Nghiên cứu đặc điểm Nông Sinh học, khả năng nhân giống In Vitro Hoa Lilium Poilanei Gapnep và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen chi Lilium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ VŨ QUANG KHÁNH “NGHIÊN CỨU ðẶC ðIỂM NÔNG SINH HỌC, KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG IN VITRO HOA LILIUM POILANEI GAPNEP VÀ ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN CHI LILIUM” LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Vũ Quang Khánh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, người hướng dẫn khoa học ñã tận tình giúp ñỡ với tinh thần trách nhiệm cao và ñóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tập thể Thầy, Cô giáo khoa Nông Học, khoa Sau ñại học, ñặc biệt các Thầy, Cô giáo trong Bộ môn công nghệ sinh học trường ðại Học Nông nghiệp Hà Nội ñã trực tiếp hướng dẫn và ñóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tập thể cán bộ, công nhân viên viện sinh học nông nghiệp, các bạn học sinh K49 trường ðại học nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm ñề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn bè, ñồng nghiệp, gia ñình và người thân ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành ñề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2008 Tác giả luận văn Vũ Quang Khánh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii 1. Mở ñầu 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu 2 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3 2. Tổng quan tài liệu 4 2.1. Giới thiệu chung về hoa lily 4 2.2. Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới và Việt Nam 9 2.3. Tình hình nghiên cứu về xử lý nhiệt ñộ thấp ñối với cây hoa lily 14 2.4. ứng dụng nuôi cấy in vitro trên cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam 20 2.5. Nghiên cứu ða dạng di truyền trên cây hoa lily 25 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 32 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 33 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 35 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 41 4.1. Nghiên cứu về thời lượng xử lý nhiệt ñộ thấp 41 4.1.1. Phân loại củ Lilium poilanei Gapnep 41 4.1.2. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến tỷ lệ mọc mầm của củ hoa Lilium poilanei Gapnep 43 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 4.1.3. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng chiều cao cây hoa Lilium poilanei Gapnep 46 4.1.4. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến thời gian ñạt chiều cao tối ña (khi cây ra nụ) cây hoa Lilium poilanei Gapnep 49 4.1.5. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái ra lá cây hoa Lilium poilanei Gapnep 50 4.1.6. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến thời gian ñạt số lá tối ña cây hoa Lilium poilanei Gapnep 52 4.1.7. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến các thời kỳ sinh trưởng cây hoa Lilium poilanei Gapnep 54 4.1.8. Một số ñặc ñiểm hình thái cây hoa Lilium poilanei Gapnep 57 4.2. Nghiên cứu khả năng nhân in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep 59 4.2.1. Thí nghiệm 1. Nghiên cứu thời gian khử trùng thích hợp tạo mẫu sạch ñưa vào nuôi cấy 59 4.2.2. Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ 60 4.2.3. Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA ñến khả năng phát sinh hình thái của vẩy củ 62 4.2.4. Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ 63 4.2.5. Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến khả năng nhân nhanh của chồi 65 4.2.6. Thí nghiệm 6. ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng ra rễ của chồi Lilium poilanei Gapnep 68 4.3. ðánh giá ña dạng di truyền của một số giống/loài hoa lily bằng kỹ thuật RAPD 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v 4.3.1. Nghiên cứu ña dạng di truyền một số giống/loài hoa lily bằng chỉ thị phân tử RAPD 70 4.3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của các giống/loài lily nghiên cứu với mồi RAPD 71 4.3.3. Số băng ADN thu ñược của 32 giống/loài lily với mồi RAPD 72 5. Kết luận và ñề nghị 76 5.1. Kết luận 76 5.2. ðề nghị 77 Tài liệu tham khảo 78 Phụ lục 86 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CT: Công thức TB: Trung bình THT: Than hoạt tính α -NAA: Axit α - naphtyl axetic BA: Benzyl adenin MS: Murashige & Skoog, 1962 ð/C: ðối Chứng NST: Nhiễm sắc thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Diện tích trồng hoa lily ở một số nước năm 2005-2006 10 3.1. Danh sách tên và ký hiệu các loài/ giống lily sử dụng phân tích RAPD 33 3.2. Các mồi sử dụng trong phân tích ña hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 34 4.1. Phân loại theo hình thái củ Lilium poilanei Gapnep 42 4.2. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến tỷ lệ mọc mầm của củ Lilium poilanei Gapnep 44 4.3. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng chiều cao cây hoa Lilium poilanei Gapnep 47 4.4. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến thời gian ñạt chiều cao tối ña cây hoa Lilium poilanei Gapnep 49 4.5. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái ra lá cây hoa Lilium poilanei Gapnep 51 4.6. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến thời gian ñạt số lá tối ña cây hoa Lilium poilanei Gapnep 53 4.7. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến các thời kỳ sinh trưởng cây hoa Lilium poilanei Gapnep 55 4.8. Một số ñặc ñiểm hình thái cây hoa Lilium poilanei Gapnep 57 4.9. ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu sạch của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep (sau 2 tuần nuôi cấy) 60 4.10. ảnh hưởng của α-NAA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep (sau 8 tuần nuôi cấy) 61 4.11. ảnh hưởng của BA ñến khả năng tái sinh của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii 4.12. ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep 64 4.13. ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến khả năng nhân nhanh của chồi hoa Lilium poilanei Gapnep tái sinh (sau 6 tuần nuôi cấy) 66 4.14. ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng ra rễ của chồi loài hoa Lilium poilanei Gapnep 69 4.15. Số băng ADN thu ñược của 32 giống/loài lily với 3 mồi RAPD 72 4.16. Hệ số tương ñồng di truyền của 27 giống/loài lily nghiên cứu 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Lilium poilanei Gapnep 4 2.2. Sự sắp xếp lá cây hoa lily 7 2.3. Hình dạng bông hoa lily 7 4.1. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến tỷ lệ mọc mầm của củ Lilium poilanei Gapnep 45 4.2. Sự nảy mầm của củ hoa Lilium poilanei Gapnep (CT3) 46 4.3. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng chiều cao cây hoa Lilium poilanei Gapnep 48 4.4. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh ñến ñộng thái ra lá cây hoa Lilium poilanei Gapnep 52 4.5. Sinh trưởng của cây hoa Lilium poilanei Gapnep ở các thời lượng xử lý lạnh khác nhau (sau trồng 14 tuần) 57 4.6. Một số ảnh về hoa Lilium poilanei Gapnep 58 4.7. Sự phát sinh thái của mô vẩy củ hoa Lilium poilanei Gapnep 65 4.8. ảnh hưởng của BA và α -NAA ñến khả năng nhân nhanh của của chồi Lilium poilanei Gapnep tái sinh 67 4.9. ảnh hưởng của BA và α-NAA ñến khả năng nhân nhanh của của chồi Lilium poilanei Gapnep tái sinh 68 4.10. Kết quả ñiện di ADN tổng số tách chiết từ 32 giống/loài lily 70 4.11. ảnh ñiện di sản phẩm PCR với mồi OPA-10 71 4.12. ảnh ñiện di sản phẩm PCR với mồi P615 72 4.13. ảnh ñiện di sản phẩm PCR với mồi P650 72 4.14. Sơ ñồ cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của 27giống/loài nghiên cứu 74 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 1. Mở ñầu 1.1. ðặt vấn ñề Hoa lily là một loài hoa có giá trị kinh tế cao và hiện rất ñược thị trường trong và ngoài nước ưa chuộng. Lily là một trong những cây quan trọng nhất trong ngành công nghiệp hoa của thế giới. Trên thế giới lily ñược trồng ở nhiều nước như Hà Lan, Pháp, Nhật, Úc, Chi Lê... Ngày nay nhu cầu tiêu dùng hoa lily ở nước ta ngày càng cao và ñược tiêu thụ nhiều thứ 2 chỉ sau hoa hồng. Ở Việt Nam, do ñời sống người dân ñược nâng cao nên nhu cầu hoa tươi ngày càng cao, bên cạnh ñó ngành trồng và sản xuất hoa ñang ñặt mục tiêu không chỉ phục vụ nhu cầu trong nước mà còn hướng ra thị trường quốc tế. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2005 diện tích hoa và cây cảnh cả nước có 13189 ha, kim ngạch xuất khẩu ñạt khoảng 13,5 triệu USD dự kiến ñến năm 2010 diện tích hoa cây cảnh ñạt 15000 ha, trong ñó sản lượng hoa ñạt 1,5 tỷ cành, kim ngạch xuất nhập khẩu ñạt 60 triệu USD [1]. Chính vì vậy mà việc trồng và sản xuất một loại hoa cắt như hoa lily ñang ñược chú ý ñầu tư trong những năm gần ñây. Tuy nhiên, thực tế cho thấy rằng hầu hết các giống hoa lily ở Việt Nam ñược nhập từ nước ngoài (phần lớn là từ Trung Quốc, Hà Lan...) với giá thành cao, chất lượng không ñảm bảo và nhất là dễ bị thoái hoá do nấm, vi khuẩn, virus... vì thế năng suất thấp, chất lượng hoa lily giảm, việc sản xuất hoa lily là không chủ ñộng. ðây là những hạn chế trong trồng và sản xuất hoa lily ở nước ta cần tìm ra biện pháp ñể khắc phục. Như chúng ta ñã biết, nguồn gen cây hoa lily trên thế giới rất ña dạng và phong phú, ở nước ta các nhà khoa học ñã tìm thấy một số loài hoa lily rất khác nhau, nhất là các loài hoang dại. Có thể kể ñến ở ñây là các loài như cây Bách Hợp (Lilium brownii F.E Brown) mọc hoang dại trên núi ñá, các ñồi cỏ ở Bắc Thái, Cao Lạng và loài Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 Lilium poilanei Gapnep có ở ñồi cỏ Sa Pa tỉnh Hoàng Liên Sơn (Võ Văn Chi, Dương ðức Tiến, 1978) [2]. Năm 2008, nhà khoa học Julian Shaw ñã mô tả trên tạp chí The Plantsman loài hoa lily mới ở Sa Pa - Lào Cai có tên Lilium arboricola [49]. ðây là những nguồn gen rất có ý nghĩa trong chọn tạo giống. Bởi vì, có một nền di truyền ña dạng, phong phú là tiền ñề tiên quyết ñể dẫn ñến thành công cho bất kỳ một chương trình chọn giống nào. Các thông tin về nền di truyền của các giống là cơ sở quan trọng cho ñịnh hướng tiếp theo. ðối với loài hoa lily khi chúng ta xác ñịnh ñược mối quan hệ di truyền giữa các giống lily với nhau, từ ñó chọn ra ñược những cặp bố mẹ phù hợp dẫn ñến chọn tạo ñược những giống hoa lily có năng suất cao và phẩm chất tốt thích hợp với ñiều kiện khí hậu Việt Nam là vô cùng cần thiết. Xuất phát từ thực trạng nêu trên, nhằm góp phần vào việc nghiên cứu bảo tồn và phát triển hoa lily ở Việt Nam chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu ñặc ñiểm nông sinh học, khả năng nhân giống in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep và ñánh giá ña dạng di truyền nguồn gen chi Lilium” 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích Khảo sát sinh trưởng của hoa Lilium poilanei Gapnep và ñánh giá ña dạng di truyền nguồn gen hoa lily nhằm cung cấp một số dẫn liệu cơ bản về ñặc tính nông sinh học và phân tử phục vụ công tác chọn tạo giống hoa lily mới ở Việt Nam, bước ñầu nghiên cứu nhân in vitro phục vụ bảo tồn, phát triển nguồn gen hoa lily bản ñịa. 1.2.2. Yêu cầu - Khảo sát sinh trưởng, phát triển của củ giống hoa Lilium poilanei Gapnep ñược trồng trong ñiều kiện nhà lưới tại Gia Lâm - Hà Nội. - Xác ñịnh một số khâu trong quy trình nhân giống in vitro (khử trùng, môi trường khởi ñộng, nhân nhanh, tạo rễ). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 - ðánh giá ña dạng nguồn gen hoa lily ở mức phân tử (RAPD). 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của ñề tài Cung cấp các số liệu cơ bản về ñặc tính hình thái, ña dạng di truyền nguồn gen hoa lily ở Việt Nam. Từ kết quả ñó sẽ bổ sung tài liệu tham khảo giảng dạy và nghiên cứu về cây hoa lily. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài Kết quả của ñề tài góp phần cung cấp vật liệu khởi ñầu và các thông tin quan trọng về về ñặc tính hình thái, sinh trưởng và phát triển phục vụ cho chọn tạo giống hoa lily mới ở Việt Nam. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Giới thiệu chung về hoa lily 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố Cây hoa lily thuộc chi Lilium ñã ñược nghiên cứu và thuần hoá gần 100 năm nay từ các loài hoa dại phân bố hầu hết trên các châu lục từ 10- 600 vĩ bắc, ñặc biệt là các vùng ôn ñới và hàn ñới hoặc các vùng núi nhiệt ñới có ñộ cao từ 1200m trở lên như: Hình 2.1. Lilium poilanei Gapnep Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, California (Mỹ) và một số nơi khác. Ngày nay, hoa lily ñược trồng ở rộng rãi trên khắp thế giới (Trần Duy Quý,2004) [19]. 2.1.2. Vị trí phân loại thực vật Trong hệ thống phân loại thực vật, hoa lily ñược xếp vào nhóm một lá mầm (Monocotylendones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (Liliaceae), chi Lilium (Võ Văn Chi, Dương ðức Tiến, 1978) [2]. Nếu phân loại theo khả năng sử dụng thương mại thì chia thành 3 nhóm lớn là Asiatic lily, Oriental lily và Lilium longiflorum (Easter lily) (Rimando.T.J, 2001) [50]. Nhóm Asiatic lily bao gồm các giống hoa màu ñỏ sẫm, cam, hồng, hồng ñào, vàng tươi cho ñến màu kem, màu trắng hay có sọc. Nhóm Oriental lily thì bao gồm các màu trắng, ñỏ thẫm, trắng có nhiều ñốm ñỏ hoặc hồng. Nhóm Easter lily bao gồm các giống hoa có màu trắng. Hiện nay, việc lai giữa nhóm Asiatic lily và Oriental lily với Easter lily nhằm cải thiện các ñặc tính của các giống lai có sẵn ñang là xu hướng trong công tác lai tạo giống lily. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 Chi Lilium (Lilium spp.) bao gồm khoảng 100 loài, ñược phân loại thành 7 nhóm (Veli-Pekka Pelkonen, 2005) [58]. Lớp Loài 1. Nhóm Martagon L. distichum, hansonii, martagon, medeoloides, isingtauense 2. Nhóm American a) L.boladner, columbianum, kelloggii, umboldtii, rubescens, washingtonianum b) L.maritimum, nevadense, occidentale, parryi, parvum, roezlii c) L.canadense, grayi, iridollae, michauxii, michiganense, superbum d) L. catesbacei, philadelphicum 3. Nhóm Candidum L.bulbiferum candidum, carniolicum, chalcedomcum, monadelphun, polyphyllum, pomponium, pyrenaicum. 4. Nhóm Oriental L. auratum, brownii, japonicum, nobilissimum, rubellum, speciosum 5. Nhóm Asiatic a) L. davidii, duchartrei, henryi, lancifolium, lankogencse, leichtlini, papilliferum b) L. amabile, callosum, cernuum, concolor, pumilum c) L. bakerianum, mackliniae, neplense, ochraceum, sempervivoideum, taliense, wardii 6. Nhóm Trumpet a) L. leucanhum, regale, sargentiae, sulphureum b) L. lormosanum, longiflorum, nedgherrense, philimg/lense, wallichianum 7. Nhóm Dauricum L. danricum, maculatum ðến năm 2008 ở nước ta ñã phát hiện ñược 3 loài hoa lily là: Lilium brownii F.E Brown (Bắc Thái, Cao Lạng), Lilium poilanei Gapnep và Lilium arboricola (Sa Pa - Lào Cai). Trong sản xuất hiện nay ở nước ta chủ yếu trồng hoa loa kèn Lilium longiflorum Thunb. ðây là giống ñược nhập nội vào Việt Nam từ rất lâu do Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 người Pháp du nhập vào từ thế kỉ XIX, gần ñây có một số giống hoa lily màu nhập nội ñang ñược trồng thử nghiệm ở Sa Pa, ðà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng và cho hiệu quả kinh tế cao. 2.1.3. ðặc ñiểm thực vật học cây hoa lily Cây hoa lily thuộc loại cây thân thảo một lá mầm và là cây lâu năm, gồm 2 phần: phần dưới mặt ñất (thân vảy, rễ), phần trên mặt ñất (lá, thân). 2.1.3.1. Thân vảy Thân vảy cây hoa lily là phần phình to của thân tạo thành. Trên ñĩa thân vảy có vài chục vảy hợp lại, vảy có dạng hình cầu, hình dẹt, hình trứng dài, hình elíp. Thân vảy không có vỏ bao bọc, có màu sắc, số lượng vảy tuỳ giống. 2.1.3.2. Rễ Gồm 2 loại: rễ thân hay còn gọi rễ trên và rễ gốc còn gọi là rễ dưới. Rễ thân do phần thân mọc dưới ñất sinh ra, có chức năng nâng ñỡ thân, hút dinh dưỡng, nước. Rễ gốc ñược sinh ra từ gốc thân vảy, có nhiều nhánh, sinh trưởng khoẻ, chức năng chủ yếu hút nước, dinh dưỡng. 2.1.3.3. Lá Lá sắp xếp trên thân có thể xen kẽ, ñối diện hoặc vòng xoắn. Lá có dạng hình kim, xoè hoặc thuôn, hình giải, ñầu lá hơi nhọn, lá mềm có mầu xanh bóng. Kích thước lá tuỳ từng giống. ðối Vòng Xen kẽ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 Hình 2.2. Sự sắp xếp lá cây hoa lily 2.1.3.4. Hoa Mọc ñơn lẻ hoặc xếp ñặt trên trục hoa, bao hoa hình lá nhỏ. Hoa chúc xuống, vươn ngang hoặc hướng lên tuỳ giống, ñây là ñặc ñiểm cơ bản ñể phân loại giống, ví dụ: hoa các giống Lilium formolongo có hoa hướng lên, hoa các giống Lilium longiflorum có hoa vươn ngang. Hoa có nhiều màu sắc ña dạng và phong phú, có mùi thơm quyến rũ. Hình 2.3. Hình dạng bông hoa lily 2.1.3.5. Quả, hạt Quả lily là quả nang hình trứng dài, có 3 góc và 3 nang, có tới vài trăm hạt. Hạt lily hình dẹt, xung quanh có cánh mỏng, hình bán cầu, hoặc 3 góc, hoặc vuông dài. ðộ lớn, số lượng, trọng lượng hạt tuỳ giống. 2.1.4. ðặc ñiểm sinh trưởng, phát triển và yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh 2.1.4.1. ðặc ñiểm sinh trưởng, phát triển ðối với loại có hạt mọc nhanh như các giống thuộc nhóm Asiatic và Trumpet, trong ñiều kiện tốt có thể nẩy mầm sau khoảng 14 ngày hoặc sớm hơn, lá thật sẽ xuất hiện trong 4 tuần hoặc hơn. ðối với loại có hạt mọc chậm như các giống thuộc nhóm Oriental và Martagon có 2 giai ñoạn nẩy mầm. Giai ñoạn ñầu thích hợp ñiều kiện ấm áp, kéo dài khoảng 3 tháng, củ nhỏ xuất Dạng buông thõng Dạng uốn ngược Dạng phẳng Dạng bát Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 hiện sau khoảng 2 tháng. Giai ñoạn sau thích hợp với ñiều kiện lạnh kéo dài từ 2 ñến 3 tháng, lá thật xuất hiện sau ñó từ 1 ñến 2 tuần. Củ hoa lily vùi trong ñất khoảng 2 tuần thì nẩy mầm tuy nhiên trong trường hợp xử lý lạnh không ñầy ñủ hoặc trời lạnh, thời gian nẩy mầm có thể kéo dài ñến 5 tuần. Các giống khác nhau có mức ñộ chênh lệch khá lớn về thời gian sinh trưởng. Sau khi mọc, sự sinh trưởng và phát dục có thể chia ra năm giai ñoạn là phát triển trục thân, ra nụ, nở hoa, kết hạt, chết khô (ðặng Văn ðông, ðinh Thế Lộc, 2004) [3]. Chiều cao cây ñược quyết ñịnh bởi số lá và chiều dài ñốt, số lá chịu ảnh hưởng bởi chất lượng củ giống, ñiều kiện và thời gian xử lý lạnh củ giống, thường thì số mầm lá ñược quyết ñịnh trước khi trồng vì vậy chiều cao cây chủ yếu ñược quyết ñịnh bởi chiều dài ñốt. ðiều kiện ánh sáng yếu, ngày dài, nhiệt ñộ thấp và xử lý bảo quản lạnh lâu ñều có tác dụng kéo dài ñốt thân, ngược lại ánh sáng mạnh, ngày ngắn nhiệt ñộ cao, ức chế ñốt kéo dài. 2.1.4.2. Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh * Nhiệt ñộ: Nhìn chung cây hoa lily chịu lạnh khá, chịu nóng kém, nhiệt ñộ thích hợp ban ngày khoảng 20-250C, ban ñêm khoảng 120C, thời gian ñầu nhiệt ñộ thấp có lợi cho ra rễ và phân hoá hoa. * Ánh sáng: Hoa lily ưa cường ñộ ánh sáng trung bình. Chiếu sáng ngày dài ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng và phát dục của hoa. * ðộ ẩm: ðất quá ẩm hoặc quá khô ñều ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển của hoa lily, ñộ ẩm thích hợp 70 - 80%. ðộ ẩm không khí thích hợp là 80 - 85%, nếu quá lớn dễ gây thối củ và thối rễ. * ðất: ðất trồng lily có thành phần cơ giới nhẹ, ñất xốp, nhiều mùn, ñộ ẩm vừa phải, thoát nước nhanh nhưng giữ ẩm tốt. Loại ñất thích hợp nhất ñó là ñất phù sa và ñất thịt nhẹ giàu chất hữu cơ, ñất trung tính pH = 6.5 - 7. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 2.1.5. Tổ chức gen của cây hoa lily Lily là một trong những loài có kích cỡ gen rất lớn. Ví dụ như: ADN của Lilium henryi chứa 32 tỷ cặp bazơ, một số loài có số cặp bazơ tăng lên 100 tỷ cặp (Bennet, M.D and Smith, J.B 1976) [31]. Như vậy có sự khác nhau trong kích cỡ bộ gen giữa các loài (Siljak- Yakovlev etal, 2003) [51]. Bộ gen của lily ñược xắp xếp trong các NST ñơn và NST kép. Thể ñơn bội số nhiễm sắc thể là 12 và không thay ñổi giữa các giống. Lilium trong tự nhiên thì hầu hết là lưỡng bội (2n=24) nhưng có một vài loài có thể tam bội (3n=36) không có khả năng sinh sản. Tất nhiên thể tứ bội có tìm thấy và thường là sinh sản tốt [8]. Khi kỹ thuật nhân giống ñã phát triển, sản xuất cây tứ bội ñã ñược thực hiện một cách nhân tạo bằng xử lý hạt hoặc củ của cây lưỡng bội với colchicines. Dạng tứ bội ñã ñược chứng minh là bền vững hơn trong tập tính sinh trưởng, có cấu trúc tế bào dày hơn và khả năng chống bệnh cao. Khi lai với thể lưỡng bội chúng sinh ra con lai thể tam bội (McRae Edward Austin, 1998) [46]. Nói chung, kích cỡ gen và cấu trúc của nó là rất ổn ñịnh trong giống, thông thường thể lưỡng bội số nhiễm sắc thể chiếm ưu thế trong các loài, cây lai hoặc cây trồng. 2.2. Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới Với ưu thế là một loài hoa ñẹp và ñược ưa chuộng ở nhiều nơi trên thế giới vì vậy hoa lily ñược trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới với diện tích không ngừng ñược mở rộng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 Bảng 2.1. Diện tích trồng hoa lily ở một số nước năm 2005-2006 STT Nước Diện tích (ha) 1 Hà Lan 3699 2 Nhật Bản 189 3 Pháp 420 4 Mỹ 170 5 New zealand 110 6 úc 25 7 Isael 100 8 Chilê 240 9 Achentina 200 10 Trung Quốc 200 11 Nam Phi 20 Tổng 5173 (Nguồn: Trung tâm củ giống hoa Quốc tế) Một trong những nước ñứng ñầu trong sản xuất hoa lily trên thế giới hiện nay là Hà Lan. Năm 1997, tổng diện tích trồng hoa lily của Hà Lan là 356 ha, ñến năm 2006 thì diện tích này ñã là 3699 ha diện tích này ñứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ sau hoa tuylip. Hoa lily ñược phát triển mạnh trong những năm gần ñây là do người Hà Lan ñã tạo ra ñược rất nhiều giống hoa mới có hoa ñẹp, chống chịu sâu bệnh tốt và cho năng suất cao. Bên cạnh ñó do kỹ thuật ñiều khiển ra hoa của người Hà Lan ñã phát triển rất nhanh và có thể ñiều khiển cho hoa ra ñược quanh năm. Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15-20 giống mới, sản xuất 1315 triệu củ giống lily, cung cấp cho nhiều nước trên thế giới (ðặng Văn ðông, ðinh Thế Lộc, 2004) [3]. Ở Italia tổng diện tích trồng hoa là trên 8000 ha (1996) thì hoa lily chiếm từ 280-300 ha, với tổng sản lượng thu ñược ñạt giá trị 71 triệu USD. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 Toàn bộ củ giống, ước tính khoảng 152 triệu củ, dùng trong sản xuất hoa cắt ñược nhập khẩu chủ yếu từ Hà Lan, khoảng 70% là giống Lilium elegans, 20% là giống lai phương ñông và 10% là giống Lilium longiflorum (Grassotti. A,1996) [38]. Ở Châu Á hiện nay thì Trung Quốc là nước phát triển mạnh mẽ việc sản xuất hoa lily với nhiều vùng trồng hoa rộng lớn như ở: Thượng Hải, Bắc Kinh, Cam Túc, Vân Nam, Tứ Xuyên. Trong ñó Vân Nam ñược mệnh danh là vương quốc hoa của Trung Quốc ñứng ñầu về diện tích và sản lượng hoa cắt cành của cả nước. Hiện nay diện tích hoa lily cắt cành ở ñây là 450 ha, sản lượng là 2201 triệu cành, diện tích sản xuất củ giống là 120 ha, sản lượng là 2600 triệu củ. Hoa lily ở ñây thường ñược tiêu dùng trong nước và xuất khẩu sang một số nước thuộc khu vực ðông Nam Á và Nhật Bản. Nhật Bản là nước sản xuất hoa lớn ở Châu Á với diện tích là 4600 ha (1992), trong ñó diện tích hoa lily chiếm 508 ha, ñứng ở vị trí thứ tư sau hoa hồng, hoa cẩm chướng và hoa cúc. Hàn Quốc cũng là quốc gia có thế mạnh trong nghề trồng hoa, lượng hoa xuất khẩu của Hàn Quốc lớn nhất khu vực ðông Bắc Á. Theo thống kê năm 2002, Hàn Quốc có 15000 ha trồng hoa với 1,2 vạn người tham gia, giá trị sản lượng ñạt 700 triệu USD, gấp 8 lần năm 1989. Trong ñó, hoa lily là loại hoa có hiệu quả kinh tế cao nhất trong các loại hoa ở ñây. Ngoài ra còn phải kể ñến một quốc gia có công nghệ sản xuất hoa lily cắt cành rất tiên tiến ñó là ðài Loan. Năm 2001 nước này trồng 490 ha hoa lily, trong ñó xuất khẩu hoa lily cắt cành ñạt 7,4 triệu USD. Kênia là nước sản xuất hoa chủ yếu của Châu Phi và là nước xuất khẩu hoa tươi lớn nhất của châu lục này. Hiện nay, nước này có tới 3 vạn nông trường với hơn 2 triệu người trồng hoa, chủ yếu là hoa phăng, hoa lily, hoa hồng. Mỗi năm nước này xuất khẩu sang Châu Âu 65 triệu USD, trong ñó chỉ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………12 riêng hoa lily ñã chiếm 35% (ðặng Văn ðông, ðinh Thế Lộc, 2004) [3]. Ngoài các nước kể trên thì còn nhiều nước khác cũng có diện tích trồng hoa lily lớn là: ðức, Pháp, Mêhicô, Israel… Những năm qua, nhờ áp dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống kết hợp với công nghệ sinh học hiện ñại, trên thế giới ñã tạo ra hàng nghìn giống hoa lily thương phẩm với ñủ kích thước, màu sắc, kiểu dáng và hương thơm dịu mát, quyến rũ. Có thể nói, hiện nay hoa lily là một trong những loại hoa chiếm vị trí quan trọng trong các nhóm hoa cắt cành ở các nước tiên tiến. 2.2.2. Tình hình sản xuất hoa lily ở Việt Nam Việt Nam có ñiều kiện khí hậu, thổ nhưỡng thuận lợi ñể có thể trồng ñược nhiều loại hoa và cây cảnh. Sản phẩm hoa và cây cảnh có vai trò quan trọng trong cuộc sống khi thu nhập và nhu cầu thẩm mỹ của người dân ngày càng cao. Thị trường trong nước rộng lớn và phong phú, bên cạnh ñó tiềm năng xuất khẩu cũng ñầy hứa hẹn, hoa và cây cảnh Việt Nam nếu tổ chức tốt từ khâu sản xuất, quảng bá ñến tiêu thụ sẽ tạo ra tiềm lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Việt Nam trong tiến trình chuyển ñổi cơ cấu cây trồng. Hiện nay, ở nước ta hoa lily mới chỉ ñược trồng ở một số tỉnh thành phố có nghề trồng hoa phát triển: ðà Lạt, Thành Phố Hồ Chí Minh, Hà Nội, Hải Phòng... So với các chủng loại hoa khác thì hoa lily chiếm tỷ lệ về diện tích và số lượng còn nhỏ. Nước ta hình thành những vùng sản xuất hoa lily chính là: * Vùng ñồng bằng sông Hồng: Với khí hậu bốn mùa, ñây là vùng thích hợp cho trồng hoa. Hà Nội ñược ñánh giá là có vùng trồng hoa lớn nhất tại huyện Từ Liêm với diện tích 500 ha trong ñó xã Tây Tựu có 330 ha (chiếm 66% diện tích trồng hoa toàn huyện) chủ yếu là trồng hoa hồng, hoa cúc, hoa ly, hoa ñồng tiền...Ngoài ra hoa lily ñược trồng rải rác ở cả 11 tỉnh khác như: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………13 Vĩnh Phúc, Thái Bình, Quảng Ninh, Hưng Yên... với diện tích khoảng trên 10 ha, chủ yếu mới chỉ cung cấp cho tiêu dùng trong vùng và một phần nhỏ ñể xuất khẩu. * Vùng các tỉnh phía Nam: Tập trung nhiều tại TPHCM với diện tích hoa cây cảnh hiện có 700 ha, tập trung ở 8 quận huyện như quận 12 (110 ha), Thủ ðức (87 ha), nhiều nhất là Củ Chi (131 ha) với khoảng 1400 hộ sản xuất hoa, cây cảnh. Các giống hoa cao cấp như lily, hồng môn, lay ơn giống mới, hoa ñồng tiền giống mới, thiên ñiểu, tulip ñang ñược ưa chuộng. * Vùng ðà Lạt: vùng này có diện tích trồng hoa không lớn nhưng lại là nơi sản xuất hoa nổi tiếng của cả nước. ðây là nơi có khí hậu ôn ñới trong vùng nhiệt ñới chung của cả nước. Lịch sử hình thành vùng ðà Lạt gắn liền với quá trình phát triển nông nghiệp. ðà Lạt ñược coi là một vùng nông nghiệp ñặc sản chuyên sản xuất các loại hoa phù hợp với ñiều kiện thời tiết, khí hậu, ñất ñai. Ở ñây ñã xuất hiện nhiều công ty liên doanh với nước ngoài sản xuất hoa tại Việt Nam. ðiển hình là công ty ðà Lạt Hasfarm, công ty này bắt ñầu công nghệ trồng hoa trong nhà kính từ năm 1994 và hiện nay vẫn ñang tiếp tục mở rộng diện tích sản xuất. ðà Lạt Hasfarm là công ty ñầu tiên ở Lâm ðồng áp dụng công nghệ này. Sản phẩm chính của ðà Lạt Hasfarm là hoa cắt cành, gồm hoa hồng, cúc, lily, cẩm chướng, ñồng tiền...Trong số 20 ha trồng hoa của Hasfarm, hoa lily chiếm khoảng 4 ha, mỗi năm sản xuất 2 vụ, thu ñược khoảng 3 triệu bông phục vụ cho nội ñịa và xuất khẩu. Tuy nhiên, công ty ðà Lạt Hasfarm ñộc quyền và không chuyển giao bất cứ một kỹ thuật trồng trọt nào về hoa lily cho bất cứ một cơ sở nào trong nước vì họ muốn chiếm lĩnh thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước. ðà Lạt hiện ñang có diện tích trồng hoa lily nhiều nhất so với các ñịa phương khác trên cả nước (chiếm khoảng 8% trong tổng diện tích trồng hoa). Tình hình phát triển hoa lily ở ðà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu ñãi cho sự phát Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………14 triển của các giống hoa nói chung và cho hoa lily nói riêng, một phần do kỹ thuật trồng hoa lily của ðà Lạt tương ñối cao nên sinh trưởng phát triển khá tốt. Hiện nay, hoa lily là một trong những loại hoa ñem lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho một số công ty hoa ở ðà Lạt. Theo ñề án phát triển rau quả và hoa cây cảnh ñến năm 2010, tầm nhìn 2020 thì nước ta sản xuất rau hoa quả phải trên cơ sở áp dụng công nghệ cao, trước hết phải thực hiện quy trình sản xuất theo hướng thực hành nông nghiệp tốt (GAP) bảo ñảm vệ sinh an toàn thực phẩm, cạnh tranh với hàng hóa nhập khẩu ngay tại thị trường trong nước và ñẩy mạnh xuất khẩu. Trong thời kỳ 2010-2020, ngoài ñáp ứng nhu cầu nội ñịa, kim ngạch xuất khẩu của rau hoa quả Việt Nam phấn ñấu ñạt 1,2 tỷ USD/năm [1]. 