Tóm tắt Luận văn - Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II)

ặc tính huỳnh quang của các chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên kết. Kết quả tính toán cho thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh quang trong phức Hg2L2. Sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC- Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích thích electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc Kasha. 1 MỞ ĐẦU Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) và Homocysteine (Hcy) là là những hợp chất thiol, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh học. Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh. Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người. Vì vậy, việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),,và phương pháp huỳnh quang. Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể phân tích các chất trong tế bào sống. Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W. Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992. Với những ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại, anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007 bởi tác giả Dương Tuấn Quang. Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)). Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, -S trong vòng hoặc ở mạch hở. 2 Tuy nhiên, đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II). Hiện nay, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh quang nói riêng. Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại. Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố. Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) ". Những đóng góp mới của luận án: - Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất của Hg(II) với L (Hg2L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys bằng Hg2L2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. - Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. - L và AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang 1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang 23 NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN 1. Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai sensor huỳnh quang mới là L và AMC. Sự kết hợp linh hoạt này đã giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và thực nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả năng thành công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được nghiên cứu dự đoán từ tính toán và khẳng định từ kết quả tổng hợp thực nghiệm sau đó. 3. Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu và khẳng định từ các kết quả thực nghiệm. 4. (a). Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự có mặt các ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo phương pháp trắc quang là 0,076 μM và 0,25 μM; theo phương pháp huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM. Phức Hg2L2 có thể phát hiện chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. Sensor L phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys. (b). Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys, GSH, Hcy) trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol, hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. Sensor AMC phản ứng với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) theo cơ chế phản ứng AMC cộng Michael. 22 Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0 tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm. Trong khi đó, các quá trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 của AMC-Cys là xảy ra. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171; điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC-Cys quan sát được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3 nm là mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm. Ngoài ra, do quá trình chuyển electron từ S2 về S1 tại cấu hình R EES1, với cấu hình S2 tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá trình (6) ở Hình 3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình 3.48b. Đó có thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (340,3 nm) mạnh hơn rất nhiều so với ở bước sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong thực nghiệm. Đối với AMC-Hcy và AMC-GSH (tương tự AMC-Cys). Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các trạng thái kích thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC- GSH cho thấy, đối với sensor AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu hình REES1 và REES2, điều này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa hai tiểu phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy bị phân tách mạnh. Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa các MO trong các bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích của sensor AMC. Ngược lại, tại REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy nằm trong cùng một mặt phẳng. Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen phủ giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái. Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của sensor AMC và các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt nguồn từ trạng thái S1. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc của Kasha. 3 1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang 1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang 1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang 1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và phương pháp phát hiện 1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng 1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol 1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II) 1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II) 1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II) 1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol 1.4.1. Dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde 1.4.2. Dựa trên phản ứng cộng Michael 1.4.3. Dựa trên phản ứng ghép nối peptide 1.4.4. Dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm 1.4.5. Dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester bởi thiol 1.4.6. Dựa trên phản ứng phân tách disulfides bởi thiol 1.4.7. Dựa trên phản ứng hình thành và phân hủy phức 1.4.8. Dựa trên các cơ chế khác 1.5. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) 1.5.1. Dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II) 1.5.2. Dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) 1.6. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa trên fluorophore là cyanine và coumarin 1.7. Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu các sensor huỳnh quang CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc các biothiol và ion Hg(II): 4 + Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của sensor L. + Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L. + Nghiên cứu lý thuyết về ứng dụng của sensor L phát hiện ion Hg(II). + Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L) phát hiện các biothiol. Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo. - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc các biothiol: + Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng của sensor AMC với các biothiol. + Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor AMC. + Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết - Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn được thực hiện bằng phương pháp DFT tại B3LYP/LanL2DZ, sử dụng phần mềm Gaussian 03. - Các thông số năng lượng tương tác được hiệu chỉnh ZPE gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng của các sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia. - Tính toán trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời gian được thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết. - Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 21 quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực nghiệm. Ngoài ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ S0→S2 (quá trình (2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0 (quá trình (4) ở Hình 3.48a). Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn cường độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong thực nghiệm. Hình 3.48. Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái kích thích electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH (d) (a) (b) (c) 20 3.2.3.2. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang a. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích Từ kết quả tính toán cho thấy, trong sensor AMC, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích S1 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn nhất là 0,5348, tại bước sóng 320,9 nm. Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO, với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21%. Bên cạnh đó, sự xen phủ giữa HOMO và LUMO là rất lớn, điều này cho thấy việc chuyển electron từ HOMO sang LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể. Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số liệu tính toán cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lần lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất nhiều so với các bước chuyển khác), tại các bước sóng tương ứng là 300,6; 300,4 và 300,7 nm. Trong các bước chuyển trạng thái này, bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển chính, với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17; 89,05 và 89,24%. Mặt khác, sự xen phủ giữa HOMO-1 và LUMO là rất lớn, nên việc chuyển electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể. Kết quả phân tích các MO biên cũng cho thấy, không có sự xen phủ giữa HOMO và HOMO-1. Do đó, trong AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến HOMO-1. Kết quả, các chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC- GSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở thực nghiệm. b. Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là bị cấm. Tại cấu hình REES2, các quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là xảy ra. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều này dẫn đến cường độ huỳnh 5 - Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi các phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS. - Đặc tính, ứng dụng của các sensor được thực hiện bởi phương pháp quang phổ huỳnh quang và UV-Vis. - Các điều kiện tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa trên kết quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm công bố trước đây về các phản ứng tương tự [2], [3], [29]. Quy trình tổng hợp các sensor được tóm tắt như sau: a. Tổng hợp sensor L * Tổng hợp CBZT 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic (4,18 g, 0,03 mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 8 giờ. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa nhiều lần với ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất rắn CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%). * Tổng hợp sensor L CBTZ (290mg,1mmol) và 4-diethylamino-2- hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL ethanol tuyệt đối. Thêm 1 giọt piperidine, dung dịch phản ứng chuyển sang màu đỏ. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10 giờ, sau đó làm nguôi đến nhiệt độ phòng. Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều lần bởi diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng 3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%). b. Tổng hợp AMC Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu được dung dịch. Làm lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 0 oC. Thêm từ từ (trong khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng từng giọt dung dịch acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL). Sau đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm nước vào dung dịch thu được để hòa tan các muối amine. Tiếp tục rửa sạch pha hữu cơ thu được bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng 6 muối MgSO4 khan. Làm bay hơi dung môi hữu cơ trên máy cô quay chân không. Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng cách kết tinh lại trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất của cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức 3.1.1. Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp, đặc trưng của sensor L 3.1.1.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ đã được áp dụng cho hệ nghiên cứu. Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các dạng này đều có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor. Trong đó, donor (nhóm đẩy electron) là một nhóm amino; aceptor (nhóm rút electron) là ion amoni. Chúng được biết đến là những hợp chất màu, phát huỳnh quang mạnh [40]. Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: N S N S -O2C BrCH2COOH N S -O2C N HO OHC N HO LCBZTBZT (I) (II) Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là nhóm có ái lực mạnh với ion Hg(II); các phản ứng tổng hợp L thực hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) và giai đoạn (II). Receptor Fluorophore 19 huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol + các amino acids với các dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b). d. Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 10 μM, tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], với R = 0,982. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys đã được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. 3.2.3. Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của AMC 3.2.3.1. Hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH ở trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích electron Đối với sensor AMC, ở trạng thái cơ bản S0, tiểu phần coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng. Trong khi đó, ở trạng thái kích thích electron S1(REES1) và S2(REES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau. Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, trong các cấu hình S0(RGS) và S1(REES1), có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và acryloxy. Trong khi đó, ở cấu hình S2(R EES2), tiểu phần coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng. Hình 3.38. (a) Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) trong sự hiện diện của hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr và Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH 18 Trong khi đó, dung dịch sensor AMC tự do hiển thị một dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375 nm và 450 nm (Hình 3.33b). Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ) của sensor AMC đã được xác định là 0,05. Khi thêm Cys vào dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần ở cả hai đỉnh phát xạ. Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước sóng dài tăng mạnh hơn cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước sóng ngắn. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng 375 và 450 nm như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng để xác định Cys. b. Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys Khi thêm Cys từ 0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10 μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys. Sau đó, tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys. Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ mol 1:1 (tương tự Hcy và GSH). Kết quả này phù hợp với kết quả thu được khi xác định hệ số tỷ lượng của phản ứng giữa AMC với Cys bằng phương pháp đồng phân tử gam và phân tích phổ khối lượng của sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys. c. Khảo sát ảnh hưởng của các amino axit cạnh tranh Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung các amino acids có chứa thiol, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng 450 nm và tăng vừa phải ở bước sóng phát xạ 375 nm. Tuy nhiên, mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys> GSH> Hcy (Hình 3.38a). Đối với amino acids khác không có chứa nhóm thiol hầu như không làm thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch sensor AMC (Hình 3.38a). Sự có mặt của amino acids này cũng không làm ảnh hưởng đến phản ứng giữa các biothiol (Cys, GSH và Hcy) với AMC, bằng chứng là không xuất hiện sự khác biệt đáng kể giữa phổ 7 Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I) dựa trên phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic [29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa trên phản ứng phản ứng cộng andol và ngưng tụ croton [3]. a. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I) Phản ứng hình thành CBZT từ BZT và acid bromoacetic được trình bày ở Hình 3.2 và 3.3. Kết quả tính toán cho thấy, phản ứng giữa BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm để hình thành CBZT là thuận lợi về mặt nhiệt động. b. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (II) Phản ứng hình thành L từ CBZT với DHB có thể tạo ra 4 sản phẩm (Hình 3.5). Kết quả tính toán cho thấy, biến thiên năng lượng tự do Gibbs (∆G298) của phản ứng (12) là âm nhất. Theo đó, phản ứng giữa CBZT với DHB theo hướng hình thành sản phẩm L là thuận lợi về mặt nhiệt động. S N BrCH2COOH Br - S N+ COOHCBZT-1 (1) S N BrCH2COOH HBr S N+ COO- BZT CBZT-2 (2) S N BrCH2COOH S N+ COOH...Br-BZT CBZT-3 (3) S N BrCH2COOH S N+ COOHBZT CBZT-4 (4) Br- S N BrCH2COOH S N COOHBZT CBZT-5 Br (5) BZT Hình 3.2. Các sản phẩm có thể có từ phản ứng giữa BZT với acid bromoacetic CH3CH2OH Br- S N+ COO- CBZT S N+ COOH...Br- CH3CH2OH2 + H2O Br- S N+ COO- CBZT (7) S N+ COOH...Br- CBZT-3 H3O + OH- Br- S N+ COO- CBZT (8) S N+ COOH...Br- CBZT-3 H2O (6) CBZT-3 Hình 3.3. Các phản ứng hình thành CBZT từ CBZT-3 N+ S COO- N+ S COO- N HO OHC N HO CBZT (9) N+ S COO- L-1 (11) HO N L-3 H2O H2O N+ S COO- N (10) L-2 H2O HO N+ S COO- (12)N L H2O HO DHB Hình 3.5. Các sản phẩm phản ứng có thể hình thành giữa CBZT với DHB 8 3.1.1.2. Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của L a. Cấu trúc phân tử của L Chiều dài các liên kết, số đo các góc liên kết, góc nhị diện trong L đã được tính toán. Trong đó, các tiểu phần BZT, acid bromacetic và DHB ít thay đổi so với ban đầu. Trong L có sự hình thành liên kết mới giữa N7 và C11 và liên kết đôi giữa nguyên tử C10 và nguyên tử C12. b. Phân tích phổ UV-Vis của sensor Phổ UV-Vis của sensor L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm. Trong một công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự như sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại ở 405 nm, là một chất phát xạ huỳnh quang mạnh ở bước sóng 495 nm. Kết quả này dẫn đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của L tương tự BZTVPA. c. Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L Bảng 3.5. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ Bước chuyển MO Năng lượng (eV) Bước sóng (nm) f Tỷ lệ % đóng góp S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44 96→97 35,80 S0→S2 93→97 2,74 452,6 0,5626 29,22 95→97 28,63 96→97 28,66 S0→S3 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90 93→97 8,83 94→97 77,56 S0→S4 92→97 3,00 413,2 0,5815 5,42 93→97 49,94 Hình 3.6. Hình học bền của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 17 ester tạo bởi acid acrylic và các ancol (thường là các fluorophore), ban đầu tạo ra các thioether, tiếp theo là hình thành các hợp chất dị vòng đối với trường hợp của Cys và Hcy. Trong khi đó, các thioether của GSH thường bền, không xảy ra quá trình tạo các hợp chất vòng sau đó. Khác với nghiên cứu trên, kết quả tính toán về mặt nhiệt động cho thấy, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol (bao gồm Cys, Hcy và GSH) để hình thành các thioether theo tỉ lệ mol 1:1 là thuận lợi về mặt nhiệt động. 3.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của AMC 3.2.2.1. Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm AMC đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS. 3.2.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của sensor AMC a. Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ của dung dịch sensor AMC tự do đạt cực đại tại bước sóng 275 và 320 nm. Khi thêm Cys vào dung dịch của sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không đáng kể. Hình 3.33. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) tại 25C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang, AMC (10 μM) khi thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25C, bước sóng kích thích 320 nm 16 0,998. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã được xác định tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. 3.2. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh quang AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael 3.2.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol 3.2.1.1. Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại ở bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159]. Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4- metylcouramin) từ dẫn xuất của coumarin dùng để phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7- hydroxylcoumarin được chọn làm fluorophore, còn receptor là acryloyl chloride, vì phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với dẫn xuất axit [2] và receptor này có thể gây ra phản ứng cộng với các biothiol. Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau: OO OH OO O O AMC O Cl + HCl+ (A) (B) Hình 3.29. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC Kết quả tính toán cho thấy, ΔG298 của phản ứng tổng hợp sensor AMC là âm, theo đó phản ứng tổng hợp sensor AMC là thuận lợi về mặt nhiệt động. 3.2.1.2. Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây, phản ứng cộng Michael giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các Receptor Fluorophore 9 Bước chuyển MO Năng lượng (eV) Bước sóng (nm) f Tỷ lệ % đóng góp 94→97 10,62 95→97 9,35 96→97 11,07 S0→S5 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61 93→97 7,68 S0→S6 90→97 3,92 316,7 0,0051 44,35 91→97 41,32 96→97 8,40 Kết quả tính toán (Bảng 3.5) cho thấy, các trạng thái kích thích có cường độ dao động lớn là S0→S1, S0→S2 tại các bước sóng tương ứng lần lượt là 489,8 nm và 452,6 nm đều có sự đóng góp khá lớn (tương ứng là 35,80% và 28,66%) của bước chuyển electron từ MO-96 lên MO-97. Do đây là các MO liên tiếp, nên không có quá trình PET nào can thiệp đến bước chuyển này. Kết quả này dẫn đến một kỳ vọng rằng L là hợp chất phát huỳnh quang. 3.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L 3.1.2.1. Thực nghiệm tổng hợp L Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm CBZT và L đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ FAB-MS. 3.1.2.2. Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II) a. Khảo sát phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm 10 Như dự đoán từ tính toán, L phát huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175; bước sóng huỳnh quang cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm. b. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L phát hiện ion Hg(II) Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng và làm thay đổi phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L. Cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm dần khi tăng nồng độ Hg(II). c. Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II) Hình 3.12 cho thấy, cường độ huỳnh quang dung dịch L giảm mạnh khi nồng độ ion Hg(II) tăng từ 0 đến 5,0 M; và sau đó giảm không đáng kể khi tiếp tục tăng nồng độ ion Hg(II). Điều này cho thấy L phản ứng với Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1. Hình 3.12. Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản ứng giữa ion Hg(II) với L (L (5,0 M) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH ~7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm Hình 3.11. Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích