Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống In Vỉto cây hoa huệ hương (Polianthes Tubeosa L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NƠNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------ NGUYỄN THỊ Y THANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA HUỆ HƯƠNG (POLIANTHES TUBEROSA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ NƠNG NGHIỆP Chuyên ngành : Trồng trọt Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI – 2009 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong l

pdf122 trang | Chia sẻ: huyen82 | Lượt xem: 1376 | Lượt tải: 0download
Tóm tắt tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống In Vỉto cây hoa huệ hương (Polianthes Tubeosa L.), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
uận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tơi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho luận văn này đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Y Thanh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành luận văn này, ngồi sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tơi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cơ giáo, bạn bè, người thân và các cơ quan đơn vị. Trước tiên, tơi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cơ giáo đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích cho tơi trong suốt thời gian qua. Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cơ giáo trong Bộ mơn Cơng nghệ sinh học – Sinh học phân tử và cơng nghệ vi sinh đã chân thành đĩng gĩp ý kiến quý báu giúp cho luận văn của tơi được hồn thiện hơn. ðặc biệt tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Quang Thạch đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ cơng nhân viên Phịng Cơng nghệ sinh học, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và cơng nghệ - Sở Khoa học và Cơng nghệ tỉnh Bình ðịnh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả người thân, bạn bè, những người luơn bên cạnh động viên giúp đỡ tơi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tác giả Nguyễn Thị Y Thanh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn đề 1 1.2. Mục đích, yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa huệ 4 2.2. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước 10 2.3. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào. 11 2.4. Những nghiên cứu về nuơi cấy mơ cây hoa huệ trong nước và trên thế giới. 23 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. ðối tượng 27 3.2. Nội dung nghiên cứu 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu 33 3.4. Xử lý số liệu 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất 37 4.2. Giai đoạn nuơi cấy khởi động 42 4.3. Giai đoạn nhân nhanh 52 4.3.1. Nhân nhanh chồi 52 4.3.2. Ứng dụng phương pháp nuơi cấy protocorm trong nhân nhanh. 68 4.4. Giai đoạn nghiên cứu tạo cây hồn chỉnh 75 4.5. Giai đoạn vườn ươm 82 4.6. So sánh và thảo luận với các kết quả nghiên cứu khác trên cây hoa huệ. 83 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………iv 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 85 5.1. Kết luận 85 5.2. Kiến nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 1 92 PHỤ LỤC 2 93 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS : Murashige and Skoog, 1962. BA : benzyl adenin IBA : indol butyric acid α-NAA : α-naphtyl acetic acid 2,4-D : 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA : indol acetic acid ðC : ðối chứng PSHT : Phát sinh hình thái CT : Cơng thức Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần nuơi cấy). 38 4.2. Ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần nuơi cấy). 40 4.3. Ảnh hưởng của kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuơi cấy). 43 4.4. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuơi cấy). 45 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuơi cấy). 49 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi. 53 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuơi cấy). 56 4.8. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và α-NAA đến hệ số nhân và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuơi cấy). 59 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuơi cấy). 62 4.10. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào mơi trường đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi 66 4.11. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và chiều cao chồi khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm (sau 6 tuần nuơi cấy). 69 4.12. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến hệ số nhân và chiều cao chồi khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm (sau 6 tuần). 72 4.13. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ (sau 5 tuần) 76 4.14. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ (sau 5 tuần) 79 4.15. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây huệ (sau 4 tuần) 83 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1. Cây hoa huệ hương 27 4.1. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau 39 4.2. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau 41 4.3. Ảnh hưởng của Kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 44 4.4. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2mg/l kinetin 44 4.5. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 4mg/l BA 47 4.6. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 47 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. 50 4.8. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 51 4.9. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 51 4.10. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 51 4.11. Mẫu phát sinh hình thái trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 51 4.12. Kết quả nhân nhanh chồi trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 2mg/l BA 54 4.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi 55 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành 55 4.15. Kết quả nhân nhanh trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 3mg/l BA 57 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………viii 4.16. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi . 57 4.17. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến chiều cao chồi tạo thành 58 4.18. Kết quả nhân nhanh trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l kinetin + 0,25mg/l α-NAA 60 4.19. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi 61 4.20. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành 61 4.21. Kết quả nhân nhanh chồi trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2,5mg/l kinetin + 0,25 mg/l IAA 63 4.22. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi 64 4.23. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến chiều cao chồi tạo thành 64 4.24. Kết quả nhân nhanh chồi trên mơi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA +150ml/l nước dừa 67 4.25. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào mơi trường đến hệ số nhân chồi 67 4.26. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào mơi trường đến chiều cao chồi 68 4.27. Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm trên mơi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA 70 4.28. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm. 71 4.29. Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm. 71 4.30. Kết quả nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm trên mơi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 3mg/l BA + 0,5mg/l α- NAA 73 4.31. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm 74 4.32. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm 74 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………ix 4.33. Chồi đủ tiêu chuẩn đưa vào mơi trường tạo cây hồn chỉnh 75 4.34. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số rễ trung bình /chồi 77 4.35. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến chiều dài trung bình của rễ 78 4.36. Cây con hồn chỉnh trên mơi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 2g/l than hoạt tính 78 4.37. Cây con hồn chỉnh trên mơi trường MS + 30 g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1mg/l α-NAA 80 4.38. Ảnh hưởng của α-NAA đến số rễ trung bình của chồi. 81 4.39. Ảnh hưởng của α-NAA đến chiều dài trung bình của rễ. 81 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn đề Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhĩm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa huệ được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa huệ được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xố đĩi giảm nghèo cho vùng chuyên canh lồi cây này. Hiện nay, việc canh tác cây huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh cĩ sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày càng thối hố. Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa huệ xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đĩ cĩ một bệnh rất khĩ trị là bệnh chai bơng. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh khơng làm cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ và hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nơng dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mơ tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện của cây huệ ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân? Sự phát triển của cơng nghệ sinh học trong lĩnh vực chọn giống đã giúp các nhà chọn giống rất nhiều trong việc giải quyết vấn đề trên. Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hố và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khơi phục lại các phẩm chất vốn cĩ của giống. ðồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống cĩ chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mơ rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuơi cấy mơ đã được nghiên cứu ứng dụng rất cĩ hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………2 Cây hoa huệ là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuơi cấy mơ ở nước ta, cho đến nay chưa cĩ cơng trình nghiên cứu nào được cơng bố, chỉ cĩ một thơng báo khoa học của các tác giả trường ðại học Cần Thơ. Năm 2007, xuất phát từ yêu cầu bức xúc của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bơng trên cây hoa huệ và yêu cầu nhân nhanh giống huệ hương, một giống huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nơng dân, tỉnh Bình ðịnh đã cĩ chủ trương xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào. Trên cơ sở đĩ, Bộ Khoa học và Cơng nghệ giao cho tỉnh Bình ðịnh dự án xây dựng quy trình nhân giống cây hoa huệ, đặc biệt là cây huệ hương. Chính vì thế, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ Khoa học và Cơng nghệ tỉnh Bình ðịnh (Sở Khoa học và Cơng nghệ tỉnh Bình ðịnh) đã bước đầu tiến hành nghiên cứu thử nghiệm nhân nhanh giống huệ này bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ. Cĩ thể nĩi, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây huệ là một yêu cầu bức xúc của thực tiễn, đề tài được nghiên cứu sẽ cĩ nhiều phát hiện mới về khoa học. Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương (Polianthes tuberosa L.)” 1.2. Mục đích, yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định được những khâu cơ bản trong quy trình nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương, gĩp phần giải quyết những bức xúc của thực tiễn sản xuất hoa tỉnh Bình ðịnh. 1.2.2. Yêu cầu Xác định được phương pháp khử trùng mẫu thích hợp. • Xác định được mơi trường nuơi cấy phù hợp nhất cho các giai đoạn khởi động mẫu, nhân nhanh, tạo rễ và tạo cây hồn chỉnh trong nuơi cấy in vitro. • Xác định được giá thể ra cây nuơi cấy thích hợp. • Bước đầu đề xuất quy trình nhân giống cây huệ hương in vitro. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân giống vơ tính cây hoa huệ hương bằng phương pháp nuơi cấy mơ, tế bào, gĩp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuơi cấy mơ cây hoa. ðề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái, hệ số nhân nhanh chồi, nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm, tác động của chất điều tiết sinh trưởng và than hoạt tính đến khả năng tạo cây hồn chỉnh, tác động của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in vitro. Các kết quả nghiên cứu của đề tài cĩ thể được sử dụng để giảng dạy và nghiên cứu trong nuơi cấy mơ, tế bào cây hoa. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp chúng tơi đề xuất một quy trình nhân giống cây huệ hương bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào, gĩp phần sản xuất cây giống cĩ hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống. Kết quả nghiên cứu được ứng dụng vào sản xuất sẽ gĩp phần phục tráng giống và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa huệ. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa huệ 2.1.1. Nguồn gốc Cây hoa huệ cĩ tên khoa học là Polianthes tuberosa L. ðây là lồi hoa cắt cành, thuộc nhĩm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm cĩ nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện đã cĩ mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Singapore, Indonexia, Iran, Hawaii...[51]. Lồi cây này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ biến tại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ như: Bình ðịnh, Khánh Hịa, Tiền Giang, Cần Thơ… Hiện nay nĩ đang là cây trồng chính của người dân nơi đây [18]. 2.1.2. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật học [5], cây hoa huệ là cây thuộc: - Giới: Cây trồng. - Lớp: Một lá mầm (Monocotylendon). - Bộ: Hành (Liliadae). - Họ: Thủy tiên (Amaryllidaceae). Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiện tại ở Mexico cĩ khoảng 12 lồi tuberosa [51]. Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủ yếu là huệ đơn và huệ kép: - Huệ đơn hay cịn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bơng chỉ cĩ một lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm. - Huệ kép cịn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bơng dài hơn huệ đơn nhưng hương thơm kém hơn [52]. 2.1.3. ðặc điểm thực vật học 2.1.3.1. Thân Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay cịn gọi là thân giả được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau. Thân thẳng đứng khơng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………5 phân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 -1m [9]. 2.1.3.2. Lá Cây hoa huệ cĩ lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gĩc rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá khơng phân biệt rõ ràng. Chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm [9]. 2.1.3.3. Hoa Cây hoa huệ là cây cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ yếu vào mùa hè cịn mùa đơng tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bơng ngắn hơn. Hoa huệ cĩ màu trắng, bao hoa hình phễu, thường tỏa hương vào ban đêm. Hoa cĩ vị ngọt, hơi chát, thơm, khơng độc. Cành hoa thường dài, ở nách mỗi lá bắc cĩ 2 hoa màu trắng, cĩ tràng đơn hay tràng kép, nhị gắn giữa ống, bầu dưới 3 ơ [5], [53]. 2.1.3.4. Củ và rễ Cây huệ cĩ bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 0-15cm. Cĩ 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu (củ mẹ), gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con do củ mẹ đẻ ra gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ [9]. 2.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa huệ 2.1.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố vật lý cĩ ảnh hưởng lớn đến thời gian sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân hĩa hoa của cây hoa huệ. Cây hoa huệ là cây ưa nhiệt độ mát mẻ (20-250C), nhưng chịu nĩng tốt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa hè. Tuy vậy, khi nhiệt độ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năng sinh trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh. Trước khi phân hĩa hoa và lúc cây cĩ 5-6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15-220C) nếu khơng tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém [9]. 2.1.4.2. Ánh sáng Cây huệ là cây ưa ánh sáng mạnh. Giai đoạn đầu sau khi trồng, cây sống chủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ. Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từ quá trình quang hợp. Trong thời kỳ phân hĩa mầm hoa nếu khơng cung cấp đủ ánh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………6 sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ… Ngồi ra nếu thiếu ánh sáng cây hoa huệ rất dễ bị nhiễm bệnh. Trong điều kiện ngày ngắn, ánh sáng yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của cây. Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hĩa mầm hoa. Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500lux thì cường độ quang hợp và sự thốt hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu. Do đĩ khi trồng ở vụ đơng cần đảm bảo chế độ chiếu sáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân hĩa mầm hoa, hoa tự dài đồng thời tăng chất lượng hoa. Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12-16 giờ và cường độ ánh sáng khoảng 6000lux [9]. 2.1.4.3. Nước Cây hoa huệ là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởng cần phải cĩ đủ nước. Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì cĩ nhu cầu về nước khác nhau. Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đất xung quanh củ phải đủ ẩm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước. Khi cây mọc nếu đất quá khơ thì phải tưới nước ngay. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa huệ cần rất nhiều nước, đặc biệt là ở giai đoạn cĩ 3-7 lá, đây là thời kỳ cây cĩ nhu cầu về nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khả năng phân hĩa của hoa. 2.1.4.4. ðất Cây hoa huệ cĩ thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉ sinh trưởng tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 -7), cĩ cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt. Tuy vậy, huệ khơng thích hợp nơi đất quá trũng, chua hay cớm bĩng [20]. Cây hoa huệ cĩ thể trồng trên các loại đất cĩ thành phần cơ giới sau: - ðất cát pha cĩ độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thống khí, ngấm nước tốt nhưng cĩ độ phì kém. Do đĩ, khi trồng hoa huệ trên loại đất này cần phải bĩn nhiều phân hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây. - ðất thịt nhẹ, thốt nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với cây hoa huệ. Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháo nước kịp thời khơng để ruộng bị ngập úng. Mặt khác hoa huệ cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………7 ðặc biệt là loại đất cĩ hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển chậm và khả năng ra hoa kém. Chính vì vậy trước khi trồng huệ cần chú ý đến các biện pháp canh tác đất [9]. 2.1.5. Kỹ thuật trồng và chăm sĩc Theo ðặng Phương Trâm (2005) [19] thì trong quá trình trồng và chăm sĩc cây huệ cần chú ý các khâu sau: 2.1.5.1. Chuẩn bị giống Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây cĩ nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ cĩ kích thước đạt tiêu chuẩn sau đĩ cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2-3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quản nơi thống mát, cao ráo, sau 2-3 tháng cĩ thể đem trồng trở lại. Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối. Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bơng trên diện rộng, vì vậy để phịng trừ bệnh chai bơng trên cây huệ cần tiến hành các bước sau: - Khơng sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnh trước đĩ làm củ giống. - Phơi củ trong vịng 1-1,5 tháng trước khi đem ra trồng. - Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây huệ với một loại cây trồng khác. - Khi phát hiện thấy cĩ triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khơ và đốt bỏ. Khi khơng cĩ củ giống sạch bệnh, cĩ thể chọn củ ở cây khơng cĩ triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kỹ từ 1-1,5 tháng, sau đĩ xử lý củ với nước nĩng khoảng 56-570C. Quy trình xử lý củ huệ bằng nước nĩng để phịng trừ bệnh chai bơng gồm các bước sau: - Bước 1: Chuẩn bị củ huệ để xử lý. Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1-1,5 tháng, chọn những củ cĩ đường kính từ 3cm trở lên để xử lý. - Bước 2: Xử lý củ huệ bằng nước nĩng ðổ nước nĩng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………8 chỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56-570C thì bắt đầu cho củ vào nước. Lượng nước xử lý cần gấp 6-7 lần lượng củ xử lý. Sau đĩ đậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56-570C bằng cách đổ thêm một ít nước sơi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa. - Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khơ trong 2 ngày sau rồi đem trồng ra ruộng. 2.1.5.2. Chuẩn bị đất Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng lên liếp rộng khoảng 1,2m và sâu 0,5m để cĩ thể giữ nước tốt. Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận ánh sáng tốt và đồng đều. Trước khi trồng nên bĩn phân lĩt và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh. 2.1.5.3. Chăm sĩc Trong canh tác cây hoa huệ yêu cầu về nước là rất quan trọng, phải thường xuyên tưới nước đồng thời phải xới đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt. Phân bĩn thường sử dụng để bĩn cho cây là hỗn hợp (Urea, lân và Kali), sau khi trồng được khoảng 2-3 năm cây huệ bắt đầu bị thối hĩa: sinh trưởng chậm, cho hoa ít và kém chất lượng. Do đĩ phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tích khác. Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bĩn phân, tưới nước, phun thuốc..., thường xuyên để tránh lây lan nguồn sâu bệnh hại. Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ cịn non và trừ sạch, cĩ thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc. Trong quá trình trồng, nên bĩn phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt như bĩn lĩt, bĩn thúc. Ngồi cách bĩn vào đất cịn cĩ thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa. Trong thời kỳ phân hĩa mầm hoa cần bĩn thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bĩn thêm lân và kali [9]. 2.1.6. Vấn đề sâu bệnh trên cây huệ Trên cây hoa huệ, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyến trùng. Bệnh gây hại trên cây huệ được chia thành hai nhĩm: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………9 - Nhĩm bệnh khơng truyền nhiễm, do ngoại cảnh khơng phù hợp thường gặp nhất là thối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt... cĩ thể phịng trị bằng các loại thuốc hĩa học. - Nhĩm bệnh truyền nhiễm chủ yếu do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus... thường rất khĩ trị, nhất là bệnh do virus gây ra do rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhĩm cây nhân giống vơ tính (bằng củ) như cây huệ [8]. Virus khơng thể phịng chống hay tiêu diệt bằng hĩa chất như vi khuẩn, nấm và sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy biện pháp làm sạch virus phải luơn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh [3]. Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa huệ thường bị nhện đỏ phá hại nặng trên lá, từ 3-4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên cĩ thể phịng trị bằng các loại thuốc sau: Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9- 10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì cĩ thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol...[52]. 2.1.7. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây huệ Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sĩc khơng quá khắt khe nên huệ được trồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân. Trong những năm gần đây, cây hoa huệ đem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, ðồng Tháp... ðặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Bình ðịnh, Khánh Hịa, từ khi người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành cây xĩa đĩi giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa huệ ở đồng bằng sơng Cửu Long bình quân từ 150-200 triệu/ha và ở Nam Trung bộ là 80-150 triệu/ha. Ngồi giá trị sử dụng thơng thường như trên, gần đây người ta cịn sử dụng một số bộ phận của cây này làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm [54]. Hiện nay, một số nghiên cứu về lồi hoa này đã tìm ra một số thành phần hố học cĩ liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý,... được chiết xuất từ các bộ phận như hoa và sáp hoa... trong đĩ loại tinh dầu tuyệt đối thu được Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………10 khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metil (4,5%), antranilat metil (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoat benzil (24%). Ngồi ra, n-alkan chiếm tỷ lệ khơng nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hố học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm [54]. Bên cạnh đĩ, cây hoa huệ cịn cĩ cơng dụng trong y học, bộ phận được sử dụng là củ huệ. Trong tinh dầu củ huệ cĩ chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin và tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý. Từ lâu trong dân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa huệ để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn ðộ người ta đã dùng củ phơi khơ, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ huệ để chữa bệnh sốt rét. Ở một số nơi, dân gian cịn dùng củ huệ để chữa bệnh hĩc xương bằng cách đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hĩc xương sau 1-2 phút sẽ khỏi [54]. 