Báo cáo nghiên cứu khoa học - Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà rịa vũng tàu và nghiên cứu ứng dụng trong dược mỹ phẩm

xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong Dược Mỹ Phẩm. Mã số: 1459/HD-BVU 2. Chủ nhiệm đề tài: Tống Thị Ngọc Bé, sinh viên lớp DH15HC, Viện: Kỹ thuật – Kinh Tế biển, Trường: Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. 3. Nội dung chính: - Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. - Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 4. Kết quả đạt được: - Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là: Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 OC, thời gian: 35 phút. - Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần. Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%. Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41% - Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá chè. - Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ. - Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml). - Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế. - Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm). 5. Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019. 6. Chữ ký của CNĐT:. MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... iii DANH MỤC SƠ ĐỒ ......................................................................................................... iv MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 1.1. Giới thiệu chung về cây chè ..................................................................................... 5 1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè ................................................................ 5 1.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 5 1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam .................................................................... 6 1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè ............................................................... 6 1.1.5. Dược tính của chè ............................................................................................... 8 1.2. Polyphenol trong chè................................................................................................ 9 1.2.1. Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật. ................ 9 1.2.2. Các hợp chất Polyphenol có trong chè ............................................................. 10 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè ......... 16 1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ........................... 17 1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè ............................................................. 22 1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè ................................................................................................................................... 24 1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly .......................................................................... 24 1.3.2. Các phương pháp trích ly .................................................................................. 24 1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm ................................................................................................................. 28 1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi ............................................. 28 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ....................................................................... 30 1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly ...................................................................... 30 1.4.4. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................ 31 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ..................................................... 31 1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh ........................................................ 32 1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................................................. 33 1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn ......................................................................... 33 1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ........................................... 42 1.5. Phương pháp Sấy thăng hoa ................................................................................. 44 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................ 46 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 46 2.1.1. Nguyên liệu chè ................................................................................................ 46 2.1.2. Chủng vi sinh vật .............................................................................................. 46 2.1.3. Hóa chất, thiết bị ............................................................................................... 46 2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis ........................ 47 2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số .................................... 47 2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic .............................................. 48 2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè ............................................ 49 2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ ............................................. 49 2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác ......................................................................... 52 2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ enzym .......................................................................................................................... 52 2.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá............................................................. 53 2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè ............................................ 53 2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè ................................... 54 2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử .. 54 2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) .................. 56 2.4.3. Định tính bằng UV-VIS .................................................................................... 56 2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC ............................................. 57 2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè ................................................... 57 2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè ....................................... 57 2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................... 58 2.6. Khảo sát các quy trình quy trình sấy ................................................................... 61 2.6.1. Sấy nhiệt độ cao ................................................................................................ 61 2.6.2. Sấy thăng hoa .................................................................................................... 61 2.7. Nghiên cứu ứng dụng cao lá chè trong sản phẩm kem dưỡng da ..................... 62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 64 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè ......................... 64 3.1.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ .... 64 3.1.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym .. 65 3.1.3. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa .......... 65 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol ...................................................................................................................... 66 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ............... 66 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng .............................. 67 3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng . 68 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng ............................... 69 3.2.5. Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng ....................................... 70 3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè..................................................................................................... 71 3.4. Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác ....................................................... 72 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách polyphenol ...................................................................................................................... 73 3.5.1. Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol ...... 73 3.5.2. Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol ....... 74 3.6. Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng ................................................................................................................................. 75 3.7. Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ..................................... 76 3.7.1. Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử ......................................... 76 3.7.2. Định tính bằng TLC .......................................................................................... 77 3.7.3. Định tính bằng UV – VIS ................................................................................. 78 3.7.4. Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC ...................................................... 79 3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè .................................................. 80 3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa ................................................................................. 