Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính proteaseddoong tụ sữa từ Aspergillus awamori và ứng dụng trong sản xuất phomat

phẩm sữa lên men. Phomat là một sản phẩm lên men từ protein sữa có giá trị dinh dưỡng cao, chúng được sản xuất bằng cách đông tụ cazein là loại protein chủ yếu trong sữa. Trong phomat các chất có giá trị dinh dưỡng ít bị tổn thất, ngoài ra một số thành phần còn được tăng thêm do được tổng hợp bởi quá trình ngâm chín sinh hoá và sự lên men của vi sinh vật. Các vitamin được bảo tồn, chất béo, protein được phân giải để cơ thể dễ dàng hấp thụ. Phomat được coi là sản phẩm sữa cao cấp nhất, phomat chứa một lượng protein, chất béo tương đối cao, mức độ sinh năng lượng của 1 kg phomat tương đương vớ 25000-45000 Kcal. Đông tụ sữa là quá trình rất quan trọng trong sản xuất phomat. Người ta thường dùng renin làm tác nhân đông tụ. Nhưng do sự khan hiếm và không kinh tế của nguồn nguyên liệu renin này mà người ta đã nghiên cứu và sử dụng protease từ vi sinh vật có khả năng đông tụ sữa. Nấm mốc là một trong những loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại protease và quan trọng nhất là chúng có khả năng tổng hợp protease axit đông tụ sữa. Chúng có khả năng thay thế renin rất tốt. Mặc dù sản phẩm phomat còn chưa được sử dung rộng rãi ở Việt Nam do giá thành cao và hơn nữa nhiều người chưa quen sử dụng phomat. Nhưng trong tương lai loại sản phẩm này sẽ được sử dụng rông rãi bởi giá trị dinh dưỡng cao của chúng. Với những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính protease đông tụ sữa từ Aspergillus awamori và ứng dụng trong sản xuất phomat” Để đạt được mục đích trên chúng tôi cần nghiên cứu những vấn đề sau: - Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease đông tụ sữa cao. - Nghiên cứu môi trường nuôi thích hợp cho sự tổng hợp protease đông tụ sữa. - Thu chế phẩm và xác định một số đặc tính của protease đông tụ sữa - Sản xuất phomat có sử dụng protease đông tụ sữa trên quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm. Phần I. tổng quan Nguồn thu protease đông tụ sữa Enzym là những chất không thể thu được bằng con đường tổng hợp hoá học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả các cơ quan, mô của động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzym nhất là tách với quy mô công nghiệp thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong những trường hợp mà vật liệu có chứa một lượng lớn enzym cũng như cho phép thu được enzym với hiệu suất cao. Với protease đông tụ sữa thì chủ yếu được thu từ động vật hoặc vi sinh vật[1]. Nguồn thu protease đông tụ sữa từ động vật, thực vật Protease là các enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit trong phân tử protein và các chất tương tự. Sản phẩm của quá trình thuỷ phân là các peptit và các axit amin. Protease đông tụ sữa là một dạng protease có khả năng tấn công vào vị trí Phe(105)-Met(106) của kappa-casein làm lộ ra các đầu kị nước và dẫn tới hiện tượng đông tụ. Proetase đông tụ sữa truyền thống thường được lấy từ động vật cụ thể là từ ngăn thứ tư của dạ dày bê, nghé và protease đông tụ sữa này được gọi là rennet. Lilla S. và cộng sự (1977) đã phân tích thấy thành phần của rennet gồm 6 loại chymosin và được xếp vào 2 nhóm chimosin A và B, mỗi nhóm trên lại bao gồm 2 dạng có các đầu N khác nhau, một dạng có 3 đầu dài hơn và một dạng có 2 đầu ngắn hơn Từ thực vật thượng đẳng có thể thu được một số chế phẩm emzym thuỷ phân protein như papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ dứa,... tuy nhiên chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu đó không thể làm nguyên liệu để sản xuất enzym với quy mô công nghiệp hơn nữa không thể sản xuất với số lượng lớn nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Muốn khắc phục được khó khăn và