2.2. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước Du nhập vào nước ta từ lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây huệ được trồng phổ biến hơn cả ở Miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa huệ ngày càng được mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng. Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh ðồng bằng sơng Cửu Long cĩ diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh cĩ khoảng 500-1000 ha canh tác cây hoa huệ, khi thu hoạch cĩ thể cho thu nhập từ 150-200 triệu đồng/ha [55]. Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao. Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa huệ, đặc biệt là ở Bình ðịnh và Khánh Hịa. Ở Bình ðịnh, cây hoa huệ dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80-120 triệu đồng [53]. Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khĩ khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đĩ cĩ một bệnh rất khĩ trị là bệnh chai bơng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………11 Hiện nay, bệnh phá hoại rất mạnh, cĩ thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng. Chính vì vậy, năng suất huệ trên nhiều vùng cĩ xu hướng khơng ổn định và chất lượng hoa thì giảm đáng kể. Hiện nay, bệnh chai bơng đang là nguyên nhân chính làm giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Triệu chứng bệnh thể hiện: - Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chĩp lá, lá cĩ thể bị xoắn. - Trên bơng: nếu bị nhiễm nặng, bơng sẽ bị chai khơng trỗ được hoặc bơng bị đen thui và khơ, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ. - Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân cĩ những gai sần dày đặc. Tác nhân gây bệnh hiện nay._. vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên các triệu chứng bệnh thể hiện giống với những mơ tả các triệu chứng bệnh do virus của Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) [28], [32]. Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với huệ, nguồn vật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đĩng vai trị quan trọng, nĩ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này. Củ huệ tái sinh theo phương pháp thơng thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá cĩ một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên. Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư khơng cao nhưng cĩ rất nhiều nhược điểm như: hệ số nhân thấp, thường làm thối hĩa giống, gây nhiễm bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa. 2.3. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào. Là phương pháp nuơi cấy mơ, tế bào trong mơi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vơ trùng và tái sinh chúng thành cây con. Nhân giống bằng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, cĩ thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………12 2.3.1. Lịch sử nuơi cấy mơ, tế bào thực vật Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người ðức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy cĩ khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuơi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính tồn năng của tế bào. Theo ơng mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang tồn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thơng tin của sinh vật đĩ, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều cĩ thể phát triển thành cơ thể hồn chỉnh. Ơng tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hố về chức năng khác nhưng khơng thành cơng. ðiều đĩ đã giảm sự tin t- ưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuơi cấy mơ, tế bào trong thời gian dài. ðến năm 1922 học trị của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ơng. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hịa thảo nuơi cấy trong mơi trường cĩ khống, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang mơi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuơi cấy mơ, tế bào thực vật khi White đã nuơi cấy thành cơng đầu tiên rễ cà chua trên mơi trường lỏng cĩ chứa đường, muối khống, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ơng thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhĩm B: thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6). Sau đĩ ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA. Năm năm sau Gautheret đã thơng báo về sự tái sinh của cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mơ sẹo khơng bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào mơi trường nuơi cấy, ơng cĩ thể kích thích sự phát triển của mơ đã biệt hố trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vơ trùng. Sau này người ta mới thấy rằng callus cĩ thể trực tiếp nuơi cấy vơ thời hạn. ðến năm 1948, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………13 Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mơ sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhĩm auxin được tổng hợp như naphthylacetic acid (NAA), 2,4 – Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mơ sẹo gây phân chia tế bào thành cơng ở nhiều đối tượng thực vật trước đĩ khĩ nuơi cấy. Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trị của chất kích thích sinh trưởng là 6 – Furfuryl aminopurin (kinein). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ hai. Năm 1957, Miller và Skoog cơng bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong mơi trường nuơi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mơ sẹo cĩ khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mơ sẹo cĩ khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đĩng gĩp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh các cơ quan của mơ, tế bào trong nuơi cấy. Thành cơng của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuơi cấy tế bào thực vật. Những thành cơng trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuơi cấy mơ, tế bào thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỷ thuật nuơi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai tây và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuơi cấy tế bào thực vật, đĩ là vi nhân giống. Từ những năm 1960, ngồi các hướng trên, nuơi cấy bao phấn và hạt phấn, nuơi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuơi cấy mơ, tế bào thực vật. ðĩ là giai đoạn nuơi cấy mơ, tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………14 2.3.2. Cơ sở lý luận của nuơi cấy mơ, tế bào thực vật. Cơ sở lý luận của phương pháp nuơi cấy mơ, tế bào in vitro là học thuyết về tính tồn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật người ðức, tất cả các tế bào của cây đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều cĩ khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hồn chỉnh [24]. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hồn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm lồi cây trồng đã được nhân giống trên qui mơ thương mại bằng cách nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo vơ trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vơ cùng lớn (Murashige, 1980) [41]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuơi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hĩa và phản phân hĩa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phơi sinh. Sự chuyển tế bào phơi sinh thành các tế bào chuyên hĩa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hĩa tế bào. Cịn quá trình phản phân hĩa thì ngược lại với quá trình phân hĩa, cĩ nghĩa là tế bào đã phân hĩa thành mơ chức năng khơng hồn tồn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng cĩ thể trở về dạng phơi sinh và tái phân chia. Các quá trình trên cĩ thể tĩm tắt như sau: Ví dụ như khi nuơi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện mơi trường thích hợp, các tế bào đã phân hĩa của lá, đốt thân sẽ phản phân hĩa, phân chia trở lại thành mơ sẹo, khơng cịn là tế bào cĩ chức năng như tế bào lá, đốt thân nữa. Nếu chuyển sang mơi trường khác thì tùy theo thành Tế bào dãn Phân hĩa tế bào Phản phân hĩa tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chuyên hĩa Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………15 phần mơi trường mà các tế bào mơ sẹo cĩ thể phân hĩa theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay cây hồn chỉnh...). Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hĩa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều cĩ một số gen nhất định được hoạt hĩa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. ðiều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hĩa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luơn được hài hịa. Mặt khác, khi nằm trong khối mơ bình thường, tế bào luơn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh khơng cịn nữa thì các gen được hoạt hĩa và quá trình phân hĩa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn [16]. 2.3.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro cĩ khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm chính: - Cây con được trẻ hĩa và sạch bệnh, vì vậy cĩ tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. - Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dịng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây cĩ genotip mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu giữ tập đồn gen. - Cĩ khả năng sản xuất quanh năm. - Cĩ thể nhân nhanh nhiều cây khơng kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở lồi cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà [3]. Trong cơng tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………16 lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hồn tồn sạch virus. Limasset và Cornel (1945) [36] đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hồn tồn sạch virus (Morel và Martin, 1952) [37]. Nguyên nhân của hiện tượng này là: - ðỉnh sinh trưởng khơng cĩ hệ mơ dẫn, làm cho virus và vi sinh vật khơng cĩ khả năng thâm nhập. - ðỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin cĩ tác dụng ức chế sinh sản của virus. - Quá trình phân chia của tế bào phơi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) khơng kéo theo sự phân chia của virus. Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp khơng gì cĩ thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Chỉ tính riêng lĩnh vực true-to-type, nuơi cấy in vitro cĩ thể coi là một cuộc đại cách mạng về hệ số nhân. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân cĩ thể tạo ra hàng chục vạn cây D.fLoribunda trong vịng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979) [27], (Phạm Văn Hiển và cs, 1988) [7] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng (Shah, Dalal, 1980) [43] từ một lát cắt ban đầu. Thơng thường một cây D.foLoribunda chỉ tạo ra 8-10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5-7 cây nếu nhân giống bằng cành. Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vịng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [13]. ðặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10-15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khĩ khăn [23]. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta cĩ thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vịng một năm (Staricky, 1970) [49]. Nhược điểm chính của phương pháp nuơi cấy in vitro là địi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ cĩ hiệu quả đối với những cây cĩ giá trị cao hoặc khĩ nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) [44]. Ngồi ra, phương pháp này cịn cĩ những bất lợi sau: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………17 - Mặc dù số lượng cây giống thu được cĩ thể rất cao nhưng cây con cĩ kích thước nhỏ, địi hỏi phải cĩ chế độ chăm sĩc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây cĩ thể cĩ những đặc tính khơng mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh cĩ thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần. - Cây giống cĩ thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho cơng tác chọn giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực cĩ củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhĩm cây thân thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhĩm thân gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vơ trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản và lưu giữ các tập đồn giống nhân giống vơ tính và các lồi giao phấn trong ngân hàng gen. 2.3.4. Kỹ thuật nuơi cấy in vitro Kỹ thuật nuơi cấy in vitro cĩ thể chia thành các bước sau: + Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp Nguyên liệu sử dụng cho nuơi cấy mơ, tế bào thực vật cĩ thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá...), các cấu trúc của phơi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, nỗn... thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành...) cũng được dùng cho nuơi cấy [23]. + Khử trùng mẫu và tiến hành nuơi cấy Nguyên liệu để nuơi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………18 của lồi, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều cĩ nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với mơi trường xung quanh. Cĩ một số bộ phận như phơi trong hạt, mơ trong quả, dịng lúa non... ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, cĩ lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thơng dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuơi cấy là sử dụng các hĩa chất cĩ hoạt tính diệt khuẩn và nấm [24]. Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hĩa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mơ cấy. ðể làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70-80% trong 30 giây, sau đĩ mới xử lý bằng dụng dịch diệt khuẩn. ðối với những mẫu cĩ bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol... vì các chất này làm tăng tính bám dính của hĩa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phịng và để dưới vịi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ cĩ tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy (Narayanswamy S., 1997) [42]. Tác nhân khử trùng, ngồi tác dụng diệt vi sinh vật cịn ảnh hưởng đến mơ cấy vì vậy việc lựa chọn loại hĩa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hĩa chất hay được sử dụng để khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay được sử dụng hơn cả vì cĩ độc tính thấp đối với mơ được xử lý, khơng gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của canxi hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5-15% và 0,5-2% trong thời gian 15-30 phút. Tuy nhiên, những chất này khơng bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế. + Xác định điều kiện nuơi cấy (mơi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển mơ nuơi cấy theo định hướng. Thành cơng của phương pháp nuơi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuơi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………19 ưu của các lồi là khơng giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau (Murashige và Skoog, 1962) [39]. Sự lựa chọn mơi trường nuơi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hĩa chất sử dụng đĩng vai trị quyết định đối với bản thân sự phân hĩa và chiều hướng phân hĩa của tế bào. Cho đến nay, đã cĩ nhiều loại mơi trường dinh dưỡng được tìm ra: mơi trường Murashige và Skoog (1962), mơi trường Linsmaer và Skoog (1963), mơi trường Gamborg (1968), mơi trường Knop (1974)... ðây là những mơi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại mơi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đĩ, mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các lồi thực vật và chính Murashige (1974) đã dùng mơi trường này để nuơi cấy nhiều lồi cây trồng [40]. Thành phần chủ yếu của tất cả các loại mơi trường gồm những nhĩm chất sau: muối khống đa lượng và vi lượng (muối chlorid, nitral, sulphat, chất tham gia điều chỉnh sự phân hĩa của rễ, chồi... (Bhojwani and Razdan, 1983) [26]. Các auxin đều cĩ hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng độ từ 10-1M đến 10-6M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Auxin được thêm vào mơi trường nuơi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hĩa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mơ sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuơi cấy mơ là IBA (indol butyric acid), α-NAA (α-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indol acetic acid). Cytokinin là nhĩm phytohormon dẫn xuất của adenin, cĩ vai trị sinh lý tương tự nhau. Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hĩa các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hĩa chồi từ mơ sẹo nuơi cấy... Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………20 rễ (Narayanaswamy S., 1997) [42]. Các cytokinin thường được dùng trong nuơi cấy là kinetin, 2ip, BAP (benzylaminopurin) với nồng độ 10-4-10-7M. Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hĩa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhĩm auxin và cytokinin. Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi. Ở tỷ lệ trung gian, mơ sẹo được hình thành. ðây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái của mơ nuơi cấy. Các mơ khác nhau cĩ phản ứng khơng giống nhau. Vì vậy, với từng loại mơ và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm được tổ hợp nồng độ auxin-cytokinin thích hợp cĩ ý nghĩa rất quan trọng. + ðưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên. ðây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hồn tồn. Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần. 2.3.5. Các đường hướng nhân giống vơ tính in vitro Khả năng thành cơng của nuơi cấy mơ, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào. Tế bào càng gần trạng thái phơi sinh bao nhiêu, khả năng nuơi cấy thành cơng càng cao bấy nhiêu. Như vậy tế bào phơi thường cĩ triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chĩp rễ) và sau đĩ là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). Trong nhân giống in vitro, cây con cĩ thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng cĩ sẵn trong các bộ phận (phơi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mơ cĩ khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ. Cĩ hai phương pháp tái sinh cây con: + Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phơi, ngọn, chồi hay chồi nách. + Tái sinh cây gián tiếp thơng qua giai đoạn hình thành mơ sẹo. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………21 Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuơi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mơ nuơi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phơi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho lồi. Cây con tạo ra theo con đường này hồn tồn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983) [33]. Trong đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuơi cấy khơng tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mơ sẹo (callus). Cĩ thể thấy ngay là hệ số nhân của con đường này vơ cùng lớn. Từ một khối mơ sẹo cĩ thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thơng qua kỹ thuật tạo phơi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Nhiều cây tái sinh từ mơ sẹo cĩ thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền. Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mơ sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể khơng giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân (endomitosis hay endoreduplication). Nội nguyên phân là hiện tượng nhân đơi nhiễm sắc thể khơng kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của các thành phần của mơi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuơi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần (D’Amato, 1977) [30]. ðột biến tuy khơng cĩ lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền (trueness-to-type) trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Ngồi việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mơ sẹo cịn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc cơng nghệ gen. Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo đường hướng trực tiếp, cịn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………22 2.3.6. Quy trình nhân giống in vitro Theo Debergh (1991) [31] thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: 2.3.6.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu ðây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống. Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng. Mỗi cây đều cĩ ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với cây nhiệt đới và á nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991) [31]. 2.3.6.2. Tái sinh mẫu nuơi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuơi cấy. Mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu. Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu. Khả năng thành cơng của nuơi cấy mơ, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng thái phơi sinh bao nhiêu thì nuơi cấy càng cĩ khả năng thành cơng bấy nhiêu. Như vậy, tế bào phơi thường cĩ triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đĩ là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). 2.3.6.3. Nhân nhanh chồi ðây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống (liên quan đến hệ số nhân chồi). Mơi trường ở giai đoạn này được bổ sung hormon sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux. Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hĩa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20-300C. 2.3.6.4. Tái sinh rễ Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang mơi trường tạo rễ. Mơi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở mơi trường khơng cĩ chất sinh trưởng (Bhojwani và Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………23 Razdan, 1983) [26]. 2.3.6.5. ðưa cây in vitro ra đất Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của mơi trường, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con. 2.4. Những nghiên cứu về nuơi cấy mơ cây hoa huệ trong nước và trên thế giới. 2.4.1. Những nghiên cứu về nuơi cấy mơ cây hoa huệ ở Việt Nam. Hoa huệ khi nhân giống bằng củ thường cho hệ số nhân thấp. Mặt khác, nếu nhân giống theo phương pháp truyền thống liên tục trong nhiều năm sẽ làm lây lan các mầm bệnh sẵn cĩ trong củ, tăng lượng virus tích lũy trong củ, và cĩ thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cây sinh trưởng kém, hoa nhỏ và ra ít. ðể khắc phục nhược điểm trên người ta đã sử dụng phương pháp nuơi cấy mơ, tế bào. Cây hoa huệ là một đối tượng mới của phương pháp nuơi cấy mơ ở nước ta. Hiện nay, mới chỉ cĩ một vài nghiên cứu bước đầu được thực hiện và cho kết quả. Năm 2006, trước tình hình diễn biến bệnh chai bơng gây hậu quả nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất hoa huệ tại ðồng bằng sơng Cửu Long, Nguyễn Lê Trâm Anh dưới sự hướng dẫn của T.S Nguyễn Bảo Tồn và các cộng sự ở Bộ mơn Sinh lý Sinh hĩa, Khoa Nơng nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường ðại học Cần Thơ đã tiến hành nuơi cấy phân sinh mơ chồi cây huệ. Từ cây huệ bị nhiễm bệnh ngồi đồng, các tác giả đã phân lập phân sinh mơ chồi. Phân sinh mơ chồi (cịn gọi là đỉnh sinh trưởng) là nơi tận cùng của chồi hoặc rễ. Khi phân sinh mơ chồi phát triển, nĩ cĩ thể phát sinh chồi, lá non hoặc hoa. ðể phân lập phân sinh mơ chồi, các tác giả đã dùng 2 biện pháp: phân lập trực tiếp từ chồi ngọn được lấy ngồi đồng và phân lập gián tiếp từ nuơi cấy mầm trong ống nghiệm. Các phân sinh mơ chồi sau khi phân lập, được nuơi cấy trong ống nghiệm với các chất điều hịa sinh trưởng và các chất dinh dưỡng để tạo ra cây con. Các tác giả đã nhận thấy mơi trường MS bổ sung 0,25 mg/l 2,4-D là mơi trường tốt nhất kích thích mẫu tạo chồi. Cũng theo kết quả này, trên nền mơi trường MS bổ sung các loại auxin khác nhau thì sự gia tăng kích thước đỉnh sinh trưởng, số chồi tạo thành và chiều cao chồi tái sinh khác biệt khơng ý nghĩa. Mơi trường nuơi cấy tạo cây hồn chỉnh là MS + 3g/l Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………24 than hoạt tính + 500 ml nước dừa + 0,125 mg/l 2,4-D [2]. Sau đĩ, khi nghiên cứu mơi trường nhân nhanh cây hoa huệ bằng phương pháp nuơi cấy in vitro, Huỳnh Thị Huế Trang đã sử dụng chồi cây huệ được tái sinh từ đỉnh sinh trưởng của nghiên cứu trên để làm vật liệu nghiên cứu, đã xác định mơi trường nhân nhanh tốt đối với cây hoa huệ là mơi trường MS bổ sung 1mg/l BA đạt hệ số nhân chồi 6,3. Mơi trường tốt nhất cho quá trình tạo cây hồn chỉnh là MS + 3 g/l than hoạt tính + Atonik 10 ml. Thuần dưỡng cây huệ trên giá thể Xơ dừa và phủ bằng khay mủ cĩ lỗ thống khí cho tỷ lệ sống cao nhất [18]. 