng: o Chaát khaùng sinh nhoùm polypeptit theo con ñöôøng truøng hôïp caùc axit amin. o Chaát khaùng sinh amyloglucozid ñöôïc taïo thaønh töø caùc phaûn öùng truøng hôïp polymersaccarit: neomicine, streptomycine. o Chaát khaùng sinh ñöôïc taïo thaønh nhôø phaûn öùng polymer hoùa caùc ñôn vò acetat, propionat. o Chaát khaùng sinh ñöôïc hình thaønh theo con ñöôøng toång hôïp caùc chaát izopreonit töø caùc ñôn vò acetat [25]. 1.2.3.2 Chaát khaùng sinh coù töø naám men Ketler toxin hay coøn goïi laø zymocine: laø loaïi chaát khaùng sinh ñöôïc moät soá chuûng naám men vaø vi naám tieát ra nhaèm choáng laïi söï caïnh tranh giöõa caùc chuûng cuøng loaøi hoaëc chuûng thuoäc hoï gaàn. Hieän töôïng naøy laàn ñaàu tieân ñöôïc Bevan vaø Macower phaùt hieän naêm 1936 treân chuûng naám men Saccharomyces. Cho ñeán nay khaû naêng sinh zymocine ñaõ ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu chuûng naám men thuoäc hoï khaùc nhau nhö: Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces, Candida, Sporidiobolus, Cryptcoccus (Schmitt vaø 11 Neuhansen, 1994, Magliani et al., 1997, Vondrejs vaø Palkova, 1997). Taát caû caùc zymocine ñöôïc bieát ñeán ñeàu laø nhöõng polypeptid hoaëc glycoprotein. Ñaëc tính sinh hoïc coù theå ñöôïc maõ hoùa treân ARN maïch keùp, DNA plasmid vaø maïch thaúng treân chromosome. Do tính chaát choïn loïc raát cao, zymocine coù tieàm naêng nhö nhöõng chaát khaùng sinh höõu hieäu choáng laïi moät soá beänh nang y [45]. Khaû naêng taïo chaát khaùng sinh cuûa moät loaøi naám men ñöôïc nhieàu coâng trình nghieân cöùu, öùng duïng nhaéc tôùi ñoù laø chuûng naám men Saccharomyces boulardii vôùi coâng trình nghieân cöùu “Xaây döïng quy trình nuoâi caáy vaø thöû taùc duïng trò loaïn khuaån cuûa chuûng naám men Saccharomyces boulardii”. Thaïc só Nguyeãn Kim Minh Taâm cho thaáy khaû naêng coù theå saûn xuaát moät loaïi thuoác trò loaïn khuaån ñöôøng ruoät môùi vôùi öu ñieåm vöôït troäi so vôùi caùc loaïi thuoác trò loaïn khuaån khaùc: coù khaû naêng ñeà khaùng caùc chaát khaùng sinh. Trong töông lai coù theå saûn xuaát loaïi thuoác noùi treân vôùi chi phí thaáp. Beân caïnh ñoù caùc keát quaû nghieân cöùu cuõng cho thaáy naám men Saccharomyces boulardii coøn coù khaû naêng tieát ra protease tieâu giaûi ñoäc toá cuûa Clostridium difficile, vi khuaån gaây vieâm ruoät keát maøng giaû cuõng nhö trung hoøa ñöôïc noäi ñoäc toá E. coli vaø Vibrio cholerae neân coù theå duøng trong döï phoøng tieâu chaûy caáp tính [37]. Hieän nay coâng ty döôïc cuûa Myõ ñaõ cheá taïo khaùng sinh töø naám men Saccharomyces boulardii ôû daïng vieân neùn, loï 50 vieân [69]. 1.3 Phaân loaïi naám men 1.3.1 Phöông phaùp phaân loaïi naám men Ñeå phaân loaïi naám men, ngöôøi ta söû duïng phöông phaùp phaân loaïi coå ñieån (döïa vaøo caùc ñaëc ñieåm hình thaùi hoïc, sinh lyù sinh hoùa) vaø phöông phaùp phaân loaïi döïa vaøo keát quaû cuûa phaân tích kyõ thuaät di truyeàn [27] [32]. 1.3.1.1 Phöông phaùp döïa vaøo ñaëc ñieåm hình thaùi hoïc, ñaëc ñieåm sinh lyù sinh hoùa 12 Chuûng naám men ñöôïc caáy vaøo caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng Hansen ñeå quan saùt hình thaùi khuaån laïc (hình daïng, kích thöôùc, maøu saéc), hình daïng teá baøo, kích thöôùc teá baøo, hình thöùc naûy choài, xaùc ñònh khaû naêng sinh baøo töû cuûa caùc chuûng naám men, quan saùt khuaån ty, khaû naêng leân men caùc nguoàn hydratcacbon, thöû khaû naêng sinh tröôûng treân moâi tröôøng agar chöùa muoái nitrat, aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä, pH, khaû naêng phaân giaûi ureâ…[6] [27]. 1.3.1.2 Phöông phaùp phaân loaïi döïa vaøo kyõ thuaät di truyeàn Phaân loaïi theo phöông phaùp coå ñieån coù ñoä chính xaùc khoâng cao vaø bò haïn cheá khi xaùc ñònh caùc chuûng coù ñaëc ñieåm gaàn gioáng nhau. Maëc khaùc thôøi gian kieåm tra thöôøng bò keùo daøi [32]. Ngaøy nay cuøng vôùi söï tieán boä cuûa sinh hoïc phaân töû nhieàu phöông phaùp phaân loaïi môùi vôùi ñoä chính xaùc cao ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø öùng duïng. Trong ñoù phöông phaùp phaân tích trình töï chuoãi RNA ribosom cuûa teá baøo naám men ñaõ ñöôïc bieát ñeán nhö moät phöông phaùp phaân loaïi hieän ñaïi, nhanh choùng vaø coù ñoä tin caäy cao [27]. Phöông phaùp naøy döïa vaøo trình töï chuoãi RNA cuûa caùc gen r18S, 26S vaø ITS. ™ Caùc gen naøy ñöôïc khueách ñaïi baèng phaûn öùng PCR (Polymerase Chain Reaction) ™ Caùc caëp moài (primers) ñöôïc söû duïng vaø coù trình töï acid nucleic nhö sau: Moài cho khueách ñaïi gen 18S rRNA: NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA Moài cho khueách ñaïi gen ITS rRNA: ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG 13 ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC Moài cho khueách ñaïi moät phaàn gen 26S rRNA vuøng D1/D2: NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NC4: GGTCCGTGTTTCAAGAAGG Chu kyø nhieät phaân cuûa phaûn öùng ñöôïc aùp duïng: 980C/giaây, 580C/60giaây, 720C/120giaây vôùi 35 chu kyø vaø moät thôøi gian môû roäng 720C/15phuùt treân maùy PCR. Saûn phaåm ñöôïc tinh saïch baèng kít Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega, Southampton, United Kingdom) theo höôùng daãn söû duïng cuûa haõng. ™ Xaùc ñònh tröïc tieáp baèng trình töï caùc gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S rRNA ñöôïc tieán haønh baèng vieäc söû duïng caùc kít phaûn öùng Applied Biosystem ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh trình töï chuoãi cuûa gen 18S rRNA laø: NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC NS2: GGCTGCTGGCACCAGCTTGC NS3: GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC NS4: CTTCCGTCAATTCCTTTAAG NS5: AACTTAAGGAATTGACGGAAG NS6: GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC NS7: GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen ITS1 rRNA laø: ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS2: GCTGCGTTCTTCATCGATGC 14 Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen ITS2 rRNA laø: ITS3: GCATCGATGAAGAACGCAGC ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen 26S rRNA vuøng D1/D2 laø: NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG Chu trình nhieät ñöôïc tieán haønh theo caùc böôùc: 960C/10giaây, 500C/5giaây vaø 400C/4phuùt vôùi 25 chu kyø ñöôïc thöïc hieän treân maùy PCR Perkin Elmer 9600. Saûn phaåm PCR naøy ñöôïc tinh saïch vaø ñieän di treân gen polyacrylamide. Trình töï chuoãi ñöôïc ñoïc töï ñoäng baèng maùy Sequencer 373 Acid DNA (Appied Biosystem GmbH-Germany). Keát quaû trình töï chuoãi cuûa gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S rRNA cuûa naám men ñöôïc phaân tích so saùnh vôùi caùc trình töï chuoãi coù saün trong ngaân haøng gen vôùi söï trôï giuùp cuûa phaàn meàm editor (ae2) alignment (DSMZ-Germany). Phaàn traêm gioáng nhau giöõa caùc trình töï chuoãi cuûa gen cuûa naám men ñöôïc trình baøy döôùi daïng ma traän. 