80 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn ...................................................................................... 82 3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè .............................. 85 3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè .................................................................................................................. 86 3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè ...................................................................... 87 3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da ................................................................... 89 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 92 4.1. Kết luận ................................................................................................................... 92 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 94 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C Catechin CG Catechingallate CK Chất Khô DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl EC Epicatechin ECG Epicatechingallate EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechingallate GC Gallocatechin GCG Gallocatechingallate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao MIC Minimum inhibitory concentration TLC Sắc ký lớp mỏng UV Vùng tử ngoại VIS Khả kiến i DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu ............................................................. 21 Bảng 3. 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 64 Bảng 3. 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 65 Bảng 3. 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 65 Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng .......... 66 Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng ......................... 67 Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ................................................................................................................................ 68 Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .................. 69 Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng .................................. 70 Bảng 3. 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá .................................. 71 Bảng 3. 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác ......................................................... 72 Bảng 3. 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol ..................................................................................................................... 73 Bảng 3. 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol ..................................................................................................................... 74 Bảng 3. 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol ........................... 76 Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất ................................................. 77 Bảng 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol .............................. 78 Bảng 3. 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế ................................. 78 Bảng 3. 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol ....................................................... 79 Bảng 3. 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................. 80 Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ ............................... 81 Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ .................................................. 81 Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè ............................................... 83 Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol ................................. 86 Bảng 3. 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da ................................................ 90 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT ........................................ 5 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của catechin .................................................................... 11 Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG ................................................................. 11 Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của ECG ......................................................................... 13 Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) ......................................................... 13 Hình 1. 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin ........................................................... 14 Hình 1. 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin ........................................... 16 Hình 1. 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi ............................................... 34 Hình 1. 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi ............................................... 35 Hình 1. 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi ...................................................... 37 Hình 1. 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi ................................... 38 Hình 1. 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi .............................. 41 Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý ..................................................................................... 50 Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách ......................................................................................... 51 Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS ......................................................................................... 51 Hình 2. 4: Hệ thống cô quay chân không ...................................................................... 51 Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme ........................................................................ 53 Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................... 57 Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá ..................................................................... 58 Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 59 Hình 2. 9: Tủ sấy nhiệt độ cao ....................................................................................... 61 Hình 2. 10: Thiết bị sấy thăng hoa ................................................................................ 62 Hình 3. 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 64 Hình 3. 2: Đường chuẩn axit gallic ............................................................................... 64 Hình 3. 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 65 Hình 3. 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 66 Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng ................ 66 iii Hình 3. 6: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol tổng ............... 68 Hình 3. 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ............................................................................................................. 69 Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .............. 70 Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng ........ 71 Hình 3. 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá .................................................. 72 Hình 3. 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng polyphenol tổng ............................................................................................................. 73 Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng ....................................................................................................................................... 74 Hình 3. 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng ....................................................................................................................................... 74 Hình 3. 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat ........................ 75 Hình 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol ............................... 76 Hình 3. 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm ............................. 77 Hình 3. 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế .............. 79 Hình 3. 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ........................................................ 80 Hình 3. 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá ......................................................... 81 Hình 3. 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ ................................................... 82 Hình 3. 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè .................... 83 Hình 3. 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè ............................. 84 Hình 3. 24: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol ..... 85 Hình 3. 23: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol .............. 86 Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa ....................................................... 87 Hình 3. 25: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè .............................................................. 90 iii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. 1: Phân loại polyphenol ................................................................................... 10 Sơ đồ 1. 2: Quy trình tinh chế polyphenol .................................................................... 32 Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết tách polyphenol .................................................................. 49 Sơ đồ 2. 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol........................................................................... 54 iv Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây chè là sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta, theo thống kê của Hiệp hội Chè Việt Nam, khối lượng xuất khẩu chè tháng 8 năm 2017 ước đạt 13 nghìn tấn đưa khối lượng xuất khẩu chè 8 tháng đầu năm 2017 ước đạt 90 nghìn tấn. Đối với tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu có thuận lợi về khí hậu và địa hình nương rẫy, phù hợp cho diện tích trồng chè lớn.[77] Ngành công – nông nghiệp và thương mại chè đã giải quyết công ăn việc làm cho hàng triệu lao động, đặc biệt ở các vùng khó khăn, vùng trung du đồi núi. Theo thống kê của Tổng cục hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kim ngạch xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD. Điều này cho thấy, sản phẩm chè Việt Nam đã có chỗ đứng trên thị trường thế giới và đã có đóng góp không nhỏ vào nền kinh tế nước nhà. Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè và các sản phẩm từ chè Việt Nam hiện nay chưa tương xứng với tiềm năng của nó, đời sống người trồng và chế biến chè vẫn khó khăn do giá trị sản phẩm thấp. Do vậy, cần đẩy mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến, đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (polyphenol) nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Việt Nam. Nhiều kết quả ngiên cứu cho thấy hợp chất trong chè xanh có hoạt tính sinh học như: hoạt tính chống oxy hóa, chống xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch, ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm.[78] Liên quan đến hoạt tính sinh học, Fumio và cộng sự [35] đã chỉ ra rằng, khả năng quét gốc tự do DPPH của các catechin chè cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C. Ngoài ra, hoạt tính này của chè xanh cũng cao gấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương.[70] Gần đây, khi so sánh khả năng quét gốc tự do DPPH của chè vàng (một loại chè bán lên men) với một số đối tượng khác, Barhe và Tchouya[23] cũng chỉ ra rằng, hoạt tính này của chất chiết chè vàng > chất chiết đỗ tương > vang đỏ > hibiscus. Bên cạnh hoạt tính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol (chất chiết chè) có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối hỏng thực phẩm.[21][49] Điều này cho thấy, đối tượng này không chỉ có tiềm năng ứng dụng cao trong mỹ phẩm, dược phẩm mà còn mở ra những ứng dụng quan trọng trong GVHD: Tống Thị Minh Thu 1 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học chè như một chất bảo quản tự nhiên không độc hại. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong bối cảnh hiện nay,khi tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang ngày càng trở lên trầm trọng, mất kiểm soát ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Có thể thấy, mặc dù việc nghiên cứu chiết xuất polyphenol trong lá chè xanh cũng như việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học của chúng đã được báo cáo. Tuy nhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quả chiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó áp dụng trong điều kiện Việt Nam hiện nay như trích ly có hỗ trợ vi sóng hay trích ly dùng sóng siêu âm, nhiều công trình nghiên cứu và khai thác hoạt tính sinh học của Polyphenol từ chè xanh, nhưng ở Việt Nam vấn đề này còn khá mới mẻ, nhất là hoạt tính kháng khuẩn. Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học có trong lá chè xanh vẫn cần phải được nghiên cứu sâu hơn và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường, đặc biệt đối với những khu vực có trữ lượng trà xanh lớn như các nước Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ.... Vì vậy; trong nghiên cứu này này, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách hợp chất POLYPHENOLS ứng dụng trong Dược - Mỹ Phẩm và Thực phẩm từ lá Chè Xanh được trồng tại xã Suối Nghệ - huyện Châu Đức - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu” nhằm tìm ra phương pháp chiết tách polyphenol phù hợp ở điều kiện Việt Nam và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng với nguồn chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Từ đó nghiên cứu ứng dụng của chúng làm mặt nạ dưỡng da nhằm giải quyết các vấn đề: Lợi ích kinh tế cho người trồng chè, khai thác triệt để hoạt tính sinh học của polyphenol, tạo ra sản phẩm đẹp da, chất lượng tốt và an toàn. 2. MỤC TIÊU - Xây dựng được quy trình chiết tách các hợp chất polyphenol từ lá chè xanh. - Tính chất hóa lý, định tính, định lượng polyphenol trong lá chè. - Đánh giá được khả năng oxy hóa và kháng khuẩn của polyphenol trong lá chè - Ứng dụng cao polyphenol trong các sản phẩm làm đẹp da. 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trong nghiên cứu này các nội dung được giới hạn như sau: - Đối với lá chè khảo sát: chúng tôi sử dụng chè trồng tại xã Suối Nghệ, huyện Tân Thành, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. GVHD: Tống Thị Minh Thu 2 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học - Đối với nghiên cứu chiết tách polyphenol: phương pháp trích ly bằng dung môi được chúng tôi sử dụng. Do đây là phương pháp khá đơn giản, có khả năng cho hiệu suất thu hồi cao. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng chỉ đòi hỏi đầu tư vừa phải, dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ, phù hợp với điều kiện Việt Nam. - Đối với xác định hoạt tính oxy hóa: Xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) theo mô hình phospho molybdenum.[56] - Đối với hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. - Đối với nghiên cứu ứng dụng chất chiết polyphenol chè trong dược mỹ phẩm: Nghiên cứu trên 2 dòng sản phẩm Mặt nạ dưỡng da và kem dưỡng da từ trà xanh. Các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. - Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 5.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả của đề tài tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng hàm lượng polyphenol tổng số, các catechin thành phần) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxi hóa, kháng khuẩn), so sánh hàm lượng polyphenol tổng số của các loại chè non, chè già..của giống chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Các dữ liệu khoa học này là nguồn GVHD: Tống Thị Minh Thu 3 SVTH: Tống Thị Ngọc ...n lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. Một số thuốc thử Flavnoid: Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính. Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau. Khảo sát sự hiện diện của saponin Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base: - Thuốc thử: HCl : 0,1N NaOH : 0,1N - Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid. 1.2.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Định nghĩa: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. GVHD: Tống Thị Minh Thu 19 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả Ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: b R = f a Trong đó: a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. . Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. 1.2.4.3. Phương pháp UV-VIS Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang, phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tích công cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện GVHD: Tống Thị Minh Thu 20 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học nay, gọi là máy quang phổ hấp thụ phân tử UV - VIS. Các máy đo quang làm việc trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) từ 190nm đến khoảng 900nm. Sự hấp phụ ánh sáng của dung dịch màu: Dung dịch có màu là do bản thân dung dịch đã hấp thụ một phần quang phổ (một vùng phổ) của ánh sáng trắng, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch, chính là màu phụ của phần ánh sáng trắng đã bị hấp thụ (vùng quang phổ còn lại). Sự hấp thụ của dung dịch theo màu được trình bày trong bảng : Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu TIA SÁNG ĐƠN SẮC BỊ HẤP THỤ MÀU CỦA DUNG DỊCH 400nm ÷ 450nm: vùng tím lục ánh vàng 450nm ÷ 480nm: vùng chàm vàng 480nm ÷ 490nm: vùng chàm lục da cam 490nm ÷ 510nm: vùng lục chàm đỏ 510nm ÷ 560nm: vùng lục đỏ tía 5600nm ÷ 575nm: vùng lục ánh vàng tím 575nm ÷ 590nm: vùng vàng chàm 590nm ÷ 640nm: vùng da cam chàm lục 640nm ÷ 720nm: vùng đỏ lục chàm 720nm ÷ 800nm: vùng đỏ tía lục Sự hấp thụ bức xạ đơn sắc (BXĐS) của dung dịch còn phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp thụ. 1.2.4.4. Phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ). GVHD: Tống Thị Minh Thu 21 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè 1.2.5.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của polyphenol chè Ngày nay mối quan tâm trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng. Mối quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với nhiều phân loại, ví dụ như lão hóa sớm, ung thư và một loạt các bệnh trong đó có liên quan đến các gốc tự do. Ngoài ra, thực hiện các quy định rất nghiêm ngặt về việc sử dụng chất bảo quản thực phẩm, do đó họ chỉ cho phép sử dụng chất chống oxy hóa tự nhiên. Các ứng dụng tiềm năng là chất bảo quản trong thực phẩm, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp dược phẩm. Sự quan tâm về việc loại bỏ chất độc của trong quá trình tổng hợp các chất chống oxy hóa trong thực vật và trong việc xác định các nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên đã thúc đẩy chúng tôi phát triển để xác định giá trị của chất tan trong nước. Khi nghiên cứu khả năng quét gốc tự do tổng hợp như 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), các polyphenol-catechin đều thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E. Nanjo và cộng sự [52] đã chỉ ra rằng, các catechin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C. Trong các hợp chất catechin, nhìn chung dạng galloyl hóa có khả năng quét DPPH cao hơn so với dạng khác. Trong các thành phần của catechin chè, khả năng quét DPPH được xếp theo trật tự giảm dần như sau: EGCG > ECG > EGC > EC > C .[41][47] Đối với chè, thành phần các catechin đóng góp khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.[49] Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo cũng chỉ ra rằng, polyphenol chè có hiệu quả cao trong việc giảm cholesterol tổng số cũng như phần LDL trong huyết thanh,[59][76] chống oxy hóa các acid béo,[28][31] hay quét các gốc tự do superoxyl, hydroxyl.[19][66] Trong nghiên cứu về tác dụng của polyphenol đối với độc tố ochratoxin A ở tế bào gan, Hundhausen và cộng sự [39] đã chỉ ra rằng, EGCG có hoạt tính kháng oxi hóa cao gấp 4 lần trolox và genistein, 3,4 lần daidzein và khoảng 1,3 lần quercetin. GVHD: Tống Thị Minh Thu 22 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Khả năng kháng oxi hóa của chất chiết chè xanh cũng là chủ đề của nhiều nghiên cứu. Khi đánh giá khả năng này của chè xanh, hoa nhài, oải hương, hoa hồng, sả và hương thảo thông qua khảo sát khả năng quét DPPH, khả năng kháng oxi hóa tương đương trolox (TEAC) và khả năng hấp phụ gốc oxygen (ORAC assay). Tsai và cộng sự [70] đã nhận thấy rằng, trong tất cả các thử nghiệm, chè xanh có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất. Cụ thể với DPPH, hoạt tính này của chất chiết chè xanh cao gấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương (bảng 1.2). Trong thí nghiệm khác với cùng đối tượng, Aoshima và cộng sự [15] cũng cho quy luật tương tự. Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) khác dựa theo mô hình phospho molybdenum [56] bằng phép đo quang phổ trên cơ sở việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa. Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác định lực kháng oxy hóa của Polyphenol lá chè xanh. 1.2.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol chè Về cơ chế kháng khuẩn của polyphenol chè, các catechin đặc biệt là EGCG đã can thiệp vào quá trình tổng hợp acid béo type II của tế bào vi khuẩn.[75] Bên cạnh đó, gốc galloyl của catechin cũng gây ra sự rối loạn đặc hiệu trong cấu trúc của lớp đôi phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine trong thành màng tế bào.[26] Ngoài ra, hiệu quả sát khuẩn của catechin còn có thể liên quan đến việc tạo hydrogen peroxide – kết quả từ tác động của oxygen với EGCG.[16] Khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm của polyphenol/chất chiết chè được tổng hợp qua bảng 1.3 [49]. Đối với vi khuẩn, polyphenol chè có tác dụng tốt đối với nhiều loài vi khuẩn gây ngộ độc cũng như gây thối hỏng thực phẩm.[21] Mendel [49] đã chỉ ra rằng, EGCG, CG, EGC thể hiện hoạt tính kháng B. cereus ở mức độ nmol, chất chiết chè xanh và chè đen đều có thể ức chế sự phát triển của C. jejuni và C. coli trong vòng 4 giờ [30], nồng độ ức chế tối thiểu (minmum inhibitory GVHD: Tống Thị Minh Thu 23 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học concentration) trung bình của các catechin chè đối với S. aureus và một số chủng Vibrio là 192 ± 91 và 162 ± 165 µg/ml tương ứng trong khi đối với các vi khuẩn gram (-) như Salmonella và E. coli là 795 ± 590 và 1519 ± 949 µg/ml tương ứng.[68] Một số nghiên cứu đã tiến hành về ảnh hưởng của polyphenol chè đối với các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Fukai và cộng sự [34] đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất chiết catechin chè trên 8 chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách, súp lơ, cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh (wilt), thối ướt (spring rot), đốm lá (necrotic leaf spot) trên tỏi, súp lơ, xà lách, kết quả chỉ ra rằng, catechin chè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của các polyphenol chè đều dưới 100 ppm. Trong số 4 cấu tử catechin thử nghiệm (EGC, EGCG, EC, ECG), thì EGCG và EGC hiệu quả hơn cả. Liên quan đến khả năng kháng một số vi khuẩn gây thối hỏng thực phẩm, Yam và cộng sự [72] cũng kết luận rằng, chất chiết chè cũng như thành phần polyphenol chè có tiềm năng trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt khả năng kháng lại P. vulgaris, P. aeruginosa và S. marcescens. 1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè 1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán các chất có nồng độ khác nhau. Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng gọi là trích ly lỏng – lỏng, còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly rắn – lỏng [21]. 1.3.2. Các phương pháp trích ly Hiện nay tùy theo mục đích (mục đích khai thác và mức độ tinh sạch mong muốn hay mục đích phân tích) cũng như điều kiện áp dụng công nghệ mà việc trích ly các hợp chất có trong thực vật có thể tiến hành theo một số phương pháp sau: 1.3.2.1. Kỹ thuật soxhlet Chiết soxhlet là một trong các kỹ thuật cổ điển nhất, được đề xuất bởi nhà hóa học người Đức Franz Ritter Von Soxhlet. Đầu tiên nó được thiết kế chủ yếu cho việc tách chất béo nhưng hiện nay được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau, trong đó có chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong chiết soxhlet, dung môi thích hợp liên tục được bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với vật liệu rắn để tách chất mục tiêu GVHD: Tống Thị Minh Thu 24 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học trong một thiết bị chuyên dụng (bộ soxhlet). Đối với kỹ thuật này, do những hạn chế như làm việc gián đoạn, năng suất thấp, thời gian chiết dài nên hiện nay thường chỉ được sử dụng trong nghiên cứu, phân tích và để đối sánh với các kỹ thuật mới khác [31]. 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm (maceration) Với kỹ thuật này, quá trình chiết thường gồm các bước cơ bản sau: i) vật liệu được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, ii) dung môi thích hợp được đưa vào trong bình chiết và được trộn đều với vật liệu, iii) tách dung môi có chứa chất mục tiêu ra khỏi bã và ép bã để thu hồi triệt để chất mục tiêu, iv) lọc làm sạch dung môi chứa chất mục tiêu thu được. Ngoài ra, trong phương pháp này người ta thường kết hợp với khuấy đảo để tăng quá trình khuếch tán của chất tan và làm mới dung môi trên bề mặt vật liệu. Từ đó làm tăng hiệu suất trích ly.[20] Ưu điểm của phương pháp là rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu thiết bị phức tạp, thích hợp với việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt nhưng có nhược điểm là thời gian trích ly dài và có hạn chế về hiệu suất trích ly. 1.3.2.3. Kỹ thuật ngấm kiệt (percolation) Trong kỹ thuật này, vật liệu được ngâm ngập trong dung môi và không có khuấy đảo. Khi sự chênh lệch nồng độ chất tan trong vật liệu và ngoài dung môi gần đạt trạng thái cân bằng, dung môi chứa chất tan sẽ được chiết rút từ từ nhỏ giọt ra khỏi bình chiết. Đồng thời với quá trình này, dung môi mới sẽ được đưa vào để chiết kiệt chất mục tiêu trong vật liệu. Kỹ thuật này có thể thực hiện đơn giản như trên hoặc có thể tiến hành theo cách phân đoạn. Trong chiết phân đoạn, dịch chiết loãng được sử dụng làm dung môi để chiết vật liệu mới. Kỹ thuật này cũng có ưu điểm là khá đơn giản, dễ áp dụng. Tuy nhiên thời gian chiết dài và lượng dung môi tiêu thụ lớn. 1.3.2.4. Trích ly có hỗ trợ siêu âm Cơ sở của phương pháp này là sử dụng sóng siêu âm làm tăng cường quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường quá trình chuyển khối, từ đó có thể làm tăng hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng cho phép rút ngắn thời gian trích ly và làm giảm tiêu tốn dung môi[3]. Tuy nhiên kỹ thuật này có thể làm tăng nhiệt của hệ dung môi – vật liệu trong quá trình, do đó có thể không thích hợp trong trích ly các GVHD: Tống Thị Minh Thu 25 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học hoạt chất nhạy cảm nhiệt như polyphenol. Ngoài ra, những khó khăn trong việc triển khai công nghiệp cũng là điểm hạn chế của kỹ thuật này [58]. Cuối cùng, hiện nay phương pháp này vẫn chưa có các đánh giá toàn diện như ảnh hưởng của sóng siêu âm đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt tính sinh học của chất cần trích ly, hiệu suất trích ly polyphenol có thực sự được cải thiện hay không vẫn chưa có những kết luận đồng thuận. Ví dụ như trong khi Tao và cộng sự [69] cho biết, trích ly polyphenol từ chè có hỗ trợ siêu âm cho phép nâng hàm lượng polyphenol trong dịch chiết từ 22,04% lên 22,67% thì Amir và cộng sự [14] lại không nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa trích ly polyphenol từ vỏ quả hồ trăn (Pistachia vera) có và không có hỗ trợ của sóng siêu âm với cả hai dung môi là nước và methanol. 1.3.2.5. Trích ly có hỗ trợ vi sóng Trích ly có hỗ trợ vi sóng cũng được xem là một phương pháp mới trong trích ly các hợp chất tự nhiên. Trong kỹ thuật này, trường điện từ trong dải tần từ 300 MHz tới 300 GHz thường được sử dụng. Chúng tạo ra hai trường dao động trực giao là trường từ và trường điện. Trong quá trình này, năng lượng điện từ sẽ được chuyển hóa thành năng lượng nhiệt.[20] Kỹ thuật này thường gồm 3 bước:[13] i) đầu tiên có sự phân tách chất mục tiêu khỏi các vị trí hoạt động của vật liệu do sự tăng nhiệt độ và áp suất, ii) tiếp theo có sự di chuyển của dung môi vào trong vật liệu, iii) cuối cùng, chất mục tiêu được hòa tan vào dung môi. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nâng nhiệt và chiết tách nhanh, ít tiêu tốn dung môi, hiệu suất thu hồi cao.[13] Tuy nhiên, nó cũng gặp những hạn chế như trong kỹ thuật trích ly có hỗ trợ siêu âm như kém phù hợp trong chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt và những vấn đề về thiết bị trong triển khai công nghiệp.