2.4.2. Những nghiên cứu nuơi cấy mơ cây hoa huệ trên thế giới. Nuơi cấy mơ cây hoa huệ trên thế giới đã đạt được nhiều thành cơng trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Theo các nguồn tài liệu, các nghiên cứu về nuơi cấy mơ cây hoa huệ được các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu tiến hành từ năm 1998 và đã thu được nhiều thành cơng. Khi nuơi cấy các chồi ngủ của cây hoa huệ trên mơi trường MS cĩ bổ sung IAA, BA với các nồng độ khác nhau, Sangavai C và Chellapandi P (1998) đã đưa ra kết luận rằng khi nồng độ BA là 0,5 mg/l thì khả năng tái sinh của các chồi ngủ là cao nhất (98%) với tỷ lệ hình thành chồi trung bình là 2,2 ± 1,2 chồi/ mẫu. Sau khi các chồi ngủ được tái sinh trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5mg/l BA thì ơng tiến hành lấy nguồn mẫu lá trên chồi huệ tái sinh để tiến hành thí nghiệm phân tích một số chất và các thành phần hĩa học quan trọng của cây hoa huệ [46]. Cũng trong thí nghiệm này, Chellapand P (1998) đã tiến hành các nghiên cứu về ảnh hưởng tổ hợp của IAA và BA đến sự hình thành callus và tạo chồi từ các chồi ngủ cây hoa huệ. Khi cảm ứng để tạo callus trên các mơi trường cĩ bổ sung các nồng độ IAA khác nhau từ 0,5-3,5mg/l tổ hợp với BA nồng độ 0,5mg/l thì kết quả cho thấy ở mơi trường cĩ bổ sung 3,0mg/l IAA và 0,5mg/l BA cho tỷ lệ tạo callus trung bình nhiều nhất là 37,8 ± 1,2. Sau đĩ, các callus tạo thành được cấy chuyển sang mơi trường MS chứa 35g/l saccaroza cĩ bổ sung tổ hợp BA với nồng độ thay đổi từ 0,5-2mg/l và 0,5mg/l IAA ơng đã đưa ra kết luận trên mơi trường cho tỷ lệ callus tạo chồi đạt cao nhất (87%) là MS cĩ bổ sung 1,5mg/l BA và 0,5mg/l IAA. Cũng trên mơi trường này, sự tái sinh chồi đạt được trung bình là 2,3 ± 1,2 chồi/callus [46]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………25 Một nghiên cứu khác cũng tiến hành nhằm cảm ứng tạo callus từ các chồi ngủ cây hoa huệ của Muhamdad (2003). Ơng tiến hành thí nghiệm và đã tạo callus từ các chồi ngủ hoa huệ từ trên mơi trường MS cĩ bổ sung α-NAA nồng độ 1mg/l. Sau đĩ, các callus được cấy chuyển sang mơi trường MS bổ sung 0,4mg/l 2,4-D thì hệ số nhân chồi là 4 chồi/callus. Các chồi tạo thành được tách ra và cấy chuyển sang mơi trường MS bổ sung 0,1mg/l L-arginine thì số chồi tăng lên 10 chồi/callus sau 12 tuần nuơi cấy. Khi các chồi tạo thành cĩ chiều cao khoảng 2-3cm tiếp tục cấy chuyển sang mơi trường MS bổ sung 2mg/l BA tổ hợp với 2,4-D nồng độ 0,4mg/l thì thấy các chồi mới mọc lên rất nhanh tại chính vị trí cắt [38]. Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ, BA, NAA và một số auxin khác đến quá trình nhân giống in vitro cây hoa huệ. Kết quả thí nghiệm của Hutchinson, M.J., Onamu, R., Obukosia, S. (2004) cho thấy khi tổ hợp TDZ và BA với nồng độ thấp dưới 0,5mg/l thì cĩ hiệu quả cao nhất, nĩ làm tăng nhanh chiều cao chồi trung bình từ 0,7-1cm và chiều dài của lá/chồi trung bình đạt từ 2,7-3,2cm sau 2 tuần nuơi cấy. Tuy nhiên, khi nồng độ TDZ sử dụng cao hơn 0,5mg/l thì gây độc và cĩ thể làm chồi bị chết. Ngồi ra, khi kết hợp giữa NAA và TDZ hoặc ._.AGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 4.8048 2.3053 0.24398E-01 0.5 0.0000 CAO CHOI 21 3.6576 0.38564 0.27080E-01 0.7 0.0000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………100 Thí nghiệm 7. Ảnh hưởng của BA và IAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 94.9581 15.8263 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 14 .149994E-01 .107139E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 94.9731 4.74865 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 1.90786 .317976 106.84 0.000 2 * RESIDUAL 14 .416668E-01 .297620E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.94952 .974762E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.08333 3.96667 2 3 1.66667 3.41667 3 3 3.13333 3.23333 4 3 4.21667 3.08333 5 3 6.06667 3.26667 6 3 6.45000 3.06667 7 3 6.61667 3.03333 SE(N= 3) 0.188978E-01 0.314971E-01 5%LSD 14DF 0.573213E-01 0.955377E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN7 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 4.1762 2.1791 0.32732E-01 0.8 0.0000 CAO CHOI 21 3.2952 0.31221 0.54555E-01 1.7 0.0000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………101 Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 36.6514 6.10857 434.84 0.000 2 * RESIDUAL 14 .196671 .140480E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 36.8481 1.84240 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 3.29143 .548571 25.04 0.000 2 * RESIDUAL 14 .306667 .219048E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 3.59810 .179905 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.00000 4.16667 2 3 1.46667 3.76667 3 3 2.18333 3.93333 4 3 4.65000 3.16667 5 3 4.60000 2.93333 6 3 3.18333 3.63333 7 3 2.68333 3.53333 SE(N= 3) 0.684299E-01 0.854493E-01 5%LSD 14DF 0.207563 0.259187 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN8 10/ 8/** 18:18 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 2.8238 1.3574 0.11852 4.2 0.0000 CAO CHOI 21 3.5905 0.42415 0.14800 4.1 0.0000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………102 Thí nghiệm 9. Ảnh hưởng của kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 54.2698 9.04496 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 14 .113339 .809566E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 54.3831 2.71915 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 1.82416 .304027 79.81 0.000 2 * RESIDUAL 14 .533335E-01 .380953E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 1.87750 .938748E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 1.00000 4.08000 2 3 1.16667 4.13667 3 3 2.90000 3.95000 4 3 3.55000 4.03333 5 3 4.66667 3.66667 6 3 5.20000 3.36667 7 3 4.90000 3.43333 SE(N= 3) 0.519476E-01 0.356349E-01 5%LSD 14DF 0.157569 0.108088 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN9 10/ 8/** 18:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 21 3.3405 1.6490 0.89976E-01 2.7 0.0000 CAO CHOI 21 3.8095 0.30639 0.61721E-01 1.6 0.0000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………103 Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của nước dừa đến hệ số nhân chồi và chất lượng chồi. BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 3.18567 .796417 116.55 0.000 2 * RESIDUAL 10 .683335E-01 .683335E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3.25400 .232429 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CAO CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.48833 .622083 373.24 0.000 2 * RESIDUAL 10 .166669E-01 .166669E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.50500 .178929 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS HSN CAO CHOI 1 3 7.00000 3.13333 2 3 7.01667 3.85000 3 3 7.48333 4.06667 4 3 7.85000 4.21667 5 3 6.50000 4.23333 SE(N= 3) 0.477261E-01 0.235704E-01 5%LSD 10DF 0.150387 0.742711E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN10 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 15 7.1700 0.48211 0.82664E-01 1.2 0.0000 CAO CHOI 15 3.9000 0.42300 0.40825E-01 1.0 0.0000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………104 Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 CHOI TY LE MAU TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 8666.67 1733.33 249.60 0.000 2 * RESIDUAL 12 83.3334 6.94445 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 8750.00 514.706 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 93.6776 18.7355 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .219541 .182951E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 93.8971 5.52336 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CAO CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 .183133 .366266E-01 13.62 0.000 2 * RESIDUAL 12 .322667E-01 .268889E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 .215400 .126706E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS CHOI HSN CAO CHOI 1 3 41.6667 1.20000 2.67667 2 3 100.000 4.33333 2.46667 3 3 100.000 6.91667 2.43333 4 3 100.000 8.28333 2.39333 5 