Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida, Streptococcus suis và Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh đường hô hấp ở lợn tại một số huyện ngoại thành Hà Nội và các tỉnh lân cận

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp hà nội ------------------ Nguyễn thị phương giang Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida, Streptococcus suis và Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh đường hô hấp ở lợn tại một số huyện ngoại thành Hà Nội và các tỉnh lân cận Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: thú y Mã số: 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: Pgs.TS. trương quang Hà Nội - 2008 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là côn

doc99 trang | Chia sẻ: huyen82 | Ngày: 09/12/2013 | Lượt xem: 1461 | Lượt tải: 7download
Tóm tắt tài liệu Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida, Streptococcus suis và Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh đường hô hấp ở lợn tại một số huyện ngoại thành Hà Nội và các tỉnh lân cận, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
g trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Phương Giang Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn: - PGS.TS. Trương Quang, người hướng dẫn khoa học trực tiếp đã giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. - Các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; khoa Sau đại học-Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. - Sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các đồng nghiệp đặc biệt là gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Hà Nội, Ngày tháng năm 2008 Tác giả Nguyễn Thị Phương Giang Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các biểu đồ vii danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu A. pleuropneumoniae: Actinobacillus pleuropneumoniae AGID: Agargel Immuno Diffuse AGPT: Agar Gel Precipitin Test B. bronchiseptica: Bordetella bronchiseptica BHI: Brain Heart Infusion CAMP: Christie – Atkinson – Munch – Peterson cs: cộng sự D.S.A: Dextrose Starch Agar DNA: Deoxyribo Nucleic Acid ELISA: Enzyme – Linked Immuno Sorbant Assay Fg : Greenish Fluorescent Fo: Orange Fluorescent H. parasuis: Haemophilus parasuis H. pleuropneumoniae: Haemophilus pleuropneumoniae M. hyopneumoniae: Mycoplasma hyopneumoniae MR: Methyl red NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide PBS: Phosphat buffer solution Nf: Not Fluorescent P. multocida: Pasteurella multocida PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TSA: Tryptic Soy Agar VP: Voges – Proskauer YPC Yaest extract pepton, L.cystine Danh mục bảng STT Tên bảng Trang 4.1. Kết quả xác định số loại khuẩn lạc từ các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn khỏe 53 4.2. Kết quả xác định số loại khuẩn lạc từ các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp 54 4.3. Kết quả giám định 3 loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae phân lập được từ đường hô hấp của lợn 56 4.4. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của 3 loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae vi khuẩn phân lập từ đường hô hấp của lợn 56 4.5. Kết quả phân lập được Streptococcus sp từ đường hô hấp của lợn 58 4.6. Kết quả phân lập Str. suis từ đường hô hấp của lợn 60 4.7. Kết quả phân lập vi khuẩn P. multocida từ đường hô hấp của lợn 62 4.8. Kết quả phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của lợn 64 4.9. Tỷ lệ phân lập 3 loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của nhóm lợn khỏe 66 4.10. Tỷ lệ phân lập 3 loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của nhóm lợn có triệu chứng bệnh 67 4.11. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng Str. suis phân lập được từ đường hô hấp ở lợn 69 4.12. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng P. multocida phân lập được từ đường hô hấp của lợn 71 4.13. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được từ đường hô hấp của lợn 73 4.14. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Str. suis phân lập được (n=7) 75 4.15. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được (n=9) 76 4.16. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được (n=8) 77 Danh mục biểu đồ STT Tên biểu đồ Trang 1. Số loại khuẩn lạc xác định từ các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn khỏe 53 2. Số loại khuẩn lạc xác định từ các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp 55 3. Kết quả phân lập Streptococcus sp từ đường hô hấp của lợn 58 4. Kết quả phân lập Str. suis từ đường hô hấp của lợn 60 5. Kết quả phân lập vi khuẩn P. multocida từ đường hô hấp của lợn 63 6. Kết quả phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của lợn 65 7. Tỷ lệ phân lập 3 loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của nhóm lợn khỏe 66 8. Tỷ lệ phân lập 3 loại vi khuẩn Str.suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae từ đường hô hấp của lợn có triệu chứng bệnh 68 1. Mở đầu 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Như chúng ta đã biết, trong đường hô hấp của bất kỳ động vật nào nói chung và loài lợn nói riêng luôn có một số lượng vi khuẩn nhất định. Bình thường, chúng tồn tại ở trạng thái cân bằng và không gây bệnh cho vật chủ, chỉ khi nào sức đề kháng của con vật bị giảm xuống chúng mới thừa cơ tăng cường về số lượng và độc lực để gây bệnh, làm cho bệnh trở nên trầm trọng hơn. Gần đây có một số dịch bệnh bùng phát liên quan đến những vi khuẩn sống trong đường hô hấp gây thiệt hại vô cùng to lớn về kinh tế, đặc biệt gây tử vong cho người chăn nuôi, người tiếp xúc với gia súc bệnh và sản phẩm tươi sống của gia súc bệnh… làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống xã hội của một bộ phận không nhỏ người dân nước ta trong thời gian qua. Trong khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 8 năm 2005, tại tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc, một đợt dịch bệnh lớn đã xẩy ra gây thiệt hại rất lớn về kinh tế. Nguy hiểm hơn là bệnh này còn lây sang người, làm 214 người bị nhiễm bệnh và 44 người tử vong. Nguyên nhân được xác định là do vi khuẩn Streptococcus suis - liên cầu khuẩn gây bệnh ở lợn gây ra. Tại Việt Nam, đầu năm 2007 dịch bệnh liên cầu khuẩn cũng xuất hiện với những hậu quả không kém. Theo thống kê của Cục Y tế dự phòng, trong 7 tháng đầu năm 2007 đã có 42 người nhiễm bệnh trong đó có 2 người đã tử vong, tỷ lệ tử vong là 7% [58]. Bên cạnh đó, tháng 3 năm 2007, hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome- PRRS) ở lợn bất ngờ bùng phát tại tỉnh Hải Dương. Từ đó đến nay, dịch bệnh đã lan ra khắp ba miền Bắc, Trung, Nam và chưa có dấu hiệu dừng lại. Trước tình hình trên, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu PRRS về hình thái, tính chất của vi rút gây bệnh, biểu hiện lâm sàng, đặc điểm bệnh tích nhằm đưa ra những giải pháp tốt nhất để ngăn chặn dịch bệnh. Trong quá trình nghiên cứu về bệnh, nhiều tác giả nhận thấy vai trò kế phát của các vi khuẩn ký sinh đường hô hấp của lợn trỗi dậy, góp phần cùng PRRS thể hiện căn bệnh với triệu chứng là “viêm phổi dính sườn”. Theo Đào Trọng Đạt, 2008 [1] vi rút gây PRRS có tính hướng đại thực bào. Chúng xâm nhiễm vào cơ thể động vật, đi vào các đại thực bào, độc chiếm chúng và nhân lên trong đó, giết chết các loại đại thực bào, mở đường cho vi khuẩn, vi rút xâm nhập vào phổi, gây tổn thương ở phổi. Do đó lợn sẽ bị bội nhiễm các vi khuẩn thứ phát như Streptococcus suis (Str. suis), Pasteurella multocida (P. multocida) và Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae)…và bệnh do vi rút gây PRRS càng trở nên trầm trọng. Vấn đề đặt ra ở đây là liệu những vi khuẩn khu trú thường xuyên trong đường hô hấp có phải là nguồn nguy cơ gây bệnh ở đường hô hấp đối với lợn hay không? nếu như có, giống như đại dịch cúm gia cầm, thì nguy cơ đó có là nguy cơ chung của cả loài lợn và loài người không? hậu quả sẽ ra sao nếu nguy cơ đó xảy ra? Trên thực tế từ trước đến nay đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về các vi khuẩn đường hô hấp ở lợn, nhưng qua kiểm tra chẩn đoán vi khuẩn học vi khuẩn gây bệnh ở hai đợt dịch trên, ngoài các vi khuẩn chính gây bệnh nhận thấy sự xuất hiện tỷ lệ khá cao với vai trò quan trọng của 3 vi khuẩn Str.suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae đối với lợn bệnh. Từ vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida, Streptococcus suis và Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh đường hô hấp ở lợn tại một số huyện ngoại thành Hà Nội và các tỉnh lân cận”. 1.2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập và xác định tỷ lệ mang vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae ở lợn khỏe mạnh và lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp. - Xác định độc lực của các vi khuẩn phân lập được đối với chuột bạch. - Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của Str.suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae. 1.3. Phạm vi nghiên cứu Lợn trưởng thành khỏe mạnh và lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp được lấy từ các lò mổ Tam Trinh, Thịnh Liệt, Khương Đình, một số điểm giết mổ ở Gia Lâm - Hà Nội và lợn bệnh được người dân mang về Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 1.4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Dựa trên kết quả phân lập và xác định độc lực của Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae đưa ra những hiểu biết mới về vai trò gây bệnh đường hô hấp của lợn đồng thời kết hợp với việc kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh, từ đó giúp cho việc điều trị và phòng bệnh đường hô hấp của lợn có hiệu quả. 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Những hiểu biết về bộ máy hô hấp Đối với nhiều loài động vật và con người, nhịp thở được coi là dấu hiệu nhận biết sự sống. Sự thở chớnh là biểu hiện bờn ngoài của quỏ trỡnh hụ hấp. Con người cú thể nhịn ăn từ 20-30 ngày, nhịn uống được khoảng 3 ngày, nhưng khụng nhịn thở được quỏ 3 phỳt. Muốn duy trì được sự sống, tế bào cần oxy để biến năng lượng hoá học của thức ăn thành các dạng năng lượng khác: cơ năng, nhiệt năng...