hạn chế khi dùng enzym từ động, thực vật thì người ta dùng chế phẩm enzym từ vi sinh vật. Vì vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn. Thực tế đã chứng tỏ tính ưu việt và khả năng to lớn của nguồn nguyên liệu này [1]. Nguồn thu protease động tụ sữa từ vi sinh vật Cùng với sự phát triển của xã hội thì nhu cầu về renin cũng ngày càng lớn nếu chỉ thu từ động vật thì ngành chăn nuôi không đáp ứng được đầy đủ, do vậy từ thập kỷ 50-60 đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào một loại đối tượng rất giàu tiềm năng đó là vi sinh vật. Thực tế đã cho thấy với hầu hết các enzim được sử dụng trong công nghiệp đều có nguồn gốc từ vi sinh vật đó chính là tính ưu việt và khả năng to lớn của nguồn nguyên liệu vi sinh vật này. Protease đông tụ sữa đa số được tổng hợp ở nấm mốc, phần lớn là các chủng thuộc giống Aspergillus như A. saitoi, A. niger, A. awamori, A. oryzae, và một số chủng giống Rhizopus, Penicilium. Đặc biệt là các chủng nấm mốc có bào tử đen có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease đông tụ sữa và phát triển thích hợp trong môi trường pH thấp[4]. Đặc điểm cũng như sự sinh tổng hợp protease nói chung và protease đông tụ sữa nói riêng phụ thuộc vào đặc tính sinh lý, di truyền của bản thân vi sinh vật và điều kiện phát triển của chúng như độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ thoáng khí, thành phần môi trường… Vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp protease thuộc về các nhóm vi khuẩn hiếu khí, yếm khí có các chi Bacillus: như B. cereus tổng hợp hai loại protease trung tính và axit tính. ở Nhật Bản trong công nghệ sản xuất phomat, người ta đã dùng protease đông tụ sữa từ các chủng Mucor pusillus, Rhizopus chinensis, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Rhizopus nodous, Rhizopus pseudokinensis, Rhizopus peka làm đông tụ sữa trong sản xuất phomat. Theo nghiên cứu của A. F. Abdel-Fattah thì chủng nẫm mốc Penicillium citrinum có khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa. Theo nghiên cứu của Amal M. Hasbem 1999 thì các chủng vi sinh vật như Aspergillus oryzae 3483, Trichoderna viride 24631, Aspergillus oryzae 3488, Aspergillus oryzae 3486 Aspergillus terrus đều có khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sũa. Trong đó có chủng Aspergillus oryzae 3486 cho hoạt tính cao nhất 4,5 (U/phản ứng). Tuy nhiên mức độ sing tổng hợp protease thuỷ phân cazein của các chủng này cũng tương đối cao nên người ta thường không dùng các chủng này để sinh tổng hợp protease đông tụ sữa[8]. Theo nghiên cứu của H. G Osaman và cộng sự (1969) thi các chủng nấm mốc như Penecillium chrysogenum 102, P. notatum 62, P. notatum 105, P. ochraceus Wilhelm 67, Siemiphylium consortiale 21, Ocspora sp. 3, Mucor sp, Geotrichum candidum, đều cho hoạt tính đông tụ sữa. nhưng cho hoạt tính đông tụ sữa cao nhất là Aspergillus niger 58[17]. Các protease được tách từ vi khuẩn được biết nhiều hơn cả là Subtilizin, Subtilizin, B Subtilizin C. Các Subtilizin này thuộc nhóm enzym tiolic có tính đặc hiệu hơn nhiều protease động vật. Protease của B. subtilis và B. mesenrericus ngoài khả năng thuỷ phân hoàn toàn protein còn có hoạt tính đông tụ sữa, song các chủng vi khuẩn cũng rất ít được sử dụng trong sản xuất protease đông tụ sữa vì protease của chúng thuỷ phân sâu sắc protein nên không phù hợp trong sản xuất phomat. Trong tự nhiên cũng có nhiều xạ khuẩn cũng có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh, chúng thuộc chi Streptomyces. Điều kiện nuôi cấy thu protease động tụ sữa Mỗi chủng vi sinh vật đều có những điều kiện nuôi cấy để thu được những sản phẩm mình mong muốn. Các yếu tố ngoại cảnh có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình hình thành sản phẩm. Khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa vi sinh vật cũng như các enzym vi sinh vật khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ, độ thoáng khí và thành phần môi trường. Mỗi loại vi sinh vật trong các điều kiện khác nhau thì ưu tiên sinh tổng hợp một loại enzym nhất định. bằng cách tác động đến các yếu tố môi trường nuôi cấy ta có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa từ chủng vi sinh vật đã chọn. Để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzym trong môi trường cần có các chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như Mn, Ca, P, Fe, K và một số chất khác. Thành phần môi trường như nguồn dinh dưỡng cacbon, nguồn nitơ, các muối khoáng phải tối thích cho vi sinh vật để sinh tổng hợp ra những enzym mình mong muốn. Nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường dùng để nuôi vi sinh vật là gluxit. Đặc tính tác dụng của gluxit tuỳ theo bản chất hoá học và đặc điểm sinh lý của vi sinh vật. Nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease của một số nòi Bacillus và Aspergillus là tinh bột, dextrin hoặc maltoza và sacaroza. Tinh bột và các sản phẩm thuỷ phân tinh bột có ảnh hưởng khác nhau đối với sự tổng hợp protease ở vi sinh vật. Tinh bột, dextrin và maltoza có tác dụng tăng sự tích lũy sinh khối của vi sinh vật, qua đó làm tăng tổng hoạt lực protease trong môi trường. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hai loại monosacarit và disacarit khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa ở một số loài thuộc giống Aspergillus cho thấy nguồn cacbon tốt nhất cho sự tổng hợp protease đông tụ sữa là sacaroza. Ngoài ra fructoza, maltoza và glucoza cũng là nguồn cacbon tốt cho quá trình tổng hợp protease. Theo nghiên cứu của Amal M. Hasbem 1999 thì nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp protease đông tụ sữa từ Penicillium oxalicum là sacaroza. ông đã nghiên cứu với các nguồn cacbon khác nhau là: sacaroza, maltoza, tinh bột, milk-whey, lactose. Kết quả thu được ở bảng: Nguồn cacbon Thời gian lấy mẫu (ngày) pH môi trường Sinh khối (g/50ml) Hàm lượng Pr (mg/ml) Hoạt độ đông tụ (U/phản ứng) Hoạt độ thuỷ phân (U/ml) Sucaroza 8 4.5 0.62 5.07 5.00 0.44 Molasses 5 5.1 1.60 14.02 2.22 1.70 6 4.9 1.78 15.10 2.33 2.02 7 4.8 1.82 14.49 3.33 1.94 8 4.7 1.92 14.06 3.03 1.89 Lactose 5 4.9 0.96 10.97 3.33 1.80 6 5.1 1.12 11.12 4.65 2.34 7 5.2 0.99 12.80 5.00 4.50 8 5.5 0.98 11.90 5.60 3.50 Starch 5 5.8 1.15 9.67 3.13 1.10 6 5.9 1.17 9.50 3.13 2.21 7 5.9 1.82 8.09 4.55 2.46 8 6.0 1.32 8.26 6.02 3.78 Milk-whey 5 5.9 1.47 6.20 0.88 0.41 6 5.8 1.40 8.37 1.11 0.66 7 5.8 1.37 6.44 1.09 1.26 8 5.9 0.94 6.34 4.35 1.33 Kêt quả ở trên cho thấy đối với hoạt tính đông tụ của tinh bột là cao nhất(6.02 u/reaction) nhưng hoạt tính thuỷ phân casein cũng cao 3,78 u/ml nên người ta không chọn tinh bột. Tương tự đối với milk-whey và lactose, các nguồn cacbon này đều cho hoạt ính đông tụ cao nhưng hoạt tính thuỷ phân cũng cao. Chỉ có sacaroza cho hoạt tính đông tụ cao (5U/reaction) và hoạt tính thuỷ phân thấp 0.44 (U/ml). Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường cacbon đến quá trình sinh tổng hợp protease đông tụ sữa H. G Osman đã chọn các nguồn cacbon khác nhau là: corn steep liquor (2%,w/v) + lactose(1%w/v), whey, whey+lactose(2%w/v), molasses (12%w/v), molasses (12%w/v)+ lactose(1%w/v). Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng: Nguồn cacbon pH môi trường Thời gian đông tụ Corn steep liquor (2%,w/v)+ lactose(1%w/v) 3.7 10 Whey 2.5 10 whey+lactose(2%w/v) 3.0 40 molasses (12%w/v) 4.0 60 molasses (12%w/v)+ lactose(1%w/v) 2.5 0.00 Như vậy nguồn cacbon tôt nhất đã được nghiên cứu là whey hoặc Corn steep liquor (2%,w/v)+ lactose(1%w/v). Nguồn dinh dưỡng nitơ: Có thể là hợp chất vô cơ, hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể là hợp chất giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đậu, cao nấm men, pepton… Nguồn nitơ vô cơ ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease nhưng khi sử dụng phối hợp các nguồn nitơ hữu cơ sẽ làm tăng đáng kể những quá trình sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật. Ví dụ thêm NaNO3 hoặc NH4 với lượng 0.6-3.8 % vào môi trường có chứa đủ nguồn nitơ hữu cơ thì hiệu suất tổng hợp protease của nhiều chủng thuộc giống A. niger tăng tới khoảng 140-190%. Cũng theo nghiên cứu của Amal M. Hasbem (1999) về sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp protease đông tụ sữa từ Penicillium oxalicum. Tác giả đã nghiên cứu trên các nguồn nitơ khác nhau, kết quả thu được ở bảng sau: Nguồn nitơ pH canh trường Hàm lượng sinh khối (g/50ml) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ đông tụ sữa (U/phản ứng) Hoạt độ thuỷ phân (U/ml) Cao nấm men+pepton 4.5 0.62 5.07 5.00 0.44 CSL 4.3 0.48 14.96 2.22 2.72 Khô đậu 4.5 0.79 20.00 2.22 1.31 Ure 5.0 0.30 1.26 0.71 0.54 Nấm men bánh mì 5.0 1.01 4.80 5.00 0.63 Kêt quả cho thấy đối với nguồn nitơ là hỗn hợp cao nấm men và pepton cho hoạt độ đông tụ cao nhất (5 U/phản ứng) hoạt độ thuỷ phân thấp nhất 0,44( U/ml). và người ta đã chọn nguồn nitơ là cao nấm men và pepton[8]. Nồng độ nitơ của môi trường cũng ảnh hưởng rõ rệt và tác động có quy luật đến quá trình tổng hợp protease đông tụ sữa ở vi sinh vật. Chẳng hạn khi tăng hàm lượng nitơ trong môi trường không những không kích thích quá trình tổng hợp mà còn có tác dụng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật. Ngoài nitơ và cacbon thì phospho và lưu huỳnh cũng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protease đông tụ sữa ở vi sinh vật. Phospho vô cơ thường ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease đông tụ sữa. Tuy nhiên, có thể có ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp enzym cũng như protein nội bào. Do đó, nó có thể đóng vai trò trong quá trình quá trình sinh tổng hợp enzym, protein ở trong và ngoài tế bào vi sinh vật. Để thu chế phẩm protease làm đông tụ sữa H.G. Osman (1969) và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất enzym này từ Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất phomat. Nuôi A. niger 58 trên một số môi trường cho thấy trên môi trường whey cho hoạt độ đông tụ sữa cao nhất và bằng với dịch chiết ngô. Trên môi trường khoáng, glucose và NH4NO3 không cho hoạt độ[17]. Từ nuôi cấy Penecilium citrinum người ta cũng thu được protease đông tụ sữa dùng trong sản xuất phomat. Môi trường tối ưu cũng là dịch whey [23]. Axit amin có ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp protease đông tụ sữa ở vi sinh vật. Các axit amin glyxin, cystein kích thích qua trình tổng hợp protease đông tụ sữa ở A. awamori, A. flavus. Cho đến nay chưa có một tác giả nào giải thích một cách hợp lý về cơ chế kích thích hoặc kìm hãm đối với quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật. Theo nhiên cứu protease vi sinh vật tổng hợp được có dải hoạt động trong vùng pH từ 1.8-10.5 và có thể lớn hơn. Các loại nấm mốc có sắc tố màu đen như Aspergillus awamori, A. saitoi, A. usami, sinh tổng hợp enzym protease có pH tối ưu 2.5-3. Phần lớn các loại nấm mốc Rhizopus formosensis, Mucor chienmalis, Mucor racemeus sinh tổng hợp protease có độ hoạt động ở pH=6. Như vậy tuỳ thuộc từng loại vi sinh vật sinh tổng hợp protease đông tụ sữa mà có pH tối thích khác nhau. Nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp cho vi sinh vật khác nhau tuỳ loại vi sinh vật. Nhiệt độ tối thích cho nuôi cấy nấm mốc giai đoạn đầu là 29-300C. Đối với vi khuẩn thì nhiệt độ tối thích là 37-380C, nhiệt độ này được giữ trong suốt quá trình nuôi cấy. Theo nghiên cứu của Dorokhov (1968) thì sự tổng hợp enzym protease đông tụ sữa ở nấm mốc xảy ra chủ yếu ở pha sinh trưởng, sau khi nuôi 24 giờ khoảng 70% tổng lượng protease đông tụ sữa đã được tạo thành. Còn theo nghiên cứu của Gracheva[4] thì protease đông tụ sữa của nấm mốc được tạo thành nhiều nhất trong giai đoạn tạo thành bào tử. Với đa số nấm mốc thì thời gian nuôi cấy từ 35-42 giờ khi nuôi bằng phương pháp bề mặt, khi nuôi bằng phương pháp bề sâu thời gian thường vào khoảng 40-48 giờ. Ngoài các yếu tố ảnh hưởng trên thì các yếu tố như độ oxy hoà tan, hàm lượng khí cacbonic cũng ảnh hưởng đến tính sinh tổng hợp protease. E. Villegas và cộng sự (1993) đã nghiên cứu với hàm lượng gồm CO2 4% và O2 21% thì lượng protease tạo ra nhiều nhất. Cấu tạo protease đông tụ sữa Khối lượng phân tử Các protease vi sinh vật thường có trọng lượng phân tử không lớn khoảng 20000-40000 Da, như protease-xerin có trong lượng phân tử 20000-27000 Da. Trọng lượng phân tử của các protease kim loại thường lớn hơn so với prtotease không phải là kim loại chúng vào khoảng 33800-48400 Da. protease –tiol cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000-40000 Da. Số axitamin, trình tự axitamin, trung tâm hoạt động. Đến nay người ta đã xác định được thành phần axit amin của hơn 30 protease ngoại bào của vi sinh vật. Số gốc axit amin trong phân tử của các protease –serin thường ít hơn 280 gốc. Các phân tử của protease axit có khoảng 290-300 gốc, protease kim loại khoảng 315-450 gốc axit amin[1,2]. Các nghiên cứu về trung tâm hoạt động của protease đã được công bố, Sanger (1963) đã xác định được trung tâm hoạt động của enzym protease-serin từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae là - Tre – Ser – Met -Ala -. Trung tâm hoạt động của protease-thiol của Streptococcus là -Gly – His – Cys – Val – Ala do Liu và các công sự (1965) xác định. Năm 1969 Mikes xác định được trung tâm hoạt động của Aspergillopeptidase F1 từ Aspergillus flavus là - Gly –Thr – Ser – Met – Ala – 1.3.3. Cấu tạo protease đông tụ sữa Protease đông tụ sữa của vi sinh vật có phân tử chứa khoảng 290-300 gốc axit amin và có trọng lượng phân tử không lớn khoảng 30000-40000 Da. Kết quả nghiên cứu cho thấy protease đông tụ sữa vi sinh vật có hằng số sa lắng, độ nhớt, thể tích riêng nhỏ chứng tỏ protease đông tụ sữa vi sinh vật có cấu trúc chặt chẽ, cân đối. Các đặc điểm về cấu tạo phân tử kể trên cũng như tính mềm dẻo của phân tử do không chứa hoặc chứa rất ít liên kết disunfua có thể liên quan đến khả năng vận chuyển dễ dàng của enzym qua màng tế bào[4]. Cấu trúc phân tử protease đông tụ sữa của A. saitoi cho thấy Aspergillopeptidaza A chỉ gồm một mạch polypeptit hoàn toàn cuộn khúc và gần như không có cấu trúc xoắn . Cấu trúc của protease đông tụ sữa từ vi sinh vật R. chinensis cũng có đặc điểm tương tự. Trung tâm hoạt động của protease đông tụ sữa vi sinh vật có thể có một hay nhiều nhóm –COOH tham gia. Ngoài ra còn có gốc triptophan cũng có vai trò quan trọng đối với Aspergillopeptiaza A nhưng chúng không tham gia vào quá trình xúc tác[4]. Trật tự axit amin của đoạn peptit ở vị trí hoạt động: theo Shin, Kenji (1977) trung tâm hoạt động của R. chinensis có hai đoạn peptit: đoạn 1: -Asp – Tre – Gly – Ser – Ser – Asp- đoạn 2: - Asp – Tre – Gly – Tre – Tyr – Leu- Tính chất protease Tính chất protease chung. Protease là các enzym xúc tác sự thuỷ phânliên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. H2-CH-CO-NH-CH-CO-…-NH-CH-COOH R1 R2 Rx H2O H2N-CH-COOH+H2N-CH-CO-…-NH-CH-COOH R1 R2 Rx Nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin Một trong những đặc tính của protease vi sinh vật là những enzyme ngoại bào có tính đặc hiệu rộng rãi. Hiện nay người ta đã biết có nhiều protease vi sinh vật có tính chất, tác dụng và cấu trúc trung tâm hoạt động tương tự với các protease động vật và thực vật quen biết. Dựa theo phân loại quốc tế các enzym thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm chủ yếu sau: Aminopeptidase: là enzym xúc tác thuỷ phân các liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit. Cacboxypeptidase: là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit ở đầu cacboxy của mạch polypeptit. Dipeptithydrolaza: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết dipeptit. Proteinaza: xúc tác thuỷ phân các liên kết nội mạch. Theo pH tối ưu thì có Protease axit Protease trung tính Protease kiềm tính Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa[4]. Theo nghiên cứu protease vi sinh vật tổng hợp được có dải hoạt động trong vùng pH từ 1.8-10.5 và lớn hơn. Protease của A. awamori có độ hoạt động lớn nhất ở pH 2.5 ở nhiệt độ 40-500C. Enzym bền trong pH 2.5-6. Người ta đã nghiên cứu đặc tính của phức hợp enzym của nấm mốc A. oryzae nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trên môi trường cám mì đã nhận thấy rằng pH tối ưu của protease là 2.7 đối với cơ chất là hemoglobin, còn với cazein, gelatin thì pH tối ưu là7.8-8. Theo Yoshda (1957) cho rằng các chủng nấm mốc mang sắc tố màu vàng xanh như A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. tericola, A. sojae sinh tổng hợp protease có tác dụng trong vùng pH từ 3.7-10, còn pH tối thích gần 6.5. Khi pH giảm xuống 3 thì độ hoạt động của enzym sẽ yếu đi[3]. Dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động người ta có thể chia ra. Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm OH Tripxin, Substilopeptdase.. Protease tiol: Trung tâm hoạt động có nhóm SH như papain, blomelin.. Protease aspactic: Trung tâm hoạt động có nhóm COOH như pepxin, renin. Protease kim loại: Trung tâm hoạt động có ion kim loại như cacboxylpeptidase A. Khác với thực vật và động vật, protease nấm mốc là những enzym ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi. Protease của A. awamori hoạt động trong vùng đệm pH 2.5 thuỷ phân cơ chất hemoglobin đến các peptit nhưng không thuỷ phân sâu sắc đến các axit amin. Protease của A. flavus được Turkova nghiên cứu thuỷ phân liên kết peptit mạch B insulin tạo thành các nhóm cacboxyl của phenylalanin, loxin, tirozin và axit aspactic. Protease của A. oryzae thuỷ phân gelatin, hemoglobin, fibrinogen và fibrin[1]. Prottese trung tính của B. subtilis thuỷ phân liên kết peptit vốn được tạo thành nhóm caboxyl của alanin, serin hay histidin và nhóm amin của valin, loxin hay phenylalanin. Tính đặc hiệu protease kiềm tính của B. subtilis thì lại khác, nó thuỷ phân hành loạt các protein thành peptit, mức độ thuỷ phân nhiều hơn so với protease trung tính. Hoạt tính của một số protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của một só ion kim loại và một số hợp chất khác. Một số các chất này có tác dụng hoạt hoá còn một số các chất khác lại có tác dụng kìm hãm. Protease của A. Awamori bị kìm hãm bởi các ion Co2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, Mg2+, Mn2+. Protease của A. oryzae không bị kìm hãm bởi các ion Ba2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng Co2+, Fe2+, Cu2+. Protease của B. subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp chất tạo phức và khi môi trường có nồng độ ure cao. Tính hoạt động của protease của Streptococus lactic bị kìm hãm bởi clorua thuỷ ngân, natribenzoat. Còn natrisunfit làm tăng sự hoạt động của nó. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ protease nhiều tác giả nhận thấy ion Na+ và K+ với nồng độ lớn sẽ là chất kìm hãm, còn ion Mg++ và Ca++ sẽ làm chất hoạt hoá. Tính chất protease đông tụ sữa Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy các protease đông tụ sữa vi sinh vật thường có pH tối thích là 3.0, nó có tính chất tương tự như protease axit. Protease đông tụ sữa của các chủng nấm mốc đen thường có pH tối thích thấp hơn 1.8-2.5 so với protease đông tụ sữa của các chủng nấm mốc vàng, xanh pH là 3-3.5. Protease đông tụ sữa thường hoạt động mạnh trong vùng nhiệt độ từ 40-450C, protease của các chủng nấm mốc đen có nhiệt độ hoạt động tối thích thấp hơn so với protease đông tụ sữa ở các chủng nấm mốc vàng và xanh. Theo nghiên cứu của Ghareib M và cộng sự năm 2001 thì cho thấy nhiệt độ tối ưu cho quá trình đông tụ của protease đông tụ sữa từ vi sinh vật thường là 55 0C. Protease đông tụ sữa vi sinh vật thường bền trong vùng pH axit từ 2-6. Tính bền axit của enzym có thể do sự hình thành các liên kết hidro giữa các nhóm cacboxyl không bị phân ly trong điều kiện axit thấp. Khi pH>6 enzym bị mất hoạt tính nhanh nguyên nhân là do sự biến tính protein enzym làm biến đổi cấu trúc phân tử của nó. Theo nghiên cứu của H. G. Osman (1969) thì protease đông tụ sữa từ Aspergillus niger 58 có nhiệt độ tới ưu là500C, pH tối ưu là 5,8 đây là pH thích hợp nhất cho quá trình đông tụ sữa. protease này bền ở pH 3-4. Tính bền nhiệt phụ thuộc vào pH. ở 450C, pH 3-4 thì hoạt tính còn nguyên sau 3 giờ ủ, cùng nhiệt độ đó pH 3-5 thì protease bị mất hoàn toàn hoạt tính sau 1 giờ [17]. Theo nghiên cứu của A. F. Abdel-Fattah (1972) thì protease đông tụ sữa của Penecillium citrinum có pH tối ưu là 6, nhiệt độ tối ưu là 600C nhưng protease bị phá huỷ khi ủ ở nhiệt độ là 550C và pH 3.42 trong 10 phút khi không có cơ chất. ở 400C thì protease đông tụ sữa ổn định nhất ở pH 5,3[7]. Về tính đặc hiệu, protease đông tụ sữa vi sinh vật có tính đặc hiệu với liên kết phe(105)-met(106) trong kapa-cazein tuy nhiên chúng cũng có khả năng thuỷ phân ở một số liên kết peptit khác và cũng có khả năng gây ra khả năng đông tụ sữa. ứng dụng protease Các chế phẩm protease có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các ngành khác nhau. ứng dụng protease chung 1.5.1.1. Trong công nghiệp thịt Trong công nghiệp thịt có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt. Protease có thể thuỷ phân một phần nào đó các protein tham gia vào thành phần của thịt. Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao, có thể chuyển từ thịt chất lượng thấp thành thịt loại có chất lượng cao hơn. Chế phẩm enzym để làm mềm thịt thường chứa papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật. Tùy theo tính chất của thịt mà sử dụng các chế phẩm một cách thích hợp. Kỹ thuật làm mềm thịt không phức tạp lắm. Có thể ngâm thịt trong dung dịch chứa phức hệ enzym cần thiết ở pH, nhiệt độ thích hợp hoặc rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột trong đó có chứa enzym và chất phụ gia. 1.5.1.2. Trong công nghiệp da Trong công nghiệp da protease của vi sinh vật có tầm quan trọng trên hai quá trình: làm mềm và tách lông. Chúng ta đã biết chất quan trọng nhất của da là colagen. Phân tử của nó gồm những axit amin kết lại với nhau thành mạch dài. Dưới tác dụng của protease chất nhờn bị tách ra và một số liên kết trong sợi colagen bị phá huỷ. Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da tính chất này lại được củng cố thêm. 1.5.1.3. Trong sản xuất tơ tằm Quá trình làm sạch các sợi tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Chúng ta đều biết tơ là sợi ngoại bào được nhả ra bởi cặp tuyến của con tằm. Sợi tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin. Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì phải nấu tơ trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1.5-2 giờ. Chỉ sau khi có sự gia công này, tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí trên lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó người ta dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt là từ vi khuẩn. 1.5.1.4. Trong hương và mỹ phẩm Các hương và mỹ phẩm có tác dụng phục hồi các da già và trong một chừng mực nhất định cũng có tác dụng sát trùng. Hiện nay ở một cố nước người ta đã sản xuất những loại kem có chứa enzym dùng để xoa mặt, xoa tay và cạo râu,… Dưới tác dụng của protease trong kem các kiểu bì của da chết sẽ được tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt. 1.5.1.5. Trong công nghiệp y học Trong công nghiệp y học, các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn như môi trường dinh dưỡng để nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh, chất kháng độc, v.v… ứng dụng protease đông tụ sũa trong sản xuất phomat. Việc sử dụng enzym làm đông tụ sữa trong công nghiệp sản xuất phomat và thực phẩm đã có từ lâu, có rất nhiều nguồn enzym khác nhau, bao gồm từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Renin là một loại enzym được chiết từ ngăn thứ tư dạ dày bê non, còn có tên khác như men đông tụ sữa. Từ xưa, người ta đã bbiết ứng dụng enzym này để làm động tụ sữa trong sản xuất phomat. Năm 1943 người ta thu được renin dưới dạng tinh thể. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzym là 400C, pH tối thích là 5.6, điểm đẳng điện pI là 4.6. Renin bền trong vùng pH5.3-6.3. Renin không thuỷ phân sâu sắc protein mà chỉ phân cắt thành các peptit. Nhờ đó mà tạo cho phomat không có vị đắng (do thuỷ phân sâu sắc tạo thành các axit amin), hương thơm đặc trưng, an toàn, không độc mà nhờ đó phomat làm từ enzym này có chất lượng cao. Ngoài renin ra, ở nguồn động vật có pepxin được chiết từ dạ dày bò hoặc lợn, enzym này đã được đề xuất là một enzym htay thế một phần renin, việc ứng dụng hoàn toàn pepxin trong sản xuất phomat làm cho phomat có vị đắng, gel tạo thành mềm gây mất nhiều chất béo dẫn đến làm giảm chất lượng phomat. Đã có nhiều những nghiên cứu để sử dụng protease đông tụ sữa từ thực vật bậc cao trong sản xuất phomat. Papain được tách từ nhựa đu đủ, khi mới tách nhựa này ra chúng không có khả năng hoạt động mà phải được hoạt hoá bởi Cystein, enzym này thuỷ phân protein mạnh. Ngoài ra còn có ficin nhựa của giống cây họ sung, và có khả năng đông tụ sữa. nói chung, nguồn enzym từ thực vật này khi sản xuất trong phomat làm sản phẩm có vị đắng, nhão, làm ảnh hưởng đến chất lượng phomat trong quá trình ngâm chín. Nhưng có một enzym thực vật có thể làm thay thế renin đó là bromelain có trong dứa, enzym này đã được sử dụng trong sản xuất phomat có chất lượng tương đối tốt. Nói chung do nguồn enzym đã nói ở trên đều khan hiếm, không thoả mãn về hiệu quả kinh tế, nhất là renin. Do vậy xu hướng trên thế giới hiện nay người ta tập trung nghiên cứu sản xuất enzym đông tụ sữa từ vi sinh vật như vi khuẩn và nấm mốc. Các enzym từ vi khuẩn Streptococus liquifaciens, Micrococus cascolyticus, Bacillus coagulans và Bacillus subtilis theo nghiên cứuvà dã được công nhận có khả năng sử dụng trong sản xuất phomat, đặc biệt là Bacillus subtilis. Protease trung tính của Bacillus subtilis có trong liposom cho vào sữa cừu đã được thanh trùng có tác dụng đối với phomat Machego, khi chín làm tăng hàm lượng protein, không gây vị đắng chất lượng cao hơn[22]. Channe Prakash S. và cộng sự (1998) đã cố định protease đông tụ sữa từ chủng Aspergillus niger MC4 lên glycidyl methacrylate-pentaerythritol triacrylate copolymer GP4 để thuỷ phân liên tục kappa-casein ứng dụng trong sản xuất phomat Người ta đã tách từ phomat Cheddar chất lượng tốt loại lactobaccillus các protease và nghiên cứu ảnh hưởng của các protease này tới vị phomat. Tất cả các vi sinh vật này có hoạt lực protease thấp không phụ thuộc vào nhiệt độ và pH trong quá trình sản xuất phomát này, không bị NaCl làm ảnh hưởng[12]. Protease từ nấm mốc đã được nghiên cứu rộng rãi, theo Sannabathi và Srinivasan [21] thì enzym protease của các giống A. nidulans, A. glaucus, Syncephalasrum raccemosum và Cladosporium herbarum có khả năng ._.