2.3. Tình hình nghiên cứu về xử lý nhiệt ñộ thấp ñối với cây hoa lily 2.3.1. Cơ sở khoa học về ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình ra hoa ở cây trồng Có rất nhiều thực vật mà yếu tố nhiệt ñộ ảnh hưởng rất sâu sắc ñến sự khởi ñầu và phát triển của cấu trúc sinh sản. Với những cây hàng năm thì ảnh hưởng._. của nhiệt ñộ ñến sự ra hoa thường là thứ yếu sau ảnh hưởng của quang chu kỳ. Nhưng với cây hai năm thì ngược lại: trong năm ñầu chúng duy trì trạng thái dinh dưỡng, năm sau khi trải qua một thời gian lạnh dài thì chúng ra hoa. Nếu thực vật này không ñược tác ñộng bởi nhiệt ñộ thấp thì phần lớn chúng ñược giữ lại ở trạng thái sinh trưởng sinh dưỡng không xác ñịnh. Người ta ñã chứng minh rằng phần lớn những cây hai năm khi ñược xử lý lạnh nhân tạo và kèm theo quang chu kỳ thích hợp thì chúng có thể ra hoa ngay trong mùa sinh trưởng ñầu tiên, tức là có thể biến cây hai năm thành cây một năm bằng biện pháp xử lý lạnh. Từ lâu người ta ñã chứng minh rằng cơ quan tiếp nhận phản ứng nhiệt ñộ là ñỉnh sinh trưởng của thân. Chỉ cần ñỉnh sinh trưởng chịu tác ñộng của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………15 nhiệt ñộ thấp cũng có thể gây nên sự phân hoá mầm hoa. Như vậy, ñối với sự cảm nhận quá trình xuân hoá có các tế bào ñang phân chia của ñỉnh sinh trưởng. Giới hạn tác ñộng của nhiệt ñộ thấp và thời gian tiếp xúc có hiệu quả thay ñổi tuỳ theo từng loại thực vật, tức là tuỳ theo mức ñộ mẫn cảm của cây với nhiệt ñộ cảm ứng nói chung với ña số thực vật nhiệt ñộ từ 0-150C là có hiệu quả xuân hoá. ðộ tuổi mẫn cảm với xuân hoá cũng thay ñổi theo từng loài thực vật. Về bản chất của quá trình ra hoa ở thực vật ñã có hai nghiên cứu riêng biệt về việc nở hoa của Sibum Sung, Richard M. Amasino và Caroline Deans. Những nghiên cứu này ñược tiến hành ñộc lập ñể tìm hiểu sự phát triển của hoa ở mức ñộ phân tử và nhằm phát hiện ra cơ chế ngăn cản cây cải thìa Arabidopsis thaliana không ra hoa cho tới tận mùa xuân. Caroline Dean và cộng sự (2004) [33] nghiên cứu gen VRN1 và VRN2 có trong gen nở hoa FLC (flowering locus C) - một sản phẩm protein ngăn chặn sự ra hoa bằng cách kiềm chế nhiều gen cần cho quá trình nở hoa. Trong khi ñó Sung và Amasino (2004) [52] lại xác ñịnh gen khác là VIN3. Ba gen trên là do gen FLC kiểm soát và là các gen trong số nhiều gen cần thiết cho việc nở hoa của cây. Gen FLC cũng kiểm soát thời ñiểm thực vật nở hoa, ñặc biệt là ñộ dài của ngày, tuổi của cây và các yêu cầu về quá trình xuân hoá. Trong mùa lạnh sự thể hiện của gen FLC ở mức thấp và thậm chí ở mức thấp này cho tới khi thời tiết ấm trở lại. Sung và Amasino ñã xác ñịnh ñược gen có liên quan tới việc ño thời gian chịu lạnh và bắt ñầu tình trạng xuân hoá. Họ kết luận rằng sự kích hoạt quá trình xuân hoá thay ñổi trong các protein histone (các thành phần của chất nhiễm sắc) xung quanh gen FLC và VRN1, VRN2, VIN3 lặp lại những thay ñổi này. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………16 2.3.2. Một số kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp ñến quá trình ra hoa cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam * Trên thế giới ñã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới sự ra hoa của cây hoa lily. Trong ñó xử lý lạnh củ giống ñuợc xác ñịnh là ñiều kiện tiên quyết ñể ñiều tiết ra hoa. Củ giống lily có tập tính ngủ nghỉ, củ mới ñào lên không thể nảy mầm, phải trải qua một thời gian rất dài mới có thể nảy mầm, nhưng nảy không ñều. Xử lý lạnh phá vỡ ngủ nghỉ mới có thể nảy mầm ñược. Có thể kể ñến một số kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự sinh trưởng phát triển của cây hoa lily như sau: Nghiên cứu của Lee.J và cộng sự (1996) [43] ñã xác ñịnh ñiều kiện thuận lợi, thời gian xuân hoá cho các dòng mới của cây lai Asiatic (Lilium X elegans Thunb.) Kết quả cho thấy thời gian ñể cho hình thành chồi và hoa nở giảm khi khoảng thời gian của sự xuân hoá củ tăng. Xử lý lạnh hơn 4 tuần thì sớm xuất hiện chồi và hoa, 100% hoa nở và tăng số bông trên cành. Chiều cao cây, chiều dài và ñường kính hoa không chỉ rõ mối quan hệ với sự xuân hoá, mặc dù có sự phản ứng khác nhau giữa các dòng. Liên tiếp xử lý lạnh (5+21+5 trong 2 tuần ở mỗi nhiệt ñộ) ñã cho củ không ra hoa sớm, số hoa hình thành so với ñối chứng (không xuân hoá) là như nhau. Kết quả nghiên cứu của Choi S.T và cộng sự (1998) [34] khi nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng thời lượng xử lý lạnh và ñộ sâu trồng cây với sinh trưởng và nở hoa của Lilium spp. Ông ñã kết luận rằng củ Lilium gelra và Lilium casablanca cho chất lượng hoa cắt cao, nếu ñược trồng sâu (vùi sâu 3 hoặc 6 cm) sau khi ñược xử lý lạnh 60 và 90 ngày. Củ Lilium joladan và Lilium dremadan nẩy mầm tốt nếu trồng nông (ñể lộ 1/2 củ) sau khi xử lý lạnh 75 ngày. Như vậy tuỳ thuộc từng giống mà có thời gian xử lý lạnh và ñộ sâu trồng phù hợp khác nhau. Erwin J.E và Engelen - Eigles G (1998)[37] nghiên cứu sự ngủ nghỉ và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………17 tính thuần thục trên củ Lilium longiflorum cv. Nellie While. Kết quả cho thấy sự ngủ nghỉ và tính thuần thục là 2 hiện tượng tách rời và ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ khác nhau. ðộ chín thuần thục của củ là khác nhau trong 2 năm trồng. Củ chín thuần thục là củ trải qua nhiệt ñộ lạnh dưới 160C trước 6 tuần, quá trình xuân hoá sẽ quyết ñịnh số lá cuối cùng và sự nở hoa nhưng chỉ khi củ còn non thì không dễ phản ứng với xuân hoá. Biểu hiện nhiệt ñộ xuân hoá và thời gian xuân hoá sẽ thay ñổi trên cơ sở năm của củ chín thuần thục ñạt ñược khi hình thái không thay ñổi. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ và ñiều kiện chiếu sáng của Niimi Y và cộng sự (1999) [49] tới sự tái sinh và phát triển của vẩy củ ñã ñược tiến hành trên 7 loài Lilium spp. Kết quả nghiên cứu cho thấy: ñể củ của 7 loài Lilium (Lilium rubellum Baker, Lilium speciosum Thunb.'Uchida', Lilium nobilissimum Makino, Lilium formosanum Wallace, Lilium longiflorum Thunb. 'Hinomoto', Lilium maculatum Thunb. và Lilium asiatic hybrid X 'Benisugata') trong 10 tuần ở nhiệt ñộ 150C hoặc 250C dưới ñiều kiện chiếu sáng liên tục (1000-1200 lux) hoặc tối. Hầu hết củ ñược hình thành ở 250C nhiều hơn ở 150C. Củ ñược hình thành hầu hết ở sáng tốt hơn ở tối và ánh sáng kích thích sự hình thành vẩy. ðối với Lilium nobilissimum củ hình thành từ vẩy lá dưới mọi ñiều kiện. Tất cả các loại củ hình thành sinh trưởng tốt ở 250C. Củ ñược hình thành sinh trưởng tốt nhất là Lilium formosanum, Lilium maculatum ở trong tối, Lilium rubellum và Lilium nobilissimum dưới ánh sáng, giống nhau là Lilium speciosum và Lilium asiatic hybrid X 'Benisugata' dưới ánh sáng hoặc trong tối. Củ hình thành ở 150C bị hỏng trong suốt thời lượng xử lý lạnh so với những củ hình thành ở 250C và mọc mầm thường muộn hơn sau khi trồng ở nhà kính. Bên cạnh việc xử lý củ lily thu ñược từ ruộng trồng thì củ lily in vitro cũng là một ñối tượng ñược rất nhiều các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Trên ñối tượng này Yae B.W (2001) [60] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………18 ñường saccaroza trong nuôi cấy in vitro, kích thước củ trong ngủ nghỉ và sinh trưởng của củ sau in vitro. Củ in vitro của Lilium oriental hybrid “Casa Blanca” ñược ñưa vào nhiệt ñộ thấp 50C và cây trồng trong nhà lưới trong thời gian 2 tuần. Hơn 95% lá ñược hình thành sau 6 tuần ñược theo dõi ở 50C ở củ trồng trong 3% saccaroza, 10 tuần trong 6% saccaroza và 12 tuần trong 9% saccaroza. Xử lý với GA3, GA4+7, và BA không có ảnh hưởng trong phá ngủ của củ. Tuy nhiên, xử lý lạnh cho kết quả phá vỡ sự ngủ nghỉ của củ. Tốc ñộ xuất hiện lá của củ tăng khi thời gian lạnh ñược kéo dài. 50% ñộ ẩm trong ñất suốt giai ñoạn lạnh là thích hợp cho sự tồn tại của củ và sự xuất hiện của lá. Rimando. T.J (2001) [50] cho biết ñiều kiện tốt nhất và thường sử dụng ñể xuân hoá củ giống là xử lý nhiệt ñộ thấp 50C trong 6-8 tuần. Củ không xuân hoá vẫn có thể nở hoa nhưng tốc ñộ sinh trưởng và sự nở hoa chậm. Sau khi xử lý lạnh củ Lilium longiflorum ñem trồng ở nhiệt ñộ cố ñịnh 160C (ñêm) và 210C (ngày) thì hoa nở sau trồng 110-120 ngày. Hoa xuất hiện ñầu tiên 5-6 tuần sau trồng khi thân cao khoảng 10-15cm. ðiều kiện tốt nhất cho Lilium longiflorum là khoảng 200C, thay ñổi 13-230C cho các loài lily khác nhau. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ cất giữ củ ñối với sự hình thành nụ hoa và sự phá ngủ ñã ñược Suzuki S, Kanahama K (2002) [53] tiến hành trên 3 giống lily lai:‘Morino-otome’, ‘Morino-sei’ và ‘Morino-roman’ là kết quả của phép lai Lilium X formolongi X Lilium rubellum. Khi củ của 3 giống ñược ñể ở nhiệt ñộ từ 50C ñến 210C trong 8 tuần. Nhiệt ñộ thuận lợi cho hình thành nụ hoa của cây là khoảng 130C, nó thấp hơn của Lilium rubellum. * Ở Việt Nam các nghiên cứu về phản ứng xuân hoá thực hiện trên nhiều ñối tượng khác nhau. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp trên ñối tượng hoa lily ñã ñược tiến hành. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1987) [4] ñã tiến hành nghiên cứu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………19 ảnh hưởng của xử lý nhiệt ñộ thấp và Gibberellin ñến sự sinh trưởng phát triển của cây hoa loa kèn trắng. Kết quả cho thấy việc xử lý nhiệt ñộ thấp 100C (liên tục trong 40 ngày) và Gibberellin ñã làm cho cây sinh trưởng phát triển nhanh, rút ngắn thời gian ra hoa hàng tháng. ðây là nghiên cứu có ý nghĩa trong việc trồng và sản xuất hoa loa kèn trắng. Cụ thể hơn về ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp ñến sinh truởng phát triển, Cao Ngọc Thuý và Hoàng Minh Tấn (1997) [5] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt ñộ thấp ñến sinh trưởng phát triển và hiệu quả kinh tế của hoa loa kèn trắng Lilium longiflorum hance. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xử lý nhiệt ñộ thấp 50C trong 20 ngày ñã rút ngắn thời gian sinh trưởng từ 175 ngày (ñối chứng) xuống 107 ngày và chất lượng hoa giảm sút không nhiều. Nguyễn Mạnh Khải, Nguyễn Quang Thạch (1999) [6] ñã xử lý nhiệt ñộ thấp 50C củ giống hoa Lilium longiflorum thu thập từ Nam ðịnh trong 3 tuần. Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thước củ dùng ñể xử lý (ñường kính 2,5 cm ñến 4,5 cm) củ càng nhỏ mọc mầm càng sớm, ra nụ sớm, thu hoạch hoa sớm và tập trung hơn so với củ to. Tuy nhiên, củ càng nhỏ thì chất lượng hoa càng thấp (chiều cao, ñường kính thân, số mỏ hoa trên một cành, kích thước mỏ, tuổi thọ bảo quản trung bình ñều thấp hơn so với củ to). Hoàng Thị Thuý Nga, Nguyễn Quang Thạch (2006) [7] ñã nghiên cứu phản ứng xuân hoá và phản ứng sáng của giống hoa Lilium fomolongo. Kết quả cho thấy việc xử lý nhiệt ñộ thấp (4-50C) có tác ñộng làm rút ngắn thời gian ngủ nghỉ từ 55,36 - 43,80 ngày. Thời lượng xử lý nhiệt ñộ thấp thích hợp là 40 ngày có thể phá ngủ hoàn toàn ñược. Tiếp tục nghiên cứu trên giống hoa loa kèn trắng Lilium formolongo, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2007) [8] ñã nghiên cứu phản ứng xuân hoá của củ giống kết quả cho thấy xử lý củ giống trước khi trồng ở nhiệt ñộ 40C trong 45 ngày thì cây sẽ sinh trưởng tốt nhất, tổng thời gian sinh trưởng là Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………20 161 ngày, chất lượng hoa ñủ tiêu chuẩn xuất khẩu trong khi ñó công thức không xử lý lạnh có tổng thời gian sinh trưởng là 295 ngày. Qua ñây có thể thấy rằng các nghiên cứu về xử lý nhiệt ñộ ñối với cây lily ñã cho kết quả tích cực, những kết luận này có thể ñem vào ñể áp dụng trong trồng và sản xuất loài hoa này. 2.4. Ứng dụng nuôi cấy in vitro trên cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho cây hoa lily nhằm tạo ra những cây con ñồng nhất về kiểu gen với số lượng lớn mà các phương pháp nhân giống vô tính thông thường khác không thể có ñược. Có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau của cây hoa lily ñể làm vật liệu khởi ñầu trong nuôi cấy in vitro như meristem, vảy củ, ñoạn thân... Asjes và cộng sự (1974) [14] ñã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem ñể tạo ra các giống hoa lily hoàn toàn sạch virus ở Hà Lan. Tiếp theo ñó Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1979) cũng ñã thành công trong việc sử dụng ñỉnh sinh trưởng ñể nuôi cấy. Ngoài ra nhiều bộ phận khác cũng ñược sử dụng ñể nuôi cấy như ñoạn thân (Sheridan,1968); nhị và cánh hoa (Takayama và Miawa, 1979) [14]. Sử dụng vẩy củ làm vật liệu khởi ñầu trong nuôi cấy ñã ñược nghiên cứu bởi nhiều tác giả Robb (1957), Hackett (1969), Allen (1974), Simmondds và Cumming (1976), Stimart và Ascher (1978), Van Aartrijk và Blom- Barnhoorn (1977)... Cho ñến nay thì vẩy củ là một nguồn nguyên liệu chủ yếu trong việc nuôi cấy mô khi sản xuất cây giống hoa lily do việc sử dụng vây củ rất tiện lợi, dễ thành công và có hiệu quả cao hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ phận khác của cây hoa lily ñể nuôi cấy [14]. Cùng với việc nghiên cứu khả năng cảm ứng từ vẩy củ của hoa lily thì nhiều tác giả trên thế giới ñã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số ñiều Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………21 kiện và yếu tố môi trường trong việc nhân nhanh in vitro như mức ñộ gây tổn thương cho mô (Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn, 1984), ñiều kiện nhiệt ñộ ánh sáng (Niimi và Onozawa, 1979), thành phần môi trường dinh dưỡng (Slimart và Ascher,1978) [14]. Gautheret (1969) [14] quan sát thấy hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng ñóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phân chia của mô hoa lily nuôi cấy. Các tác giả Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984)[57] ñã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy hoa lily là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm ñi một nửa. Các ông cũng chứng minh rằng việc bổ sung nicotinic acid, pyridoxin HCl và glicin là không cần thiết ñối với việc nhân giống mô hoa lily, trong khi thiamin HCl và meso inositol lại ñóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy (Barz và Nicolas, 1978 [32]; Murashige, 1974 [45]). ðường saccaroze ñóng một vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro, ñiều này ñã ñược chứng minh bởi nhiều tác giả. Takayama và Misawa (1979) [5] ñã chứng minh ñược môi trường có bổ sung 15% ñường Saccaroze ñã làm giảm sự hình thành chồi và sinh trưởng của nụ hoa lily trong nuôi cấy vẩy củ in vitro. Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] cũng ñã tìm thấy hàm lượng ñường từ 3-4% làm tăng cả về hệ số nhân chồi cũng như trọng lượng của củ hoa lily trong nuôi cấy. Giảm hàm lượng ñường xuống dưới 3% ñã hạn chế các chỉ tiêu trên. Torres - K (1985) [56] cho rằng nồng ñộ ñường saccaroze hoặc glucoze từ 40 - 60g/l là thích hợp nhất cho sự hình thành chồi ñối với 2 giống Saintpaulia và Agrostis. Nhìn chung các loại ñường khác nhau và hàm lượng của chúng trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22 môi trường là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến sự phát sinh cơ quan và sự nhân nhanh. Các nghiên cứu của Zaghmout-O, Lorres-K [63] trên giống Lilium longiflorum Harson chỉ ra rằng Glucoze, xylose, maltoze, lactoze có tác dụng làm tăng trọng lượng tươi của củ cũng như kích thích sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo. Ảnh hưởng của lactose, galactoze và fructoze tuy có kém hơn song vẫn cho kết quả tốt hơn nhiều so với ñối chứng không có ñường. Một yếu tố không thể thiếu và mang tính quyết ñịnh trong nhân nhanh in vitro phải kể ñến sự có mặt của các chất ñiều tiết sinh trưởng. Theo Murashige (1962) [47] thì quá trình phát sinh chồi phụ thuộc vào tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng các chất ñiều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô, tế bào ngày càng ñược sử dụng bởi nhiều tác giả khác nhau và cho các kết quả tương tự như trên. Van Aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] ñã xác ñịnh ñược vai trò của α-NAA và BA trong nuôi cấy vẩy củ. Theo 2 ông thì α-NAA ñóng vai trò quyết ñịnh ñến sự tái sinh chồi, số chồi/vẩy và sự tăng trưởng của củ về trọng lượng khi dùng ở nồng ñộ thấp. Ở nồng ñộ cao, tác dụng của α-NAA hoàn toàn ngược lại. Trong nuôi cấy, BA hoàn toàn không ảnh hưởng ñến sự tái sinh chồi song lại thúc ñẩy quá trình sinh trưởng của các chồi tái sinh. Nghiên cứu quá trình nhân củ hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường ñược bổ sung axit abscisic của Kyowa và Hakko (1986) [42] kết quả cho thấy rằng axitabcisic có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo song lại kích thích quá trình hình thành củ con và làm mập chồi. Maesato - K, Sarma - K, Fukui - H, Hara - T (1991) [48] khẳng ñịnh hàm lượng thấp của α - NAA và 2,4-D thích hợp cho tạo rễ trong khi hàm lượng cao của α - NAA không chỉ kích thích tạo rễ nhiều mà còn thúc ñẩy sự hình thành lá tốt hơn. Các củ có rễ và lá sinh trưởng tốt hơn khi trồng ra ñất. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23 Ở Việt Nam nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lily cũng ñược tiến hành và ñã ñạt ñược một số thành tựu sau: Mai Xuân Lương và cộng sự (1993) [12] ñã thăm dò quy trình nhân giống hoa loa kèn trắng (hoa huệ tây - Lilium longiflorum Hance) trên các môi trường ña lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như: MS, White, B5, Knutson C, thậm chí cả môi trường Knop nhưng tốt nhất là môi trường MS. Tất cả các môi trường ña lượng trên ñều cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, vitamin. ðiều kiện thích hợp cho tái sinh và sinh trưởng là nhiệt ñộ 18-20oC, chế ñộ chiếu sáng 2500-3000 lux, 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày. Dương Tấn Nhựt (1994)[13] ñã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa huệ tây bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ, nhằm ñưa ra một giải pháp hữu hiệu khắc phục hiện tượng thoái hoá giống trầm trọng tại ðà Lạt hiện nay. Vẩy củ ñược khử trùng bằng HgCl2 2% trong 5 phút, sau ñó cấy trên môi trường MS có bổ sung các thành phần Vitamin, chất hữu cơ và saccaroze. Sau khi tạo ñược cây con trong ống nghiệm, có thể tiếp tục nhân bằng tách các chồi ñược tạo thành ñem cấy trên môi trường nhân. Dương Tấn Nhựt (1998) ñã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của than hoạt tính tới sự phát triển bộ rễ của cây hoa loa kèn (Lilium longiflorum) ở nồng ñộ 1g/l trong nhân giống in vitro. Năm 2001 Dương Tấn Nhựt và cộng sự ñã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy than hoạt tính có ảnh hưởng tốt ñến tỉ lệ sống và sự phát sinh chồi của lát mỏng ñoạn thân Lilium longiflorum ở nồng ñộ 1g/l [27]. Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [15] cho biết có thể sử dụng hỗn hợp 0,2 mg/l α-NAA + 1 mg/l BA trong môi trường tái sinh mầm chồi từ vẩy củ hoa loa kèn trắng. Cũng trên môi trường này cho hệ số nhân là 4,4 lần (sau 4 tuần nuôi cấy) khi tiếp tục nhân nhanh các mầm chồi tạo ñược. Hàm lượng saccaroze thích hợp cho quá trình tạo củ trong ống nghiệm là 4,5 % và ñặt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24 trong ñiều kiện bóng tối hoàn toàn. Một số nghiên cứu tạo củ in vitro của giống hoa lily cũng ñã ñược nghiên cứu: Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [16] cho biết nồng ñộ ñường saccaroze 5%là môi trường cho chất lượng củ giống cao và tạo ñiều kiện cho cây sinh trưởng phát triển tốt hơn. Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Thị Nhẫn (2001) [17] ñã ñưa ra kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống hoa loa kèn. Nghiên cứu khác của Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) [30] công bố kết quả nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium và kết luận ñường saccaroze là thành phần quan trọng quyết ñịnh sự hình thành củ in vitro, hàm lượng ñường từ 9-12% cho hệ số nhân củ từ 1,8-4,1 lần tuỳ thuộc vào từng giống, môi trường bán lỏng 12% ñường có bổ sung 0,1 BA và 0,01 α-NAA trong ñiều kiện tối là tốt nhất cho quá trình tạo củ từ vẩy và tăng cường kích thước củ. Theo Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự (2005) [25] thì tuổi chồi trong ống nghiệm cũng ảnh hưởng tới sự hình thành củ in vitro, các chồi 10 tuần tuổi có khối lượng củ trung bình tốt nhất, chồi 8 tuần tuổi cho hệ số nhân thấp hơn. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2006) [29] cho biết môi trường tốt nhất cho sự tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ mô vẩycủ của giống hoa loa kèn trắng Lilium formolongo là môi trường MS + 1 BA + 0,25 α-NAA + 30 saccaroze + 6,5 g/ agar (pH = 5,7). Nghiên cứu của Cao Huyền Trang (2006) [21] cho biết khả năng tạo củ nhỏ từ lát cắt vẩy củ phụ thuộc vào kích thước và vị trí lát cắt vẩy củ in vitro. Chiều dày lắt cắt 1,0-1,5 mm từ củ in vitro có ñường kính 4-5 mm cho hiệu quả tạo củ cao nhất. Lát cắt càng sát phần gốc củ thì càng cho tỷ lệ phát sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25 củ cao. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) [26] cho thấy kiểu gen ảnh hưởng rất nhiều lên khả năng tái sinh của các mẫu cấy, khả năng nhân chồi cũng như sụ phát triển của chồi. Hai giống lai Lily ‘Tiber’ và Lily ‘Sorbone’ có khả năng tái sinh từ thân non và vẩy củ rất cao. 2.5. Nghiên cứu ða dạng di truyền trên cây hoa lily 2.5.1. Khái niệm về ña dạng di truyền ða dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức ñộ gen. Gen tạo nên từ ADN là thành phần quyết ñịnh sự phát triển của cấu trúc sinh vật cũng như các ñặc ñiểm và khả năng mà sinh vật sẽ có. Cấp ñộ ña dạng này có thể tạo ra các biến thể khác nhau của cùng một gen (Nguyễn Thị Ngọc Ẩn, 2004) [9]. 2.5.2. Nguyên nhân phát sinh ña dạng di truyền Gen có khả năng tái tạo trên cơ sở tự sao chép một cách chính xác ñể ñảm bảo sự tồn tại của vật chất di truyền qua các thế hệ sinh vật. Tuy nhiên, gen cũng có thể bị biến ñổi dưới tác dụng của các yếu tố môi trường trong và ngoài cơ thể, ñặc biệt là những tác ñộng mạnh của các yếu tố lí hoá. Sự biến ñổi trong phân tử ADN có thể là nhỏ như sự thay ñổi xảy ra ở các cặp bazơ nitơ hoặc ở mức lớn hơn như các hiện tượng thêm bớt một ñoạn gen nào ñó nhưng lượng ADN trong một tế bào là lớn nên sự biến ñổi ấy trong từng cơ thể và cả quần thể là rất lớn. Vì thế không có hai cơ thể nào ñó có sự giống nhau hoàn toàn về trật tự phân bố các nucleotit trong chuỗi ADN. Sự biến ñổi của một gen hay một nhóm gen như vậy gọi là sự ñột biến và làm xuất hiện thể ñột biến, ñến lượt mình các ñột biến mới ñược hình thành sẽ ñược di truyền lại cho thế hệ sau và ñó chính là nguyên nhân phát sinh ña dạng di truyền. 2.5.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu ña dạng di truyền ða dạng di truyền rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26 tự nhiên. Sự ña dạng di truyền là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì ñược nòi giống, kháng với các loài dịch bệnh và thích nghi với những thay ñổi của môi trường. Sự ña dạng di truyền của cây trồng, vật nuôi có giá trị ñặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con người. 2.5.4. Các phương pháp xác ñịnh ña dạng di truyền 2.5.4.1. Chỉ thị hình thái Việc sử dụng các ñặc ñiểm hình thái trong phân loại sinh vật ñược sử dụng từ rất sớm. Những tính trạng hình thái ñược sử dụng như là một chỉ thị di truyền là những tính trạng do một locus gen quy ñịnh và sự thể hiện của chúng không bị ảnh hưởng của nhân tố môi trường. Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ tiêu hình thái trong phân tích ña dạng di truyền cũng có những hạn chế nhất ñịnh: số lượng các chỉ tiêu hình thái là có hạn, chúng bị ảnh hưởng bởi quá trình tương tác gen và các nhân tố môi trường, các chỉ tiêu hình thái chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể. 2.5.4.2. Chỉ thị hoá sinh * Chỉ thị Protein: Mỗi gen trong ñoạn ADN cần tìm mã hoá cho một protein ñặc hiệu, hoạt ñộng của gen trong dòng tế bào ñó sẽ sinh ra một protein ñặc trưng. Người ta sẽ sử dụng các mẫu dò là các protein kháng thể ñã ñánh dấu phóng xạ ñể phát hiện ra protein cần tìm. Từ ñó suy ra dòng tế bào nào ñã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò. Bởi vì, trình tự của nucleotid của gen ñã ñược dịch sang ngôn ngữ hoàn toàn chính xác ñó là protein. * Chỉ thị Isozym: là các enzym cùng xúc tác một phản ứng trong tế bào nhưng do các locus khác nhau quy ñịnh. Enzym có bản chất là protein và là chất ña ñiện di nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng ñiện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tĩnh ñiện... sẽ chuyển ñộng với tốc ñộ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gen sau khi ñiện di. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27 2.5.4.3. Chỉ thị phân tử ADN Từ khi ra ñời kỹ thuật PCR, người ta ñã áp dụng thành công kỹ thuật PCR trong việc ñánh giá ña hình ADN của sinh vật. ðáng chú ý là các kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR, STS, RFLP. Trong các phương pháp thì hiện nay ứng dụng nhiều hơn cả trên ñối tượng lily là RAPD. Các phương pháp này ñều sử dụng kỹ thuật PCR làm nền nhưng khác nhau ở chỗ là sử dụng các mồi ñược thiết kế khác nhau. * Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN) - ða hình các ñoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên. Nguyên lý của phương pháp: Sử dụng một số mồi ngẫu nhiên nhất ñịnh (thường từ 10-40 mồi) ñể thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các ñoạn ADN ñặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu ñược gồm các ñoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân ñược các ñoạn khác biệt nhau. Mồi ngẫu nhiên là các ñoạn oligo nucleotid gồm khoảng 8-20 nucleotid, ñặc trưng cho mỗi loài sinh vật. Ngày nay, kỹ thuật RAPD ñược ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu, phân tích di truyền ở mức phân tử trên các loài cây trồng khác nói chung và ở Lilium nói riêng. * Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) - ða hình chiều dài các ñoạn ADN cắt bởi enzym giới hạn. Kỹ thuật RFLP dựa trên ñặc ñiểm của các loại enzym giới hạn khác nhau, tạo nên các ñoạn cắt ADN khác nhau, tạo nên các ñoạn cắt ADN khác nhau phân biệt bằng ñiện di ñồ. Bản ñồ di truyền các kết quả RELP, có tính chính xác cao sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28 nghiên cứu, xác ñịnh nguồn gốc hoặc kiểm tra mức ñộ tiến hoá của các loài sinh vật. * Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - Sự ña hình chiều dài của các ñoạn ADN ñược khuyếch ñại chọn lọc. Kỹ thuật AFLP dựa trên cơ sở sử dụng PCR với các mồi ñặc hiệu ñể khuyếch ñại một ñoạn ADN ñặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Sau ñó thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi nối thêm 1 hoặc 2 nucleotid ở ñầu 3’(hoặc 5’) của mồi, ñể nhân các ñoạn ADN có tính ñặc hiệu cao. Kết quả PCR cho phép phân biệt mức ñộ giống và khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu ngay cả các mẫu so sánh có quan hệ di truyền gần nhau. Sự ña hình thể hiện qua mỗi phản ứng khi sử dụng AFLP cao hơn nhiều so với RFLP và RAPD vì vậy AFLP có thể cho phép xem xét sự ña hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian ngắn và có thể sử dụng lượng nhỏ ADN. AFLP ñang trở thành hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt các nghiên cứu di truyền và ñược sử dụng trong việc lập bản ñồ liên kết phân tử. * Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) - ðiểm trình tự ñược ñánh dấu Nguyên lý: dựa vào những locus ñã biết (gen, cADN,..) nhân trực tiếp bởi mồi PCR ñược thiết kế từ trình tự ñầu cuối của những locus ñặc trưng này. Kỹ thuật STS cho phép xác ñịnh những vị trí cần biết bằng các trình tự ADN biết trước. * Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) - ða hình trình tự lặp lại ñơn giản. Hệ gen sinh vật Eukaryote có mặt các trình tự nucleotid lặp lại, có kích thước khác nhau ñặc trưng cho loài. SSR gồm 2-5 nucleotid lặp lại nhiều lần: (TG)n hoặc (AAT)n. Các ñoạn ADN nhắc lại này có trình tự 2 ñầu rất ñặc trưng nên ñược sử dụng ñể thiết kế mồi cho PCR. Do có sự sai khác về kích thước của các ñoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu ña hình, lập bản ñồ và phân lập gen. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………29 Kỹ thuật SSR ñơn giản, không tốn kém, là chỉ thị ñồng trội nên ñược sử dụng ñể phát hiện cá thể dị hợp tử. 2.5.5. Một số kết quả nghiên cứu ña dạng di truyền của cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam RAPD là kỹ thuật ñược sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu ña dạng di truyền của các loài sinh vật ñặc biệt khi mà hệ gen của chúng còn ít ñược nghiên cứu về trình tự. Hiện nay, trên thế giới ñã sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ña dạng di truyền. Trong ñó, có rất nhiều nghiên cứu về ña dạng di truyền trên cây Lilium bằng phương pháp chỉ thị phân tử. Sau ñây là tóm tắt một số kết quả nghiên cứu. Lee. J, Lee. P, Lim.Y, E.Shin, Mark S.Roh (1994) [44] ñã ñi tiên phong trong việc phát triển hệ thống phân loại Lilium bằng phân tích ña hình các ñoạn ADN ñược nhân bản ngẫu nhiên (RAPD). Ba mồi ñã thu ñược ña hình giữa 15 giống lai châu Á Lilium x elegans, 5 giống lai phương ñông Lilium speciosum, Lilium x formolongi, Lilium concolor và Lilium lancifolium. 