để dùng vào mọi hoạt động sống. Đồng thời khí cacbonic sinh ra trong quá trình sống cùng cần thải ra ngoài. Vì vậy cung cấp oxy và thải khí cacbonic là chức năng chính của hệ hô hấp. Đối với động vật đa bào do cường độ trao đổi chất cao, mặt khác các tế bào nằm sâu trong cơ thể nên đã hình thành cơ quan hô hấp là phổi để đảm bảo chức năng trao đổi khí. Hô hấp là quá trình trao đổi khí giữa: môi trường bên ngoài với phổi; mạch quản với phổi; mạch quản với tổ chức và sự vận chuyển chất khí. Bốn quá trình này được hoàn thành bởi cơ quan hô hấp, bao gồm: mũi, hầu, khí quản, nhánh phế quản lớn, nhánh phế quản nhỏ và phế bào. * Cơ quan hô hấp bên ngoài: gồm mũi, hầu, khí quản, nhánh khí quản lớn, nhánh khí quản nhỏ. Cơ quan hô hấp bên ngoài được coi là vùng vô hiệu vì chưa có quá trình trao đổi khí, nhưng nó rất cần thiết cho quá trình hô hấp, vì: + Nó có tác dụng sưởi ấm không khí trước khi vào phổi, tiếp xúc với lớp biểu mô có mao mạch phân bố dày, có nhiệt độ xấp xỉ 37oC và bão hoà hơi nước trước khi không khí vào phổi. + Trong khí quản và xoang mũi có màng nhày tiết ra dịch nhày có tác dụng ngăn chặn bụi bẩn vào phổi. Các chất bẩn được thải ra ngoài thông qua phản xạ hắt hơi. + Nhánh khí quản có rất nhiều tế bào biểu mô tiêm mao, hướng vận động từ trong ra ngoài có tác dụng cản bụi. * Cơ quan hô hấp bên trong (phổi) ở đây diễn ra quá trình trao đổi khí giữa mạch quản và môi trường. Phổi bao gồm phế quản và các túi phế bào. Thành phế bào mỏng chỉ gồm một lớp tế bào (0,5m). Xung quanh phế quản và các phế bào có một hệ thống mao quản dày đặc bao phủ, làm cho diện tích phổi tăng lên nhiều lần. ở trạng thái sinh lý bình thường mỗi loài động vật sẽ có tần số hô hấp ổn định và khác nhau. Tần số hô hấp phụ thuộc vào cường độ trao đổi chất, tuổi, tầm vóc, trạng thái sinh lý, vận động, nhiệt độ môi trường.... Gia súc non có cường độ trao đổi chất mạnh nên tần số hô hấp cao. Động vật nhỏ so với động vật lớn cũng có tần số hô hấp cao hơn. Đặc biệt khi gia súc bị mắc các bệnh đường hô hấp, tần số hô hấp sẽ thay đổi rõ rệt. Tần số hô hấp bình thường của một số loài động vật (lần/phút): Ngựa: 8-16 Bò: 10-30 Lợn: 20-30 Trâu: 18-21 Nghé: 30-40 Dê: 10-18 Gà: 22-25 Chuột bạch: 100-200 Dọc đường hô hấp có hệ thống mạch quản dày đặc nên nhiệt độ luôn ấm và các tuyến nhờn giữ cho không khí luôn ẩm ướt, đây chính là điều kiện khá thuận lợi cho các vi khuẩn hiếu khí phát triển. Trong số này có những vi khuẩn vô hại nhưng cũng có những vi khuẩn ở điều kiện thuận lợi khác nhau sẽ có vai trò gây bệnh khác nhau ở đường hô hấp. Khi sức đề kháng của cơ thể giảm sút, có thể do điều kiện và chế độ nuôi dưỡng như nhiệt độ và độ ẩm chuồng nuôi tăng cao đột ngột, thức ăn bị ôi mốc, khẩu phần ăn không đủ dinh dưỡng hoặc bị các tác nhân gây bệnh khác như phó thương hàn, xuyễn lợn…lúc đó các vi khuẩn đang sống cộng sinh trong cơ thể thừa cơ nhân lên về số lượng, tăng cường về độc lực và gây bệnh đặc trưng cho vi khuẩn đó (Gupta, 1971 [71]; Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 [15]). 2.2. Vi khuẩn Str. suis và bệnh do vi khuẩn Str. suis gây ra ở lợn 2.2.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus ở trong và ngoài nước Rosenbach và cs, 1984 [51] lần đầu tiên đã mô tả vi khuẩn Streptococcus khi ông phân lập được vi khuẩn từ vết thương có mủ của một người nông dân. Theo Clifton- Hadley và cs, 1986 [33] vi khuẩn Streptococcus thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, Str. suis có thể tồn tại ở họng, xoang mũi. Những lợn khỏe mang trùng này nhốt chung với đàn lợn mới chưa bị bệnh có thể sẽ phát ra bệnh. Lợn mẹ truyền căn bệnh cho lợn con qua đường hô hấp từ đó truyền cho nhiều con khác lúc nhập đàn hay sau khi cai sữa. Sanford và Tilker, 1984 [52]; Erickerson và cs, 1984 [36] đều cùng cho rằng Str. suis gây dung huyết kiểu b thường xuyên phân lập được từ phổi bị viêm của lợn lớn, lợn cai sữa và lợn con đang bú, từ lợn bị viêm phế quản phổi, viêm màng não có triệu chứng thần kinh. Vecht và cs, 1989 [55] đã phân lập được Str. suis ở phổi viêm của lợn và gây được bệnh thực nghiệm cho lợn. Lợn sau khi bị nhiễm bệnh có đầy đủ triệu chứng, bệnh tích của bệnh viêm phổi tự nhiên. Gần đây nhất là ở Tứ Xuyên, Trung Quốc ổ dịch liên cầu khuẩn bắt đầu xuất hiện từ cuối tháng 6 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. Theo thống kê có 6736 lợn bị mắc bệnh với 641 ổ dịch, số lợn chết là 319 con. Quan trọng hơn vi khuẩn liên cầu thuộc serotype 2 đã làm cho 214 người bị nhiễm bệnh và 44 người tử vong (Đăng Văn Kỳ, 2007 [4]) ở Việt Nam, Hoàng Tuấn Lộc và Lê Văn Phan (1961-1962) đã phát hiện bệnh liên cầu khuẩn kết hợp với bệnh tụ huyết trùng đã gây hội chứng viêm phổi, thối loét da thịt làm chết và phải hủy bỏ hơn 2000 lợn tại trại lợn Cầu Thị - Hà Nội (Phạm Sỹ Lăng, 2007 [6]. Cũng theo Phạm Sỹ Lăng, 2007 [6] Võ Tiến Thoại, Khương Bích Ngọc (1981-1983) đã nghiên cứu các ổ dịch viêm đường hô hấp cấp, nhiễm trùng huyết ở lợn do liên cầu khuẩn ở Hà Nội và Hà Nam. Năm 1979, Nguyễn Danh Ngô, Phạm Sỹ Lăng, Lê Hồng Căn đã xác định được ổ dịch lợn viêm phổi, viêm phúc mạc có mủ là do liên cầu khuẩn và tụ cầu vàng ở trại lợn giống Cầu Diễn và trại chăn nuôi Mễ Hạ. Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên, 1993 [9] đã điều tra hệ vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm thấy rằng tỷ lệ phân lập được Str. suis 74%. Thời gian gần đây, theo nghiên cứu của Viện thú y Quốc gia đã phân lập được 35 serotype, trong đó serotype 2 có 8 chủng. Tuy nhiên đầu năm 2007 đến nay không phát hiện được ổ dịch do vi khuẩn liên cầu hoặc các bệnh trên lợn ở Việt Nam. Các trường hợp bị bệnh đơn lẻ, các thể chưa được xác định (Đăng Văn Kỳ, 2007 [4]). 2.2.2. Hình thái và đặc tính nuôi cấy ở các môi trường Streptococcus là loại vi khuẩn hình cầu hoặc bầu dục, đường kính có khi đến 1m. Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không di động, thường xếp thành chuỗi từ hai vi khuẩn trở lên, độ dài của chuỗi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy: - Trong bệnh phẩm, vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn, thường có từ 2-8 đơn vị. - Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng, vi khuẩn hình thành chuỗi dài. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae và Streptococcus equi có chuỗi từ 10-100 đơn vị. - ở môi trường đặc, liên cầu hình thành chuỗi ngắn. Các vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là dạng hình cầu. Trong canh trùng già, sau 30 – 48 giờ nuôi cấy có thể thấy thay đổi tính chất bắt màu và chuỗi cũng dài hơn lên. Đặc biệt ở môi trường nuôi cấy có 5% huyết thanh thì hình thái chuỗi vi khuẩn được nhìn thấy rõ nhất. Hầu hết Streptococcus phát triển trong các môi trường hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, mọc tốt ở các loại môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ là 37oC. Đôi khi có một số chủng vi khuẩn đòi hỏi hiếu khí nghiêm ngặt. Trong môi trường nước thịt, vi khuẩn mọc tốt, lúc đầu môi trường đục đều. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành những hạt hoặc những cụm bông lắng xuống đáy ống nghiệm, lớp nước trong bên trên và dưới đáy ống có cặn. Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S, màu hơi xám. Trên môi trường thạch máu, Streptococcus mọc tốt, đa số vi khuẩn gây dung huyết và một số không gây dung huyết. Dựa vào mức độ dung huyết người ta phân ra làm 3 loại (Taylor và cs, 1990 [54]): - Dạng a: Vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường màu xanh lơ do tác động của Streptococcus làm cho Hemoglobin biến thành Met-hemoglobin, xung quanh khuẩn lạc là vùng tan máu. Đây là hiện tượng dung huyết từng phần hoặc không hoàn toàn. Liên cầu khuẩn thuộc loại này gọi là liên cầu dung huyết nhóm a, độc lực của nhóm này không cao. - Dạng b: Vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc rõ và trong suốt do Hemoglobin được phủ hoàn toàn. Đây thường là nhóm phụ Streptococcus gây bệnh cho người. Liên cầu thuộc dạng này gọi là liên cầu dung huyết nhóm b, nhóm vi khuẩn có độc lực cao. - Dạng g: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu, hồng cầu vẫn giữ nguyên màu hồng. Liên cầu khuẩn thuộc dạng này không có khả năng làm dung huyết thạch máu, thường là vi khuẩn không gây bệnh. Khương Bích Ngọc, 1996 [10] trong quá trình nghiên cứu đã có nhận xét: khả năng gây bệnh của vi khuẩn thuộc nhóm cầu khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố gây dung huyết của mầm bệnh. Các yếu tố dung huyết lại phụ thuộc vào mầm bệnh phân lập được ở giai đoạn đầu, giai đoạn giữa hay giai đoạn cuối của quá trình sinh bệnh. ở giai đoạn đầu của bệnh hoặc các ổ dịch mới phát hiện lần đầu và có tính chất ồ ạt thì tỷ lệ vi khuẩn Streptococcus thường gây dung huyết dạng b là 48,33% và dạng a là 35,00%. 2.2.3. Đặc tính sinh hóa - Vi khuẩn Streptococcus gây bệnh ở lợn có khả năng lên men một số đường: Glucose, Lactose, Saccarose, Trehalose, Maltose, Fructose…, không có khả năng lên men một số đường như: Dulciton, Mannit, Innulin… Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 [15] tính chất không lên men đường Innulin là đặc tính quan trọng vì nhờ nó chúng ta phân biệt được các chủng gây bệnh. Vi khuẩn không có men Oxydase và men Catalase nên phản ứng Oxydase, Catalase âm tính. - Phản ứng sinh Indol âm tính. - Phản ứng sinh H2S âm tính. Theo Nguyễn Như Thanh, 2001 [22], Streptococcus có khả năng sinh các loại men: - Streptokinase: Có tác dụng làm tan tơ huyết, men này có tính kháng nguyên cao, kích thích cơ thể hình thành kháng thể. - Streptodonase: Có tác dụng làm lỏng mủ đặc, hoạt động của chúng chỉ có tác dụng khi có mặt ion Mg++. - Hyaluronidase: Men này có tác dụng phân hủy axit Hyaluronic gây nhão mô, giúp vi khuẩn tăng khả năng lan tràn. Ngoài ra Streptococcus còn có khả năng sinh men Diphotpho- Pyridin- Nucleotidase (làm chết bạch cầu), Proteinase (có tác dụng phân hủy Protein, nếu tiêm liều cao cho động vật sẽ gây nên các tổn thương ở tim). 2.2.4. Giáp mô và các yếu tố độc lực Những nghiên cứu của nhiều tác giả đều khẳng định rằng nhóm vi khuẩn Streptococcus không hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh. Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1987 [15], trong phòng thí nghiệm, bằng phương pháp tiêm canh khuẩn vào tĩnh mạch hay xoang phúc mạc, nếu vi khuẩn có độc lực sẽ gây chết chuột bạch và thỏ do bại huyết. Anon, 1960 [25] lại phân lập được những type đặc biệt của vi khuẩn có độc lực trên cơ thể động vât bình thường mà động vật đó không có biểu hiện gì rõ ràng về bệnh. Chỉ khi có ảnh hưởng của một vài điều kiện nào đó như sức đề kháng của vật chủ suy giảm, vệ sinh kém, thời tiết khí hậu bất lợi thì những chủng độc lực này mới gây bệnh cho vật chủ. Roger, 1991 [50] thấy rằng các xoang của cơ thể vật chủ khỏe mạnh là nơi cư trú mầm bệnh Streptococcus độc hay không độc và rất dễ bài xuất mầm bệnh ra ngoài. Bởi vậy, vật khỏe mạnh mang trùng là rất đáng quan tâm, điều này phù hợp với kết luận của Burrow và Moulder, 1968 [29]. ông cho rằng, viêm phổi viêm màng não do vi khuẩn Streptococcus ít khi các tác nhân gây bệnh được truyền từ vật mắc bệnh, từ con ốm, đa số được truyền từ con vật lành mang vi khuẩn. 2.2.5. Bệnh do vi khuẩn Str. suis gây ra ở lợn Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn do vi khuẩn có tên khoa học là Str. suis gây nên, hiện có 20 nhóm huyết thanh và 25 type khác nhau. Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh ở lợn đều thuộc type 1 và type 2. Đặc trưng lâm sàng của bệnh là gây viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, bại huyết, bệnh đường tiêu hóa, viêm khớp, xuất huyết ở da, gây sẩy thai và đột tử ở lợn. Str. suis thường thấy ở vùng mũi họng của lợn nhà mà không gây bệnh. Tuy nhiên, khi gặp một số điều kiện thuận lợi chúng có thể gây bệnh cho đàn lợn. Str. suis nhiễm phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi đến sau cai sữa vài tuần, đặc biệt Str. suis type 2 có thể gây bệnh cho người . Dịch tễ học Bệnh gây ra do Str. suis xảy ra ở những địa phương nuôi lợn trên khắp thế giới. Lợn con sơ sinh đến 22 tuần tuổi dễ bị mắc, đối với lợn sau cai sữa nếu bị stress bởi các vấn đề như vận chuyển, xáo trộn đàn, mật độ nuôi cao, không đủ thông gió… Str. suis type 2 gây ra nhiều ổ dịch viêm màng não ở lợn 10-14 ngày sau cai sữa. Gần đây, bệnh hay xảy ra ở lợn sau cai sữa chăn nuôi tập trung với mật độ cao. Vi khuẩn cũng được tìm thấy ở heo rừng, ngựa, dê, trâu, bò, chó, mèo và cả ở các loài chim. Theo Clifton – Hadley, 1986 [30], sự tiếp xúc giữa lợn cai sữa, lợn cái sinh sản, lợn đực khỏe mang trùng với đàn không bị nhiễm thường phát sinh bệnh ở những lợn cai sữa, lợn lớn. Lợn con có thể nhiễm chính từ lợn mẹ qua đường hô hấp, từ đây lại gây nhiễm cho những con khác khi chúng nuôi chúng với nhau sau khi cai sữa. Vì vậy, các bệnh gây ra do Str. suis là phổ biến ở những trại chăn nuôi tập trung, mật độ cao. Theo Hofman và Henderson, 1985 [39], Str. suis có thể gây bệnh quanh năm nhưng sự phát dịch có thể xảy ra dễ dàng vào giai đoạn đầu xuân hoặc sau những thay đổi thời tiết đột ngột. Bằng nhiều phương pháp khác nhau người ta đã xác định được sự lưu hành của vi khuẩn, như nuôi cấy phát hiện vi khuẩn từ các mô của lợn lấy từ lò giết mổ, từ lợn con theo mẹ các lứa tuổi và phản ứng huyết thanh học đối với lợn lớn. ở Canada, người ta đã phân lập được tất cả 23 type, trong đó type 2 chiếm tỷ lệ cao nhất (32%). Trong một nghiên cứu điều tra ở Quebec, đối với lợn con 4- 8 tuần tuổi, khoẻ mạnh về lâm sàng kết quả 94% số lợn và 98% số trại bị nhiễm vi khuẩn. Những serotype thường thấy theo thứ tự giảm dần là các serotype 3, 4, 8 và 2; có 32% số lợn con phát hiện nhiễm 2 serotype phân biệt, nhiễm 3 serotype là 1%. Serotype 1 và 2 phân lập từ lợn con viêm màng não và viêm phổi hoá mủ. ở Đan Mạch serotype 7 phát hiện nhiều hơn các serotype khác, chiếm 75%. ở phần Lan, phân lập từ lợn chết thấy nhiều nhất là serotype 7, sau đó là serotype 3 và 2, thường phân lập từ lợn viêm phổi. ở hà Lan, Str. suis type 2 phân lập phổ biến nhất ở lợn viêm màng não. Xét nghiệm từ hạch amidan của lợn lấy ở lò mổ (lợn khoẻ mạnh) ở vùng trước đó có nhiễm liên cầu type 2 thấy 45% số mẫu dương tính, ở vùng không có bệnh là 38%. ở úc, liên cầu type 9 và type 2 được cho là nguyên nhân gây ra nhiễm trùng huyết và viêm màng não ở lợn cai sữa. ở canada trong số lợn bệnh phát hiện thấy nhiều nhất là Str. suis type 2, sau đó là type 3, 5 và 7. Str. suis type 2 được phát hiện ở hầu hết các nước có chăn nuôi lợn. Một nghiên cứu về Streptococcus ở lò mổ lợn của úc và Niu-di-lan cho thấy ở hạch amidan đã phát hiện thấy 54% số mẫu nhiễm Str. suis type 1 và 73% nhiễm Str. suis type 2; 3% phát hiện thấy vi khuẩn này trong máu lợn khi giết mổ. Có thể phân lập được vi khuẩn này ở nhiều mô khác nhau, trong đó có cả ở đường sinh dục con cái, nhưng không thấy ở con đực. Vi khuẩn có thể phân lập từ âm đạo con cái, điều này làm cho con non bị nhiễm trong khi sinh. Tỷ lệ lợn mắc bệnh có biểu hiện lâm sàng từ 0-15%, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn serotype 2 là 3,8% và tỷ lệ chết là 9,1%. Cách truyền lây Những mầm bệnh khác nhau sẽ có những đường xâm nhập khác nhau. Một loại mầm bệnh có thể có một hoặc nhiều đường xâm nhập, trong đó có đường xâm nhập chính. Theo Willams D.M và cs, 1973 [57], vi khuẩn Str. suis truyền theo đường hô hấp, xâm nhập vào amindan, vòm họng. Từ vị trí đó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, ở đây chúng có thể cư trú ở các mô, cơ thể không có dấu hiệu gì về triệu chứng lâm sàng của bệnh. Vi khuẩn có thể tồn tại trong phân, bụi bẩn, xác lợn và ở cả ruồi, nhặng trong một thời gian dài. Bệnh có thể lây truyền qua đường hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm trùng. Lợn con có thể bị lây nhiễm từ lợn mẹ qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, đường máu. Vi khuẩn có thể truyền trực tiếp từ lợn mang trùng hoặc lợn bệnh sang lợn khỏe. Bình thường vi khuẩn khu trú ở hạch amidan và niêm mạc mũi của lợn khoẻ, vi khuẩn từ con khoẻ này truyền cho lợn không bị nhiễm có thể xảy ra trong vòng 5 ngày sau khi nhốt chung. Việc đưa những con nái hậu bị từ đàn nhiễm bệnh có thể gây bệnh cho lợn con theo mẹ và lợn choai ở đàn tiếp nhận. Tỷ lệ mang trùng ở lợn các lứa tuổi khác nhau từ 0 đến 80% và cao nhất ở nhóm tuổi sau cai sữa (từ 4 đến 10 tuần tuổi). Trong một đàn có thể có tới 80% số lợn cái là con mang trùng không thể hiện triệu chứng bệnh. Những con mang trùng đã cai sữa sẽ truyền vi khuẩn cho những con không bị nhiễm khác khi nhập đàn. Vi khuẩn tồn tại ở hạch amidan của lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay cả khi có các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn. Điều này cho thấy vi khuẩn mang tính địa phương ở một số đàn nhưng không thể hiện bệnh lâm sàng. Ruồi nhà có thể mang vi khuẩn ít nhất 5 ngày và lây nhiễm vào thức ăn ít nhất 4 ngày. Austrilan, 1976 [27] nhận thấy rằng 30%-70% số vi khuẩn cư trú ở đường hô hấp trên của con vật khỏe mạnh nhưng lại gây bệnh đường hô hấp dưới và ở phổi. Khi hệ thống hàng rào của cơ thể bị suy giảm thì vi khuẩn sẽ xâm nhập vào đường hô hấp dưới gây viêm phổi, sau đó vào hệ thống tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết rồi tràn vào nội, ngoại tâm mạc, màng não, xoang khớp để gây bệnh. Triệu chứng Theo Hoàng Văn Năm, 2007 [7], triệu chứng của các thể bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra rất phức tạp, khó nhận biết và khó phân biệt khi mà bệnh có hiện tượng bội nhiễm, kế phát bởi một số vi khuẩn khác. Viêm màng não và viêm khớp có thể xảy ra riêng rẽ hoặc kết hợp phổ biến ở lợn 2 - 6 tuần tuổi, lợn con bị nhiễm trong cùng một ổ mắc nặng hơn. Biểu hiện của thể viêm màng não là phản ứng toàn thân như sốt, biếng ăn và cơ thể suy sụp. Lợn con đứng trên đầu ngón chân, bước đi cứng nhắc, phần sau thân đu đưa, tai xuôi ép về phía thân. Lợn có thể bị mù, co giật cơ, mất cân bằng, nằm nghiêng một bên, chân đạp bơi chèo rồi chết. Một số trường hợp viêm rốn, viêm nội tâm mạc ở lợn thường thấy khi hôn mê hoặc chết không có biểu hiện triệu chứng trước đó. Trong các đợt dịch viêm màng não do Str. suis type 2, biểu hiện chết đột ngột một hoặc nhiều con có thể là dấu hiệu đầu tiên, những con còn sống mất phối hợp, sau đó nhanh chóng chuyển sang nằm phủ phục. Có hiện tượng co giật nhãn cầu, đạp bơi chèo, rối loạn vận động và chết. Thường sốt tới 41oC. ở Anh quốc viêm màng não hay gặp nhất ở lợn mới cai sữa, viêm khớp hay gặp ở lợn non hơn. Ngoài ra còn thấy viêm van tim ở lợn 13 tuần tuổi nuôi vỗ béo ở trại lợn có tiền sử mắc viêm màng não do Streptococcus. Vi khuẩn có thể phân lập từ dịch khớp, dịch não tuỷ, máu, mô não, phổi, mẫu swab, từ hạch amidan của lợn khoẻ. Liên cầu khuẩn (Streptococcus sp) gây ra nhiều bệnh khác nhau ở các loài vật tuỳ theo chủng gây bệnh. Một số thể bệnh thường gặp như sau: - Thể nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng huyết cấp tính do liên cầu xảy ra rải rác ở lợn nái và lợn con theo mẹ. Bệnh xảy ra làm chết lợn đột ngột trong vòng 12 đến 48 giờ. Triệu chứng gồm: cơ thể suy yếu, nằm phủ phục, sốt, thở khó, đi kiết, huyết niệu. Mổ khám thấy xuất huyết điểm hoặc tràn lan ở hầu hết nội tạng. Những con sống sót sau vài ngày mắc bệnh: phổi bị phù và chắc đặc. Bệnh lây khá nhanh và tỷ lệ chết cao nếu như không dùng kháng sinh tác dụng tốt với vi khuẩn để điều trị dự phòng. Str. suis gặp ở loài nhai lại mọi lứa tuổi nhưng thường gây bệnh cho lợn nhiều hơn, vi khuẩn theo đường máu khu trú ở nhiều cơ quan bao gồm phổi, khớp, xương, màng não. - Thể viêm não và màng não Viêm não và màng não khá phổ biến do nhiễm trùng huyết của Streptoccocus ở con vật sơ sinh, nhưng cũng gặp ở lợn sau cai sữa 10 đến 14 tuần tuổi và lợn lớn hơn đến 6 tháng tuổi. Thể bệnh này ở lợn thường do Str. suis type 2 gây ra. Con vật biểu hiện chậm chạp, mất phối hợp, co giật từng cơn, giật nhãn cầu. Bệnh tiến triển nhanh trong vòng 4 giờ và thường không biểu hiện ốm trước khi chết. - Thể viêm da Viêm da truyền nhiễm ở lợn đặc trưng bởi mụn mủ ở mặt, cổ, gặp ít hơn ở thân. Trong ổ mủ phát hiện cả liên cầu và tụ cầu. Bệnh lây lan qua vết trầy xước ngoài da, đặc biệt ở lợn con khi cắn nhau, những lợn con này không được cắt răng nanh. Bệnh có thể nhầm lẫn với viêm da do thẩm xuất. Bệnh tích Lợn chết do Str. suis type 2, bệnh tích đại thể, vi thể bao gồm một hoặc nhiều ổ viêm tương mạc hoá mủ, viêm phổi và màng phổi xuất huyết hoặc viêm tơ huyết, viêm màng não mủ, viêm cơ tim, thoái hoá xuất huyết, viêm van tim hai lá. Trong trường hợp viêm màng não, dịch não tuỷ bị đục, xung huyết và viêm màng não tích tụ thể trắng, ổ mủ ở vùng dưới nhện. Hầu hết các trường hợp hệ thống mạng lưới võng mạc nội mô bị ảnh hưởng nặng, các mạch máu ở tâm thất, não và tuỷ sống bị tắc nghẽn do dịch thẩm._. xuất, nhiều khi gây ra phù não. Mô thần kinh của tuỷ sống, tiểu não và cuống não có thể biểu hiện thoái hoá dạng lỏng. Chẩn đoán Có thể thấy viêm khớp rải rác ở lợn do tụ cầu trùng nhưng phổ biến hơn vẫn là do liên cầu trùng. Viêm khớp do Mycoplasma hyorhinis sinh mủ ít hơn, do đó cần phải nuôi cấy xác định. Bệnh glasser (bệnh gây ra bởi Haemophilus spp biểu hiện viêm đa khớp cấp tính, viêm màng phổi, viêm bao tim và viêm phúc mạc) thường xảy ra ở lợn lớn hơn và kèm theo viêm màng phổi và phúc mạc. Bệnh đóng dấu lợn ở lợn con thường biểu hiện nhiễm trùng huyết. Tuy nhiên, thể viêm màng não do nhiễm Streptococcus có thể dễ nhầm lẫn với viêm não do vi rút. Str. suis type 2 cũng có thể gây viêm màng não ở lợn lớn từ 10-14 tuần tuổi. Phòng và trị bệnh - Phòng bệnh Str. suis là vi sinh vật thường xuyên cư trú ở niêm mạc và các hốc tự nhiên trong cơ thể lợn, đồng thời nó cũng được phân bố rộng rãi trong môi trường thiên nhiên, giữa vi khuẩn và động vật ở trạng thái cân bằng . Khi trạng thái cân bằng bị phá vỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tăng cường độc lực và trở thành tác nhân gây bệnh. Vì vậy Clifton-Hadley và cs, 1986 [33] cho rằng để phòng bệnh, biện pháp vệ sinh chuồng trại, chăm sóc nuôi dưỡng, quản lý và phân đàn, chia ô là yếu tố vô cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn. Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh bằng cách giảm mật độ và nuôi trong các ô chuồng sạch sẽ là điều kiện cần thiết và có hiệu quả. - Trị bệnh Trong một vài thử nghiệm tính mẫn cảm kháng sinh cho thấy vi khuẩn mẫn cảm với Ampicillin, Penicillin, Trimethoprim-sulfamethoxazole, kháng với Lincomycin, Erythromycin, Neomycin, Streptomycin và Tetracyclin. Trong thí nghiệm khác lại cho thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập được mẫn cảm với Penicillin và Ampicillin, 1/3 kháng với Trimethoprim-sulfamethoxazole, kháng rất mạnh với Nitrofuran và Tetracyclin. Tính mẫn cảm với Penicillin có thể không lâu dài với tất cả các chủng Str. suis vì vậy nếu dùng lâu phải đánh giá lại tính mẫn cảm. Hofman và Henderson, 1985 [39], Sanford và Tilker, 1992 [52] cho rằng với bệnh do vi khuẩn Str. suis gây ra thì phương pháp điều trị từng cá thể sớm bằng Penicillin và chăm sóc, nuôi dưỡng tốt có thể khỏi bệnh hoàn toàn và tránh được tử vong. Collier (1956) cho rằng thuốc kháng sinh không có tác dụng khi bệnh đã hình thành các ổ apxe hoặc con vật đã có biểu hiện sốt, ho, khó thở, ủ rũ. Nguyễn Ngọc Nhiên và cs, 1996 [12] khi điều trị bệnh đường hô hấp của lợn trong chăn nuôi tập trung đã dùng Tylosin để diệt Mycoplasma, dùng kháng sinh tiêm kết hợp với vacxin được chế từ chủng gây bệnh để tiêu diệt vi khuẩn kế phát trong đó có vi khuẩn Streptococcus đã thu được kết quả tốt. Vì vậy, việc dùng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra là rất cần thiết. Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại hiệu quả tốt. Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm và chỉ có hiệu quả khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng. Nếu điều trị muộn thì hiệu quả sẽ kém hoặc không có hiệu quả ( Armstrong, 1982 [26]). Bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra ở người Vi khuẩn gây bệnh cho người được tìm thấy ở mọi vùng khí hậu trên thế giới. Chúng gây ra những thể bệnh lâm sàng khác nhau và hậu quả của chúng rất nghiêm trọng (thấp khớp, viêm cầu thận cấp). Các tư liệu hiện có về tỷ lệ phát bệnh do nhiễm Streptococcus đã cho biết chúng là một trong những bệnh do vi khuẩn thường gặp nhất ở vùng ôn đới, phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo đó bệnh này trở thành vấn đề kinh tế và y tế quan trọng ở mọi nơi. Người nhiễm phổ biến Str. suis type 2 và thường xảy ra với người tiếp xúc với lợn hoặc sản phẩm tươi sống của chúng. Người cũng có biểu hiện triệu chứng viêm não, xuất huyết, viêm phổi, viêm cơ tim và viêm khớp. Tỷ lệ chết có thể lên tới 7%. Việc truyền bệnh từ lợn bệnh sang người có thể do các vết thương ở da, đường hô hấp, tiếp xúc với máu hoặc các dịch tiết của lợn bệnh. Những người dễ nhiễm bệnh từ lợn gồm các công nhân công nghiệp chế biến thịt có rủi ro lớn nhất, những người làm việc ở trại chăn nuôi, người giết mổ gia súc, cán bộ thú y, người ăn tiết canh lợn hoặc ăn thịt lợn bệnh hoặc bất kỳ ai tiếp xúc với thịt lợn chưa nấu chín, lợn sống đều có nguy cơ nhiễm bệnh. Các bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra trên người đã được thông báo ở Đan Mạch, Hà lan, Vương Quốc Anh, Canada, Hồng Kông. Bệnh có thể xuất hiện như là một bệnh giống bệnh cúm, theo sau là viêm màng não. Trên 60% ca nhiễm bệnh ở người sau khi phục hồi bị mất khả năng nghe vĩnh viễn. Nhưng đến thời điểm này, các chuyên gia về y tế cả trong và ngoài nước đều khẳng định chưa thấy có dấu hiệu bệnh liên cầu khuẩn ở lợn có thể lây từ người sang người. 2.3. Vi khuẩn P. multocida và bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra ở lợn 2.3.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn P. multocida ở trong và ngoài nước Theo De Alwis, 1992[34], Nguyễn Văn Quang, 2001 [20] Louis Pasteur là người đầu tiên phát hiện mầm bệnh gây tụ huyết trùng gà (Fowl chorela) vào năm 1880; Gaffky (1881) phát hiện được mầm bệnh ở thỏ; Kitt (1885) phân lập được vi khuẩn ở bò . Năm 1886, Loefer phát hiện bệnh ở lợn và cùng năm này nhà giải phẫu học người Đức Hueppe chú ý đến những nét tương đồng của một bệnh ở các động vật khác nhau được gây ra bởi cùng một loại vi khuẩn, đó là P.multocida. Trevisan (1887) đã đề nghị đặt tên vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur. Vi khuẩn P. multocida gây bệnh tụ huyết trùng, là bệnh truyền nhiễm ở nhiều loài động vật: chim, động vật nhai lại, ngựa, thỏ, lợn…với những đặc tính chung về hình thái và tính chất sinh vật, hóa học. Bệnh chủ yếu là nhiễm khuẩn huyết, vi khuẩn tấn công có chọn lựa vào cơ quan tiêu hóa, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp. Theo phân loại của Bergey, 1984-1986 thì P. multocida nằm trong bộ Eubacteriales thuộc họ Pasteurellaceae, thuộc giống Pasteurella. P. multocida có sức đề kháng yếu, nó dễ dàng bị tiêu diệt bởi nhiệt độ cao, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường. Trong đất ẩm có nhiều Nitrat và thiếu ánh sáng vi khuẩn có thể sinh sản và sống khá lâu. Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm (Nguyễn Như Thanh, 2001 [22]). 2.3.2. Hình thái và đặc tính nuôi cấy của P. multocida ở các môi trường Vi khuẩn P. multocida là loại cầu trực khuẩn nhỏ, ngắn, có hình trứng, bầu dục hay hình cầu, bắt màu gram âm, không có lông, không di động, không hình thành nha bào, có hình thành giáp mô. Kích thước vi khuẩn 0,25-0,4 mm x 0,4-1,5 mm, vi khuẩn thường đứng riêng lẻ, đôi khi ghép đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trong cơ thể gia súc mắc bệnh, vi khuẩn phân lập được nhuộm bằng thuốc nhuộm Anilin có hiện tượng phân cực ở hai đầu, có nghĩa là vi khuẩn sẽ bắt màu sẫm ở hai đầu còn ở giữa không bắt hoặc bắt màu nhạt hơn. Tính lưỡng cực này là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn sinh sản tăng lên về kích thước và nguyên sinh chất dồn về hai đầu (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970 [16]). Vi khuẩn P. multocida là vi sinh vật hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, không mọc trên môi trường MacConkey, phản ứng Catalase, Oxydase dương tính, Urease âm tính, lên men đường Glucose, Saccharose, Mannitol, không lên men Lactose. (Carter, 1984 [32]). Nhiệt độ tốt nhất cho vi khuẩn P. multocida phát triển là 37oC, pH là 7,2-7,8. Vi khuẩn mọc tốt hơn nếu cho thêm 5-10% huyết thanh động vật (Nguyễn Như Thanh, 2001 [22]). Theo Skalinxki (1956) và G.R.Smith (1959) vi khuẩn phân lập từ bò có kích thước 0,5-1,2mm và tương đối đồng nhất. Vi khuẩn phân lập từ lợn có hình tròn hơn, kích thước 0,8-1,0 mm. Vi khuẩn phân lập từ gà ít đồng nhất hơn, có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình que. Khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo, vi khuẩn thường đa dạng, có hình que, hình trứng, hình cầu, còn gặp cả dạng tế bào khổng lồ trong các canh khuẩn có độc lực yếu hoặc không có độc lực. Trong môi trường lỏng, P. multocida mọc sẽ làm đục môi trường và có mùi tanh đặc trưng. Số lượng vi khuẩn đạt tối đa sau khi cấy 16 – 24 giờ, để lâu dưới đáy có cặn nhày, trên bề mặt có váng mỏng (G.R.Cater, 1955 [ 27]; Nguyễn Vĩnh Phước, 1970 [16]; Hoàng Đạo Phấn, 1986 [13]). Trong môi trường nước thịt: Theo Hoàng Đạo Phấn, 1986 [13] trong môi trường nước thịt peptone, sau nuôi cấy 24 giờ, nhiệt độ 37oC vi khuẩn làm đục môi trường, vài ngày sau nước thịt trở nên trong, đáy có cặn nhày lắc khó tan, trên mặt môi trường có lớp màng mỏng khi lắc lớp màng này tan ra môi trường đục, lắc lên có vẩn như sương mù rồi lại lắng xuống. Đáy ống có cặn nhầy, sinh ra một lớp màng mỏng trên mặt môi trường. Môi trường có mùi tanh giống như mùi của nước dãi khô. Tác giả còn thấy: vi khuẩn mới được phân lập mọc tốt trong các môi trường nuôi cấy thông thường nhưng khi nuôi cấy tiếp tục sẽ mọc yếu, vì vậy phải cho thêm vào môi trường huyết thanh hoặc máu vỡ. Điều này giải thích sự cần thiết của việc cấy chuyển vi khuẩn qua thạch máu khi giữ giống tươi. Môi trường thạch thường: vi khuẩn mọc cho khuẩn lạc trong như giọt sương, dạng S (tròn, trơn, bóng, láng, rìa gọn). Khi chiếu ánh sáng qua thấy khuẩn lạc trong suốt và có màu xám. Nuôi khuẩn lạc dài ngày hay để ở nhiệt độ phòng thì khuẩn lạc có màu trắng ngà, nhầy, dính vào mặt môi trường. Môi trường thạch máu: vi khuẩn mọc tốt, không làm dung huyết thạch máu, kích thước khuẩn lạc to hơn khuẩn lạc mọc trên thạch thường. Khi để khuẩn lạc ở nhiệt độ phòng, vi khuẩn đôi khi mọc thành khuẩn lạc kép (Hoàng Đạo Phấn, 1986 [13]). Theo tác giả kích thước của khuẩn lạc bình thường từ 1-2mm, nhưng khi vi khuẩn phân lập được từ những thể bệnh mãn tính, kích thước khuẩn lạc thường to hơn, từ 2-3mm. Môi trường này thường được dùng để giữ giống vi khuẩn. Môi trường thạch huyết thanh huyết cầu tố: đây là môi trường đặc biệt để phân lập, giám định và kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella. Môi trường thạch huyết thanh huyết cầu tố được chế bằng cách lấy 100ml thạch Mactin nấu chảy, để nguội đến 45oC, cho vào 1ml huyết cầu tố 1/10 của cừu hay dê và 4ml huyết thanh của bò, ngựa hoặc dê. Khi nuôi cấy trên môi trường này, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc đặc biệt. Quan sát khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp (20 lần) và góc chiếu phản quang của ánh đèn điện là 450 thấy hiện tượng phát huỳnh quang. Hiện tượng này của khuẩn lạc có thể quan sát thấy rõ sau khi nuôi cấy 24h. Nếu để lâu (sau 72h) thì huỳnh quang sẽ mất đi. Chủ yếu dựa vào độ dày mỏng của giáp mô mà khi soi kính bằng phương pháp trên thấy màu sắc huỳnh quang khác nhau. - Đối với các vi khuẩn có độc lực cao thì khuẩn lạc của chúng phát huỳnh quang màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích bề mặt khuẩn lạc về phía đèn, 1/3 diện tích bề mặt khuẩn lạc còn lại màu vàng kim loại, vàng da cam. Khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). - Nếu vi khuẩn có độc lực vừa thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy màu xanh lơ chiếm diện tích ít hơn màu vàng da cam. Khuẩn lạc này là Fo (Orange Fluorescent). - Nếu vi khuẩn có độc lưc rất yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát huỳnh quang, gọi là loại Nf (Not Fluorescent). Cách xem khuẩn lạc như trên chỉ áp dụng cho Pasteurella gây bệnh ở lợn và trâu bò, không áp dụng cho Pasteurella gây bệnh ở gia cầm. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn P. multocida có thể là lỏng, bán cố thể hay đặc. Môi trường có thể được cho thêm chất kích thích P. multocida tăng cường phát triển hay ức chế các loại vi khuẩn khác. Tùy mục đích nghiên cứu mà người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và các vi khuẩn khác nhau để nuôi cấy vi khuẩn. Theo Das M.S (1958), để tạo cho P. multocida mọc tốt có thể bổ sung gồm: + Cristal violet 2ml dung dịch 0,1% + Cloruacoban 6ml dung dịch 10% + Esculin 1g Môi trường này có thể ức chế sự phát triển liên cầu khuẩn và các loại vi khuẩn khác. Theo Moriss (1958) Neomycine có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của Pasteurella pseudotubeculosis và một phần Pasteurella pestis nhưng cho P. multocida và Pasteurella haemolytica phát triển. Namioka và Murata, 1961 [49] sử dụng môi trường có thêm 5-10% huyết thanh thỏ hoặc ngựa để phân lập P. multocida. Theo tác giả môi trường nuôi cấy vi khuẩn P. multocida là môi trường YPC (Yaest extract pepton- L.cystine) có thêm Saccarose và Sodium sulfit, đây cũng là môi trường giúp tái tạo giáp mô của vi khuẩn. Để nuôi cấy và thu hoạch kháng nguyên dùng môi trường chiết xuất nấm men YPC thấy có tác dụng tốt trong việc phục hồi những khuẩn lạc thoái hóa và thu được kháng nguyên có chất lượng dùng trong các phản ứng sinh hóa và định type vi khuẩn. Khi giữ giống tươi có thể dùng môi trường này đậy nút kín, giữ được vi khuẩn từ 2 đến 3 tuần ở 4oC. Theo Gurleva và cs (1971) môi trường nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn P. multocida là thạch Hottinger với 10% máu và 10% chiết xuất ngô. Để phân lập vi khuẩn P. multocida có thể dùng môi trường D.S.A (Dextrose Starch Agar), thạch máu hay môi trường chiết đậu Tryptone có bổ xung 5% huyết thanh đã khử hoạt tính. Beirey, 1975 cho rằng khi so sánh nhu cầu dinh dưỡng của hai chủng P. multocida có độc lực và không có độc lực nhận thấy cả hai chủng đều cần Nicotinamide và axit Pantothenic, Guanin, Inozit, Piridoxin, Vitamin B12, axit Folic và Hematine. Hiện nay ở Việt Nam, khi nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường lỏng, một số cơ sở đã sử dụng phương pháp lên men sục khí để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn P. multocida. So sánh phương pháp nuôi cấy lên men sục khí và phương pháp nuôi cấy tĩnh người ta thấy phương pháp lên men sục khí có số lượng vi khuẩn gấp 20 lần ở cùng loại môi trường. Chính từ ưu điểm đó, một số cơ sở đã áp dụng phương pháp lên men sục khí để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn P. multocida nhằm giảm thời gian trong quá trình sản xuất vacxin phòng bệnh cho gia súc gia cầm. Theo Nguyễn Văn Quang, 2001 [20] cần lưu ý: khi cấy chuyển trên môi trường nhân tạo nhiều lần, vi khuẩn tụ huyết trùng có sự biến động về khả năng mọc, đặc điểm hình thái và giáp mô cũng như sự tạo khuẩn lạc. Đồng thời có sự thay đổi về độc lực, thay đổi về tính kháng nguyên của chủng nuôi cấy. 2.3.3. Đặc tính sinh hóa Đã có nhiều nghiên cứu về đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn P. multocida người ta dựa vào các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn để xác định, phân biệt với các loài vi khuẩn khác và dùng để xác định các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ loài động vật khác nhau. - Phản ứng lên men đường: vi khuẩn P. multocida có khả năng lên men không sinh hơi một số đường như Glucose, Saccarose, Mannit, Sorbit, Xylose, Manose… - Không lên men đường: Maltose, Arbinose, Lactose, Ramnose… - Các phản ứng sinh hóa khác: + Vi khuẩn