1.3.2 Khoùa phaân loaïi naám men Phaân loaïi naám men laø coâng vieäc khoâng ñôn giaûn. Töø tröôùc ñeán nay coù raát nhieàu khoùa phaân loaïi naám men cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhau. Hansen laø ngöôøi ñöa ra khoùa phaân loaïi naám men ñaàu tieân, oâng chia naám men thaønh 8 gioáng: Saccharomyces, Saccharomycopsis, Monospora, Zygosaccharomyces, Pichia, Nematospora, Saccharomycodes, Willia. Naêm 1907, Klocker chia naám men thaønh 12 gioáng vôùi 3 gioáng phuï: Saccharomyces (gioáng phuï Zygosaccharomyces), Hanseniaspora, Nadsonia, 15 Torulaspora, Pichia (gioáng phuï Pichia vaø gioáng phuï Zygopichia), Monospora, Atichia, Debaryomyces, Schwanniomyces, Saccharomycodes, Nematospora. Naêm 1920, Guilliermond chia naám men thaønh hai nhoùm vôùi 18 gioáng Nhoùm naám men thaät: Schizosaccharomyces, Nadsonia, Saccharomycodes, Hansenia, Monospora, Zygosaccharomyces, Schwanniomyces, Saccharomycopsis, Pichia, Nematospora, Debarymyces, Torulaspora, Saccharomyces, Willia. Nhoùm naám men giaû: Torula, Mycoderma, Pseudosaccharomyces, Cryptococcus Naêm 1952, J.Lodder cuøng vôùi Kreger Van Rij toång keát laïi moät caùch khaù hoaøn thieän veà vaán ñeà phaân loaïi naám men. Naêm 1971, boå sung vaø söûa chöõa laïi taøi lieäu phaân loaïi naám men ñaày ñuû nhaát vaø coù uy tín nhaát hieän nay. Naêm 1954, Kudriavtxev (Lieân Xoâ) ñaõ xeáp naám men vaøo boä Unicellomycetables bao goàm 3 hoï: Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae vaø Saccharomycodaceae. Naêm 1962, Phöông phöông Taâm (Trung Quoác) ñaõ chia naám men 31 gioáng vaø 11 gioáng phuï. Maëc duø heä thoáng phaân loaïi cuûa Kudriavtxex (Lieân Xoâ) vaø Phöông Phöông Taâm ñaùng ñöôïc chuù yù nhöng ñeán nay vaãn khoâng ñöôïc söû duïng roäng raõi vaø thoâng duïng nhö heä thoáng phaân loaïi cuûa Lodder vaø Kreger Van Rij. Theo khoùa phaân loaïi cuûa Lodder (1971) naám men ñöôïc chia thaønh 39 gioáng vaø 4 nhoùm [22] Nhoùm thöù 1: Nhoùm naám men hình thaønh nang (tuùi) thuoäc lôùp naám tuùi (Ascomycetes) goàm 22 gioáng: Gioáng Citeromyces: 1 loaøi, teá baøo hình caàu hay hình elip, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû hoaëc vaùng, baøo töû tuùi hình caàu, chæ coù moät 16 baøo töû tuùi, tuùi coù thaønh moûng, baøo töû tuùi coù thaønh saàn suøi, coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Coccidiascus: 1 loaøi, teá baøo hình caàu hay hình chöõ nhaät, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû hoaëc vaùng, baøo töû tuùi hình thoi (fusiform), coù theå coù 8 baøo töû tuùi. Gioáng Debaryomyces: 8 loaøi teá baøo hình caàu, hình elip, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, moät soá coù khuaån ty giaû, coù theå taïo vaùng, baøo töû tuùi hình caàu, baàu duïc, saàn suøi, coù 1- 4 baøo töû tuùi, tieáp hôïp ngay tröôùc khi hình thaønh tuùi. Gioáng Dekkera: 2 loaøi, teá baøo thöôøng hình nhoïn ñaàu, coøn coù hình caàu, eâlip, oáng, hoaëc hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, coù khuaån ty giaû, coù theå taïo vaùng, baøo töû tuùi hình muõ, coù 1-4 baøo töû tuùi, sinh acid acetic, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Endomycopsis: 10 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty, khuaån ty giaû, moät soá taïo vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi, hình caàu, muõ, hình löôõi lieàm, tuùi coù khuaån ty giaû. Tuùi naèm ôû ñaàu ôû giöõa khuaån ty. Nhieàu loaøi coù khaû naêng ñoàng hoùa hoùa toát tinh boät. Gioáng Henseniaspora: 3 loaøi, teá baøo hình quaû chanh Chaâu AÂu hoaëc hình ong, hình baàu duïc, naûy choài nhieàu phía, khoâng sinh khuaån ty vaø vaùng, moät soá ít coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình muõ caùt, hình muõ saét, hình quaû hoà ñaøo. Taát caû caùc loaøi ñeàu caàn söû duïng inoâzitol vaø pantotenat. Gioáng Hansenula: 25 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình chöõ nhaät, hình oáng, naûy choài hình phía, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng sinh khuaån ty, khuaån ty giaû vaø vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi hình muõ, hình baùn caàu, hình caàu, khuaån laïc coù daïng nhaày, daïng bô hay daïng phaán ñuïc. Nhieàu loaøi sinh photphamannan hoaëc Sphingolipit. Coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. 17 Gioáng Kluyveromyces: 18 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû vaø ñoâi khi taïo vaùng, coù moät hoaëc nhieàu baøo töû tuùi hình baùn nguyeät, hình thaän, hình keùo daøi vôùi ñaàu tuø, hình caàu, hình caàu daøi-eâlip, coù theå taïo saéc toá ñoû (khoâng phaûi carotenoit) treân moâi tröôøng sinh baøo töû. Gioáng Lipomyces: 3 loaøi, teá baøo hình eâlip, hình caàu, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû, deïp-eâlip, hình thaáu kính loài, baøo töû tuùi maøu naâu, choài “hoaït ñoäng” coù theå tieáp hôïp hoaëc thaønh tuùi (asci), teá baøo coù theå saûn sinh nhieàu lipid. Gioáng Lodderomyces: 1 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, coù khuaån ty giaû khoâng taïo vaùng, 1-2 baøo töû tuùi hình keùo daøi vôùi ñaàu tuø, hình caàu daøi-eâlip, kích thöôùc khaù roäng, coù khaû naêng ñoàng hoùa toát parafin. Gioáng Metschnikowia: 5 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình quaû leâ, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû vaø moät soá loaøi taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình kim vôùi phaàn phuï (appendage), tuùi hình keùo daøi, moät soá loaøi coù baøo töû aùo (chlamydospore), moät vaøi loaøi sinh pulcherimin. Gioáng Nadsonia: 2 loaøi, teá baøo hình oáng hay hình quaû chanh Chaâu AÂu, hay hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài theo 2 cöïc hay phaân caét choài (bud fission), khoâng coù caû khuaån ty laãn khuaån ty giaû, moät soá coù theå taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình caàu saàn suøi, choài tieáp hôïp ngay vôùi teá baøo meï, phaùt trieån toát ôû nhieät ñoä thaáp hôn 260C. Gioáng Nematospora: 1 loaøi, hình daïng thay ñoåi (dò hình), naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty, thöôøng khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, tuùi roäng chöùa 2 boù, moãi boù 4 baøo töû hình kim, kyù sinh treân thöïc vaät, sinh riboflarin (vitamin B2). 18 Gioáng Pachysolen: 1 loaøi, teá baøo coù hình eâlip, hình caàu, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 4 baøo töû tuùi hình baùn caàu vôùi rìa heïp, tuùi phaùt trieån ôû ñaàu cuûa moät oáng daøi, sinh ra ngoaøi teá baøo photphomannan coù daïng nhaày, coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Pichia: 35 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình chöõ nhaät, naûy choài nhieàu phía, thöôøng coù khuaån ty giaû, moät ít loaøi coù khuaån ty thaät, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng taïo vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi hình caàu, hình muõ, hình sao Thoå, saàn suøi, khuaån laïc, coù daïng nhaày, daïng boät nhaõo (pasty) hay daïng phaán ñuïc. Moät soá loaøi sinh photphomannan. Gioáng Saccharomyces: 41 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình caàu, hình caàu daøi-eâlip, khuaån laïc coù daïng boät nhaõo, hôi boùng. Gioáng Saccharomycodes: 1 loaøi, teá baøo hình ong hay hình quaû chanh chaâu AÂu, hình keùo daøi naûy choài, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 4 baøo töû tuùi hình caàu, teá baøo lôùn, baøo töû tieáp hôïp ngay trong tuùi, baøo töû coù moät rìa raát heïp. Gioáng Saccharomycopsis: 1 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình oáng, hình naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình baàu duïc, hình oáng, baøo töû coù 2 lôùp thaønh, soáng trong ñöôøng tieâu hoùa cuûa thoû vaø moät ñoäng vaät gaëm nhaám khaùc, chæ phaùt trieån ôû nhieät ñoä giöõa 30 vaø 400C, caàn CO2 vaø nitô höõu cô. Gioáng Schizosaccharomyces: 4 loaøi, teá baøo hình caàu, hình oáng, sinh saûn theo loái phaân caét teá baøo, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty, khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 4-8 tuùi hình caàu, hình baàu duïc, thaønh teá baøo khoâng chöùa kitin (chitin). 19 Gioáng Schwanniomyces: 4 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình caàu, hình keùo daøi, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình quaû hoà ñaøo (walnut), saàn suøi, choài phaân baøo giaûm nhieãm (meiosis), taát caû caùc loaøi ñeàu coù khaû naêng ñoàng hoùa tinh boät tan. Gioáng Wikerhamia: 1 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, hình ong hay hình quaû chanh chaâu AÂu, naûy choài theo 2 cöïc hay phaân caét choài, khoâng sinh khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 1-16 baøo töû tuùi hình muõ (cap), sinh ra ngoaøi teá baøo riboflavin (vitamin B2). Gioáng Wingea: 1 loaøi, teá baøo hình caàu, hình elip, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng taïo vaùng, coù 1- 4 baøo töû tuùi hình caàu deïp-eâlip hoaëc hình thaáu kính loài [5]. Nhoùm thöù 2: Nhoùm naám men giaû thuoäc boä Ustilaginales Goàm 2 gioáng: Gioáng Leucosporidium: 6 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù khuaån ty thaät nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng. Khaùc vôùi Candida ôû choã khoâng phaùt trieån ñöôïc ôû 370C, nhieàu loaøi coù khaû naêng saûn sinh tinh boät, nhieàu loaøi laøm dòch hoùa gelatin, coù baøo töû ñoäng. Gioáng Rhodosporidium: 4 loaøi, teá baøo coù hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, sinh saéc toá hoàng, khoâng leân men. Khaùc vôùi Rhodotorula ôû choå coù baøo töû ñoäng [6] Nhoùm thöù 3: Nhoùm naám men giaû thuoäc hoï Sporobolomycetaceae Goàm 3 gioáng: Gioáng Bullera: 3 loaøi, teá baøo coù hình caàu, hình baàu duïc, coù naûy choài, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baøo töû ñoäng, coù baøo töû baén vôùi hình daïng ñoái xöùng, coù hoaëc khoâng sinh saéc toá carotenoit. 20 Gioáng Sporidiobolus: 2 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, hình oáng, coù naûy choài, coù khuaån ty, coù taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, sinh saéc toá carotenoit, coù baøo töû baén vôùi hình daïng khoâng ñoái xöùng, coù baøo töû aùo vôùi thaønh daøy maøu naâu. Gioáng Sporobolomyces: 9 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû vaø vaùng, coù baøo töû baén vôùi hình daïng khoâng ñoái xöùng, nhieàu loaøi sinh saéc toá carotenoit [6]. Nhoùm thöù 4: Nhoùm naám men khoâng sinh baøo töû khoâng thuoäc hoï Sporobolomycetaceae: Goàm 12 gioáng: Gioáng Bretlanomyces: 7 loaøi, teá baøo hình nhoïn ñaàu (ogival), hình eâlip, hình caàu, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, coù hoaëc khoâng coù vaùng, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo, saûn sinh acid acetic, khaùng xicloheximit, sinh tröôûng chaäm. Gioáng Candida: 81 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, moät soá ít loaøi coù khuaån ty, coù hoaëc khoâng coù vaùng, moät soá ít loaøi coù baøo töû aùo. Gioáng Cryptococcus: 17 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, moät ít loaøi taïo vaùng vaø coù khuaån ty giaû, moät soá ít loaøi coù baøo töû aùo, coù hoaëc khoâng sinh saéc toá, teá baøo cuûa ña soá caùc loaøi coù bao nhaày (capsules). Gioáng Kloeckera: 4 loaøi, teá baøo coù hình ong, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài 2 cöïc, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty vaø khoâng taïo vaùng. Hoaøn toaøn coù nhu caàu ñoái vôùi inoâzitol vaø pantotenat. 21 Gioáng Oosporidium: 1 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù baøo töû noäi (endospores), coù sinh saéc toá. Teá baøo thöôøng xeáp thaønh chuoãi. Gioáng Pityrosporum: 3 loaøi, teá baøo hình chai, hình caàu, hình eâlip, naûy choài theo 2 cöïc hoaëc caét phaân choài, moät soá ít loaøi coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baát kyø loaïi baøo töû naøo, sinh tröôûng caàn lipid. Gioáng Phodotorula: 9 loaøi, hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, moät soá ít loaøi coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù saéc toá thuoäc loaïi carotenoit taïo maøu töø hoàng ñeán da cam. Gioáng Schizoblastosporion: 1 loaøi, teá baøo hình eâlip, hình oáng, hình chai, naûy choài theo 2 cöïc hoaëc phaân caét choài, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo. Gioáng Sterigmatomyces: 3 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, sinh saûn baèng baøo töû traàn (conidia) treân nhöõng cuoáng moïc töø teá baøo meï, taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû. Gioáng Torulopsis: 36 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, moät soá ít loaøi coù khuaån ty giaû vaø taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty, khoâng coù baát kyø loaïi baøo töû naøo. Gioáng Trichosporon: 8 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, coù khuaån ty, khuaån ty giaû, coù hoaëc khoâng coù vaùng, coù baøo töû ñoát, moät soá loaøi coù baøo töû voâ tính. Gioáng Trigonopsis: 1 loaøi, teá baøo hình tam giaùc vaø naûy choài ôû ñænh, coù taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo [6]. 22 CHÖÔNG 2: ÖÙNG DUÏNG CUÛA NAÁM MEN TRONG COÂNG NGHIEÄP CHEÁ TAÏO ÑOÀ UOÁNG LEÂN MEN Hieän nay caùc loaïi ñoà uoáng leân men treân theá giôùi raát phong phuù vaø ña daïng. Döïa vaøo noàng ñoä röôïu, ngöôøi ta chia ñoà uoáng leân men thaønh 2 nhoùm: ñoà uoáng coù ñoä röôïu nheï vaø ñoà uoáng coù ñoä röôïu cao [8]. 2.1 Ñoà uoáng coù ñoä röôïu nheï Tuøy thuoäc vaøo nguoàn nguyeân lieäu cheá bieán maø ta coù ñoà uoáng töø tinh boät vaø ñoà uoáng töø traùi caây. 2.1.1 Ñoà uoáng töø tinh boät 2.1.1.1 Bia Bia laø loaïi thöùc uoáng coù ñoä röôïu nheï vaø coù tính giaûi khaùt cao, ñöôïc nhieàu ngöôøi öa chuoäng. Bia coù töø haøng ngaøn naêm tröôùc coâng nguyeân vaø hieän nay khoâng nöôùc naøo treân theá giôùi laø khoâng saûn xuaát hoaëc tieâu thuï bia. Bia ñöôïc saûn xuaát töø malt hoaëc keát hôïp vôùi caùc nguyeân lieäu coù chöùa tinh boät (khoâng phaûi laø malt), hoa houblon vaø nöôùc. Thaønh phaàn cuûa bia goàm coù 80-90% nöôùc; 1,5-7% coàn; 3-10% chaát hoøa tan; 0,3-0,4% CO2. Chaát hoøa tan chuû yeáu laø hydratcacbon (dextrin, maltose, glucose vaø moät ít pentose, caùc protein vaø saûn phaåm thuûy phaân cuûa noù (anbumin, pepton, caùc acid amin), caùc chaát khoaùng (muoái kali, natri, phospho, canxi, mangan,…), moät soá acid höõu cô, caùc vitamin (B1, B2, B6, PP, biotin) vaø caùc chaát ñaéng, chaát thôm cuûa hoa houblon [32]. 