3 83.3333 6.76333 2.41000 6 3 65.0000 5.32667 2.38000 SE(N= 3) 1.52145 0.780921E-01 0.299382E-01 5%LSD 12DF 4.68811 0.240628 0.922498E-01 ------------------------------------------------------------------------------- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………105 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN11 29/ 8/** 9: 7 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHOI 18 81.667 22.687 2.6352 3.2 0.0000 HSN 18 5.4706 2.3502 0.13526 2.5 0.0000 CAO CHOI 18 2.4600 0.11256 0.51854E-01 2.1 0.0002 Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh bằng phương pháp nuơi cấy protocorm BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 CHOI TY LE MAU TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 12 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 HSN HE SO NHAN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 17.3490 3.46981 462.64 0.000 2 * RESIDUAL 12 .899996E-01 .749997E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 17.4390 1.02583 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CHOI FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CAO CHOI CHOI CHOI CHIEU CAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 .721250 .144250 173.10 0.000 2 * RESIDUAL 12 .100000E-01 .833334E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 .731250 .430147E-01 ----------------------------------------------------------------------------- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………106 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS CHOI HSN CAO CHOI 1 3 100.000 8.23333 2.31667 2 3 100.000 8.38333 2.66667 3 3 100.000 8.53333 2.86667 4 3 100.000 7.51667 2.88333 5 3 100.000 6.38333 2.63333 6 3 100.000 6.03333 2.48333 SE(N= 3) 0.000000 0.499999E-01 0.166667E-01 5%LSD 12DF 0.000000 0.154067 0.513557E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN12 29/ 8/** 9:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHOI 18 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 HSN 18 7.5139 1.0128 0.86602E-01 1.2 0.0000 CAO CHOI 18 2.6417 0.20740 0.28868E-01 1.1 0.0000 Thí nghiệm13: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TY LE RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 TY LE RE TY LE RA RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 10 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO RE SO RE TREN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 87.5173 21.8793 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 10 .800008E-01 .800008E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 87.5973 6.25695 ----------------------------------------------------------------------------- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………107 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB RE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CDTB RE CHIEU DAI TRUNG BINH RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 16.7773 4.19433 399.46 0.000 2 * RESIDUAL 10 .105000 .105000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 16.8823 1.20588 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CAY FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V006 CAO CAY CHIEU CAO CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.86000 .715000 59.58 0.000 2 * RESIDUAL 10 .120000 .120000E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2.98000 .212857 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V007 SO LA SO LA TREN CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4.32933 1.08233 13.53 0.001 2 * RESIDUAL 10 .800001 .800001E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.12933 .366381 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TY LE RE SO RE CDTB RE CAO CAY 1 3 100.000 2.86667 2.03333 4.50000 2 3 100.000 4.40000 2.16667 5.26667 3 3 100.000 6.80000 3.13333 5.36667 4 3 100.000 8.33333 4.30000 5.60000 5 3 100.000 9.36667 4.60000 5.76667 SE(N= 3) 0.000000 0.516400E-01 0.591607E-01 0.632455E-01 5%LSD 10DF 0.000000 0.162720 0.186418 0.199289 CT$ NOS SO LA 1 3 5.13333 2 3 5.23333 3 3 6.06667 4 3 6.40000 5 3 6.30000 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………108 SE(N= 3) 0.163299 5%LSD 10DF 0.514562 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN13 10/ 8/** 18:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TY LE RE 15 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 SO RE 15 6.3533 2.5014 0.89443E-01 1.4 0.0000 CDTB RE 15 3.2467 1.0981 0.10247 3.2 0.0000 CAO CAY 15 5.3000 0.46136 0.10954 2.1 0.0000 SO LA 15 5.8267 0.60529 0.28284 4.9 0.0006 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………109 Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ BALANCED ANOVA FOR VARIATE TY LE RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 TY LE RE LE RE TY LE RA RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 0.000000 0.000000 0.00 1.000 2 * RESIDUAL 12 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 0.000000 0.000000 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO RE RE SO RE TREN CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 77.3267 15.4653 592.29 0.000 2 * RESIDUAL 12 .313335 .261112E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 77.6400 4.56706 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTB RE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CDTB RE RE CHIEU DAI TRUNG BINH RE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 24.4752 4.89504 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .485340E-01 .404450E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 24.5237 1.44257 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO CAY FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V006 CAO CAY CAY CHIEU CAO CAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 5.87176 1.17435 162.35 0.000 2 * RESIDUAL 12 .868003E-01 .723336E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 5.95856 .350504 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V007 SO LA LA SO LA TREN CAY Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………110 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 4.81833 .963667 78.85 0.000 2 * RESIDUAL 12 .146667 .122222E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 4.96500 .292059 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS TY LE RE SO RE CDTB RE CAO CAY 1 3 100.000 4.20000 1.16667 4.43333 2 3 100.000 7.60000 3.23667 4.83333 3 3 100.000 8.33333 3.11000 5.66333 4 3 100.000 9.26667 4.21000 5.66667 5 3 100.000 10.6000 4.60000 6.05333 6 3 100.000 9.80000 4.39000 5.76667 SE(N= 3) 0.000000 0.932938E-01 0.367174E-01 0.491031E-01 5%LSD 12DF 0.000000 0.287470 0.113139 0.151303 CT$ NOS SO LA 1 3 5.13333 2 3 5.33333 3 3 5.96667 4 3 6.20000 5 3 6.56667 6 3 6.30000 SE(N= 3) 0.638285E-01 5%LSD 12DF 0.196677 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN14 10/ 8/** 18:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TY LE RE 18 100.00 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 SO RE 18 8.3000 2.1371 0.16159 1.9 0.0000 CDTB RE 18 3.4522 1.2011 0.63596E-01 1.8 0.0000 CAO CAY 18 5.4028 0.59203 0.85049E-01 1.6 0.0000 SO LA 18 5.9167 0.54042 0.11055 1.9 0.0000 Thí nghiệm 15. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 SONG TY LE SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1491.26 745.632 201.72 0.000 2 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………111 * RESIDUAL 6 22.1779 3.69631 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1513.44 189.180 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO LA FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SO LA SO LA TRUNG BINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 8.90889 4.45445 125.28 0.000 2 * RESIDUAL 6 .213333 .355555E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 9.12222 1.14028 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS SONG SO LA 1 3 61.1100 4.43333 2 3 81.1100 6.00000 3 3 92.2200 6.83333 SE(N= 3) 1.11000 0.108866 5%LSD 6DF 3.83967 0.376585 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN15 29/ 8/** 9:29 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SONG 9 78.147 13.754 1.9226 2.5 0.0000 SO LA 9 5.7556 1.0678 0.18856 3.3 0.0001 ._.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfCH2836.pdf
Tài liệu liên quan