51 mồi RAPD ñược phân tích theo từng cặp. Kết quả chỉ ra rằng phân tích băng ña hình bằng chỉ thị RAPD có thể chứng minh nguồn gốc phát sinh của hoa lily trồng. Yamagishi. M (1995) [59] ñã sử dụng mồi RAPD ñể phân biệt sự khác nhau giữa các loài thuộc chi Lilium và giữa các loài lai. Ông ñã xác ñịnh ñược nhiệt ñộ tối ưu cho phản ứng PCR của mồi RAPD là 540C, và ñã sử dụng 76 mồi ñể phát hiện sự khác nhau giữa các giống hoa lily ñược tạo ra bởi lai trong loài trong ñó có 18 mồi (24%) có xuất hiện các vạch ña hình. Trình tự Sinomartagon, Leucolirion b, Leucolirion a và Archelirion có thể ñược phát hiện bởi 6 trình tự ADN ñặc thù với 5 mồi. Có 7 cặp lai cùng loài thấy ñược các băng của cả bố mẹ, rõ ràng những chỉ thị này có thể sử dụng ñể phát hiện Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệ._.A in their effects on asventitions sprout formation on lilium bulb tissue”, Plant Tissue Culture, pp.131-132. 58. Veli-Pekka Pelkonen (2005), “Biotechnological approaches in lily (Lilium) produc”, Oulu 2005, pp.18-20, 30-31. 59. Yamagishi. M (1995), “Detection of section specific random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Lilium”. Theor Appl Genet 91, pp. 830-835. 60. Yae B.W, Han B.H và Goo H.H (2001), “Dormancy Breaking and In Vivo Growth of In Vitro Bulblets in Lilium Oriental Hybrid “Casa Blanca” “, Journal of the Korean Society for Horticultural Science, v 42(1) pp. 99- 102. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………85 61. Wen CS, Hsiao JY (1999), “Genetic differentiation of Lilium longiflorum var. scabrum Masam. (Liliaceae) in Taiwan using Random Amplified Polymorphic DNA and morphological characters”, Bot.Bul.Acad.Sin. (Taipei) v.40, pp. 65-71. 62. Wiejacha. K, Marasek .A, Sabala .I, Orlikowska. T(2002), “Molecular markers in detection of distant hyrids in lilium”, Bot.Bul.Acad.Sin, v.43, pp. 93-98. 63. Zaghmont.O, Lorres.K.C (1985), “The effect of various carbohydrate sources and concentration on the growth of lilium in vitro”, Hort science, v 20(4), pp. 660. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………86 Phụ lục 1. Thiết bị và hoá chất Các thiết bị và hoá chất ñược sử dụng tại phòng sinh học phân tử Bộ môn CNSH - Trường ðH Nông nghiệp I - HN a. Thiết bị Máy PCR Máy ổn nhiệt Tủ lạnh Máy ly tâm Máy chiếu tia UV Máy lọc nước cất 2 lần Máy ñiện di Máy chụp ảnh gel Máy votex b. Hoá chất * Hoá chất dùng ñể tách chiết DNA genom lily - Buffer 1, Buffer 2. - Hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25:24:1). - Hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24:1). - Dung dịch SDS 10%. - Ethanol 96%, Ethanol 70%. * Hoá chất ñiện di sản phẩm PCR trên gel agarose và nhuộm gel - Agarose, Ethidium bromie 10mg/ml, Bromophenol blue. - ðệm TAE, TBE 2. Cách pha hoá chất - Buffer 1: Nồng ñộ Tên hoá chất lượng cần lấy 50mM Tris Hcl (pH 8.0) 5ml 5 mM EDTA 1ml 350 mM Sorbitol 6.37g 0.1% Mercaptoethanol 0.1ml 10% Polyethylenglycol 6000 10g Total 100ml (thêm nước cất vô trùng) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………87 - Buffer 2: Nồng ñộ Tên hoá chất Lượng cần lấy 50 mM Tris Hcl (pH 8.0) 5ml 5 mM EDTA 1ml 350 mM Sorbitol 6.37g 0.1% Mercaptoethanol 0.1 ml 1% Sodium Sarkosyl (SDS) 1g = 10 ml SDS 710 mM Nacl 14.2 ml 0.1% CTAB 0.1 g Total 100ml (thêm nước cất vô trùng) 3. Quy trình tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Nubuo kobayashi ñược cải tiến. Qui trình chiết tách DNA tổng số cây lily: - Cân khoảng 70mg mô lá non hoặc vảy củ cho vào cối. - Bổ sung 1ml Buffer 1, nghiền nhuyễn rồi chuyển vào ống effendorf 1.5ml - Ly tâm 1200 rpm trong 5 phút ở 40C. - Bỏ lớp dịch phía trên. - Bổ sung tiếp 500 µl Buffer 2, trộn ñều bằng votex. - Ủ trong Waterbath ở 600C trong 10 phút. - Bổ sung 500 µl dung dịch chloroform - isoamyl alcohol (24:1), trộn ñều bằng votex, ñể ở nhiệt ñộ phòng 15 phút. - Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút ở nhiệt ñộ phòng. - Hút phần dịch phía trên (khoảng 500 µl) chuyển sang ống effendorf mới. - Bổ sung 350µl isopropanol lạnh. ðảo lắc nhẹ nhàng khoảng 5-7 lần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………88 (có thể giữ trong tủ lạnh -200C trong 30 phút hoặc hơn). - Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 40C, ñổ bỏ phần dịch phía trên. - Bổ sung 700 µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 40C, ñổ bỏ phần dịch phía trên. - Làm khô DNA bằng cách ép lên giấy thấm. - Bổ sung 50 µl TE, giữ mẫu trong tủ lạnh -200C. * Chú ý: Trong quá trình tách chiết DNA tổng số cây hoa ly bằng qui trình trên có thể lặp lại từ bước 2 ñến bước 4, và lặp lai từ bước 7 ñến bước 9, ñể tăng chất lượng của DNA tách chiết ñược. ðồng thời có thể bổ sung RNase ñể tinh sạch hơn DNA. 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Nhiệt ñộ Thời gian Tác dụng Số chu kỳ I 94 4 phút Biến tính 1 94 30 giây Biến tính X 30 Gắn mồi II 72 45 Tổng hợp 34 III 72 7 Kéo dài tổng hợp 1 IV 4 ∞ Bảo quản X là nhiệt ñộ gắn mồi, tuỳ thuộc vào từng mồi khác nhau. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Phản ứng ñược bắt ñầu ở 940C trong thời gian 4 phút, sau ñó chuyển sang giai ñoạn 940C trong 30 giây ñể biến tính các phân tử DNA (giai ñoạn biến tính), ñến nhiệt ñộ gắn mồi (nhiệt ñộ này phụ thuộc vào Tm của mồi) thường kéo dài từ 30 giây - 1 phút sau ñó là giai ñoạn 720C trong 45 giây ñể DNA polymerase hoạt ñộng tổng hợp DNA từ khuôn là các phân tử DNA tách chiết ñược bị biến tính và các dNTP trong phản ứng, tiếp ñến là 720C trong 7phút và từ bước 940C trong 30 giây sẽ ñược lặp lại cho ñến 720C trong 45 giây (chu kì) khoảng 34 lần. Sau ñó nhiệt ñộ sẽ giảm xuống 40C ñể bảo quản DNA vừa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………89 tổng hợp ñược. 5. Phương pháp chạy ñiện di phát hiện sản phẩm PCR (RAPD) + Tiến hành chạy ñiện di trên gel agarose 2%. . Chuẩn bị gel: Cân 2g agar cho vào 100ml dung dịch TAE 1X ñun ñến khi tạo agarose trong suốt. . Lấy dung dịch ñổ vào khay ñể tạo gel ñiện di. . Chạy ñiện di: Lấy 10µl DNA sản phẩm PCR trộn lẫn với 2µl Loading Buffer 10X rồi ñổ vào giếng ñiện di. . Gel ñược ñặt trong máy ñiện di với dung dịch ñiện di là TAE 1X, dưới hiệu ñiện thế 75V, trong thời gian là 30 phút. + Chụp ảnh ñiện di: Bản gel sau khi ñược chạy ñiện di ñem nhuộm trong Ethium Bromide trong 10 phút. Sau ñó bản gel ñược ñưa vào thiết bị chiếu tia UV và chụp ảnh ñiện di. Quan sát hình ảnh chạy ñiện di ñể phát hiện gen mong muốn. 6. Thành phần dinh dưỡng MS (Musahige and Skoog, 1962) Lượng pha cho một lít dung dịch mẹ - Khoáng ña lượng NH4NO3………………………… 33 g KNO3…………………………….38 g MgSO4…………………………...10 g KH2PO4......................................3,4 g *CaCl2……………………………6,6 g (pha riêng) - Vi lượng H3PO3……………………………620mg MnSO4.4H2O…………………….2230mg ZnSO4.4H2O……………………..860mg KI…………………………………..83mg Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………90 MoO4Na2.2H2O…………………..25mg CoCl2.6H2O……………………….2,5mg CuSO4.5H2O………………………2,5mg - Sắt FeSO4.7H2O………………………5,56mg Na2EDTA………………………….7,46mg - Vitamin Glycine……………………………..400mg Axit Nicotinic (B5)…………………100mg Pyridoxin (B6)………………………100mg Thiamin HCl2 (B2)………………….20mg *Inositol……………………………..100mg/l môi trường (cân riêng) *Agar…………………………………6,2g/l môi trường (cân riêng) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………91 *Kết quả xử lý thống kê SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB CHIEUCAO 566.46 2 19.000 6 29.81 0.001 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHIEUCAO CT1 3 34.2000 CT2 3 61.2000 CT3 3 52.1400 SE(N= 3) 2.51661 5%LSD 6DF 8.70536 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 9 49.180 12.485 4.3589 8.9 0.0011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………92 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOMAX FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ---------------------------------------------------------------:PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da VARIATE V003 CAOMAX LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1588.33 794.164 58.11 0.000 2 * RESIDUAL 6 82.0004 13.6667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1670.33 208.791 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ----------------------------------------------------------------:PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CAOMAX CT1 3 50.4500 CT2 3 82.7500 CT3 3 63.1800 SE(N= 3) 2.13438 5%LSD 6DF 7.38316 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CAOMAX 9 65.460 14.450 3.6969 12.6 0.0003 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………93 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB SOLA 941.67 2 10.818 6 87.05 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SOLA CT1 3 31.1233 CT2 3 63.6100 CT3 3 56.1700 SE(N= 3) 1.89893 5%LSD 6DF 6.56869 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SOLA 9 51.141 15.605 3.2890 6.4 0.0001 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………94 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LAMAX FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da VARIATE V003 LAMAX LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1200.36 600.178 36.01 0.001 2 * RESIDUAL 6 100.000 16.6667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1300.36 162.544 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS LAMAX CT1 3 45.1800 CT2 3 73.4500 CT3 3 60.2000 SE(N= 3) 2.35702 5%LSD 6DF 8.15332 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | LAMAX 9 59.610 12.749 4.0825 9.8 0.0007 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………95 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NOHOA FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa 10% VARIATE V003 NOHOA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 6858.42 3429.21 77.58 0.000 2 * RESIDUAL 6 265.220 44.2034 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 7123.64 890.455 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa 10% MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NOHOA CT1 3 192.300 CT2 3 141.400 CT3 3 128.300 SE(N= 3) 3.83855 5%LSD 6DF 11.2782 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NOHOA 9 154.00 29.840 6.6486 8.3 0.0001 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………96 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.26140 .753800 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .180041E-02 .225051E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.26320 .205745 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 0.000000 CT2 3 1.13000 CT3 3 0.870000 CT4 3 0.400000 SE(N= 3) 0.866123E-02 5%LSD 8DF 0.182434E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 0.60000 0.45359 0.15002E-01 2.5 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………97 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 8.32140 2.77380 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .180123E-02 .225153E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 8.32320 .756655 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 0.000000 CT2 3 0.600000 CT3 3 1.77000 CT4 3 2.03000 SE(N= 3) 0.866321E-02 5%LSD 8DF 0.222498E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 1.1000 0.86986 0.15005E-01 1.4 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………98 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 11.1124 2.22248 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .760014E-02 .633345E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 11.1200 .654118 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 1.10000 CT2 3 0.800000 CT3 3 0.630000 CT4 3 1.90000 CT5 3 2.67000 CT6 3 2.40000 SE(N= 3) 0.145298E-01 5%LSD 12DF 0.247712E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 18 1.5833 0.80878 0.25166E-01 1.6 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………99 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 11.0546 3.68488 192.67 0.000 2 * RESIDUAL 8 .153000 .191250E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 11.2076 1.01888 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 1.62000 CT2 3 3.04000 CT3 3 4.13000 CT4 3 3.76000 SE(N= 3) 0.798436E-01 5%LSD 8DF 0.260362 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 3.1375 1.0094 0.13829 4.4 0.0000 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………100 SỐ LIỆU KHÍ TƯỢNG Số liệu khí tượng tháng 1 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 15.9 13.2 20.0 - 8.4 46.0 2 14.6 11.1 19.3 - 9.0 47.0 3 14.7 10.8 20.2 - 8.5 59.0 4 16.0 11.3 22.2 - 0.0 67.0 5 16.6 14.5 19.5 - 3.7 80.0 6 18.4 14.6 23.8 - 4.7 79.0 7 19.1 17.2 21.3 - 0.0 84.0 8 19.6 17.5 23.2 - 0.0 86.0 9 21.5 19.1 25.7 - 2.5 79.0 10 21.9 19.6 26.9 - 5.9 85.0 Trung bình 17.82125 14.89 22.21 0 34.3 74 11 23.8 20.5 29.7 - 7.3 84.0 12 23.2 20.6 29.1 - 6.9 82.0 13 22.7 21.7 26.3 - 1.9 82.0 14 14.9 12.7 21.0 0.0 0.0 74.0 15 11.6 10.5 12.5 0.0 0.0 88.0 16 12.9 11.5 15.9 0.0 0.3 71.0 17 14.5 13.5 15.9 - 0.0 57.0 18 15.0 13.5 17.2 - 0.0 73.0 19 14.5 13.3 15.5 0.7 0.0 93.0 20 16.3 14.6 18.8 0.0 0.0 94.0 Trung bình 16.94625 15.24 20.1900001 0.7 9.1 79 21 15.0 11.8 18.3 2.6 0.0 98.0 22 11.4 10.8 12.3 0.7 0.0 91.0 23 12.3 10.0 15.8 0.0 0.0 82.0 24 12.7 11.2 15.4 0.0 0.0 73.0 25 11.4 10.2 13.3 13.0 0.0 95.0 26 12.5 11.2 15.1 0.0 0.0 88.0 27 11.7 10.7 13.7 0.0 0.0 80.0 28 9.7 8.8 10.7 0.9 0.0 96.0 29 10.7 9.3 12.7 1.5 0.0 87.0 30 10.3 9.5 11.7 1.3 0.0 93.0 31 9.1 7.9 9.4 6.2 0.0 87.0 Trung bình 18.8 17.6 20.5 4.5 5.6 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………101 Số liệu khí tượng tháng 2 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 7.5 6.8 7.8 0.2 0.0 87.0 2 9.3 6.7 13.2 5.7 0.0 81.0 3 11.8 10.4 13.9 - 0.0 71.0 4 12.4 10.6 14.8 0.0 0.0 66.0 5 12.8 11.0 14.8 0.0 0.0 80.0 6 13.2 12.1 14.7 - 0.0 69.0 7 12.9 12.0 14.1 - 0.0 70.0 8 13.1 11.9 15.0 - 0.0 68.0 9 13.2 11.3 15.5 - 0.0 50.0 10 12.2 11.3 13.2 - 0.0 57.0 Trung bình 11.84 10.41 13.7 5.9 0 68 11 11.4 11.0 11.9 - 0.0 70.0 12 12.1 10.9 14.8 - 0.0 61.0 13 12.3 11.0 14.1 - 0.0 47.0 14 12.2 10.0 14.9 0.0 0.0 57.0 15 13.7 11.7 16.6 0.0 0.6 56.0 16 14.5 13.3 16.3 - 0.0 61.0 17 11.8 11.2 12.9 1.8 0.0 92.0 18 12.1 11.2 13.2 2.1 0.0 90.0 19 12.4 11.5 13.3 0.0 0.0 90.0 20 14.1 12.8 16.8 - 0.0 84.0 Trung bình 12.6675 11.46 14.48 3.9 0.6 70.8889 21 16.8 11.6 23.0 - 7.2 78.0 22 18.4 13.0 24.9 - 7.8 76.0 23 20.2 15.5 26.2 - 5.9 74.0 24 19.6 18.2 22.0 0.0 0.0 87.0 25 18.7 17.9 20.2 1.1 0.0 93.0 26 17.7 15.6 19.2 0.8 0.0 86.0 27 15.0 13.6 17.5 0.0 0.0 54.0 28 15.1 14.0 16.2 0.0 0.0 61.0 29 15.1 11.8 20.0 2.3 4.8 72.0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………102 Số liệu khí tượng tháng 3 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 16.7 11.9 23.2 - 8.5 69.0 2 18.1 12.7 25.2 - 8.5 66.0 3 19.9 14.4 26.2 - 8.0 64.0 4 20.4 15.0 26.1 - 8.1 60.0 5 19.5 16.0 23.6 - 2.4 73.0 6 20.0 17.7 23.8 - 0.8 84.0 7 20.1 18.7 23.0 0.0 0.1 83.0 8 20.8 17.7 25.2 - 1.3 81.0 9 20.2 19.1 22.2 0.0 0.3 82.0 10 19.9 18.8 22.1 0.0 0.0 86.0 Trung bình 19.6 16.2 24.1 0.0 29.5 75.4 11 21.4 19.0 25.3 - 0.0 82.0 12 20.9 18.5 26.1 0.0 5.5 85.0 13 20.0 19.0 21.6 0.0 0.0 94.0 14 20.8 19.8 22.4 0.4 0.0 95.0 15 21.2 19.2 24.7 0.2 0.0 89.0 16 22.1 21.0 24.3 0.7 0.3 91.0 17 23.1 21.3 27.7 0.5 1.6 90.0 18 23.5 22.1 26.2 3.7 0.2 92.0 19 22.7 21.5 24.4 0.0 0.0 89.0 20 23.4 21.0 28.2 0.0 3.0 87.0 Trung bình 21.9 20.2 25.1 5.5 10.6 90.2 21 24.6 23.4 26.8 0.0 0.0 88.0 22 23.0 22.2 24.5 6.9 0.0 94.0 23 22.4 19.2 26.8 0.1 6.9 66.0 24 22.2 18.9 26.2 - 7.4 67.0 25 22.0 20.1 24.7 0.0 0.0 70.0 26 22.3 20.9 25.6 0.0 1.9 73.0 27 20.5 18.8 23.5 0.0 0.2 86.0 28 22.0 19.5 26.0 0.6 0.4 88.0 29 24.9 22.3 29.5 0.1 1.4 85.0 30 25.2 23.8 29.0 0.4 0.8 88.0 31 22.2 20.8 23.0 6.6 0.0 94.0 Trung bình 18.8 17.6 20.5 4.5 5.6 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………103 Số liệu khí tượng tháng 4 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 20.1 18.2 22.1 2.6 0.0 89 2 18.6 17.6 20.3 1.4 0.0 88 3 18.4 17.0 20.9 0.3 0.0 92 4 20.7 18.8 24.2 1.0 0.0 93 5 22.9 21.2 26.3 0.8 0.0 94 6 25.7 23.0 29.6 - 3.4 87 7 26.5 24.2 30.3 - 4.7 86 8 26.9 24.0 32.1 - 5.3 83 9 27.8 24.2 33.7 - 8.2 81 10 26.1 25.1 28.2 0.0 0.0 89 Trung bình 23.4 21.3 26.8 6.1 21.6 88 11 25.9 25.2 27.7 0.0 0.0 90 12 26.1 25.4 27.8 0.0 0.0 90 13 25.2 24.8 28.5 6.1 0.1 94 14 26.0 22.7 31.2 1.6 6.9 81 15 25.5 21.3 30.2 13.2 5.9 84 16 26.0 24.5 29.2 0.0 4.0 86 17 26.4 23.1 31.0 - 4.6 83 18 26.9 23.3 31.7 - 6.0 89 19 27.7 25.2 32.1 - 5.8 76 20 27.7 25.6 32.0 - 4.0 83 Trung bình 26.3 24.1 30.1 20.9 37.3 86 21 28.3 26.3 31.7 0.1 4.0 84 22 26.6 23.6 28.7 93.4 0.0 88 23 22.4 20.7 24.3 0.3 0.0 81 24 21.5 20.2 24.2 0.1 0.7 68 25 22.8 21.2 26.5 0.0 2.4 72 26 23.4 20.8 26.9 - 2.3 79 27 23.8 22.1 28.5 0.0 1.0 84 28 24.5 22.6 28.5 0.1 1.3 79 29 25.7 22.5 29.7 - 2.1 77 30 25.9 23.5 28.5 0.6 0.3 83 Trung bình 24.5 22.3 27.7 94.5 14.1 80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………104 Số liệu khí tượng tháng 5 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 26.6 24.5 30.4 15.8 1.1 89 2 28.1 25.8 32.6 - 3.8 86 3 28.3 25.8 32.0 0.7 2.8 84 4 29.0 26.5 33.4 - 7.8 83 5 24.0 23.0 24.4 17.1 0.0 92 6 24.6 22.3 28.1 4.1 0.4 88 7 28.1 24.5 33.0 - 6.5 83 8 28.9 26.2 33.9 0.0 6.7 84 9 28.3 25.7 32.8 3.1 3.3 86 10 24.2 22.6 27.7 9.0 0.4 78 Trung bình 27.0 24.7 30.8 49.8 31.7 85 11 24.4 21.7 27.7 0.0 0.0 72 12 26.3 23.0 31.0 - 7.5 70 13 27.1 24.2 31.0 - 5.3 71 14 27.8 23.3 31.9 - 10.3 66 15 27.1 23.5 31.6 - 3.3 72 16 27.6 24.3 32.9 - 8.0 76 17 27.8 25.1 31.5 - 2.2 75 18 27.9 25.3 33.0 12.6 4.1 84 19 22.9 21.6 23.7 102.9 0.0 93 20 25.3 22.5 30.5 0.2 4.8 81 Trung bình 26.4 23.4 30.5 115.7 45.5 76 21 26.9 24.0 31.4 - 5.8 78 22 27.0 25.0 30.6 - 1.0 85 23 28.4 25.8 33.5 - 4.0 83 24 29.2 26.9 33.0 0.0 4.9 83 25 29.6 27.3 33.8 0.2 5.0 83 26 30.5 27.5 35.9 0.2 7.4 80 27 32.0 27.9 37.8 - 9.2 73 28 32.2 28.7 36.5 - 6.5 67 29 32.1 28.4 37.1 - 9.7 74 30 29.1 25.4 33.7 3.8 1.5 78 31 26.2 24.2 29.8 14.3 4.1 80 Trung bình 29.4 26.5 33.9 18.5 59.1 78 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………105 Số liệu khí tượng tháng 6 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt ñộ trung bình (oC) Nhiệt ñộ thấp nhất (oC) Nhiệt ñộ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) ðộ ẩm (%) 1 27.5 26.0 30.9 0.0 0.3 83 2 27.1 24.3 31.6 6.4 0.2 85 3 27.5 24.5 33.0 0.1 4.2 72 4 28.0 26.1 31.7 0.0 1.0 85 5 28.0 25.5 31.9 1.4 2.1 86 6 27.3 25.1 32.0 0.0 2.9 84 7 28.6 26.0 34.0 7.8 3.7 81 8 29.2 26.1 34.4 0.3 3.3 78 9 29.3 26.6 33.5 1.1 5.6 74 10 27.6 24.9 30.8 0.1 2.0 82 Trung bình 28.0 25.5 32.4 17.2 25.0 81 11 28.9 26.1 34.1 - 5.5 80 12 29.0 26.6 33.8 0.4 1.7 78 13 28.7 27.0 31.9 0.7 2.1 81 14 28.3 25.6 33.0 19.5 3.0 86 15 29.2 26.2 34.4 21.6 4.5 84 16 28.1 26.5 30.2 1.8 0.0 86 17 28.0 26.5 30.9 0.0 1.0 87 18 27.2 24.6 31.6 67.3 0.6 91 19 26.4 25.0 28.5 19.6 0.1 90 20 29.0 24.9 34.7 22.3 7.2 83 Trung bình 28.3 25.9 32.3 153.2 25.7 85 21 29.5 25.0 36.1 0.0 8.9 74 22 31.3 28.0 36.1 - 9.5 73 23 32.2 28.5 37.5 - 10.8 76 24 29.3 25.5 34.0 21.0 4.9 79 25 30.9 28.2 35.6 - 5.0 73 26 32.1 29.1 36.8 0.0 7.6 71 27 27.7 25.2 32.5 20.7 1.0 85 28 25.8 24.4 28.3 22.2 0.6 88 29 28.5 24.4 34.4 - 8.5 76 30 30.8 28.2 35.9 0.0 7.4 76 Trung bình 29.8 26.7 34.7 63.9 64.2 77 ._.