23 Sô ñoà 2.1 Coâng ngheä saûn xuaát bia (theo Löông Ñöùc Phaåm, naêm 2001) Baõ duøng chaên nuoâi nghieàn loïc nhaân gioáng röûa Chai röûa saïch saùt khuaån Haáp Pasteur Nguyeân lieäu chính: thoùc malt, gaïo (ngoâ) Naáu (ñöôøng hoùa) Naáu vôùi hoa Laøm laïnh dòch Leân men chính 8-12°C Men gioáng: Saccharomyces Leân men phuï 1-4°C Loïc Baõo hoøa CO2 Baõ men CO2 Caáp laïnh Ñoùng chai hoaëc lon Bia chai hoaëc bia lon Bia hôi thaønh phaåm Laéng caën 24 2.1.1.2 Saûn phaåm treân theá giôùi Nöôùc uoáng coù coàn-Bubju cuûa Trieàu Tieân [23] Nguyeân lieäu: gaïo 25%, gaïo neáp 11%, nöôùc 60%, Nuruk 2%, koji 2% Quy trình saûn xuaát: Gaïo teû Naáu chín Gaïo neáp troän ñeàu cho theâm nöôùc leân men Nuruk, koji Loïc Bubju Ñaëc tính vaät lyù: daïng dung dòch, maøu traéng, coù coàn Ñaëc tính hoùa hoïc: coàn etylic 16% Vi sinh vaät chuû yeáu: Saccharomyces sp. Saûn xuaát theo qui moâ coâng nghieäp Bouza moät loaïi ñoà uoáng ôû Ai Caäp ñöôïc cheá bieán töø luùa mì. Loaïi ñoà uoáng naøy coù vò chua vaø coù thaønh phaàn röôïu 4-5% v/v. Thoå Nhó Kyø vaø moät soá nöôùc khaùc coù saûn phaåm Bouza laø moät loaïi nöôùc uoáng leân men, ñöôïc cheá bieán töø luùa mì, coù haøm löôïng röôïu thaáp (0,5-1,2 % khoái löôïng) vôùi ñoä chua 1,3 ñoä. Saûn phaåm naøy coù maøu traéng ñuïc, vò chua ngoït ñaëc tröng do keát quaû cuûa kieåu leân men hoãn hôïp giöõa leân men röôïu vaø leân men lactic [8]. ÔÛ Nga coù Kvass laø loaïi nöôùc uoáng truyeàn thoáng laøm töø malt ñaïi maïch, malt luùa maïch ñen, boät mì vaø thöôøng boå sung baïc haø. Ñaây laø loaïi thöùc uoáng leân men hoãn hôïp caû leân men röôïu vaø leân men lactic. Kvass coù nhieàu loaïi vôùi thaønh phaàn trung bình nhö sau: noàng ñoä chaát khoâ (xaùc ñònh baèng sacaromet) 5-6%; ñoä chua 2-3 ñoä; haøm löôïng röôïu etylic 0,3-0,5% v/v [8]. 25 ÔÛ Chaâu Myõ La Tinh coù nhieàu thöùc uoáng cheá bieán töø ngoâ vaø ngoâ naûy maàm nhö Chicha, Tesquino. Nhöõng saûn phaåm leân men töø ngoâ naøy coù vò chua vaø coù chöùa 2-4% röôïu etanol [8]. ÔÛ Chaâu AÙ coù moät loaït caùc saûn phaåm leân men röôïu töø gaïo nhö Sakeâ (Nhaät Baûn), Basi (Philippine), Shaosing chu (Trung Quoác), Tapeketan (Inñoâneâxia), Pachwai (AÁn Ñoä). Sakeâ laø loaïi thöùc uoáng ñaëc tröng cuûa vaên hoùa Nhaät Baûn. Röôïu Sakeâ quyù nhaát laø Ghiugioâ, coù höông vò thôm thoaûng nhö taùo, chuoái, döùa. Tröôùc ñaây Ghiugioâ saûn xuaát ít thöôøng ñöôïc söû duïng trong nhöõng ñôït thi neám. Ngaøy nay do caïnh tranh vôùi bia, röôïu vang, Ghiugioâ ñöôïc saûn xuaát nhieàu hôn, vôùi höông vò ñaëc bieät röôïu Sakeâ ñaõ trôû neân noåi tieáng treân theá giôùi, trong khu vöïc laø moät bieåu töôïng cuûa ñôøi soáng vaên hoùa töông ñoái caàu kyø nhöng tinh teá cuûa ngöôøi Nhaät [66]. 2.1.2 Ñoà uoáng töø traùi caây 2.1.2.1 Röôïu vang [4] [9] [30] Röôïu vang (vin, wine) ñuùng nghóa laø röôïu leân men khoâng caát töø nöôùc eùp quaû nho. Gaàn ñaây ngöôøi ta môû roäng khaùi nieäm röôïu vang ñeå chæ caû caùc loaïi röôïu hoa quaû khaùc (khoâng caát) [4]. Röôïu vang thöôøng coù ñoä röôïu 9-14%. Ñaëc ñieåm nöôùc quaû vaø caùc yeâu caàu veà nguyeân lieäu laøm röôïu vang Nguyeân lieäu laøm röôïu vang laø caùc loaïi quaû. Quaû chín sau khi thu hoaïch choïn loaïi quaû töôi, chaát löôïng toát ñem eùp laáy nöôùc hoaëc ngaâm vôùi ñöôøng ñeå thu dòch nöôùc quaû duøng cho leân men. Taát caû caùc loaïi quaû ñeàu coù ñöôøng, nhieàu vitamin, nhieàu acid höõu cô, trong ñoù coù nhieàu vitamin C, coù ñaày ñuû chaát khoaùng vaø moät löôïng protein ñaùng keå. Ngoaøi ra, nöôùc quaû coøn coù chöùa tanin, pectin. Trong caùc loaïi quaû duøng laøm röôïu vang tröôùc heát phaûi keå laø nho, döa, mô, daâu, maän, taùo… Caùc chuûng naám men trong saûn xuaát röôïu vang 26 Trong quaù trình saûn xuaát röôïu vang, ngöôøi ta ít duøng chuûng naám men daïi saün coù trong nguyeân lieäu maø thöôøng duøng caùc chuûng naám men thuaàn chuûng bôûi chuùng coù öu ñieåm hôn choã: chaát löôïng leân men cao, taïo haøm löôïng ñöôøng soùt ít, khaû naêng keát laéng toát, laøm trong dòch röôïu nhanh, chòu ñöôïc ñoä röôïu cao vaø ñoä acid cuûa moâi tröôøng, taïo ñöôïc höông vò thôm ngon tinh khieát. Caùc chuûng naám men thöôøng duøng trong röôïu vang laø: ¾ Saccharomyces vini: coù khaû naêng keát laéng nhanh, sinh saûn theo loái naûy choài, taïo thaønh baøo töû, coù khaû naêng khöû ñöôøng sacarose thaønh fructose vaø glucose. Tuy nhieân, giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình leân men caùc teá baøo Saccharomyces vini bò giaø vaø cheát nhanh. ¾ Saccharomyces uvarum: khaû naêng sinh baøo töû maïnh. Chòu ñöôïc ñoä coàn 12-13 ñoä trong dung dòch nöôùc nho. ¾ Saccharomyces oviformis: chòu ñöôøng cao, coàn cao, leân men kieät ñöôøng vaø taïo tôùi 18 ñoä coàn, coù khaû naêng leân men nhieàu loaïi ñöôøng khaùc nhau. Qua phaân tích ngöôøi ta nhaän thaáy ñeå leân men nöôùc quaû khoâng neân duøng moät chuûng ñôn ñoäc maø coù theå phoái hôïp caùc chuûng chòu coàn cao ñeå coù theå söû duïng trieät ñeå ñöôøng trong dòch leân men vaø cho ñoä coàn cao. Leân men Quaù trình leân men ñöôïc thöïc hieän qua hai giai ñoaïn: leân men chính vaø leân men phuï ¾ Leân men chính: tyû leä tieáp gioáng vaøo leân men chính laø 3-10%. Nhieät ñoä leân men to._.aïn leân men kò khí Khi keát thuùc giai ñoaïn leân men hieáu khí sinh khoái naám men ñaõ taêng ñöôïc trò soá cao nhaát ñònh ñuû soá löôïng teá baøo caàn thieát cho quaù trình leân men etylic 117 trong ñieàu kieän kò khí ôû giai ñoaïn tieáp theo. Giai ñoaïn leân men kò khí laø giai ñoaïn quan troïng ñeå leân men bieán ñöôøng thaønh röôïu. Ñieàu kieän leân men kò khí ñöôïc ñaûm baûo vôùi phöông thöùc sau: 9 Ngöng quaù trình nuoâi caáy laéc 9 Taêng chieàu cao coät dòch leân men baèng caùch ñoå doàn dòch leân men ôû hai bình vaøo moät bình. Nhö ñaõ trình baøy ôû muïc 11.1, ñeå coù cô sôû chaéc chaén hôn cho vieäc quyeát ñònh thôøi ñieåm döøng giai ñoaïn leân men hieáu khí neân ôû giai ñoaïn leân men kò khí tieáp theo naøy, chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt caùc chæ tieâu cuûa giai ñoaïn leân men kò khí vôùi caùc phöông aùn ôû 3 moác thôøi gian sau 5, 6, 7 giôø leân men hieáu khí. Sô ñoà thí nghieäm ñöôïc trình baøy ôû baûng 11.2. ÔÛ giai ñoaïn leân men kò khí, theo doõi söï bieán ñoäng cuûa haøm löôïng chaát khoâ (0Bx), haøm löôïng acid toång soá (g/l) theo thôøi gian töø 1-6 giôø leân men ôû 3 phöông aùn coù thôøi ñieåm keát thuùc leân men hieáu khí laø 5, 6, 7 giôø. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 11.2 vaø bieåu ñoà 11.2 Baûng 11.2 Khaûo saùt thôøi gian leân men kò khí ôû 300C cuûa chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long Keát thuùc leân men hieáu khí Sau 5 giôø (phöông aùn 1) Sau 6 giôø (phöông aùn 2) Sau 7 giôø (phöông aùn 3) Thôøi gian leân men kò khí (giôø) Haøm löôïng chaát khoâ (0Bx) Acid toång soá (g/l) Haøm löôïng chaát khoâ (0Bx) Acid toång soá (g/l) Haøm löôïng chaát khoâ (0Bx) Acid toång soá (g/l) 1 19,7 13,15 19,5 13,60 19,2 13,70 2 19,4 13,51 19,2 13,72 19,0 14,20 3 19,2 13,68 18,9 14,39 18,9 14,48 118 4 19,0 14,22 18,8 14,45 18,8 14,50 5 18,8 14,43 18,7 15,00 18,7 15,04 6 18,7 14,49 18,6 15,13 18,6 15,10 18 18.2 18.4 18.6 18.8 19 19.2 19.4 19.6 19.8 1 2 3 4 5 6 Thôøi gian (giôø) H aøm lö ôïn g ch aát k ho â ( 0 B x) Phöông aùn 1 Phöông aùn 2 Phöông aùn 3 Bieåu ñoà 11.2 Haøm löôïng chaát khoâ trong giai ñoaïn leân men kò khí Nhaän xeùt: Qua baûng 11.2 vaø bieåu ñoà 11.2 cho thaáy: Phöông aùn 1 vaø phöông aùn 2 trong 3 giôø ñaàu leân men kò khí haøm löôïng chaát khoâ giaûm nhanh 19,7→19,2 (ñoái vôùi phöông aùn 1) vaø 19,5→18,9 (ñoái vôùi phöông aùn 2). Rieâng phöông aùn 3 haøm löôïng chaát khoâ giaûm chaäm hôn töø 19,2-18,9. Coù leõ trong 3 giôø ñaàu leân men kò khí löôïng O2 hoøa tan vaãn coøn trong moâi tröôøng vaø trong teá baøo naám men neân teá baøo naám men vaãn duy trì sinh tröôûng. ÔÛ thôøi ñieåm sau 4-5 giôø leân men quan saùt thaáy dòch leân men cuûa 3 phöông aùn suûi boït khaù maïnh chöùng toû naám men ñaõ söû duïng nguoàn ñöôøng coù trong moâi tröôøng ñeå leân men, haøm löôïng chaát khoâ giaûm ñaùng keå ñoàng thôøi haøm löôïng acid toång soá cuõng taêng leân. Trong ñoù ôû thôøi ñieåm 5 giôø sau leân men ôû phöông aùn 1, haøm löôïng chaát khoâ giaûm nhanh hôn so vôùi caùc phöông aùn khaùc. 119 ÔÛ 6 giôø haøm löôïng chaát khoâ giaûm khoâng ñaùng keå so vôùi 5 giôø ôû caû 3 phöông aùn. Töø ñoù chuùng toâi choïn thôøi gian leân men kò khí laø 5 giôø ñeå tieáp tuïc khaûo saùt quaù trình leân men ôû giai ñoaïn tieáp theo. 11.3 Khaûo saùt leân men kò khí ôû nhieät ñoä thaáp Sau thôøi gian leân men ôû 300C, tieán haønh cho leân men ôû nhieät ñoä thaáp (100C). Ñaây laø giai ñoaïn leân men phuï ñeå hoaøn thieän höông vò saûn phaåm, giuùp cho saûn phaåm coù vò chua ngoït haøi hoøa, coù muøi thôm, laøm taêng giaù trò caûm quan. Ñoàng thôøi ñeå caùc teá baøo naám men laéng xuoáng, boït quaû noåi leân treân laøm trong dòch leân men nhaèm taêng hình thöùc cho saûn phaåm. Dòch leân men sau giai ñoaïn leân men kò khí ôû nhieät ñoä 300C ñöôïc ñöa vaøo nhieät ñoä thaáp 100C. Theo doõi caùc chæ soá: haøm löôïng chaát khoâ (0Bx), traïng thaùi leân men vaø ñaùnh giaù caûm quan ñoái vôùi dòch leân men qua caùc thôøi ñieåm sau: 0, 1 …12 giôø leân men. Keát quaû theo doõi ñöôïc trình baøy ôû baûng 11.3 Baûng 11.3 Khaûo saùt thôøi gian leân men kò khí ôû 100C cuûa chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long. Thôøi gian (giôø) Haøm löôïng chaát khoâ (0Bx) Traïng thaùi leân men Caûm quan 0 18,8 1 18,8 2 18,7 Dòch leân men chöa xuaát hieän taêm boït Chua ngoït chöa haøi hoøa 3 18,7 4 18,7 Dòch baét ñaàu suûi taêm Chua ngoït chöa haøi hoøa, thôm dòu 5 18,6 6 18,5 Dòch suûi taêm nhieàu Chua ngoït haøi hoøa, thôm dòu 120 7 18,5 8 18,4 9 18,4 10 18,3 11 18,3 12 18,3 Nhaän xeùt: Qua soá lieäu ôû baûng 11.3 cho thaáy: thôøi gian ñeå ôû 100C haøm löôïng chaát khoâ giaûm chaäm, höông vò cuûa saûn phaåm ngaøy caøng roõ. Töø 0-2 giôø saûn phaåm coù vò chua ngoït chöa haøi hoøa, chöa xuaát hieän taêm boït. Ñeán 5-6 giôø saûn phaåm coù vò chua ngoït haøi hoøa, coù muøi thôm dòu, noàng, dòch leân men suûi taêm nhieàu, chöùng toû khi ôû 100C höông vò saûn phaåm ñöôïc hoaøn thieän hôn so vôùi thôøi gian leân men ôû 300C. Vaäy sau thôøi gian leân men ôû 300C, saûn phaåm ñöôïc ñöa vaøo nhieät ñoä 100C trong khoaûng thôøi gian 5-6 giôø, saûn phaåm luùc naøy coù theå söû duïng ñöôïc. Keát luaän: thoâng qua keát quaû nghieân cöùu ôû muïc 11,1, 11.2 vaø 11.3 chuùng toâi ruùt ra moät soá keát luaän sau: ñeå thu ñöôïc nöôùc uoáng leân men töø dòch traùi thanh long caàn tieán haønh x Thôøi gian leân men hieáu khí: 5 giôø vôùi cheá ñoä laéc thoâng khí 150v/p (ôû nhieät ñoä 300C) x Thôøi gian leân men kò khí: 5 giôø (ôû nhieät ñoä laø 300C) vaø leân men phuï 5-6 giôø (ôû nhieät ñoä 100C) 11.4 Hoaøn thieän saûn phaåm Ñaây laø giai ñoaïn quan troïng nhaèm ñaûm baûo chaát löôïng cuûa saûn phaåm leân men. Yeâu caàu cuûa nöôùc leân men phaûi coù traïng thaùi ñoàng nhaát, maøu saéc, muøi thôm, vò chua ngoït haøi hoøa nhaát ñònh phuø hôïp vôùi thò hieáu ngöôøi tieâu duøng. 121 11.4.1 Giai ñoaïn chieát ruùt-khöû truøng taïo thaønh phaåm Trong quaù trình leân men boït quaû noåi leân treân, teá baøo naám men laéng xuoáng ñaùy. Do vaäy caàn coù giai ñoaïn chieát ruùt ñeå laáy phaàn dòch trong thoâng qua thieát bò saün coù ôû phoøng thí nghieäm. Sau chieát ruùt, saûn phaåm ñöôïc thanh truøng Pasteur 700C trong 15-20 phuùt vaø baûo quaûn ôû 100C. Saûn phaåm ñöôïc ñaùnh giaù chaát löôïng sau 24 giôø tính töø luùc baét ñaàu leân men. 11.4.2 Kieåm tra chaát löôïng-baûo quaûn saûn phaåm nöôùc leân men Ñeå coù nhöõng keát luaän veà ñaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm nöôùc thanh long leân men, chuùng toâi phaân tích moät soá chæ tieâu cô baûn veà chaát löôïng cuûa loaïi hình ñoà uoáng naøy theo tieâu chuaån Vieät Nam (TCVN). Keát quaû thu ñöôïc ôû baûng 11.4 Baûng 11.4 Keát quaû phaân tích caùc chæ tieâu veà chaát löôïng saûn phaåm ñoà uoáng leân men töø dòch traùi thanh long Stt Caùc chæ tieâu Ñôn vò Keát quaû 1 Haøm löôïng chaát khoâ g/l 74,5 2 Ñaïm toaøn phaàn g/l 0,08 3 Protid thoâ g/l 0,5 4 Ñoä acid g/l 11,7 5 Ñoä coàn 0,9 6 Haøm löôïng este 0 7 Chaát löôïng (*) Haøm löôïng coàn baäc cao 0 8 Toång soá vi khuaån hieáu khí Khuaån laïc/ml 28 900 9 Toång soá coliform 370C/48giôø/ml Khuaån laïc/ml 24 10 E. coli Khuaån laïc/ml 0 11 Vi sinh Staphylo aureus Khuaån laïc/ml 0 122 12 Clostridium Khuaån laïc/ml 0 13 B. cereus Khuaån laïc/ml 0 14 (*) Toång soá naám moác ôû nhieät ñoä thöôøng 5 ngaøy/g Khuaån laïc/ml 0 15 Caûm quan Traïng thaùi: chaát loûng ñuïc ñeàu Maøu saéc: maøu traéng kem, ñuïc. Muøi vò: chua ngoït haøi hoøa, coù muøi thôm dòu, noàng. Toång ñieåm: 17,12 (loaïi khaù) Chuù thích: * Keát quaû phaân tích cuûa Vieän Pasteur Tp. Hoà Chí Minh (phuï luïc). Nhaän xeùt: Caùc keát quaû phaân tích ôû baûng 11.4 cho thaáy saûn phaåm nöôùc thanh long leân men ñaõ ñaït ñöôïc chæ tieâu veà chaát löôïng caûm quan, chaát löôïng veà veä sinh vaø an toaøn thöïc phaåm theo Tieâu Chuaån Vieät Nam. Baûo quaûn saûn phaåm Sau khi traûi qua 3 giai ñoaïn cuûa quaù trình leân men (giai ñoaïn leân men hieáu khí (5 giôø) ôû 300C, leân men kò khí (5 giôø) ôû 300C vaø leân men phuï ôû 100C trong 5-6 giôø) dòch leân men coù theå söû duïng ñöôïc. Ñeå baûo quaûn, dòch leân men ñöôïc chieát ruùt vaø thanh truøng Pasteur thu ñöôïc saûn phaåm nöôùc thanh long leân men. Saûn phaåm ñöôïc löu giöõ ôû t0=100C nhaèm muïc ñích baûo quaûn, tieán haønh theo doõi moät soá chæ tieâu chaát löôïng nöôùc giaûi khaùt leân men trong 2 ngaøy: haøm löôïng chaát khoâ, pH, acid toång soá vaø ñaùnh giaù caûm quan. Keát quaû ñöôïc theå hieän ôû baûng 11.5 Baûng 11.5 Moät soá chæ tieâu chaát löôïng nöôùc thanh long leân men sau thôøi gian baûo quaûn Thôøi gian baûo quaûn Caùc chæ tieâu Ñôn vò 0 giôø 1 ngaøy 2 ngaøy 123 Haøm löôïng chaát khoâ 0Bx 18,5 18,3 17,9 pH 3,40 3,39 3,37 Acid toång soá g/l 15,38 15,43 15,48 Caûm quan Vò chua ngoït haøi hoøa, thôm dòu, noàng Keát quaû phaân tích caùc chæ tieâu chaát löôïng cuûa nöôùc thanh long leân men qua 2 ngaøy baûo quaûn ôû t0=100C (Baûng 11.5): haøm löôïng chaát khoâ, pH vaø acid toång soá ôû thôøi ñieåm tröôùc vaø sau baûo quaûn, haàu nhö thay ñoåi khoâng ñaùng keå. Haøm löôïng chaát khoâ vaø pH ngaøy coù xu höôùng giaûm, ñoàng thôøi acid toång soá ngaøy caøng coù xu höôùng taêng leân. Saûn phaåm trong thôøi gian baûo quaûn coù vò chua ngoït haøi hoøa, thôm dòu, noàng ñaëc tröng cho saûn phaåm leân men. 11.5 Xaây döïng quy trình cheá taïo nöôùc uoáng leân men töø traùi thanh long ôû quy moâ phoøng thí nghieäm Dòch traùi thanh long EÙp pH=3,5, 180Bx Röûa saïch, ñeå raùo, boû voû (NH4)SO4) 5g/l Thòt traùi thanh long Nhaân gioáng 18 giôø-150v/p Traùi thanh long pH=3,5, 200Bx, (NH4)2SO4 vaø vitamin B1 10mg/l OÁng men Moâi tröôøng nhaân gioáng Moâi tröôøng leân men Leân men hieáu khí 5 giôø ôû 300C Leân men kò khí 5 giôø ôû 300C Leân men phuï 5-6 giôø ôû100C trong ñieàu kieän kò khí 124 ’Thuyeát trình coâng ngheä saûn xuaát nöôùc thanh long leân men Nguyeân lieäu: choïn traùi thanh long töôi, voû coù maøu ñoû thaåm, tai laù coøn xanh, khoâng bò daäp naùt Xöû lyù nguyeân lieäu: sau khi loät boû voû, thòt traùi thanh long ñöôïc caét mieáng cho vaøo maùy eùp traùi caây thu ñöôïc dòch traùi thanh long. Men gioáng: ñöôïc söû duïng tröïc tieáp töø oáng thaïch nghieâng Saccharomyces cerevisiae LT2. Moâi tröôøng nhaân gioáng: dòch traùi thanh long ñöôïc boå sung ñöôøng sacarose ñeán haøm löôïng chaát khoâ ñaït 180Bx, ñieàu chænh pH baèng acid citric ñeán 3,5 vaø boå sung 5g/l (NH4)2SO4. Ñem dòch khöû truøng Pasteur 700C trong 15-20 phuùt. Nhaân gioáng: gioáng naám men Saccharomyces cerevisiae LT2 ñöôïc nhaân treân moâi tröôøng nhaân gioáng vôùi cheá ñoä laéc 150v/p trong 18 giôø. Moâi tröôøng leân men: dòch thanh long ñöôïc boå sung ñöôøng sacarose ñeán haøm löôïng chaát khoâ 200Bx, ñieàu chænh pH=3,5 baèng acid citric vaø boå sung 10mg/l hoãn hôïp (NH4)2SO4 100g/l vaø vitamin B1 0,25g/l. Chieát ruùt Ñoùng chai Thanh truøng Saûn phaåm nöôùc thanh long leân men 125 Leân men: tyû leä tieáp gioáng 5%. – Leân men hieáu khí: trong 5 giôø vôùi cheá ñoä laéc thoâng khí 150v/p – Leân men kò khí: ñeå baûo ñaûm ñieàu kieän kò khí: taêng chieàu cao coät moâi tröôøng baèng caùch ñoå doàn 2 bình leân men vaøo 1 bình vaø ñeå tónh trong 5 giôø, leân men phuï ôû nhieät ñoä thaáp 100C trong thôøi gian 5-6 giôø. Laéng caën-chieát ruùt: dòch leân men ñöôïc chieát ruùt phaàn dòch trong ôû giöõa, boû xaùc quaû noåi phía treân vaø caën laéng teá baøo naám men phía döôùi. Ñoùng chai-thanh truøng: saûn phaåm ñöôïc ñoùng vaøo chai coù dung tích 330ml, chai phaûi ñaûm baûo voâ truøng. Saûn phaåm ñöôïc thanh truøng Pasteur 700C trong 20 phuùt. 126 Hình 11.1 Saûn phaåm nöôùc thanh long leân men 127 PHAÀN IV: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ Ö KEÁT LUAÄN 1. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc moät soá chæ tieâu cuûa thaønh phaàn dòch traùi thanh long Bình Thuaän: haøm löôïng hydratcacbon (ñöôøng, acid höõu cô), vitamin, caùc nguyeân toá khoaùng. Vôùi caùc keát quaû thu ñöôïc cho thaáy neáu ta bieát boå sung nhöõng gì coøn thieáu moät caùch hôïp lyù thì dòch traùi thanh long cuõng seõ laø moâi tröôøng thích hôïp ñeå nuoâi caáy naám men taïo nöôùc giaûi khaùt leân men. 2. Thoâng qua nhieàu bieän phaùp cheá bieán vaø xöû lyù traùi thanh long ñaõ choïn ñöôïc dòch traùi thanh long khoâng qua loïc laø moâi tröôøng thích hôïp cho quaù trình nhaân gioáng vaø leân men ñoái vôùi naám men. 3. Ñaõ phaân laäp, tuyeån choïn ñöôïc moät chuûng naám men coù hoaït löïc leân men maïnh, taïo höông thôm vaø ñoä keát laéng teá baøo toát, thích hôïp cho quaù trình leân men etylic töø dòch traùi thanh long, ñònh teân chuûng naám men laø Saccharomyces cerevisiae LT2. 4. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 coù khaû naêng khaùng moät soá vi khuaån gaây beänh ñöôøng ruoät vôùi phoå roäng (vöøa Gram (-) vaø caû Gram (+)). Ñieàu naøy coù yù nghóa trong vieäc taïo ra saûn phaåm nöôùc giaûi khaùt leân men töø chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 vöøa coù taùc duïng giaûi khaùt, taêng cöôøng theâm dinh döôõng vöøa coù giaù trò trò lieäu. Ñoàng thôøi chuûng naám men naøy cuõng coù khaû naêng khaùng ñöôïc 6 loaïi khaùng sinh duøng ñeå ñieàu trò beänh ñöôøng ruoät ôû ngöôøi. Keát quaû naøy môû ra höôùng coù theå söû duïng chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 laøm ñoái töôïng taïo caùc cheá phaåm Probiotic duøng trong trò lieäu nhaèm taêng cöôøng heä vi sinh vaät coù lôïi trong khu heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät ôû ngöôøi vaø vaät nuoâi. 128 5. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc moâi tröôøng nhaân gioáng ñoái vôùi chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 laø moâi tröôøng dòch traùi thanh long coù boå sung ñöôøng sacarose ñeán haøm löôïng chaát khoâ 180Bx vaø ñaïm amon (NH4)2SO4 5g/l. Ñoàng thôøi ñaõ xaùc ñònh ñieàu kieän nhaân gioáng toái öu vôùi chuûng Saccharomyces cerevisiae LT2 laø: x Cheá ñoä laéc thoâng khí 150v/p. x Thôøi gian nhaân gioáng 18 giôø. x pH=3,5. 6. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc caùc ñieàu kieän toái öu cho quaù trình leân men taïo nöôùc giaûi khaùt töø dòch traùi thanh long: x Haøm löôïng chaát khoâ 200Bx. x Haøm löôïng hoãn hôïp (NH4)2SO4 (100g/l) vaø vitamin B1 (0,25g/l) laø 10mg/l. x Haøm löôïng gioáng ban ñaàu 5% x pH ban ñaàu 3,5 x Thôøi gian leân men hieáu khí: 5 giôø vôùi cheá ñoä laéc thoâng khí 150v/p (ôû nhieät ñoä 300C) x Thôøi gian leân men kò khí: 5 giôø (ôû nhieät ñoä laø 300C) vaø leân men phuï 5-6 giôø (ôû nhieät ñoä 100C) 7. Ñaõ tieán haønh cheá bieán nöôùc giaûi khaùt leân men töø dòch traùi thanh long trong ñieàu kieän toái öu ôû quy moâ phoøng thí nghieäm. Keát quaû phaân tích cho thaáy loaïi nöôùc giaûi khaùt leân men naøy ñaït ñöôïc caùc chæ tieâu veà chaát löôïng caûm quan vaø veä sinh an toaøn thöïc phaåm theo Tieâu Chuaån Vieät Nam. 8. Ñaõ xaây döïng ñöôïc quy trình cheá bieán traùi thanh long ôû quy moâ phoøng thí nghieäm laøm nöôùc uoáng leân men etylic coù giaù trò giaûi khaùt, giaøu dinh döôõng. 129 Ö ÑEÀ NGHÒ: 1. Tieáp tuïc nghieân cöùu hoaøn thieän caùc giaûi phaùp xöû lyù traùi thanh long laøm moâi tröôøng leân men vaø taän duïng nguoàn pheá phaåm sau xöû lyù ñeå taïo theâm caùc saûn phaåm coù theå söû duïng ñöôïc. 2. Nghieân cöùu keát hôïp dòch traùi thanh long vôùi caùc loaïi dòch quaû khaùc nhaèm laøm taêng hình thöùc vaø naâng cao chaát löôïng saûn phaåm cuûa nöôùc giaûi khaùt leân men. 3. Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä cheá bieán traùi thanh long thaønh ñoà uoáng leân men etylic coù giaù trò dinh döôõng vaø caûm quan thích hôïp vôùi thò hieáu ngöôøi tieâu duøng. 130 PHỤ LỤC 5.4 Phương pháp đánh giá cảm quan [38] [39] [40] [41] [42] [53] [58] Chất lượng nước giải khát lên men về mặt cảm quan được đánh giá theo Tiêu Chuẩn Nhà nước. TCVN 3216-1994 “Đồ hộp rau quả-phân tích cảm quan bằng phương pháp cho điểm”. Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại đồ hộp rau quả gồm nước quả ép, nước quả nghiền, đồ hộp quả và rau quả dầm dấm. Tiêu chuẩn này phải được áp dụng cùng với TCVN 3215-1979 “Sản phẩm thực phẩm-phân tích cảm quan-phương pháp cho điểm”. Cụ thể: Khi đánh giá tất cả các chỉ tiêu cảm quan hay từng chỉ tiêu riêng biệt của sản phẩm phải dùng hệ điểm 20 xây dựng trên 1 thang thống nhất 6 bậc 5 điểm (0, 1, 2, 3, 4, 5) trong đó: 5 trong 6 bậc đánh giá (bằng chữ số từ 5 đến 1) ở dạng điểm chưa có trọng lượng đối với mức độ khuyết tật của từng chỉ tiêu cảm quan. 1 bậc đánh giá bằng chữ số 0 để biểu thị khuyết tật ứng với sản phẩm “bị hỏng” và không sử dụng được nữa. * Để đánh giá cảm quan phải có Hội đồng đánh giá. Thành viên của Hội đồng là những người có trình độ chuyên môn, hiểu biết về sản phẩm, có khả năng phân biệt cảm giác tốt. Số thành viên trong Hội đồng ít nhất là 5 người, tối đa là 13 người. * Đối với sản phẩm nước giải khát lên men thanh long được đánh giá theo 3 chỉ tiêu: Màu sắc, mùi vị và hình thái với các hệ số quan trọng cho từng chỉ tiêu như sau: Thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 Màu sắc 0,8 2 Mùi vị 2,0 131 3 Trạng thái 1,2 Tổng cộng: 4,0 Bảng điểm tiêu chuẩn cho từng chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm nước giải khát Thanh Long lên men [38] [39] [41]. 132 BẢNG ĐIỂM CẢM QUAN CHO MẪU NƯỚC THANH LONG LÊN MEN Chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu 5 Màu trắng kem, đục, không có lẫn hột đen của thanh long. 4 Màu trắng kem, đục, có lẫn rất ít hột đen của thanh long. 3 Màu hơi ngả về nâu, đục, có lẫn hột đen của thanh long. 2 Xuống màu, ngả về nâu hẳn. 1 Màu nâu sậm. Màu sắc 0 Mất màu hoàn toàn, sản phẩm bị hư. 5 Chất lỏng đục đều, khi lắc sủi bọt mạnh, tăm bọt đều. 4 Chất lỏng đục đều, có lẫn rất ít hột đen của thanh long, khi lắc có sủi bọt. 3 Chất lỏng đục đều, các hột đen của thanh long phân tán đều, sủi bọt rất ít. 2 Chất lỏng đục, bột quả vốn cục ít, lắng cặn nhỏ. 1 Chất lỏng, bột quả vốn cục nhiều, lắng cặn. Trạng thái 0 Chất lỏng tách lớp. 5 Chua ngọt hoàn toàn hài hòa, thơm dịu, hậu vị tốt, mùi nồng hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm lên men. 133 4 Chua ngọt hài hòa, mùi thơm khó nhận thấy, mùi hơi nồng đặc trưng của sản phẩm lên men. 3 Chua ngọt chưa hoàn toàn hài hòa, mùi thơm khó nhận thấy, mùi hơi nồng đặc trưng của sản phẩm lên men. 2 Hơi chua, không có mùi thơm. 1 Chua nhiều, hơi đắng, thoảng có mùi lạ. Mùi vị 0 Có mùi khó chịu của sản phẩm hỏng. 134 HẠNG CHẤT LƯỢNG CỦA SẢN PHẨM NƯỚC GIẢI KHÁT THANH LONG ĐƯỢC CHIA THÀNH CÁC MỨC SAU: STT Mức chất lượng Điểm chung Yêu cầu về điểm trung bình chưa trọng lượng đối với các chỉ tiêu 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất lớn hơn hoặc bằng 4,8. 2 Loại khá 15,2 – 19,5 Các chỉ tiêu quan trọng nhất lớn hơn hoặc bằng 3,8. 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 2,8. 4 Loại kém (Không đạt chất lượng quy định trong tiêu chuẩn còn khả năng bán được). 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 1,8. 5 Loại rất kém (không có khả năng bán được nhưng sau khi tái chế thích hợp còn sử dụng được). 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu lớn hơn hoặc bằng 1,0. 6 Loại hỏng (không còn sử dụng được). 0 – 3,9 135 BẢNG ĐIỂM ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN MẪU NƯỚC GIẢI KHÁT LÊN MEN THANH LONG Tên sản phẩm kiểm tra: Nước giải khát lên men Thanh Long Ngày... tháng…..năm 2005 Họ và tên người kiểm tra: ........................................ Chữ ký:......................... Mẫu Các chỉ tiêu Điểm từ 0 - 5 Ghi chú (nhận xét bằng chữ) Màu sắc 5 4 3 2 1 0 1 Trạng thái 5 4 3 2 1 0 136 Mùi vị 5 4 3 2 1 0 137 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Tieáng Vieät: 1. Nguyeãn Ngoïc AÅn (1999), Kyõ thuaät troàng, chaêm soùc vöôøn caây vaø caùc vaán ñeà lieân quan, Nxb Noâng Nghieäp, Tp. Hoà Chí Minh. 2. Baùo caùo tham luaän taïi hoäi nghò sinh hoaït hoïc thuaät do Trung Taâm Tin Hoïc Noâng Nghieäp vaø Phaùt Trieån Noâng Thoân toå chöùc 6/2/2004 taïi Haø Noäi. 3. Boä Y teá (1979), Vi khuaån, vi ruùt, kyù sinh vaät, Nxb Y Hoïc. 4. Nguyeãn Laân Duõng (1986), Men gia suùc vaø men röôïu, Nxb Khoa Hoïc - Kyõ Thuaät. 5. Nguyeãn Laân Duõng, Ñoaøn Xuaân Möôïn, Nguyeãn Phuøng Tieán, Ñaëng Ñöùc Traïch, Phaïm Vaên Ty (1972), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc taäp 1, Nxb Khoa Hoïc - Kyõ Thuaät, Haø Noäi. 6. Nguyeãn Laân Duõng, Phaïm Vaên Ty, Döông Ñöùc Tieán (1979), Vi sinh vaät hoïc taäp 1, Nxb Ñaïi Hoïc Vaø Trung Hoïc Chuyeân Nghieäp Haø Noäi. 7. Vuõ Thò Minh Ñöùc (2001), Thöïc taäp vi sinh vaät, Nxb Ñaïi Hoïc Quoác Gia, Haø Noäi. 8. Quaûn Leâ Haø (1998), Nghieân cöùu moät soá ñaëc tính vaø öùng duïng heä enzim thuûy phaân tinh boät vaø protein trong saûn xuaát caùc ñoà uoáng, Luaän AÙn Tieán Só Khoa Hoïc - Kyõ Thuaät. 9. Vuõ Coâng Haäu (1993), Cheá bieán röôïu vang traùi caây trong gia ñình, Nxb Noâng Nghieäp. 10. Vuõ Coâng Haäu (1996), Troàng caây aên quaû ôû Vieät Nam, Nxb Noâng Nghieäp, Tp. Hoà Chí Minh. 138 11. Leâ Ngoïc Hieáu (2004), Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng ñoái khaùng vôùi caùc vi khuaån gaây beänh, Luaän Vaên Toát Nghieäp Chuyeân Ngaønh Vi Sinh Vaät Khoa Sinh, Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp. Hoà Chí Minh. 12. Phaïm Thò AÙnh Hoàng (2003), Kyõ thuaät sinh hoùa, Nxb Ñaïi Hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh. 13. Nguyeãn Thò Thöông Huyeàn (2000), Phaân laäp vaø tuyeån choïn chuûng naám men thích hôïp cho quaù trình leân men ñoà uoáng töø tinh boät, Luaän Vaên Toát Nghieâïp Khoa Sinh Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm, Tp. Hoà Chí Minh. 14. Nguyeãn Thò Lan Höông (2001), Tìm hieåu khaû naêng söû duïng moät soá chuûng naám men trong quaù trình cheá bieán ñoà uoáng leân men töø tinh boät, Luaän Vaên Toát Nghieäp Khoa Sinh, Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp. Hoà Chí Minh. 15. Nguyeãn Thuùy Höôøng (1994), Tuyeån choïn chuûng naám men duøng cho leân men röôïu vang quaû, Luaän AÙn Cöû Nhaân Sinh Hoïc Ñaïi Hoïc Toång Hôïp, Haø Noäi. 16. Jvirblianska A.I.A (1966), Vi sinh vaät trong coâng nghieäp thöïc phaåm, Nxb Coâng Nghieäp Thöïc Phaåm Moskva. 17. Nguyeãn Vaên Keá (1997), Caây thanh long, Hylocereus undatus, Haw., Nxb Noâng Nghieäp. 18. Phan Höõu Leã (2003), Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä vaø noàng ñoä CO2 ñeán thanh long baûo quaûn, Luaän Vaên Toát Nghieäp Khoa Coâng Ngheä Thöïc Phaåm Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp. Hoà Chí Minh. 139 19. Phuøng Thò Thuøy Linh (2004), Phaân laäp, tuyeån choïn caùc chuûng naám men duøng trong leân men röôïu vang döùa, Luaän Vaên Toát Nghieäp Khoa Sinh, Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp. Hoà Chí Minh. 20. Ñoã Taát Lôïi (1997), “Giaù trò dinh döôõng cuûa traùi thanh long”, Baùo Khoa Hoïc Vaø Coâng Ngheä. 21. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Nguyeãn Chuùc, Leâ Vaên Vieät Maãn, Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm, Tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät, Tp. Hoà Chí Minh. 22. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (chuû bieân), Phan Thò Huyeàn, Nguyeãn AÙnh Tuyeát (2003), Thí nghieäm Coâng ngheä sinh hoïc taäp 2, Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc, Nxb Ñaïi hoïc quoác gia Tp. Hoà Chí Minh. 23. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh taäp 3, Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng. 24. Nguyeãn Thò Quyønh Mai (2004), Nghieân cöùu khaû naêng söû duïng moät soá chuûng naám men trong quaù trình cheá bieán ñoà uoáng leân men töø traùi thanh long (Hylocereus undatus Haw), Luaän Vaên Toát Nghieäp Chuyeân Ngaønh Vi Sinh Vaät Khoa Sinh Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp. Hoà Chí Minh. 25. Traàn Vaên Khoa (2003), Nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh lyù sinh hoùa cuûa chuûng naám men Saccharomyces boulardii, Luaän Vaên Toát Nghieäp Khoa Coâng Ngheä Sinh Hoïc Tröôøng Ñaïi Hoïc Daân Laäp Vaên Lang. 26. Nguyeãn Hoaøi Nam (1986), Xaùc ñònh hoaït löïc khaùng sinh baèng vi sinh vaät, Nxb Khoa Hoïc - Kyõ Thuaät. 27. Leâ Vieät Nga, Ngoâ Tieán Hieån, Traàn Thò Chaâu, Nguyeãn Thuùy Höôøng, Erko Stackebrandt, Peter Hoffmann, Ina Kramer, Cathrin Spoerer, 140 Guenter Stoschek, Nguyeãn Thò Hieàn (2001), “Phaân loaïi vaø ñònh teân moät soá chuûng naám men trong saûn xuaát röôïu vang quaû coù ñoä röôïu thaáp”, Hoäi Thaûo Quoác Teá Sinh Hoïc taäp 2. 28. Nguyeãn Thò Hoàng Nhung (2000), Nghieân cöùu moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men röôïu caàn Taây Nguyeân, Luaän AÙn Thaïc Só Khoa Hoïc Sinh Hoïc tröôøng Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân, Tp. Hoà Chí Minh. 29. N.X EÂgoâroâv hieäu ñính, ngöôøi dòch Nguyeãn Laân Duõng, Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc, Nxb Ñaïi Hoïc Vaø Trung Hoïc Chuyeân Nghieäp, Haø Noäi. 30. Löông Ñöùc Phaåm (1998), Coâng ngheä vi sinh vaät, Nxb Noâng Nghieäp, Haø Noäi. 31. Löông Ñöùc Phaåm, Vuõ Kim Duõng (1980), Vi sinh vaät löông thöïc vaø thöïc phaåm, Boä Löông Thöïc Vaø Thöïc Phaåm. 32. Löông Ñöùc Phaåm (2004), Naám men coâng nghieäp, Trung Taâm Khoa Hoïc Töï Nhieân Vaø Coâng Ngheä Quoác Gia, Haø Noäi. 33. Phoøng thí nghieäm sinh hoùa, Thöïc taäp sinh hoùa, Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp.Hoà Chí Minh. 34. Leâ Xuaân Phöông, Vi sinh vaät coâng nghieäp, Nxb Xaây döïng. 35. Sôû Noâng Nghieäp Vaø Phaùt Trieån Noâng Thoân Bình Thuaän (2004), Tham luaän caây thanh long. 36. Traàn Minh Taâm (2000), Coâng ngheä vi sinh öùng duïng, Nxb Noâng Nghieäp. 37. Thoâng tin veà thaønh töïu khoa hoïc coâng ngheä Vieät Nam, Trò loaïn khuaån ñöôøng ruoät baèng naám men, theo baùo tuoåi treû ngaøy 10/01/2004. 141 38. Tieâu chuaån Vieät Nam (3215-1979), Saûn phaåm thöïc phaåm, phaân tích caûm quan, phöông phaùp cho ñieåm. 39. Tieâu chuaån Vieät Nam (3216-1994), Ñoà hoäp rau quaû, phaân tích caûm quan baèng phöông phaùp cho ñieåm. 40. Tieâu chuaån Vieät Nam (3217-79), Röôïu, phaân tích caûm quan, phöông phaùp cho ñieåm. 41. Tieâu chuaån Vieät Nam (5090-1990), Phaân tích caûm quan, phöông phaùp luaän, ñaùnh giaù thöïc phaåm baèng phöông phaùp söû duïng thang ñieåm. 42. Tieâu chuaån Vieät Nam (5042-1994), Nöôùc giaûi khaùt, yeâu caàu veä sinh, phöông phaùp thöû. 43. Leâ Hoàng Thaùi (2002), AÛnh höôûng cuûa vi sinh vaät ñeán chaát löôïng moät soá loaïi gaïo neáp trong quaù trình baûo quaûn, Luaän Vaên Toát Nghieäp Ngaønh Sinh Hoùa Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Tp.Hoà Chí Minh. 44. Traàn Thò Thanh (2000), Coâng ngheä vi sinh, Nxb Giaùo Duïc, Tp. Hoà Chí Minh. 45. Vuõ Nguyeân Thaønh, Nguyeãn Höông Giang, Ñinh Myõ Haèng, Heinrich Liinsdorf, Peter Golyshin (2001), “Vi ruùt RNA maïch keùp trong naám men sinh khaùng sinh Torulaspora delbrueckii”, Hoäi Thaûo Quoác Teá Sinh Hoïc taäp 2. 46. Nguyeãn Quang Thaûo (2001), “Choïn chuûng naám men phuø hôïp ñeå saûn xuaát nöôùc giaûi khaùt coù ñoä coàn thaáp töø traùi caây”, Hoäi Thaûo Quoác Teá Sinh Hoïc taäp 2. 142 47. Traàn Quyù Thaéng (1999), Phaân laäp, tuyeån choïn vaø nghieân cöùu moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa naám men duøng ñeå leân men vang quaû ñieàu, Luaän AÙn Tieán Só Khoa Hoïc Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm, Haø Noäi. 48. Chu Vaên Thoï, Traàn Ñình Thanh, Phaïm Minh Böûu, Nguyeãn Vaên Lieâng, Giaùo trình xaùc suaát thoáng keâ, Tröôøng Ñaïi Hoc Y Döôïc, Tp.Hoà Chí Minh. 49. Nguyeãn Thò Thuûy (1996), Nghieân cöùu moät soá phöông phaùp nhaèm oån ñònh chaát löôïng saûn phaåm daïng Squash töø cam quyùt töôi, Luaän AÙn Phoù Tieán Só Khoa Hoïc Kyõ Thuaät Ngaønh Coâng Ngheä Thöïc Phaåm, Tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa, Haø Noäi. 50. Traàn Thanh Thuûy (1998), Höôùng daãn thöïc haønh vi sinh vaät hoïc, Nxb Giaùo duïc, Tp.Hoà Chí Minh. 51. Traàn Thanh Thuûy (2003), Nghieân cöùu söû duïng vi sinh vaät leân men lactic ñoà uoáng töø saén, Luaän aùn Tieán só chuyeân ngaønh vi sinh vaät Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Haø Noäi. 52. Traàn Thanh Thuûy (2004), Taøi lieäu thöïc taäp lôùn vi sinh vaät daønh cho lôùp cao hoïc, Tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm, Tp.Hoà Chí Minh. 53. Nguyeãn Thò Hoàng Thö (1989), Kieåm nghieäm thöïc phaåm baèng phöông phaùp caûm quan, Nxb Khoa Hoïc - Kyõ Thuaät, Haø Noäi. 54. Traàn Linh Thöôùc (2003), Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät trong nöôùc, thöïc phaåm vaø myõ phaåm, Nxb Giaùo Duïc. 55. Nguyeãn Theá Trang, Nguyeãn Vaên Hieáu, Löông Ñöùc Phaåm, Traàn Ñình Maãn, Nguyeãn Traàn Dieãn (2001), “Phaân laäp vaø tuyeån choïn chuûng 143 naám men Saccharomyces sp. phuø hôïp vôùi nhu caàu saûn xuaát röôïu vang töø dòch quaû nho”, Hoäi Thaûo Quoác Teá Sinh Hoïc taäp 2. 56. Ñoã Thu Truùc (2002), Söû duïng caùc loaïi bao bì coù ñoä thaám khaùc nhau ñeå baûo quaûn thanh long (Hylocereus undatus), Khoùa Luaän Cöû Nhaân Khoa Hoïc Chuyeân Ngaønh Sinh Hoùa Tröôøng Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân, Tp.Hoà Chí Minh. 57. Traàn Theá Tuïc, Cao Anh Long, Phaïm Vaên Coân, Hoaøng Ngoïc Thuaän, Ñoaøn Theá Lö (1998), Caây aên traùi, Nxb Noâng Nghieäp, Haø Noäi. 58. Haø Duyeân Tö (1991), Kyõ thuaät phaân tích caûm quan, Toång Cuïc Tieâu Chuaån, Ño Löôøng, Chaát Löôïng. 59. Laâm Hoàng Töôøng (2004), Khaùng sinh, Baøi Giaûng Khoa Y Tröôøng Ñaïi Hoïc Y Döôïc, Tp.Hoà Chí Minh. 60. Vuõ Höôùng Vaên, “Nhöõng phaùt hieän môùi veà quaû nho ñoû”, Baùo Thuoác vaø Söùc khoûe, (297). 61. Hoà Thuùy Vaân (2002), Nghieân cöùu thöû nghieäm cheá bieán nöôùc uoáng vaø röôïu vang töø quaû mô, Luaän vaên toát nghieäp khoa Coâng nghieäp thöïc phaåm tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp.Hoà Chí Minh. 62. Ñieàn Vieân (1994), “Quaû Thanh Long, moät ñaëc saûn nhieät ñôùi”, Baùo Khoa hoïc vaø Coâng ngheä. Tieáng Anh: 63. AOAC (1984), Offical method of omalysis14th (Ed) P 220-227. 64. Cletus Pkurtzman and Jack.W.Fell (1998), The yeats, Atasonomic Study, Amsterdam, Lausanne, New York, Oxford, Shannon, Singapore, Tokyo. 144 Internet: 65. 66. 67. 68. 69. 70. ._.