[103] 1.3.2.6. Trích ly siêu tới hạn Cơ sở của phương pháp: khi chất khí ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn (gọi là chất lỏng tới hạn) nó bộc lộ khả năng của một dung môi, nhưng có độ nhớt và khả năng khuếch tán của một chất khí. Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán cao, tính vận chuyển tốt hơn một chất lỏng thường vì vậy nó có khả năng thích ứng với quá trình chiết tách. Trong kỹ thuật này, CO2 thường được lựa chọn vì nó có mật độ tới hạn cao (0,47 g/cm3).[63] GVHD: Tống Thị Minh Thu 26 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp, có thể giảm thiểu sự oxi hóa các chất cần trích ly, an toàn không độc hại và không tốn năng lượng để tách dung môi (chất lỏng tới hạn) sau trích ly.[63][58] Tuy nhiên nhược điểm chính của phương pháp này là đầu tư trang thiết bị lớn và hiệu quả thấp đối với việc trích ly các hợp chất phân cực như catechin chè. Để sử dụng phương pháp này cho trích ly polyphenol, người ta thường phải kết hợp CO2 siêu tới hạn với một dung môi phân cực khác như ethanol. Sau hơn 30 năm phát triển, phương pháp này hiện đã được phát triển ở quy mô công nghiệp trong việc tách caffeine từ cà phê và hoa húp lông.[58] 1.3.2.7. Chiết dung môi ở áp suất cao Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi Richter và cộng sự vào năm 1996.[20] Cơ sở của phương pháp là sử dụng áp suất cao trong quá trình chiết để lưu giữ trạng thái lỏng của dung môi trên điểm sôi của nó. Do vậy, điều kiện làm việc này (nhiệt độ và áp suất cao) sẽ làm tăng khả năng hòa tan của chất mục tiêu, giảm độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi. Điều này cho phép làm tăng tốc độ chuyển khối và cải thiện hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, khả năng có thể tự động hóa quá trình cũng là một trong các ưu thế của kỹ thuật này.[40] Tuy vậy, với điều kiện làm việc ở nhiệt độ và áp suất cao có thể kém phù hợp trong việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt như catechin chè. 1.3.2.8. Trích ly bằng dung môi có hỗ trợ enzym Xử lý enzyme của các mẫu thực vật là một kỹ thuật khác phù hợp để giải phóng các hợp chất phenolic. Phenolics trong vật liệu thực vật dường như được liên kết với các polysacarit vách tế bào thực vật bởi cả hai liên kết kỵ nước và kỵ nước.Việc bổ sung các enzyme có thể làm tan rã các liên kết thành tế bào phenolic và tăng cường chiết xuất phenolic. Gần đây, thủy phân enzyme sử dụng kết hợp pectinase, cellulase và hemiaellulase đã được chứng minh là tăng cường chiết xuất phenolic từ chất thải rắn mâm xôi. Maier et al. đã phát triển ứng dụng enzyme để chiết xuất phenolic từ bưởi nho. Kapasakalidis và cộng sự đã báo cáo rằng các chế phẩm enzyme cellulose thương mại thúc đẩy việc chiết xuất polyphenol và anthocyanin từ quả bưởi đen. Trong một nghiên cứu khác, việc so sánh ứng dụng của ba loại chế phẩm enzyme khác nhau bao gồm-amylase, Viscozyme L và Ultraflo L đã được tiến hành trên thân cây GVHD: Tống Thị Minh Thu 27 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Ipomoea batatas (khoai lang). Ultraflo L và Viscozyme L tạo điều kiện phục hồi phenolic và dẫn đến sản lượng axit ferulic và axit vanillic cao hơn, tương ứng, trong chiết xuất. Hong và Van Veit. đã so sánh các kỹ thuật của UAE và chiết xuất các hợp chất phenol có hỗ trợ enzyme từ quả acerola, ngược lại, sản lượng phenolics cao hơn bằng phương pháp mới của UAE so với chiết xuất enzyme. Nhận xét chung về các phương pháp trích ly: Như đã trình bày ở phần trên, Tất cả các kỹ thuật chiết tách polyphenol từ lá trà xanh đều có lợi thế và hạn chế riêng. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu các điều kiện chiết tách cho phương pháp chiết polyphenol trong lá chè bằng dung môi, ngoài ra khảo sát thêm sự hỗ trợ của một số enzym nhằm cải thiện và tối ưu hóa cả hiệu suất trích ly cùng hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol/catechin đồng thời phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu và dễ dàng triển khai ở quy mô nhỏ so với các nghiên cứu đã từng được tiến hành ở Việt Nam. 1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm Những nghiên cứu trên thế giới về chiết tách polyphenol chè nhìn chung cũng tập trung chủ yếu đến việc tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm thu được (hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn của dịch chiết/chất chiết polyphenol). 1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợp chất phenol chiết tách được. Độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng lớn bởi độ phân cực của dung môi sử dụng. Trong chiết xuất các hợp chất phenol, các dung môi có độ phân cực cao như nước hoặc ít phân cực như chlorofom hay hexane thường không cho hiệu suất thu hồi cao.[46] Dung môi nước tuy an toàn nhưng thường làm cho dịch chiết có lượng tạp chất lớn, gây khó khăn cho việc làm sạch về sau. Nếu quá trình chiết hướng tới nhiều loại hợp chất khác nhau cùng tồn tại trong vật liệu, người ta thường sử dụng hỗn hợp các loại dung môi để tạo ra một dung dịch có độ phân cực trung bình. Điều này cho phép cải thiện hiệu suất trích ly đối với tổng thể các hợp chất đích.[46] Trong chiết tách các hợp chất phenolic chè, dung môi thường được GVHD: Tống Thị Minh Thu 28 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học sử dụng là methanol, ethanol, acetone, diethyl ether và ethyl acetate. Tuy nhiên các acid có độ phân cực cao (benzoic, cinnamic acid) có thể không được chiết hoàn toàn với các dung môi hữu cơ nguyên chất mà hỗn hợp của alcohol – nước hoặc acetone – nước thường được yêu cầu.[36] Các dung môi ít phân cực như dichloromethane, chloroform, hexane và benzene thường phù hợp để tách các tạp chất như sáp, sterol và chlorophyll từ nguyên liệu thực vật.[67] Các hợp chất phenol ở dạng glycoside (tan nhiều trong nước) nhìn chung thường được tách bởi hỗn hợp nước với methanol, ethanol hoặc acetone.[60] Ngược lại, các hợp chất phenol ít phân cực hơn (dạng aglycone) như isoflavone, flavanone và flavonol thường tan hơn trong các dung môi kỵ nước.[24] Độ hòa tan của catechin (nhóm flavanol) trong dung môi phân cực được tăng cường với việc xử lý nhiệt trung bình, do đó làm tăng hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, hiệu suất này cũng được cải thiện với việc áp dụng các biện pháp như khuấy đảo, lắc hay kết hợp tác động siêu âm.[36] Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành về chủ đề này, Nihal và cộng sự [53] đã sử dụng nước, ethanol, methanol và dimethyl formamide (DMF) (dung môi hữu cơ được sử dụng ở 50%, 80% và 100% v/v) trong trích ly chè đen và chè cây nhựa ruồi (Ilex paraguariensis). Kết quả chỉ ra rằng, loại dung môi và nồng độ dung môi có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi polyphenol cũng như khả năng kháng oxi hóa của dịch chiết. Đối với chè đen, dung môi DMF 50% cho hiệu suất trích ly polyphenol cao nhất trong khi với chè nhựa ruồi dung môi tốt nhất là acetone 50% (v/v). Về hoạt tính kháng oxi hóa, dịch chiết chè đen có hoạt tính này cao nhất với dung môi acetone 50% (v/v) trong khi ethanol 50% (v/v) lại cho kết quả tốt nhất với dịch chiết chè nhựa ruồi. Tương tự, Perva- Uzunalic và cộng sự [55] cũng kết luận, acetone 50% hiệu quả nhất trong chiết tách các hợp chất catechin và proanthocyanidins trong chè xanh khi so sánh giữa acetone, methanol, ethanol, acetonitrile ở các nồng độ 25%, 50%, 80% và 100%. Hiệu suất trích ly catechin bằng acetone 50% cao gấp 2,7 lần so với trích ly bằng nước ở nhiệt độ sôi. Đánh giá hiệu suất trích ly catechin và caffeine từ chè xanh khi sử dụng hệ dung môi ethanol/nước (25%, 50%, 75% và ethanol tuyệt đối), Hu và cộng sự [38] cũng nhận thấy, hiệu suất này cao nhất ở hệ ethanol/nước 50% (v/v). Bên cạnh đó, khi nghiên cứu trích ly polyphenol từ cây nhựa ruồi (Ilex paraguariensis), Sari và cộng sự GVHD: Tống Thị Minh Thu 29 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học [64] còn chỉ ra rằng, loại dung môi không những ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol mà còn ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết. Cụ thể, acetone 50% có hiệu quả ức chế tốt nhất đối với S. aureus, H. alvei, Y. enterocolica và L. monocytogens khi so sánh với ethanol, methanol và dimethyl formamide ở cùng nồng độ 50%. Đặc biệt, chất chiết dimethyl formamide 50% có hiệu quả tốt đối với S. aureus, Y. enterocolica và L. monocytogens nhưng không có tác dụng với H. alvei. Cùng nghiên cứu vấn đề này nhưng trên đối tượng chè đen, Nihal và cộng sự [54] cũng kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của dịch chiết phụ thuộc vào dung môi sử dụng và chủng vi khuẩn thử nghiệm. Trong 6 chủng vi khuẩn nghiên cứu (S. aureus, Y. enterocolica, L. monocytogens, H. alvei, B. cereus và E. coli O157:H7) thì S. aureus tỏ ra nhạy cảm nhất đối với dịch chiết chè đen. 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly Cacace và mazza [25] đã chỉ ra rằng, hiệu suất trích ly polyphenol được tăng cường khi tăng nhiệt độ trích ly. Nhiệt độ cao làm giảm độ nhớt của dung môi, tăng tính bán thấm của thành tế bào, tăng độ hòa tan và hệ số khuếch tán của chất cần chất ly. Do đó có thể cải thiện được năng suất chiết [32]. Tuy vậy, polyphenol rất không ổn định và bị phá hủy ở nhiệt độ cao.[37] Perva- Uzunalic và cộng sự [55] đã chỉ ra rằng, hiệu suất chiết tách catechin chè với nước đã giảm khi tăng nhiệt độ chiết từ 80 lên 950C. Thời gian chiết thích hợp với hai mức nhiệt độ trên là 20 phút và 10 phút tương ứng. Ngoài ra, quá trình oxi hóa và epimer hóa các catechin chè cũng diễn ra ở nhiệt độ trích ly cao.