có phản ứng sinh Indol dương tính. + Phản ứng Oxydase dương tính. + Phản ứng Catalase dương tính. + Phản ứng sinh H2S: sản sinh bất thường. + Phản ứng VP: âm tính. + Phản ứng MR: âm tính. 2.3.4. Giáp mô và độc lực của vi khuẩn P. multocida Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn có giáp mô. Trong quá trình sinh trưởng ở điều kiện nhất định sẽ sinh ra giáp mô bao quanh tế bào. Theo Hoàng Đăng Huyến, 2004 [4] đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida đã khẳng định độc lực của vi khuẩn liên quan chặt chẽ với giáp mô. Độc lực của P. multocida rất phức tạp và không ổn định, nó tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh. Chính giáp mô đã làm cho vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào cơ thể động vật và phát triển được trong cơ thể động vật. Tuy nhiên nhiều chủng P. multocida phân lập được có giáp mô rõ nhưng độc lực của vi khuẩn lại thấp. Như vậy, độc lực phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng. Carter, 1955 [30] đã chia P. multocida thành 5 serotype kháng nguyên giáp mô khác nhau là A, B, D, E và F. Trong đó serotype A có giáp mô có cấu tạo bởi axit Hyaluronic và gắn một lớp polysaccharide. Lớp polysaccharide giáp mô là yếu tố quyết định bề mặt quan trọng không chỉ đối với P. multocida mà còn đối với một số vi khuẩn gây độc Gram âm và Gram dương khác. Giáp mô của vi khuẩn serotype D có ít axit Hyaluronic và chủng B, E không có Hyaluronic. Giáp mô của vi khuẩn P. multocida có thể quan sát nhờ các phương pháp nhuộm giáp mô như phương pháp nhuộm Hiss, phương pháp Anthony, phương pháp nhuộm bằng mực ấn Độ…quan sát bằng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi tụ quang nền đen thấy vi khuẩn bắt màu sẫm còn giáp mô bắt màu sáng. Theo Carter, 1967 [31] thì đa số trường hợp vi khuẩn phân lập từ động vật mắc bệnh cấp tính sẽ thấy có giáp mô và có độc lực cao. Khi nuôi cấy vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo sẽ thấy giáp mô mất đi và vi khuẩn không còn độc lực. Nhưng nếu cấy những vi khuẩn này trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo giáp mô và thể hiện độc lực. Theo Rhoades và Rimler, 1992, các vi khuẩn phân lập từ động vật mắc bệnh thể mãn tính thường cho khuẩn lạc to (2-3mm), hình dạng khuẩn lạc không cố định. Nếu nuôi cấy lâu ngày, khuẩn lạc sẽ to và dính. Nếu cấy chuyển liên tục thì giáp mô bị mất, khuẩn lạc nhỏ hơn, không màu và trong suốt. 2.3.5. Kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida P. multocida có kháng nguyên rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của P. multocida có hai loại chính là kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O). P. multocida có 5 serotype kháng nguyên vỏ A, B, D, E và F. Trong đó A, B và D đã được xác định gây bệnh cho lợn. Serotype A là serotype phổ biến nhất phân lập được trong bệnh viêm phổi. P. multocida có 16 serotype kháng nguyên thân. Những chủng serotype 3 và 5 cũng được phát hiện là rất phổ biến ở lợn với những chủng A:3; A:5; D:5 và D:3. Việc xác định serotype của P. multocida gồm 2 hệ thống là: + Hệ thống dựa vào kháng nguyên giáp mô. + Hệ thống dựa vào kháng nguyên thân. * Định type kháng nguyên giáp mô: Dựa vào phản ứng bảo hộ đối với chuột, Robert, 1947 đã đề xuất 4 type huyết thanh của P. multocida là: Type I, II, III, IV. Năm 1954, Husson đề xuất thêm type V. Năm 1952, Carter sử dụng phản ứng kết tủa và năm 1955 sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu để định type P. multocida và đã chia thành 4 type khác nhau: A, B, C, D. Năm 1961, chính Carter đã đề xuất thêm type E và bỏ type C. Năm 1987, đề xuất thêm type F. Như vậy hệ thống định type kháng nguyên giáp mô của Crater gồm 5 type: A, B, D, E, F. Type A, B thường gặp ở lợn, type D ít hơn. Theo Ahn và Kim, 1994 [24], tại Triều Tiên trong 80 mẫu P. multocida phân lập từ 450 phổi lợn bệnh thấy có 96,3% thuộc type A, 3,9% thuộc type D. Tại Nhật trong 116 mẫu P. multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh tích nhục hóa, apxe và viêm màng phổi thấy có 81,9% thuộc type A, 18,1% thuộc type D, đặc biệt type D chỉ thấy ở phổi lợn có apxe (theo Iwamatsu và Sawada, 1988 [40]). Theo Verma, 1988 [56] type B thường gặp ở Đông Nam á, Trung Quốc và ấn Độ. * Định type kháng nguyên thân: Định type kháng nguyên thân bằng phương pháp kết tủa trong ống nghiệm. Kháng nguyên được xử lý bằng axit HCl. Heddleston và cs, 1972 [37] bằng kỹ thuật kết tủa khuyếch tán trên thạch AGPT (Agar Gel Preciptin Test) đã chia kháng nguyên thân P. multocida thành 16 serotype và được ký hiệu từ 1 đến 16 trong đó type 3 và 5 thường gặp ở lợn. Ưu điểm của phương pháp này là có thể xác định được các chủng đã mất giáp mô mà phương pháp ngưng kết không thực hiện được và còn tránh được hiện tượng ngưng kết và ngưng kết chéo trong các phản ứng ngưng kết. Hiện nay người ta thường kết hợp giữa 2 hệ thống của Carter (kháng nguyên giáp mô) và hệ thống của Hedleston (kháng nguyên thân) để xác định các serotype của vi khuẩn P. multocida. Bên cạnh việc định type bằng các phương pháp huyết thanh học thì các phương pháp phi huyết thanh học cũng được sử dụng phổ biến: Phản ứng khử giáp mô bởi men Hyaluronidase để xác định type A của P.multocida; phản ứng kết tủa bông với Acrflavine để xác định type D; Carter và Chengapa, 1981, đã sử dụng phương pháp điện di miễn dịch đối chiếu để xác định type B, E. Ngày nay, kỹ thuật ELISA (Enzim Linking Immuno Sorbent Assay) cũng đã được sử dụng để xác định serotype kháng nguyên của P. multocida (Dawkins và cộng sự, 1990). * Yếu tố độc lực P. multocida có sinh độc tố nhưng không thể chiết tách được, chính độc tố này là yếu tố tác động chính gây viêm teo mũi. Độc lực của các chủng P. multocida phân lập từ phổi được Pijoan phát hiện lần đầu năm 1984. Kielstein, 1986 [42] cho biết những chủng có độc lực thường được tìm thấy khi phân lập vi khuẩn từ các ca bệnh cấp tính, không phải từ phổi lấy từ các lò mổ. Tuy nhiên trong thời gian gần đây, một số tác giả đã nghiên cứu về một yếu tố có tên là DNT. Sawata và cộng sự, 1984 cho rằng serotype D của vi khuẩn P. multocida có sinh ra một yếu tố được gọi là độc tố gây hoại tử, có thể tách được từ dịch nuôi cấy. DNT có thể phân ra thành 3 phần không độc. Theo Naika và Kume, 1987, tác động của DNT là gây hoại tử biểu bì, ngoài ra gây độc đối với tế bào phôi bò, gây ỉa chảy, teo lách ở chuột (Peterson và CTV, 1991). Kháng nguyên giáp mô là yếu tố rất quan trọng tạo nên độc lực của vi khuẩn P. multocida. Chính kháng nguyên giáp mô đã giúp vi khuẩn tránh được sự thực bào. Năm 1979, một số tác giả đã thông báo P. multocida bị hấp thu trong quá trình thực bào tại phổi lợn xảy ra rất chậm, thậm chí ngay cả khi có sự có mặt của opsonin. Nhận xét này cũng tương tự như kết quả của Fuentes và Pijoan đã công bố năm 1987. 2.3.6. Bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra ở lợn Vi khuẩn P. multocida là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở lợn 3-4 tháng tuổi trở lên. Đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, đặc điểm của bệnh là gây viêm phổi. Từ nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nguồn bệnh nguy hiểm nhất là lợn mắc bệnh và lợn mang trùng. Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1970 [16]; Đặng Thế Huynh, 1978 [3] lợn mắc bệnh cấp tính thì trong máu, dịch bài tiết, các phủ tạng đều có vi khuẩn và bài thải vi khuẩn ra môi trường ngay trong thời kỳ nung bệnh. Theo Gasparian (1969), ngoài lợn bệnh còn có một số lượng khá lớn lợn khỏe mang vi khuẩn và thường xuyên bài thải vi khuẩn ra môi trường. Tỷ lệ lợn khỏe mang vi khuẩn ở các lứa tuổi biến động từ 12,6% đến 33,1% (Nguyễn Văn Quang, 2001 [20]). Vi khuẩn P. multocida thường khu trú ở đường hô hấp trên của lợn và dễ dàng tìm thấy ngay cả trong những đàn lợn khỏe mạnh nên thực sự khó khăn trong việc tiêu diệt vi khuẩn. Vì vậy, P. multocida gây bệnh thường kết hợp với những tác nhân khác gây tổn thương phổi như Mycoplasma hyopneumoniae, virút cúm (Swine influenza), Aujetzky, B. bronchipseptica, A.pleuropneumoniae...và làm cho quá trình viêm phổi càng nặng thêm. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay những bệnh ghép ở đường hô hấp của lợn và gây ra tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Bahnson, 1994 [28] đã so sánh những lô lợn bình thường và những lô lợn bị bệnh viêm phổi thấy rằng ở lợn lô có bệnh tích viêm phổi giảm trọng lượng khoảng 7,8%, ở những đàn lợn bệnh, bệnh tích viêm phổi khi mổ khám chiếm tới 30-80%. Dịch tễ học Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida ra gây bệnh ở lợn từ 3-4 tháng tuổi trở lên, đặc biệt lợn 3-6 tháng tuổi, vào các thời điểm giao mùa. Vi khuẩn thường có ở ngoài môi trường và ở các đàn lợn. Người ta có thể phân lập được vi khuẩn từ dịch ngoáy mũi, hạch hầu của những lợn khỏe mạnh bình thường. Khi nuôi dưỡng không tốt, sức đề kháng của lợn giảm hoặc khi thời tiết thay đổi đột ngột, vi khuẩn sẽ tấn công gây bệnh. Theo Nielsen, 1984 [48] sự lây nhiễm vi khuẩn P. multocida là qua không khí hoặc qua sự tiếp xúc giữa mũi lợn với nhau là cách lây nhiễm phổ biến nhất. Theo Đặng Thế Huynh, 1978 [3] P. multocida lây nhiễm do tiếp xúc với gia súc bị bệnh, mang trùng hay tiếp xúc với chất thải của gia súc bệnh. Nhiều nghiên cứu cho biết sự lây nhiễm từ bên ngoài bao gồm từ chuột và những loài gặm nhấm khác. Triệu chứng Nhìn chung bệnh tụ huyết trùng lợn có thời gian nung bệnh ngắn. Theo Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 [15] thời gian nung bệnh từ 1-2 ngày, có khi chỉ vài giờ. Triệu chứng lâm sàng của bệnh rất khác nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn P. multocida, thường xuất hiện 3 thể: - Thể cấp tính Thể này thường gặp ở đầu ổ dịch. Thể bệnh này hầu hết là do các chủng thuộc serotype B, những chủng này rất ít ở Châu Âu và Bắc Mỹ. Những con vật mắc bệnh có những biểu hiện: bỏ ăn, khó thở, cố ra sức để thở, hóp bụng vào để thở, sốt cao nhiệt độ cơ thể lên tới 41-42oC, phù thũng dưới da vùng hầu mặt và tai, tỷ lệ chết cao (5- 10%) và nhanh từ 1-2 ngày vì ngạt thở. Do hoạt động của tim bị rối loạn nên có hiện tượng ứ máu làm cho niêm mạc đỏ sẫm, tím bầm đôi khi xuất huyết. Vì vậy những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết màu tím ở vùng tai, hầu, cổ, bụng... - Thể á cấp tính ở thể này hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở lợn trưởng thành. Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này giống như viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae, đặc điểm phân biệt chính 2 bệnh này là bệnh do P. multocida hiếm khi gây ra chết bất ngờ, lợn mắc bệnh có thể tồn tại thêm một thời gian dài. Biểu hiện bệnh: lợn ủ rũ, ăn ít, bỏ ăn, sốt cao 41o C hay hơn. Niêm mạc mũi bị viêm, chảy nước mũi đặc, đôi khi có lẫn máu. Lợn thở khó và nhanh, ho khan từng tiếng, có khi co rút toàn thân. Khi nghe vùng phổi thấy xuất hiện âm ran ướt, khi gõ thấy vùng âm đục mở rộng, khi ấn tay vào vùng ngực thấy con vật có hiện tượng đau rõ. Lợn xuất hiện nhiều vết tím đỏ trên da, đặc biệt là da vùng hầu, niêm mạc bị tím tái do hiện tượng ứ máu tăng. Vào giai đoạn cuối của bệnh, con vật thường ỉa chảy, có khi lẫn máu trong phân do ruột bị xuất huyết, con vật gầy yếu rồi chết. Lợn thường chết sau 3-4 ngày do ngạt thở. Tỷ lệ chết có thể tới 80%. - Thể mãn tính Lợn thở khó, nhanh, khò khè, ho từng hồi, ho nhiều khi vận động, tiêu chảy, sốt nhẹ hoặc không. Khớp xương bị viêm nóng, sưng, nhất là khớp đầu gối, da đỏ ửng từng mảng, bong tróc. Những con vật bị nhiễm thường ở lứa tuổi lớn (10-16 tuần tuổi). Lợn bệnh gầy yếu dần, kéo dài 1-2 tháng, suy nhược dần rồi chết. Tuy nhiên cũng có trường hợp con vật không chết, béo trở lại. Bệnh tích Bệnh tích đặc trưng là có các đám tụ huyết, xuất huyết ở da, niêm mạc, các màng thanh mạc và hầu hết các khí quan trong cơ thể. Bệnh tích nội quan do P. multocida thì chủ yếu phần xoang ngực và thường kèm với bệnh tích của Mycoplasma hyopneumoniae. Đặc trưng của bệnh là ở thùy đỉnh và thùy hoành của phổi, có bọt trong khí quản. Bệnh tích có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và vùng tổ chức phổi bình thường. Phần tổn thương của phổi sẽ có sự biến đổi màu sắc từ đỏ sang xám xanh, phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh. Các trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể xuất hiện viêm phế mạc và apxe ở các mức độ khác nhau. Trong các trường hợp này thường thấy phế mạc dính chặt vào thành xoang ngực và phế mạc có vùng mờ đục, khô. Nghiên cứu mô, ở thùy phụ thấy có dịch rỉ viêm của phế quản. Sự nghiêm trọng của viêm phế quản là sự tăng sản của tế bào nội mô và sự có mặt của rất nhiều tế bào bạch cầu trung tính trong mủ nhầy ở phế quản và phế nang. Bệnh tích này không đặc trưng. Chẩn đoán Việc chẩn đoán đúng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra là hết sức cần thiết, do đó cần tiến hành đồng thời nhiều phương pháp như: Dịch tễ học, chẩn đoán lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và đặc biệt là dựa trên kết quả xét nghiệm vi khuẩn học trong phòng thí nghiệm. Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn dễ nuôi cấy, phân lập trong phòng thí nghiệm. Những mẫu được lấy tốt nhất cho sự phân lập vi khuẩn là dịch khí quản và những mô tế bào phổi đã bị nhiễm bệnh được lấy từ khoảng giữa mô tế bào lây nhiễm và tế bào bình thường. Những mẫu lấy qua tăm bông từ dịch ngoáy mũi cũng được xem là mẫu tốt cho việc phân lập P. multocida và những dịch này nên để trong môi trường vận chuyển phù hợp. Những mẫu phổi phải được đưa đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt và tránh bị tạp, tất cả các mẫu phải được bảo quản lạnh (4-8o C) cho đến khi cấy. Nếu được nuôi cấy tốt trực tiếp trên đĩa thạch máu hay thạch Glucose sẽ dễ dàng tìm thấy vi khuẩn. Vi khuẩn phân lập được có thể tăng sinh do việc tiêm truyền canh trùng vào xoang bụng của chuột bạch và sau đó cấy lại vi khuẩn P. multocida sau 24 giờ từ bệnh phẩm gan và dịch ổ bụng. Bên cạnh đó còn có thể sử dụng các phương pháp khác như: Phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên gel thạch AGID (Agargel Immuno Diffuse) để xác định kháng nguyên thân (O) từ vi khuẩn phân lập được với kháng huyết thanh chuẩn, phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính để định loại kháng nguyên giáp mô (K), phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để xác định kháng nguyên giáp mô, phản ứng ELISA, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Phòng và trị bệnh - Phòng bệnh Vệ sinh chăm sóc nuôi dưỡng tốt để tăng sức đề kháng của cơ thể. Giữ chuồng sạch sẽ, khô ráo, thoáng mát. Sát trùng định kỳ chuồng nuôi và dụng cụ bằng Iodine. Khi thời tiết thay đổi cần tăng cường vệ sinh, chăm sóc và nuôi dưỡng. Hiện nay đã có nhiều loại vacxin vô hoạt dùng để phòng bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra, có thể tiêm vacxin vào lúc lợn 45 ngày tuổi, sau đó định kỳ 6 tháng lặp lại. ở Việt Nam, Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự, 1996 [12] đã và đang thử nghiệm vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh ho thở của lợn do một số loại vi khuẩn gây ra trong đó có vi khuẩn P. multocida. - Trị bệnh Khi lợn bị mắc bệnh cần cách ly và dùng kháng sinh để điều trị. Một số thuốc kháng sinh đã được dùng có hiệu quả điều trị P. multocida: Lincomycin-spectionmycin; một số Cephalosporin và nhiều Quinolones: Enrofloxacin và Danofloxacin. Trong đó Ceftiofur đã được một số tác giả chứng minh là kháng sinh tốt để chống lại vi khuẩn P. multocida. Kết hợp với các loại thuốc trợ sức như Vitamin C, B.Complex và các thuốc hạ sốt song song với việc sát trùng, vệ sinh chuồng trại hàng ngày. Tuy nhiên việc điều trị bằng kháng sinh ngày càng trở nên khó khăn và tỷ lệ chữa không thành công ngày càng cao. Hiện tượng này chính là do kháng thuốc của vi khuẩn P. multocida ngày càng nhiều. 2.4. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae và bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây r._. và độc lực, vượt qua rào cản hệ thống miễn dịch, xâm nhập vào cơ thể gây bệnh hoặc gây bệnh kế phát. Biểu đồ 8 cho thấy,tỷ lệ phân lập được vi khuẩn P. multocida có ưu thế hơn vi khuẩn Str. suis. Từ dịch ngoáy mũi tỷ lệ phân lập cao nhất là P. multocida (98,29%), tiếp đến là Str. suis (92,86%) và A. pleuropneumoniae thấp hơn (17,86%). Từ tổ chức phổi thì tỷ lệ phân lập được vi khuẩn P. multocida (69,23%), Str. suis (42,31%). Kết quả này phù hợp với kết quả của Trịnh Quang Hiệp, 2002 [3], vi khuẩn phân lập được từ dịch ngoáy mũi cao nhất là Str. suis (20,02%), tiếp đến P. multocida (9,2%) và thấp nhất là A. pleuropneumoniae (6,8%). Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên và cs, 2005 [17] đều xác định 2 loại vi khuẩn Actinobacillus và Pasteurella cư trú thường xuyên tại đường hô hấp trên của lợn là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra các đợt lợn mắc bệnh đường hô hấp tại các cơ sở chăn nuôi. ở điều kiện bình thường thì vi khuẩn Str. suis có thể phân lập được với tỷ lệ cao hơn vi khuẩn P. multocida. Nhưng về khả năng gây bệnh thì độc lực của vi khuẩn P. multocida mạnh hơn và do đó khi điều kiện thuận lợi chúng có khả năng gây thành bệnh với tỷ lệ cao hơn. Vi khuẩn Str. suis thường phát bệnh khi có một mầm bệnh tiên phát xâm nhập vào cơ thể lợn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của lợn trước, tạo điều kiện cho Str. suis nhân lên về số lượng và tăng lên về độc lực và gây bệnh. 4.9. Kết quả kiểm tra độc lực của các loại vi khuẩn phân lập được Vi khuẩn muốn gây bệnh được thì điều kiện tiên quyết là phải có độc lực. Để biết được các chủng vi khuẩn phân lập được có độc lực hay không, tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn trên dựa vào phương pháp Sawade, kết quả thu được như sau: 4.9.1. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng Str. suis phân lập được từ đường hô hấp của lợn Chọn 7 chủng Str.suis, ký hiệu từ S1 đến S7, tiến hành kiểm tra độc lực. Kết quả được trình bày ở bảng 4.11 Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng Str. suis phân lập được từ đường hô hấp ở lợn Chủng Str. suis Số chuột được tiêm (con) Liều tiêm (ml/con) Kết quả Số chuột chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) S1* 2 0,2 1 50 48 S2 2 0,2 1 50 36 S3* 2 0,2 0 0 0 S4* 2 0,2 0 0 0 S5 2 0,2 1 50 48 S6 2 0,2 0 0 0 S7 2 0,2 1 50 48 Tổng hợp S1*, S3*, S4* 6 0,2 1 17 48 S2, S5, S6, S7 8 0,2 3 37,5 36- 48 Các chủng S1*, S3*, S4* là những chủng được phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nhóm lợn khỏe mạnh. Các chủng S2, S5, S6, S7 là những chủng được phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp. Với 3 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe 1/3 chủng gây chết 50% số chuột trong vòng 48 giờ và 2/3 chủng không gây chết chuột. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn Str. suis phân lập được từ nhóm lợn khỏe là 17%. Với 4 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp thì 3/4 chủng gây chết 50% chuột trong vòng 36-48 giờ, 1/4 chủng không gây chết chuột. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn Str. suis phân lập được từ nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp là 37,5%. Đối với những chủng vi khuẩn Str. suis phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp có tỷ lệ gây chết chuột cao hơn (37,5%>17%) so với những chủng vi khuẩn Str. suis phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm lấy ở nhóm lợn khỏe. Những chuột không chết, quan sát thấy chuột có triệu chứng thần kinh mệt mỏi, ủ rũ, run rẩy…. chứng tỏ độc lực của các chủng vi khuẩn này rất thấp, chúng chỉ cư trú ở đường hô hấp của lợn mà không gây bệnh cho lợn. Những chuột chết được mổ khám có bệnh tích tương đối giống nhau : tim sưng, mềm nhão, tích nước trong xoang bao tim, vùng xung quanh chỗ tiêm có hiện tượng apxe. Khi nuôi cấy máu tim vào các loại môi trường khác nhau đều phân lập được vi khuẩn Str. suis thuần khiết. Kết quả trên phù hợp với kết quả của các tác giả Trần Đình Trúc 2007, [23] Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự, 1994 [11], Khương Thị Bích Ngọc, 1996 [9]. 4.9.2. Kết quả kiểm tra độc lực đối của các chủng P. multocida phân lập được từ đường hô hấp của lợn Trong những chủng P. multocida phân lập được chọn được 6 chủng vi khuẩn, ký hiệu từ P1 đến P6 để kiểm tra. Kết quả được tổng hợp tại bảng 4.12 Bảng 4.12. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng P. multocida phân lập được từ đường hô hấp của lợn Chủng P. multocida Số chuột được tiêm (con) Liều tiêm (ml/con) Kết quả Số chuột chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) P1* 2 0,2 0 0 0 P2* 2 0,2 1 50 36 P3 2 0,2 2 100 36 - 48 P4 2 0,2 1 50 48 P5 2 0,2 1 50 72 P6* 2 0,2 0 0 0 Tổng hợp P1*, P2*, P6* 6 0,2 1 17 36 P3, P4, P5, 6 0,2 4 67 36-72 Các chủng P1*, P2*, P6* là những chủng phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp lợn khỏe. Các chủng P3, P4, P6 là những chủng phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp. Qua bảng 4.12 cho thấy: Với 3 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe có 2/3 chủng không gây chết chuột và 1/3 chủng gây chết 50% chuột trong 36 giờ. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ nhóm lợn khỏe là 17%. Với 3 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp có 2/3 chủng gây chết 50% chuột trong 36-72 giờ và 1/3 chủng gây chết 100% chuột trong 48 giờ. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp là 67%. 5 chuột chết được mổ khám, thấy có bệnh tích điển hình: bao tim tích nước vàng, phổi, gan sưng, xuất huyết. Khi nuôi cấy máu tim vào các môi trường thì phân lập được vi khuẩn thuần khiết. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Lê Hoa, 2002 [2]; Trịnh Quang Hiệp, 2002[3]. Những chuột không chết đều có biểu hiện ủ rũ, mệt mỏi…Điều này chứng tỏ những chủng P. multocida phân lập được có độc lực, nhưng độc lực ở các mức độ khác nhau, những chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe thì độc lực thấp, để gây được bệnh thì cần phải có điều kiện thuận lợi. Đối với những chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp có tỷ lệ gây chết chuột cao hơn (67%>17%) so với những chủng vi khuẩn phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm lấy ở nhóm lợn khỏe. Thậm chí, một số chủng có độc lực rất cao có khả năng gây chết 100% chuột trong vòng 36-72 giờ. 4.9.3. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được từ đường hô hấp của lợn Trong những chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được, chọn 8 chủng vi khuẩn, ký hiệu từ A1 đến A8, để tiến hành kiểm tra độc lực đối với chuột bạch. Kết quả được trình bày ở bảng 4.13. Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae Chủng pleuropneumoniae Số chuột được tiêm (con) Liều tiêm (ml/con) Kết quả Số chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) A1 2 0,2 1 50 48 A2* 2 0,2 0 0 0 A3 2 0,2 1 50 36 A4 2 0,2 1 50 36 A5* 2 0,2 1 50 72 A6* 2 0,2 0 0 0 A7 2 0,2 2 100 48 A8* 2 0,2 1 50 36 Tổng hợp A2*, A5*, A6*, A8* 8 0,2 2 25 72 A1, A3, A4, A7 8 0,2 5 62,5 36-48 phân lập được từ đường hô hấp của lợn Các chủng A2*, A5*, A6*, A8* là những chủng phân lập được từ những mẫu từ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp lợn khỏe. Các chủng A1, A3, A4, A7 là những chủng phân lập được từ những mẫu từ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp. Kết quả cho thấy: Với 4 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe có 2/4 chủng không gây chết chuột, 2/4 chủng gây chết 50% số chuột trong vòng 72 giờ. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ nhóm lợn khỏe là 25%. Với 4 chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp có 4/5 chủng gây chết 50% số chuột thí nghiệm trong vòng 36-48 giờ và 1/5 chủng gây chết 100% số chuột trong vòng 48 giờ. Tỷ lệ gây chết chuột của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp là 62,5%. 7 chuột chết được mổ khám, thấy có bệnh tích giống nhau: phổi, gan sưng, xuất huyết. Lấy mẫu bệnh phẩm nuôi cấy vào môi trường nước thịt thì phân lập được vi khuẩn thuần khiết. Kết quả này chứng tỏ các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được có độc lực và có khả năng gây bệnh cho lợn. Kết quả của chúng tôi phù hợp với những kết quả của Trịnh Quang Hiệp, 2002[3]. Tỷ lệ chuột chết do những chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ những mẫu bệnh phẩm lấy ở nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp cao hơn (62,5%>25%) so với những chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe. Kết quả này cho thấy, những chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ mẫu bệnh phẩm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp có độc lực cao hơn những chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ những mẫu lấy từ nhóm lợn khỏe. Tóm lại, với các chủng của cả 3 loại vi khuẩn Str.suis, P. multocida, A. pleuropneumoniae đem kiểm tra độc lực có chung nhận xét như sau: Những chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu lấy ở nhóm lợn khỏe thì tỷ lệ gây chết chuột thấp, số chuột không chết có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ…chứng tỏ chúng có độc lực, nhưng độc lực thấp. Với những chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm lấy từ nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp, nhận thấy hầu hết chỉ gây chết chuột với tỷ lệ 50%. Điều này khẳng định là chúng có độc lực nhưng độc lực của chúng không cao và có khả năng gây bệnh cho lợn khi có đủ điều kiện tác động (sức đề kháng của lợn giảm, môi trường ngoại cảnh tác động…). Đáng chú ý hơn, ở một số chủng P. multocida và A. pleuropneumoniae đem kiểm tra độc lực thì tỷ lệ gây chết chuột cao, một số chủng có tỷ lệ gây chết 100% số chuột, chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độc lực cao với chuột bạch và có thể nó là nguyên nhân chính gây bệnh đường hô hấp ở lợn trong thời gian vừa qua. 4.10. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae phân lập được 4.10.1. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Str. suis phân lập được Kết quả được trình bày ở bảng 4.14 Bảng 4.14. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Str. suis phân lập được (n=7) Kháng sinh Hàm lượng (mg) Kết quả MC và RMC (số chủng) Tỷ lệ (%) Kháng (số chủng) Tỷ lệ (%) Tetracyclin 30 7 100 1 0,00 Ofloxacin 5 4 57,14 3 42,86 Ampicillin 10 3 42,86 4 57,14 Streptomycin 10 0 0,00 0 100 Kanamycin 30 3 42,86 4 57,14 Lincomycin 15 5 71,43 2 28,57 Ghi chú: MC: Mẫn cảm; RMC: Rất mẫn cảm Với Str.suis, kiểm tra 7 chủng thì cả 7 chủng đều mẫn cảm 100% với Tetracyclin. Tỷ lệ mẫn cảm của Str. suis với Lincomycin 71,43%, với Ofloxacin 57,14%. Tỷ lệ mẫn cảm của Str. suis với các kháng sinh còn lại như Ampicillin, Kanamycin không cao và đặc biệt là Streptomycin thì tỷ lệ kháng của vi khuẩn với thuốc là 100%. Vì vậy, có thể dùng 1 trong 3 loại kháng sinh Tetracyclin, Lincomycin, Ofloxacin và tốt nhất là Tetracyclin để điều trị khi lợn bị bệnh do Str. suis gây nên. 4.10.2. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được Kết quả được trình bày trong bảng 4.15 Bảng 4.15. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được (n=9) Kháng sinh Hàm lượng (mg) Kết quả MC và RMC (số chủng) Tỷ lệ (%) Kháng (số chủng) Tỷ lệ (%) Tetracyclin 30 8 88,89 1 11,11 Ofloxacin 5 7 77,78 2 22,22 Ampicillin 10 5 55,56 4 44,44 Streptomycin 10 3 33,33 6 66,67 Kanamycin 30 6 66,67 3 33,33 Lincomycin 15 6 66,67 3 33,33 Ghi chú: MC: Mẫn cảm; RMC: Rất mẫn cảm Với vi khuẩn P. multocida, kiểm tra 9 chủng với kháng sinh Tetracyclin thì có đến 8 chủng mẫn cảm (88,89%). Tỷ lệ mẫn cảm của P. multocida với Ofloxacin là 77,78%, với Lincomycin và Kanamycin là 66,67%, với Ampicillin là 55,56%. Đối với các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được thì tỷ lệ mẫn cảm với các các kháng sinh Streptomycin là rất thấp (33,33%). Nên khi xác định lợn bị bệnh do P. multocida có thể sử dụng Tetracyclin, Ofloxacin, Lincomycin và Kanamycin để điều trị bệnh. 4.10.3. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được Kết quả được trình bày trong bảng 4.16 Bảng 4.16. Tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được (n=8) Kháng sinh Hàm lượng (mg) Kết quả MC và RMC (số chủng Tỷ lệ (%) Kháng (số chủng) Tỷ lệ (%) Tetracyclin 30 7 87,50 1 12,50 Ofloxacin 5 6 75,00 2 25,00 Ampicillin 10 3 37,50 5 62,50 Streptomycin 10 3 37,50 5 62,50 Kanamycin 30 5 62,50 3 37,50 Lincomycin 15 7 87,50 1 12,00 Tiến hành kiểm tra 8 chủng và A. pleuropneumoniae thì 7 chủng mẫn cảm với Tetracyclin và Lincomycin, chiếm tỷ lệ 87,50%, với Ofloxacin là 75% và với Kanamycin là 62,50%. Tỷ lệ mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh Ampicillin và Lincomycin thấp với tỷ lệ 37,50%. Vì vậy, có thể sử dụng Tetracyclin, Lincomycin, Ofloxacin và Kanamycin để điều trị bệnh do A. pleuropneumoniae gây ra. Qua bảng 4.14; 4.15; 4.16 nhận thấy: khi dịch bệnh xảy ra và được xác định là có vai trò kế phát của 3 vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae thì có thể sử dụng Tetracyclin, Lincomycin, Ofloxacin để điều trị bệnh. Trong trường hợp vai trò kế phát chủ yếu là vi khuẩn P. multocida và A. pleuropneumoniae thì ngoài 3 kháng sinh trên có thể sử dụng Kanamycin để điều trị. Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Lê Hoa [2]; Trần Đình Trúc [23]. Cả 2 tác giả đều cho rằng Tetracyclin là kháng sinh tốt nhất để điều trị bệnh do Str.suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae gây ra. Tuy nhiên vấn đề kháng kháng sinh đang trở thành một hiểm họa lớn của nhân loại. Nếu chúng ta, những người chăn nuôi, những bác sĩ thú y không biết sử dụng kháng sinh một cách hợp lý, đúng quy trình sẽ dễ dàng tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc và gây rất nhiều khó khăn cho công tác kiểm soát dịch bệnh. 5. Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận Với 215 mẫu bệnh phẩm từ dịch ngoáy mũi, dịch khí quản, dịch phế quản và tổ chức phổi của nhóm lợn khỏe và nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp chúng tôi đã phân lập và xác định được một số đặc tính sinh học của 3 loại vi khuẩn Str.suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae và đưa ra một số kết luận sau: 5.1.1. Ba loại vi khuẩn Str. suis, P. multocida và A. pleuropneumoniae phân lập được từ đường hô hấp của lợn có đặc tính hình thái, nuôi cấy, tính chất bắt mầu và các đặc tính sinh học giống như các tài liệu kinh điển đã mô tả. 5.1.2. Tỷ lệ phân lập được các loại vi khuẩn Str.suis, P. multocida, A. pleuropneumoniae từ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn có biểu hiện triệu chứng bệnh đường hô hâp cao hơn nhiều lần so với nhóm lợn khỏe, cụ thể: Str. suis gấp 3 lần, P. multocida gấp 4,3 lần và A. pleuropneumoniae gấp 5,6 lần. 5.1.3. Kết quả kiểm tra độc lực của 3 chủng vi khuẩn phân lập được cho thấy độc lực của những chủng vi khuẩn Str.suis, P. multocida, A. pleuropneumoniae phân lập được từ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của nhóm lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp cao hơn nhiều so với độc lực của những chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nhóm lợn khỏe. 5.1.4. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh: Str.suis, P. multocida và A. Pleuropneumoniae đều mẫn cảm với Tetracyclin, Ofloxaxin và Lincomycin. Do đó có thể sử dụng 1 trong 3 loại kháng sinh này trong điều trị các bệnh do các vi khuẩn trên gây ra ở lợn. 5.2. Đề nghị Ngoài Str. suis, P. multocida, A. pleuropneumoniae cần tiếp tục nghiên cứu về các loại vi khuẩn đường hô hấp khác và bệnh do chúng gây ra nhằm tìm ra những biện pháp hữu hiệu nhất để áp dụng trong phòng và trị bệnh, góp phần hạn chế tổn thất do dịch bệnh gây ra ở lợn. Tài liệu tham khảo 1. Đào Trọng Đạt (2008): Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS). Tạp chí Khoa học ký thuật Thú y, số 5 trang 90. 2. Nguyễn Lê Hoa (2001): Xác định tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn gây bệnh hô hấp ở lợn Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, H.parasuis, A. pleuropneumoniae và biện pháp phòng trị. Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp 3. Trịnh Quang Hiệp (2002): Xác định một số đặc tính sinh vật hóa học, độc lực và vai trò gây bệnh viêm phổi ở lợn của một số vi khuẩn Actinobacilus, Pasteurella, Streptococcus. Luận án thạc sĩ Nông nghiệp 4. Hoàng Đăng Huyến (2004): Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò tại Bắc Giang (1995-2001) và đề xuất biện pháp phòng chống. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp. 5. Đăng Văn Kỳ (2007): Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn và biện pháp phòng trị. Tài liệu hội thảo hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, trang 148-156. 6. Phạm Sỹ Lăng (2007): Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn và biện pháp phòng trị. Tài liệu hội thảo hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, trang 135-140 7. HoàngVăn Năm (2007): Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn và biện pháp phòng trị. Tài liệu hội thảo hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, trang 127-134 8. Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007): Chứng rối loạn hô hấp & sinh sản. Tài liệu hội thảo hội chứng rối loạn hô hấp & sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, trang 12-24 9. Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993): Một số vi khuẩn thờng gặp trong bệnh ho thở truyền nhiễm ở lợn. Công trình Nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật 1990, 1991, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội 10. Khương Bích Ngọc (1996): Bệnh cầu khuẩn ở một số cơ sở chăn nuôi lợn tập trung và một số biện pháp phòng trị. Luận án Phó tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp. 11. Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thị Nội, Khương Bích Ngọc (1994): Nghiên cứu chế tạo vacxin phòng hội chứng ho thở truyền nhiễm ở lợn và kết quả áp dụng trong sản xuất. Tạp chí Khoa học Công nghệ và Quản lý Kinh tế, 9/1994, trang 356-357. 12. Nguyễn Ngọc Nhiên và CS (1996): Vai trò của một số vi khuẩn đường hô hấp trong hội chứng ho thở truyền nhiễm ở lợn và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sĩ Khoa học Nông nghiệp. 13. Hoàng Đạo Phấn (1986): Đặc tính của Pasteurella multocida và tuype huyết thanh của chúng. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, trang 1-7 14. Nguyễn Vĩnh Phước (1990): Vi sinh vật thú y Tập 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, trang 51-57 15. NguyễnVĩnh Phước (1978): Bệnh tụ huyết trùng lợn. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nhà xuất bản Nông thôn, trang 303-309. 