[36] Điều này cho thấy, yếu tố nhiệt độ không những ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol chiết tách được mà còn ảnh hưởng đến thành phần polyphenol và có thể cả hoạt tính sinh học của nước chiết. Nhìn chung trong trích ly polyphenol, nhiệt độ trích ly thường phải giới hạn dưới nhiệt độ sôi của dung môi (hữu cơ) còn trong trích ly bằng nước, nhiệt độ khuyến cáo thường nằm trong khoảng 80 - 950C.[55][62] 1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly Đây là một trong các yếu tố không những ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của dịch chiết và hiệu quả kinh tế của quá trình. Thời gian trích ly ngắn sẽ làm giảm hiệu suất, ngược lại nếu thời gian quá dài sẽ gây tốn kém và có thể làm tăng nguy cơ oxi hóa các hợp chất polyphenol.[50] GVHD: Tống Thị Minh Thu 30 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Perva-Uzunalic và cộng sự [55] cũng chỉ ra rằng, với dung môi nước, hiệu suất thu hồi catecchin chè giảm mạnh khi kéo dài thời gian chiết quá 20 phút ở nhiệt độ 80 0C và quá 10 phút ở 95 0C. Ngược lại, trong dung dịch ethanol 40% được acid hóa bằng 2% phosphoric acid, Choung và Lee [29] không nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hiệu suất chiết tách catechin tổng số cũng như EGCG trong thời gian từ 0,5 h đến 24 h (chiết ở 25 0C). Ngoài ra, Labbé và cộng sự [43] còn cho thấy, cặp nhiệt độ và thời gian trích ly có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách các catechin thành phần. Cụ thể, nhiệt độ 500C trong 20 - 40 phút cho kết quả tốt nhất để thu hồi EGC và EC, 90 0C trong 80 phút là tối ưu với nhóm C, EGCG, GCG và ECG và để trích ly cafein, nhiệt độ 70 – 80 0C trong 20 - 40 phút là thích hợp hơn cả. 1.4.4. Ảnh hưởng của pH Việc acid hóa dung môi chiết có thể có tác dụng đến độ ổn định của các hợp chất phenol như anthocyanin,[61] ảnh hưởng đến độ hòa tan của các polyme có thể thủy phân như lignin, hydroxycinnamic và procyanidin.[50] Bên cạnh đó nó cũng có thể làm yếu cấu trúc thành tế bào, từ đó giúp quá trình hòa tan các hợp chất phenol được dễ dàng hơn. Ngoài ra, do polyphenol là các hợp chất khử mạnh nên trong môi trường acid thấp nó sẽ được bảo vệ tốt hơn. Tuy nhiên, Malgorzata và cộng sự [48] lại kết luận, hoạt tính kháng oxi hóa của cả 7 catechin chè xanh đều tăng cùng với sự tăng pH của môi trường (khoảng khảo sát pH từ 2 đến 10) và hoạt tính này của các catechin ở dạng ester gallate cao hơn dạng không có nhóm galloyl. 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol. Tỷ lệ này càng cao tức nồng độ chất cần trích ly trên bề mặt pha rắn càng thấp. Do đó, chênh lệch gradient nồng độ giữa bên trong và bề mặt vật liệu rắn càng cao và làm tăng sự khuếch tán của chất tan từ vật liệu ra môi trường hay làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao sẽ gây tốn kém và gây khó khăn cho quá trình tinh chế về sau. Trong trích ly các hợp chất polyphenol, các nghiên cứu thường được tiến hành ở tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/10 đến 1/60.[37][65] GVHD:...tính kháng khuẩn càng cao, vi khuẩn đó hoạt động càng kém. GVHD: Tống Thị Minh Thu 82 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè Đường kính vòng kháng STT khuẩn E.coli B. cereus S. typhi P. aeruginosa S. aureus Nồng D (mm) độ (mg/ml) 1 Dịch chè 800 7,0 8,0 6,0 6,5 6,7 2 Dịch chè 400 6,5 7,5 4,0 6,0 4,0 3 Dịch chè 200 5,3 6,0 4,0 4,0 4,0 4 Dịch chè 100 5,3 5,0 4,0 3,0 3,5 5 Chloramphenicol 13 15 13 14 12 6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 4,0 4,3 Từ kết quả cho thấy nồng độ dịch chè càng giảm, đường kính kháng khuẩn càng giảm, khi pha loãng nồng độ dịch chè tới nồng độ 100 mg/ml thì vẫn thấy đường kính vòng kháng ở cả 5 loại vi khuẩn tức là khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá chè rất cao dù nồng độ cao chiết chè rất thấp. Các vòng kháng đều rất to, rõ ràng và có sự chênh lệch ít. Hình 3. 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè GVHD: Tống Thị Minh Thu 83 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Hình 3. 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè Chú thích: 1: 800 mg/ml 2: 400 mg/ml 3: 200 mg/ml 4: 100 mg/ml 5: chứng (+) tetracyline 6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5% Trên chủng E.coli khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml là 7 mm và 6,5 mm. Khi giảm nồng độ còn 200 mg/ml và 100 mg/ml thì đường kính kháng khuẩn không thay đổi là 5,3 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè đối với chủng E.coli tương đối ổn định, dù giảm nồng độ xuống thấp 100 mg/ml thì vẫn có khả năng kháng. Trên chủng vi khuẩn B.cereus khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 8 mm xuống 5 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao chiết lá chè. GVHD: Tống Thị Minh Thu 84 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Trên chủng vi khuẩn S.typhi khi khảo sát ở nồng độ 800 mg/ml thì đường kính vòng kháng là 6 mm, sau đó giảm còn 4mm và không thay đổi dù giảm xuống các nồng độ 200mg/ml, 100mg/ml. Trên chủng P.aeruginosa khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 6,5 mm xuống 3 mm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao chiết lá chè Trên chủng S.aureus khi tiến hành khảo sát với 4 nồng độ trên, nhận thấy sự giảm mạnh từ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml là 6,7 mm xuống 4 mm, sau đó giảm không đáng kể 4 mm xuống 3.5 mm khi giảm nồng độ từ 400 mg/ml xuống 100 mg/ml. 3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè 3.9.1. Ảnh hưởng của hàm lượng polyphenol tổng theo thời gian lưu mẫu Các hợp chất thiên nhiên có nhược điểm là không bền theo thời gian, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian lưu mẫu để kiểm tra xem mẫu có thể bền trong khoảng thời gian nào, sau đây là kết quả thu được: Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol Ngày 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 PP tổng (%) 19.45 18.55 17.54 17.47 17.16 16.81 16.15 15.42 12.92 12.3 Khối lượng cao 11.01 11.3 11.01 10.68 11.04 10.84 11.1 10.98 10.89 10.81 Hình 3. 23: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol GVHD: Tống Thị Minh Thu 85 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Từ kết quả cho thấy mẫu cao polyphenol có nồng độ polyphenol tổng giảm nhẹ từ ngày 1 đến ngày 8 ( từ 19,45% - 18,55%), giảm mạnh từ ngày 14-16 và thấp nhất ở ngày thứ 18 (12,3%). 3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè Các sản phẩm ứng dụng thực phẩm, dược mỹ phẩm thường được xử lý ở nhiệt độ, điều đó làm ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol của chế phẩm, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nhiệt độ sấy tới chất lượng cao chiết lá chè. Mẫu đối chứng là mẫu không sấy bằng nhiệt độ cao. Bảng 3. 23: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol Nhiệt độ Mẫu đối chứng 90 100 110 120 Pp tổng (%) 20,51 19,23 15,69 15,38 1,41 KL cao (g) 0,42 0,40 0,38 0,35 0,18 Hình 3. 24: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ càng cao hàm lượng polyphenol tổng càng giảm, ở nhiệt độ 120 0C hàm lượng polyphenol giảm mạnh còn 1,41% ,vì vậy chúng tôi quyết định sấy thăng hoa cao chiết lá chè nhằm giữ lại các thành phần có lợi cho sức khỏe khác như protein, lipit, gluxit, vitamin, enzyme và hoạt chất sinh học, màu sắc, mùi, vị v.v GVHD: Tống Thị Minh Thu 86 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè Sản phẩm sấy thăng hoa cao chiết lá chè giữ được màu và mùi thơm đặc trưng của lá chè so với sấy ở nhiệt độ cao. Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa So sánh hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của bột polyphenol sau khi sấy thăng hoa và cao polyphenol sau khi chiết thu được kết quả sau: Cao polyphenol Bột sấy thăng hoa PP tổng (%) 19,45 18,75 Tính oxy hóa 3,025 2,88 Qua bảng kết quả trên ta thấy hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của bột sấy thăng hoa giảm không nhiều so với cao polyphenol (từ 19,45 xuống còn 18,75 và 3,025 xuống còn 2,88) cho thấy tính ổn định của polyphenol trước và sau khi sấy thăng hoa. GVHD: Tống Thị Minh Thu 87 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa trên 4 loại vi khuẩn E.coli; B. cereus; S. typhi; P.aeruginosa; S. aureus, kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 3. 24: Hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa Đường kính vòng kháng STT khuẩn E.coli B. cereus S. typhi S. aureus Nồng D (mm) độ (mg/ml) 1 Dịch chè 800 7,0 8,0 7,0 7,0 2 Dịch chè 400 6,0 7,0 6,5 6,5 3 Dịch chè 200 5,0 6,0 6,0 6,0 4 Dịch chè 100 3,0 4,0 6,0 5,0 5 Chloramphenicol 11,0 12 13,0 14,0 6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 8,0 Hình 3. 26: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa GVHD: Tống Thị Minh Thu 88 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Hình 3. 27: Khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn của Bột sấy thăng hoa Chú thích: 1: 800 mg/ml 2: 400 mg/ml 3: 200 mg/ml 4: 100 mg/ml 5: chứng (+) tetracyline 6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5% Kết quả thu được cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa vẫn có khả năng kháng khuẩn cao so với trước khi sấy thăng hoa dù giảm nồng độ xuống còn 100 mg/ml cho thấy quá trình sấy thăng hoa không làm ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của cao polyphenol trong lá chè. Từ đó ta rút ra kết luận sau: Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng polyphenol tổng, tính oxy hóa và khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tế. 3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da Kem tan dùng ban ngày để bảo vệ da và làm đẹp da đã được tẩy sạch, làm mất lớp dầu trên da để các mỹ phẩm khác dễ dàng bám lên da. Khi sử dụng, kem phải lan nhanh ra trên da và dường như biến mất ngay sau khi bôi lên da. Kem còn có tác dụng GVHD: Tống Thị Minh Thu 89 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học giữ ẩm làm mềm mại da. Chất lượng kem dưỡng da được đánh giá trên các chỉ tiêu cảm quan sau: Bảng 3. 25: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da (i) Cảm quan (35%) Trên sản phẩm Trên đối tượng sử dụng Dạng và màu tự nhiên của nền Độ gây chỉnh da Độ phân pha Độ gây mát Độ bóng có ánh bạc Độ gây mùi lạ Độ linh động (ii) Định lượng (45%) Trên sản phẩm Độ pH Trên đối tượng sử dụng Độ lún kim (mm) Độ tan trên da (giây) Sai biệt độ lún kim (mm) Điểm bắt đầu chảy (oC) (iii) Tính an toàn cho người sử dụng (10.0%) Gây dị ứng cho da (iv) Tính an toàn cho môi trường (5.0%) (v) Tính tiện dụng (5.0%) Hình 3. 28: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè GVHD: Tống Thị Minh Thu 90 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Kem dưỡng da làm từ cao chiết lá chè có màu xanh nhạt nhưng khi bôi lên da có thể rửa được, màu xanh không bám lâu vào da, kem bôi lên mát và mịn, không kích ứng da. GVHD: Tống Thị Minh Thu 91 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được những kết quả như sau: 1. Về mặt lý thuyết - Tìm hiểu được tình hình trồng trọt, tiêu dùng và thương mại hóa lá chè ở Việt Nam và trên thế giới. - Tìm hiểu được các công trình nghiên cứu chiết tách polypheno, ưu nhược điểm của các phương pháp chiết tách trong nước và trên thế giới. - Tìm hiểu về các chủng vi khuẩn, lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp để nghiên cứu. 2. Về mặt thực nghiệm - Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là: Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 oC, thời gian: 35 phút. - Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần. Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%. Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41% cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá chè. - Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml). - Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế. GVHD: Tống Thị Minh Thu 92 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học - Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng polyphenol tổng, tính oxy hóa và khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tế. - Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm). 3. Đào tạo và khoa học - Đề tài này đã được tham gia cuộc thi nghiên cứu khoa học học sinh sinh viên 2018 – 2019. - Đã được tham dự Triển lãm Khoa học & Công nghệ 2019. 4.2. Kiến nghị 1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè thể hiện ở cả 5 chủng vi khuẩn dù ở nồng độ thấp, cần nghiên cứu thêm về nồng độ tối thiểu (MIC) khả năng kháng khuẩn của từng loại khuẩn nhằm ứng dụng cho các sản phẩm như thuốc đánh răng, nước súc miệng ngừa sâu răng, chống viêm khớp răng, khử hơi mồm, thơm hơi thở 2. Mở rộng nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ, PH, Thời gian.. tới hiệu suất chiết polyphenol có hỗ trợ enzym và hoạt tính sinh học của nó. Điều này cho phép tạo cơ sở dữ liệu tổng quát để sử dụng enzym cho mục đích khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học cao trong chè và có thể cung cấp một giải pháp thay thế thân thiện môi trường cho việc chiết dung môi hữu cơ thông thường. 3. Mở rộng nghiên cứu sử dụng chế phẩm polyphenol chè cho Dược Mỹ phẩm như thực phẩm chức năng, sản phẩm làm đẹp, bánh kẹovà nghiên cứu chuyển giao cho sản xuất công nghiệp. 4. Hợp chất polyphenol có tính Oxy hóa cao nên dễ bị oxy hóa ngoài môi trường, cần bảo quản nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản các hợp chất polyphenol đễ dễ dàng vận chuyển và sử dụng. 5. Cao polyphenol sau tinh chế vẫn còn một số tạp chất nên cần nghiên cứu xây dựng quy trình quy trình tinh chế phân tách từng hợp chất polyphenol tinh khiết hơn. GVHD: Tống Thị Minh Thu 93 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Mai Thanh Nga, Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học,tách chiết hợp chất poliphenol trong cây chè xanh Thái Nguyên, tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, 80(04): 159-161. 2. Nguyễn Văn Chung và Trương Hương Lan (2007), Nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh Việt Nam. Trong: các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, NXB Lao động – Xã hội, tr. 256 – 260. 3. Trần Chí Hải, Nguyễn Tấn Dân, Nguyễn Đình Nam, Lê Thị Hồng Ánh, Mẫn Phan Vãn Mẫn (2016), Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly polyphenol từ lá trà già, Tạp chí KHCN ĐHĐN, 9(106), tr. 69-72. 4. Ngô Hữu Hợp (1983), Hóa sinh chè, Đại học Bách Khoa Hà Nội. 5. Nguyễn Tiến Lực (2016), Công nghệ chế biến thịt và thủy sản, NXB ĐH Quốc gia HCM. 6. Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong (1997), Cây chè Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Vũ Hồng Sơn, Hà Duyên Tư (2008), Khảo sát hàm lượng polyphenol trong một số giống chè vùng trung du và miền núi các tỉnh phía bắc thu hái vào vụ đông, Tạp chí hóa học, 46 (5A), tr. 198-202. 8. TCVN 9745-1-2013, Chè – Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen – Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè – Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin – Ciocalteu. 9. Nguyễn Duy Thịnh (2004), Giáo trình công nghệ chế biến chè, ĐH Bách Khoa Hà Nội. 10. Vũ Thị Thư, Lê Doãn Diên, Nguyễn Thị Gấm, Giang Trung Khoa (2001), Các hợp chất có trong chè và một số phương pháp phân tích thông dụng trong sản xuất chè ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 11. Lê Bạch Tuyết (1996), Quá trình trích ly, trong: Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, NXB Giáo dục, tr. 93-101. GVHD: Tống Thị Minh Thu 94 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học Tài liệu tiếng Anh 12. A.O.C.S Official Method Cd 18-90, P-Anisidine value. In AOCS officicial method Cd 18-90. 1998, Official methods and recommended practices of the American oil chemists’society: Champaign, IL, USA. 13. Alupului, A. (2012), Microwave extraction of active principles from medicinal plants, U.P.B. Science Bulletin, Series B, 74(2), pp. 129-142. 14. Amir, H. G., Barzegar, M., Sahari, M. A. (2005), Antioxidant activity and total phenolic compounds of pistachio (Pistachiavera) hull extracts, Food Chemistry, 92, pp. 521–525. 15. Aoshima, H., Hirata, S., Ayabe, S. (2007), Antioxidative and anti-hydrogen peroxide activities of various herbal teas, Food Chemistry, 103, pp. 617–622. 16. Arakawa, H., Maeda, M., Okubo, S., Shimamura, T. (2004), Role of hydrogen peroxide in bactericidal action of catechin. Biol. Pharm. Bull., 27, pp. 277 –281. 17. Ashray Gupta (2012), Extraction, Purification, Identification and Estimation of Catechins from Camellia sinensis. 18. Astill, C., Birch, M. R., Dacombe, C., Humphrey, P. G., Martin, P. T. (2001), Factors Affecting the Caffeine and Polyphenol Contents of Black and Green Tea Infusions, J. Agric. Food Chem., 49, pp. 5340−5347. 19. Atoui, A. K., Mansouri, A., Boskou, G., & Kefalas, P. (2005), Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile, Food Chemistry, 89, pp. 27– 36. 20. Azmir, J. Zaidul, I.S.M., Rahman, M.M., Sharif, K.M., Mohamed, A.F., Sahena, Jahurul, M.H.A., Ghafoor,K., Norulaini, N.A.N., Omar, A.K.M. (2013), Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review, Journal of Food Engineering, 117, pp. 426–436. 21. Bansal, S., Choudhary, S., Sharma, M., Sharad Kumar, S., Lohan, S., Bhardwaj, V., NavneetSyan, N., Jyoti, S. (2013), Tea: A native source of antimicrobial agents, Food Research International, 53, pp. 568–584. 22. Baptista, J., Lima, E., Paiva, L., Castro, A.R. (2014), Value of off-season fresh Camellia sinensis leaves. Antiradical activity, total phenolics content and catechin profiles, Food science and technology, 59, pp. 1152-1158. GVHD: Tống Thị Minh Thu 95 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 23. Barhe´, T.A., Tchouya, G.R.F. (2016), Comparative study of the anti-oxidant activity of the total polyphenols extracted from Hibiscus Sabdariffa L., Glycine max L. Merr., yellow tea and red wine through reaction with DPPH free radicals, Arabian Journal of Chemistry, 9, pp. 1–8. 24. Bradshaw, M.P., Scollary, G.R., and Prenzler, P.D. (2001), Ascorbic acidinduced browning of (+)-catechin in a model wine system, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 49, pp. 934-939. 25. Cacace, J.E., Mazza, G. (2003), Mass transfer process during extraction of phenolic compounds from milled berries, Journal of Food Engineering, 59, pp. 379- 389. 26. Caturla, N., Vera-Samper, E., Villalain, J., Mateo, C. R., Micol, V. (2003), The relationship between the antioxidant and the antibacterial properties of galloylatedcatechins and the structure of phospholipid model membranes, Free Radic., Biol. Med., 34, pp. 648–662. 27. Chen, C-N., Liang, C-M., Lai, J-R., Tsai, Y-J., Tsay, J-S., Lin J-K. (2003), Capillary Electrophoretic Determination of Theanine, Caffeine, and Catechins in Fresh Tea Leaves and Oolong Tea and Their Effects on Rat Neurosphere Adhesion and Migration, J. Agric. Food Chem., 51, pp.7495−7503. 28. Chen, Z.Y., Chan, P.T. (1996), Antioxidativeacitivity of green tea catechins in canola oil, Chemistry and physics of lipids, 82, pp. 163 – 172. 29. Choung, M-G.and Lee, M-S. (2011), Optimal Extraction Conditions for Simultaneous Determination of Catechins and Caffeine in Green Tea Leaves, Food Sci. Biotechnol., 20(2), pp. 327-333. 30. Diker, K. S., Akan, M., Hascelik, G., Yurdakok, M. (1991), The bacterial activity of tea against Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, Lett. Appl. Microbiol, 12, pp. 34–35. 