16. Nguyễn Vĩnh Phước (1970): Trực khuẩn đóng dấu lợn, vi sinh vật học thú y. Tập 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, trang 51-96. 17. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Bích Thuỷ, Vũ Ngọc Quý (2005). Xác định nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc. Tạp chí KHKT thú y, 7(4), trang 25-32. 18. Cù Hữu Phú và CS (1998): Kết quả phân lập và xác định một số tính chất vi khuẩn của Streptococcus sp gây bệnh ở lợn một số tỉnh phía bắc. Báo cáo Khoa học Viện Thú y 1998 19. Cù Hữu Phú và CS (2001): Xác định tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính sinh hóa của các vi khuẩn Haemophillus cứ trú ở đờng hô hấp trên ở lợn, bước đầu xác định vai trò vi khuẩn gây bệnh của Haemophillus và biện pháp phòng trị. Báo cáo trình bày tại hội nghị khoa học và chăn nuôi thú y Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tháng 4/2001, trang 114-120 20. Nguyễn Văn Quang (2001): Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt tụ dấu nhũ hóa phòng bệnh tụ huyết trùng và đóng dấu lợn. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp. 21. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001): Giáo trình Vi sinh vật thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 15,16 22. Nguyễn Như Thanh (2001): Dịch tễ học Thúy y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 23. Trần Đình Trúc (2007): Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật hóa học, khả năng gây bệnh của vi khuẩn Streptococcus ở lợn và biện pháp phòng trị bệnh. Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu nước ngoài 24. Ahn, D.C and Kim, B.H. (1994): Toxigenicity and capsular serotypes of Pasteurella multocida isolate from Pneumonic lungs of slaughter pigs. Proc. Int, pig vet. Soc congr: 165 25. Anon (1960): A survey of the incidence and cause of mortality in pigs II. Findings at postmortmn axamination of pigs. 1960. Vet. Rec. 72: 1240-1247. 1959. Sow survey Vet. Rec. 71: 777-786 26. Armstrong, C.H; Wood, R.L. and Wessman, G.E (1982): A microtitration agglutination test for group E Streptococci infection in swine. Can.J. p. Med. 46:201-205 27. Austrilan, R (1976): Streptococcus pneumoniae manual of clinical Microbiology second edition. American society for Microbiology Washington D.C. 1976, 109-115 28. Bahnson, B.B (1994): Enzootic Pheumonia of Swine: Epidemiology and Effect on the Rate of Gain. PhD. Diss. Univ Minnesota. 29. Burrow, W; Moulder, J.W; Lewrt, R.W; Rippon, J.W (1968): The epidemiology of infection disease text book of Microbiology. Nineteenth edition toppan pany limmited Tokyo, Japan. 1968 30. Carter G. R. (1955): Studies on Pasteurella multocida I.A. Haemagglutination test for identification of serological types. American journal of veterinary research 31. Carter G. R. (1967): Pasteurella multocida and P. haemolytica in advances in veterinary Science. Academic Pres Newyork, 11:pp 321-379 32. Carter G. R. (1984): Pasteurella, Yersinia, and Franciella, P 111-121 in: Diagnostic procedures in veterinary bacteriology and Mycology 4th ed (Carter G. R, ed), Charles C, Thomas publisher, Springfield 33. Clifton-Hadley, F.A; Alexander, T. and Engright, M.R (1986): The epeidemiology diagnosis treatment and control of Streptococcus suis type 2 infection. Proc. Am. Assoc swine pract. Pp. 437-491 34. De Alwis M.C.L (1992): Pasteurellosis in production animals: Areview. An International workshop sponsored by ACIAR held at Bali Indonesia 10-13, August, pp.14-24 35. Desrosiers, S. Mittal; R. Rand Malo, R (1984): Procine pleuropneumoniae associated with haemophillus Procine pleuropneumoniae serotype 3 in Quibec. Vet rec 115:628-629 36. Erickerson, E.D; Doster, A.R. and Pokormy, T.S. (1984): Isolation and identification of Strep.suis. J.Am.Vet.Med.Assoc 185:666-668 37. Heddleston K.L, Rebers P.A (1972) Fowl chlera: Cross-immunity induced in turkeys with formalin-killed in vivo propagated Pasteurella multocida. Avian Dis, 16:pp.578-586 38. Hofer J; Buchner, A; Lapan (1996): Serologischer Querschnittsuntersuchungzu Verbreitung der Actinobacilluss peuropneumoniae 83:80-90 39. Hofman, L; and Henderson, L (1985): The significance of Strep.suis in swine diseases clinical pathologic and bacteriologic data from a two year study. Proc. Annu. Mect. Assoc. Vet. Lab. Diagn 28:201-210 40. Iwamatsu, S, and Swada, T (1988): Relationship between serotypes, dermonecrotic toxin production of Pasteurella multocida isolates and pneumonic lesions of porcine lungs.Jpn J vet Sci 50:1200-106 41. Jascobsen M.J and Nielssen JP (1995) : Development an devaluation of a Selectie and indicator medium for isolated of Actinobacillus pleuropneumoniae from tonsils Vet Micro 47:91-97 42. Kelstein. P (1986): On the occurrence of toxin-producing Pasteurella multocida strains in atrophic rhnitis, and in pneumonias of swine and cattle, J Vet med (B) 33:418-424 43. Killian, M. Nicolet, J and Biberstein, E.L (1978): Biochemicantand serological chaharractorzation of Haemophillus pleuropneumoniae (mathew san Pattion 1964 and Proposal of a neotype strain). Int J Bacteriol 28:20-26 44. Mittal, K.R; Higgins, R and Lariviete, S (1983): An evaluation of agglutination and coagglutination techniques for serotyping of Haemophillus pleuropneumoniae isolates.Am J Vet Re 48:219-226 45. Muniandy N, Edgar J, Woolcok J.B and Mukhur T.K.S (1992): Vurulence, purification, structure and protective potential of the putative capsular polysaccharide of Pasteurella multocida. No 43, pp. 47-54 46. Namioka. S andMurata M. (1961): Serological studies on Pasteurella multocida. II. Characteristics of the somatic “O” antigen of the organism. Cornell veterinarian, 51:pp.507-521 47. Nicolet, J. (1995): Taxonomy and Serrological identification of Actinobacillus peuropneumoniae. Lan Vet J 29:578-580 48. Nielsen, R (1984): Haemophilus pleuropneumonae serotypes-Cross protection experiments. Nord Vet Med 36:221-234 49. Perry, S &Partner (1983): Structurad characteristics of the antigenic capsular polysachhaides and lipoposaccharides involved in the serological classification of Actinobacillus (Haemophillus) pleuropneumoniae strains, Serodiagnosis and Immunotherapy in Inf Dis 4:299-308 50. Roger.S (1991): Pneumonia is a Killer disease. Nov. 1991.ARI News No 21 51. Rosenbach; Standford, S.E; Higgins, S (1984): Streptococcaldisease, 7th edition 1992. Edited by Leman. A.P . et al Iowa state University press. Ames 52. Sanford, S.E and Tilker, A.M.E (1992): Strep. suis type II associated diseases in swine. Observation of a one year study. J.Am.vet.Med.Assoc. 181:673-676 53. Shope, R.E; White, D.C; and Leidy, G (1964): Porcine contagious pleuropneumonia. II. Studies of the pathogenicity of the etiological agent Haemophilus pleuropneumoniae, J Exp Med 119:369-375 54. Taylor, D.J; Schlunz, L.R; Beeren, J.T; Cliver, D.O and Berdool, M.S (1990): Emetic action of Staphylococcal and Streptoccal enterotoxina on wearlin pigs inect immunol. 1990.36: 1263-1266 55. Vecht, U; Arends, M.D; vander molen, E.J; and Van Leengoel, L.A.M.G (1989): Difference in virulence between two strain of Strep.suis type Iiafter experimentally induced infection of new germ-free pigs. Am.J. Vet.Red 50:1037-1043 56. Verma, N.D (1988): Pasteurella multocida B:2 in Haemorhagic septicamia outbreak in pig in India. Vet. Rec 123:63 57. William, D.M; Lawson, G.H.K; and Rouland, A.C (1973): Streptococcal infection in piglets: The palatine tonsils as portal of entry for Streptococcus suis. Res. Vet. Sci 15:352-362 Nguồn trích từ Internet 58. ngày 26/07/2007 Phụ lục Bảng 1. Kết quả giám định đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu của các vi khuẩn phân lập từ đường hô hấp của lợn Loại vi khuẩn Gram Thạch thường Thạch máu Thạch MacConkey Khuẩn lạc Streptococcus sp + 100% S, nhỏ trắng Mọc mạnh, dung huyết (+) Nhỏ, trắng Pasteurella multocida - 100% S, nhỏ trắng, trong Mọc mạnh, mùi tanh (-) Không mọc Actinobacillus Pleuropneumonae - 100% S, nhỏ vàng Mọc mạnh, nhỏ, dung huyết Không mọc Staphylococcus aureus + 100% S, nhỏ Mọc mạnh (+) Không mọc Diplococcus + 100% S, nhỏ trong Một số có khả năng gây dung huyết (+) Không mọc Klebsiella - 100% M, giọt nhầy Mọc mạnh, dung huyết B. bronchiseptica - 100% Màng bóng Hồng nhạt E. coli - 100% S, tròn trắng Mọc mạnh Nhỏ, hồng cánh sen quầng trắng Salmonella - 100% S, trong trắng Mọc mạnh Nhỏ, trong không màu Bảng 2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của các vi khuẩn phân lập từ đường hô hấp của lợn Loại vi khuẩn Đặc tính sinh hóa Chuyển hóa đường Phản ứng sinh hóa Glucose Lactose Saccarose Mannit Indol Oxydase Catalase Streptococcus sp + 100% + 100% + 100% - 100% - 100% - 100% - 100% Pasteurella multocida + 100% - 100% + 100% + 100% + 100% + 100% + 100% A.pleuropneumonae + 100% - 100% + 100% + 100% - 100% + 100% + 100% Staphylococcus aureus + 100% + 100% + 100% + 100% - 100% + 100% Diplococcus + 100% + 100% + 100% - 100% - 100% - 100% - 100% Klebsiella + (h) 100% + 100% - 100% + 100% + 100% ± 100% + 100% B. bronchiseptica - 100% - 100% - 100% - 100% - 100% + 100% + 100% E. coli + (h) 100% + (h) 100% ± + (h) 100% + 100% Salmonella + 100% - 100% - 100% + 100% - 100% + 100% + 100% Sau khi định loại thấy rằng trong các mẫu nghiên cứu có 9 loại vi khuẩn. 1. Streptococcus sp 6. A. pleuropneumoniae 2. Pasteurella multocida 7. Bordeltella bronchiseptica 3. Staphylococcus 8. Salmonella 4. Diplococcus 9. E.coli 5. Klebsiella - Vi khuẩn Staphylococcus aureus: vi khuẩn Gram(+), không gây dung huyết thạch máu, mọc tốt trong các môi trường thạch thường, thạch máu, cho khuẩn lạc màu vàng tươi; không mọc trên môi trường thạch MacConkey. Các phản ứng Indol, Catalse dương tính, lên men một số loại đường như Glucose, Saccarose, Mannit, Lactose. - Vi khuẩn Diplococcus: vi khuẩn Gram(+), trong vi trường đứng riêng lẻ hay đứng thành đôi. Phát triển tốt trên các môi trường thông thường, một số chủng có khả năng gây dung huyết thạch máu. Lên men một số một loại đường như Glucose, Saccarose, Lactose, không lên men đường Mannit. Không có khả năng sinh phản ứng, Oxxydase, Catalase và Indol âm tính. - Vi khuẩn Klebsiella: vi khuẩn Gram (-) gây dung huyết thạch máu; lên men sinh hơi các loại đường Glucose, Saccarose, Lactose, Mannit; phản ứng Indol và phản ứng Catalase âm tính. - Vi khuẩn Bordetella bronchiseptica: vi khuẩn Gram (-), có khả năng di động phát triển tốt trong môi trường thạch máu, thạch MacConkey, không mọc trên môi trường thạch Sapman. Phản ứng Catalase dương tính, không sinh Indol và H2S, không lên men các loại đường Glucose, Lactose, Saccarose, Mannit. - Vi khuẩn E.coli: vi khuẩn Gram (-), mọc tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường, không làm dung huyết thạch máu. Cho phản ứng sinh Inđol dương tính. Lên men sinh hơi một số loại đường Glucose, Lactose, Mannit. - Vi khuẩn Salmonella: vi khuẩn Gram (-), mọc tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường; lên men đường Glucose, Mannit, không lên men đường Lactose, Saccrose. Cho phản ứng sinh Indol âm tính, phản ứng Oxydase, Catalase dương tính. ._.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docLuan van in bc nop4-12.doc
  • pptPHUONG GIANG.ppt
  • pptPHUONG GIANG1.ppt
  • docphuong giang 2.6.10.doc
  • docphuong giang (24.10).doc
  • docVe bieu do.doc
  • docBC tom tat.doc
  • docBC tom tat nop thay Q.doc
  • xlsgiang.xls
  • docLuan van 28.10.doc
  • docLuan van thac si sua21-10.doc
Tài liệu liên quan