31. Elgawisha, R.A.R., Rahman, H.G.A., Abdelrazek, H.M.A. (2015), Green tea extract attenuates CCl4-induced hepatic injury in male hamsters via inhibition of lipid peroxidation and p53-mediated apoptosis, Toxicology, 2, pp. 1149–1156. GVHD: Tống Thị Minh Thu 96 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 32. Escribano-Bailón, M.T., Santos-Buelga, C. (2003), Polyphenol extraction from foods. In: Williamson, and Santos-Buelga, C., Methods in Polyphenol Analysis, Cambridge: The Royal Society of Chemistry. 33. Fernaandez, P.L., Pablos, F., Martian, M.J. and Gonzaalez, A.G. (2002), Study of Catechin and Xanthine Tea Profiles as Geographical Tracers, J. Agric. Food Chem., 50, pp.1833-1839. 34. Fukai, K., Tadashi I., Hara Y. (1991), Antibacterial activity of tea polyphenol against phytopathogenic bacteria, Agric. Biol. Chem., 55(7), pp. 1895-1897. 35. Fumio, N., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara Y. (1996), Scavenging effects of tea catechins and their derivatives on DPPH, Free Radical Biology& Medicine, 11(6), pp. 895-902. 36. Gadkari, P.V., Balaraman, M. (2015), Catechins: Sources, extraction and encapsulation: A review, food and bioproducts processing, 93, pp. 122–138. 37. Gertenbach, D.D. (2002), Solid-Extraction technologies for manufacturing nutraceuticals. In: Shi, J., Mazza G. and Le Moguer, M. Functional Foods. Biochemical and processing aspect Vol 2. Boca Raton: CRC press LLC. 38. Hu, C-J., Gao, Y., Liu, Y., Zheng, X-Q., Ye, J-H., Liang, Y-R., Lu, J-L. (2016), Studies on the mechanism of efficient extraction of tea components by aqueous ethanol, Food Chemistry, 194, pp. 312–318. 39. Hundhausen, C., Bosch-Saadatmandi, C.K., Augustin, R., Blank, S., Wolffram, R. G. (2005), Effect of vitamin E and polyphenols on ochratoxin Ainduced cytotoxicity in liver (HepG2) cells. Journal of Plant Physiology, 162, pp.818—822. 40. Ibanez, E., Herrero, M., Mendiola, J.A., Castro-Puyana, M. (2012), Extraction and characterization of bioactive compounds with health benefits from marine resources: macro and micro algae, cyanobacteria, and invertebrates. In: Hayes, M. (Ed.), Marine Bioactive Compounds: Sources, Characterization and Applications. Springer, pp. 55– 98. 41. Katalinic, V., Milos, M., Kulisic, T., &Jukic, M. (2006), Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols, Food Chemistry, 94(4), pp. 550–557. GVHD: Tống Thị Minh Thu 97 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 42. Komatsu, Y., Suematsu, S., Hisanobu, Y., Saigo, H., Matsuda, R., & Hara, K. (1993), Studies on preservation of constituents in canned drinks. Effects of pH and temperature on reaction-kinetics of catechins in green tea infusion, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 57(6), pp. 907–910. 43. Labbé, D., Tremblay, A. and Bazinet L. (2006), Effect of brewing temperature and duration on green tea catechinsolubilization: Basis for production of EGC and EGCG- enriched fractions, Separation and Purification Technology, 49, pp.1-9. 44. Lin, Y-L., Juan, I-M., Chen, Y-L., Liang, Y-C. and Lin, J-K. (1996), Composition of Polyphenols in Fresh Tea Leaves and Associations of Their Oxygen-Radical- Absorbing Capacity with Antiproliferative Actions in Fibroblast Cells, J. Agric. Food Chem., 44, pp. 1387-1394. 45. Lin, Y-S., Tsai, Y-J., Tsay, J-S., Lin J-K.(2003), Factors Affecting the Levels of Tea Polyphenols and Caffeine in Tea Leaves, Agric. Food Chem., 51, pp. 1864−1873. 46. Liu, F.F, Ang, C.Y.W., and Springer, D. (2000), Optimization of extraction conditions for active components in Hypericumperforatum using surfacemethodology, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48, pp. 3364-3371. 47. Luczaj, W., Skrzydlewska, E. (2005), Antioxidative properties of black tea, Preventive Medicine, 40(6), pp. 910–918. 48. Malgorzata, M., Szymuslak H., Gliszczyn, A., Wiglo, S-S., Rietjens, I.M.C.M., Tyrakowska B. E. (2008), pH-Dependent Radical Scavenging Capacity of GreenTeaCatechins, J. Agric. Food Chem., 56, pp. 816–823. 49. Mendel, F. (2007), Overview of antibacterial, antitoxin, antiviral, and antifungal activities of tea flavonoids and teas, Mol. Nutr. Food Res., 51, pp. 116-134. 50. Naczk, M., Shahidi, F. (2004), Extraction and analysis of phenolics in food, Journal of Chromatography A (1054), pp. 95-111. 51. Naczk, M., Shahidi, F. and Sullivan, A. (1992), Recovery of rapeseed tannins by various solvent systems, Food Chemistry, 45, pp. 51–54. 52. Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara, Y. (1996), Scavenging effects of tea catechins and their derivatives on DPPH, Free Radical Biology& Medicine, 11 (6), pp. 895-902. GVHD: Tống Thị Minh Thu 98 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 53. Nihal, T., Sari, F., Velioglu Y. S. (2006), Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin–Ciocalteu methods, Food Chemistry, 99, pp. 835–841. 54. Nihal, T., Velioglu, Y. S., Sari, F. and Polat, G. (2007), Effect of Extraction Conditions on Measured Total Polyphenol Contents and Antioxidant and Antibacterial Activities of Black Tea, Molecule, 12, pp. 484-496. 55. Perva-Uzunalic, A., Sˇkerget, M., Knez, Z., Weinreich, B., Otto, F., Gruner S. (2006), Extraction of active ingredients from green tea (Camellia sinensis): Extraction efficiency of major catechins and caffeine, Food Chemistry, 96, pp. 597-605. 56. Pilar Prieto, Manuel Pineda,2and Miguel Aguilar, Spectrophotometric Quantitation of Antioxidant Capacity through the F ormation of a P hosphomolybdenum C omplex: Specific Application to the Determination of Vitamin E1. 57. Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong Ngoc Tuyen (2006), Microwave – assisted extraction of polyphenols from fresh tea shoot. Tạp chí Phát triển KH&CN, 9 (8), pp.69-75. 58. Qilong, R., Huabin, X., Zongbi, B., Baogen, S., Qiwei, Y., Yiwen, Y.andZhiguo, Z. (2013), Recent Advances in Separation of Bioactive Natural Products, Chinese Journal of Chemical Engineering, 21(9), pp.937-952. 59. Raza, H., John A. (2005), Green tea polyphenol epigallocatec hin-3-gallate differentially modulatesoxidativ e stress in PC12 cell compartments, Toxicology and Applied Pharmacology, 207, pp. 212–220. 60. Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., and Paganga, G. (1997), Antioxidants properties of phenolic compounds, Trends in Plant Science, 2, pp. 152-159. 61. Rodriguez-Saona, L.E., Wrolstad, R.E. (2001), Anthocyanins: Extraction, isolation and purification of anthocyanins. In: R.E. Wrolstad, Current Protocols in Food Analytical Chemistry. New York: John Wiley & Sons. 62. Row, K.H., Jin Y. (2006), Recovery of catechin compounds from Korean tea by solvent extraction, Bioresource Technology, 97, pp.790-793. 63. Rozzi, N. L., Singh R.K. (2002), Supercritical fluids and the food industry, Comprehensive reviews in food science and food safety, 1, pp. 33-44. GVHD: Tống Thị Minh Thu 99 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 64. Sari, F., Nihal, T., Polat, G. and SedaVelioglu, Y. (2007), Total polyphenol, antioxidant and antibacteria activities of black mate tea, Food Sci. Technol. Res, 13 (3), pp. 265 – 269. 65. Shahidi, F., Alexander D. M. (1998), Green tea catechins as inhibitors of oxidation of meat lipids, Journal of Food Lipids, 5, pp. 125-133. 66. Soussi A., Crouteb, F., Soleilhavoup, J-P., Kammoun, A., Feki A. E. (2006), Impact du thé vert sur l’effet oxydatif du métavanadate d’ammoniumchez le rat male pubère, C. R. Biologies, 329, pp.775–784. 67. Stalikas, C.D. (2007), Extraction, separation, and detectionmethods for phenolic acids and flavonoids, J. Sep. Sci., 30, pp. 3268–3295. 68. Taguri, T., Tanaka, T., Kouno, I. (2004), Antimicrobial activity of 10 different plant polyphenols against bacteria causing foodborne disease, Biol. Pharm. Bull., 27, pp. 1965–1969. 69. Tao, X., Shi, S., Wan, X. (2006), Impact of ultrasonic-assisted extraction on the chemical and sensory quality of tea infusion, Journal of Food Engineering 74, pp. 557– 560. 70. Tsai, T-H., Chien, Y-C., Lee, C-W., Tsai, P-J. (2008), In vitro antimicrobial activities against cariogenic streptococci and their antioxidant capacities: Acomparative study of green tea versus different herbs, Food Chemistry, 110, pp. 859–865. 71. Wu, C., Xu, H., Héritier, J., Andlaue, W. (2012), Determination of catechins and flavonol glycosides in Chinese tea varieties, Food Chemistry, 132, pp. 144–149. 72. Yam, T. S., Shah, S., Hamilton-Miller, J. M. (1997), Microbiological activity of whole and fractionated crude extracts of tea (Camellia sinensis), and of tea components, FEMS Microbiol. Lett., 152, pp. 169–174. 73. Yamaki, S. (1984), Isolation of vacuoles from immature apple fruit flesh and compartmentation of sugars, organic acids, phenolic compounds and amino acids, Plant and Cell Physiology, 25, pp. 151-166. 74. Yao L., Caffin, N., D’arcy, B., Jiang, Y., Shi, J., Singanusong, R., Liu, X., Datta, N., Kakuda, Y., Xu Y. (2005), Seasonal Variations of Phenolic Compounds in Australia-GrownTea (Camellia sinensis), J. Agric. Food Chem., 53, pp. 6477−6483. GVHD: Tống Thị Minh Thu 100 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học 75. Zhang, Y. and Charles O. R. (2004), Evaluation of EpigallocatechinGallate and Related Plant Polyphenols as Inhibitors of the FabG and FabIReductases of Bacterial Type II Fatty-acid Synthase, The journal of Biological chemistry, 279 (30), pp. 30994– 31001. 76. Zhao, Y., Asimi, S., Wu, K., Zheng, J., Li, D. (2015), Black tea consumption and serum cholesterol concentration: Systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials, Clinical Nutrition, 34, pp. 612 – 619. Tài liệu Internet 77. Kim ngạch xuất khẩu chè Việt Nam tăng 11,8%. 24/07/2017, trích từ URL: CHÈ VIỆT The Essence Vietnam. 78. Những công dụng hay của chè xanh với sức khoẻ. 28/05/2017, trích từ URL: Chexanh.vn. 79. FAOSTAT, (2015) GVHD: Tống Thị Minh Thu 101 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé