Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây xidi klung tại vườn quốc gia Bidoup – Núi bà, tỉnh Lâm Đồng

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp.Hồ Chí Minh, ngày..tháng..năm.. Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Phƣớc Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày..... tháng ..... năm..... Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Phƣớc Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 4 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống..................................................... 4 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn tài nguyên cây thuốc ............................................................ 4 1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian .......................................................................... 4 1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc ...................................................................... 6 1.2. Các thành phần hóa học từ thực vật ..................................................................... 7 1.2.1. Carbohydrate ..................................................................................................... 7 1.2.2. Alkaloid ............................................................................................................. 8 1.2.3. Glycoside ......................................................................................................... 10 1.2.4. Tannin ............................................................................................................. 16 1.2.5. Steroid ............................................................................................................. 16 1.2.6. Amino acid ...................................................................................................... 17 1.2.7. Isoprenoid (terpene) ........................................................................................ 19 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật.19 1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 19 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn ........................................................................................ 20 1.3.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật .................................. 22 1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam . .................................................................................................................................. 28 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ...................................................................... 31 1.4. Ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật ................... 32 1.5. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ................................................. 33 1.5.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli ..................................................................... 33 i Đồ án tốt nghiệp 1.5.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ..................................................................... 35 1.5.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. . ........................................................................ 36 1.5.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. .......................................................................... 37 1.5.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ............................................................................. 38 1.5.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. .............................................. 40 1.5.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp............................................... 41 1.5.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus. ......................................................... 42 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 44 2.1. Địa điểm và thời gian ......................................................................................... 44 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 44 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 44 2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 44 2.2.1. Nguồn mẫu ...................................................................................................... 44 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ............................................................................................... 44 2.2.3. Hóa chất, dung môi ......................................................................................... 44 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 45 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 46 2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu ............................................................ 46 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật ........................................... 46 2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ............................................. 47 2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị ................. 48 2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 49 2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ................................................ 49 2.3.7. Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC .................................... 51 2.3.8. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết ....................... 51 2.3.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................... 54 2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 55 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung ....................................................................................... 56 ii Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của các loại dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. ................................................................................ 59 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. ................................ 62 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. ................................................................................ 65 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 68 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Xidi Klung từ các dung môi tách chiết khác nhau .......................................................................................................... 68 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn gây bệnh ........................... 69 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ......................................................................................................... 70 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. ............................................................................................................... 71 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ......................................................................................................... 73 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. .............................................................................................................. 75 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................................................................................................. 77 3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ............................................................................................. 78 3.2.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh ......................................................................................................... 80 3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh ................................................... 84 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% .......................................................................................................... 87 iii Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 91 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 91 4.2. Đề nghị ............................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 92 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu RNA: Ribonucleic acid TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất .. 18 Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999).......................................................................................................................... 21 Bảng 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh ...................................... 81 Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ ethanol 70% đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh ......................................................................... 85 Bảng 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Xidi Klung từ ethanol 70% ............................................................................................................... 88 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate ............................................................ 7 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid .................................... 9 Hình 1.3. Sơ đồ phân loại glycoside ......................................................................... 10 Hình 1.4. Sơ đồ phân loại nhóm saponin .................................................................. 11 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid ...................... 14 (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid ............................................ 14 Hình 1.6. Caffeic acid ............................................................................................... 15 Hình 1.7. Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học ...................................... 15 Hình 1.8. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004).......................................................................................................................... 20 Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin ........ 23 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của catechine ............................................................... 24 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của coumarine ............................................................. 25 Hình 1.12. Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine ............................................. 26 Hình 1.13. Cấu trúc hóa học của berberine ............................................................... 27 Hình 1.14. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) ...... 34 Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) .............................. 35 Hình 1.16. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) .......................... 37 Hình 1.17. Vi khuẩn Listeria spp. ............................................................................. 38 Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) ............................... 39 Hình 1.19. Vi khuẩn Pseudomonas ........................................................................... 40 Hình 1.20. Vi khuẩn Enterococcus ........................................................................... 41 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................................ 42 Hình 2.1. Mẫu Xidi Klung ngâm trong ethanol (tỷ lệ 1:20 (w/v)) ............................ 47 Hình 2.2. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ..................................................................... 49 Hình 2.3. Đƣờng kính vùng ức chế vi khuẩn của cao ethanol 70% và Ciprofloxacin ................................................................................................................................... 50 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................. 55 Hình 2.5. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Xidi Klung ............................. 56 Hình 2.6. Mẫu bột Xidi Klung .................................................................................. 57 Hình 2.7. Dịch chiết mẫu từ cây Xidi Klung ngâm với ethanol 70% ....................... 58 Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết ......................... 60 Hình 2.9. Giếng thạch trƣớc và sau khi bổ sung cao ................................................ 61 Hình 2.10. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B) ............................. 62 Hình 2.11. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết .......... 63 Hình 2.12. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (25 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes ............................................................................................. 64 Hình 2.13. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung ............................................................................................. 65 Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ Xidi Klung với các dung môi khác nhau .. 68 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ...................... 70 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. ................................. 72 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. ........................... 74 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. ................................ 75 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ................................... 77 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau và Ciprofloxacin trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ............... 79 ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống chúng ta. Từ thời xa xƣa, ông cha ta vẫn luôn sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên để làm thuốc trị bệnh. Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn các loại thuốc là kháng sinh. Kháng sinh đƣợc biết đến nhƣ một nhóm thuốc chữa các bệnh do vi khuẩn gây ra, chúng có tác dụng tiêu diệt trực tiếp hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn để tạo điều kiện cho hệ miễn dịch của cơ thể ngƣời giải quyết tình trạng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, ngay từ khi kháng sinh ra đời thì cũng là lúc xuất hiện hiện tƣợng kháng thuốc. Mà nguyên nhân chủ yếu là do con ngƣời sử dụng kháng sinh tùy tiện, tràn lan, thiếu kiểm soát và lạm dụng nó nhƣ một loại thần dƣợc trị bệnh. Đặc biệt, tình trạng kháng thuốc ở nƣớc ta diễn ra trầm trọng hơn vì ngƣời dân có thể tự do mua kháng sinh ở các hiệu thuốc. Song, cũng xảy ra tình trạng không ít các dƣợc sỹ bán thuốc không đúng quy định, các bác sỹ điều trị kê đơn thuốc lạm dụng kháng sinh hoặc chỉ định kháng sinh không phù hợp dẫn đến hiện trạng nhiều chủng vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh kể cả kháng sinh thế hệ mới. Bên cạnh đó, việc phát triển các kháng sinh mới đã chững lại từ hơn 30 năm nay, trong khi tỷ lệ kháng của vi khuẩn ngày càng gia tăng. Hậu quả của những việc trên là làm cho hiện tƣợng kháng thuốc trở thành vấn đề mang tính toàn cầu và gia tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Trên thế giới, mỗi năm có hàng trăm ngàn ngƣời chết do kháng thuốc và chi phí cho kháng thuốc lên đến hàng trăm tỷ USD. Điều đáng quan tâm hiện nay là Việt Nam là nƣớc sử dụng kháng sinh cao gấp 5 lần so với các nƣớc Châu Âu. Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ Y, bệnh viện đa khoa tỉnh ở Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh về việc sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh năm 2009 cho thấy có đến 30 – 70% vi khuẩn gram 1 Đồ án tốt nghiệp âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40 – 60% kháng với aminoglycosid, fluoroquinolon và tình trạng kháng ngày càng tăng nhanh. Để tìm ra giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh, ngày nay ngƣời ta bắt đầu quay trở lại với thiên nhiên. Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật để thay thế dần các loại kháng sinh đã cấm sử dụng vì gây ảnh hƣởng xấu đến cơ thể con ngƣời. Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốc đƣợc con ngƣời sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính của 1 số loại vẫn chƣa đƣợc xác định cụ thể. Vì thế, việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của 1 số cây thuốc là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung tại vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng”. Đề tài này đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2 Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung với nhiều loại dung môi tách chiết khác nhau. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung. - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết từ cây Xidi Klung. 3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ cây Xidi Klung với các dung môi methanol 75%, ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc. - Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung. - Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết Xidi Klung. 4. Phạm vi nghiên cứu - Mẫu cây Xidi Klung đƣợc tách chiết cao từ các loại dung môi khác nhau: methanol 75%, ethanol ( 50%, 70%, 90% ) và nƣớc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các nhóm vi khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp. - Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac glycoside, anthraquinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid, amino acid. 3 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên cây thuốc Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nƣớc là rừng núi. Với đặc điểm khí hậu và địa hình nhƣ vậy nên nƣớc ta đƣợc đánh giá là nƣớc có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, đƣợc xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con ngƣời nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị. Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nƣớc ta có khoảng 12 000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài đƣợc dùng làm dƣợc liệu (Viện dược liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhƣng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhƣng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lƣợng các loài cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con ngƣời nhƣng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nƣớc nhà. 1.1.2. Vai trò của cây thuốc dân gian 1.1.2.1. Trong y học Cây thuốc đƣợc coi là di sản quý báu của dân tộc ta. Từ xa xƣa, cây thuốc gắn liền với cuộc sống của các gia đình ngƣời Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh. Tuy chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con ngƣời nhƣng chúng đƣợc sử dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ, độc hại cho ngƣời sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống. Hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng đƣợc nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang 4 Đồ án tốt nghiệp lại cho việc điều trị bệnh. Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo dƣợc tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh. Theo một số nghiên cứu, các loại thảo dƣợc điển hình nhƣ Trầu không (Piper betle L.), Sống đời (Kalanchoe pinnata (Lam). Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ qua (Momordica charantia L.) đã đƣợc xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn nhƣ Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật. Điều này giúp họ sử dụng hiệu quả hơn các nguồn dƣợc liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dƣợc mới, quý hiếm, có khả năng kháng đƣợc nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh. 1.1.2.2. Trong đời sống – kinh tế Cây thuốc không chỉ có giá trị trực tiếp để chữa bệnh và chăm sóc sức khoẻ, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lý thì đó còn là một nguồn thu nhập trong phạm vi hộ gia đình và các cộng đồng địa phƣơng. Nếu tổ chức trồng cây thuốc trên quy mô lớn để tạo ra nguồn hàng hoá trên thị trƣờng thì nó còn góp phần vào sự tăng trƣởng kinh tế cho đất nƣớc. Trên thế giới, nhiều nƣớc đã xuất khẩu dƣợc liệu và thu đƣợc nguồn ngoại tệ đáng kể. Ví dụ: ở Trung Quốc, vị thuốc Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) có giá tới 2000 - 5000 USD/Kg. Hoặc ở Triều Tiên, cây Nhân sâm đã mang lại một nguồn lợi kinh tế khá lớn cho những cơ sở trồng trọt và sản xuất thuốc từ cây này. Hằng năm, công ty Hồng sâm (Hàn Quốc) đã sử dụng trên 6.000 tấn Nhân sâm, để tạo ra giá trị sản phẩm trên 460 triệu USD. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của cây trồng nói chung. Một số vùng cao lại có khí hậu á nhiệt đới, phù hợp với việc trồng cây thuốc ƣa khí hậu mát mẻ. Đất đai ở miền núi nƣớc ta, đặc biệt trên dãy Trƣờng Sơn rộng lớn, còn rất nhiều đất hoang chƣa đƣợc khai thác sử dụng để phát triển kinh tế. Nếu ngƣời dân biết cách chuyển đổi cơ cấu cây trồng, kết hợp 5 Đồ án tốt nghiệp trồng rừng với trồng cây thuốc ở những nơi có khí hậu và đất đai phù hợp sẽ làm nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, góp phần tích cực trong việc xoá đói giảm nghèo cho ngƣời dân ở vùng núi (Trần Công Khánh, 2008). 1.1.3. Hoạt tính sinh học của cây thuốc Cây cỏ là nguồn không thể thiếu của các sản phẩm tự nhiên sử dụng làm thuốc, tác dụng chữa bệnh của chúng là do các hợp chất tự nhiên bên trong quyết định. Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật rất phong phú về mặt cấu trúc hóa học và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm nhƣ: kháng khuẩn, kháng sinh, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, chống sốt rét, điều hòa miễn dịch Hiện nay, thảo dƣợc chủ yếu đƣợc sử dụng ở 2 dạng: một là trong hỗn hợp các thành phần khác nhau (hỗn hợp tinh dầu, dịch chiết, dịch cô, chƣng cất), hai là sử dụng các hoạt chất đơn lẻ. Các hoạt chất đơn lẻ đƣợc cho là thành phần có hoạt tính chính trong thảo dƣợc, chúng thể hiện hoạt tính rất cao, đặc hiệu nhƣng yêu cầu liều dùng và cách sử dụng chính xác. Còn các dịch chiết, hỗn hợp sẽ áp dụng cho các loại thảo dƣợc thể hiện dƣợc tính thấp hoặc chƣa phát hiện ra hoạt chất chủ yếu có trong chúng. Nhiều hoạt chất từ cây cỏ đã và đang đƣợc ứng dụng làm thuốc và đƣợc quan tâm sản xuất ở nhiều nƣớc nhƣ reserpin từ cây ba gạc (Rawofia serpantina (L.) Benth. ex Kurz), quinidin, quinin tử cây canh ki na (Cinchona spp.) Và gần đây, nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chữa trị các bệnh hiểm nghèo (chống ung thƣ, chống HIV, tăng cƣờng miễn dịch cơ thể) đã đƣợc phát hiện từ cây cỏ nhƣ taxol, 10-deacetyl baccatin từ loài thông đỏ (Taxus spp.), (+)-calanoid A và (-)-calanoid B từ các loài mù u (Calophyllum lanigerum Miq., C. teysmanii Miq.), các nhóm chất cucurmin từ chi nghệ (Cucurma L.) và rất nhiều hợp chất thiên khác có trong nhiều loài thực vật. Việt Nam có lợi thế nguồn tài nguyên thực vật phong phú, với khoảng 4000 loài cây đƣợc dùng làm dƣợc liệu đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong nƣớc và trên thế giới. Do đó việc điều tra nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có giá trị nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc phát 6 Đồ án tốt nghiệp triển các dƣợc phẩm và sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt. 1.2. Các thành phần hóa học từ thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Đƣợc cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thƣờng m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Nhìn chung hàm lƣợng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật, carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trƣởng và phát triển. - Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận nhƣ củ, quả, lá, thân, cành. - Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate đƣợc chia ...của các loài cây thảo dƣợc nhƣ: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhusnutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. - Năm 2000 nghiên cứu của Avancini CAM, Wiest JM, Mundstock EA. cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn của “carqueja” (Baccharis trimera Less.) ức chế đƣợc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (S.aureus, Streptococcu uberis) và gram âm (Salmonella gallinarumand, Escherichia coli) . - Vào năm 2003 nhóm Candan và ctv đã nghiên cứu tinh dầu trong lá cỏ thi (Achillea millefolium) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn mẫu cao đƣợc chiết từ methanol. Tinh dầu có thể ngăn chặn sự phát triển của các nhóm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes, nấm Candida albicans và ức chế yếu hơn đối với Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffiiand, Candida krussei. - Vào năm 2006, nghiên cứu của nhóm Asolini và ctv cho kết quả nhóm hợp chất phenolic tồn tại trong mẫu cao chiết ethanol có khả năng kháng khuẩn rất tốt. Mẫu dịch chiết từ a-ti-sô (Cynara scolymus) và mẫu cao ethanol (80%) của cả a-ti- sô và “macela” (Achyrocline satureioides) ức chế sự phát triển của Bacillus cereus, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosa và S. aureus. - Năm 2011, Naveed Ahmad và ctv đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung môi khác nhau. Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis 29 Đồ án tốt nghiệp (Mehndi), Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal) chống lại Staphylococcus aureus. - Chaghaby và ctv (2014) đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây Annona Squamosa L. đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng mạnh hơn gram âm. Kết quả của ông đƣợc nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn gram âm ít bị ảnh hƣởng nhiều bởi những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn gram dƣơng là do chúng có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đó là lớp màng chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lƣu thông các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa học có trong mỗi loại dịch chiết. 1.3.4.2. Tại Việt Nam - Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hƣởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đƣa ra chế phẩm cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008). - Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phƣớc và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tƣợng nuôi động vật thuỷ sản, bƣớc đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm. - Tác giả Đặng Xuân Cƣờng (Đại học Nha Trang, 2009) đã nghiên cứu các phƣơng pháp thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ loài rong nâu Dictyota dichotoma Việt Nam. Tác giả cũng cho thấy dịch chiết thu nhận từ loài rong nâu này có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và đã phân tích đƣợc các thành phần có trong dịch chiết từ rong nâu. Cùng năm 2009, Võ Thị Mai Hƣơng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và 30 Đồ án tốt nghiệp cho kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tƣơng tự vào năm 2002 của Elysha và ctv. - Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và ctv đã thông báo kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của loài Mộc kí ngũ hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi. - Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hƣơng nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời. - Năm 2012, tại Nha Trang, Lê Thị Hƣơng Hà nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống oxi hóa của cao dịch chiết từ củ hành tăm (Allium schoenoprasum) trên các chủng vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, E. coli, S. aureus, Pseudomonas, B. subtilis, B. cereus, Aspergillus, Penicillium. - Võ Thị Mai Hƣơng và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus pumilus. - Năm 2014, Huỳnh Kim Diệu và Võ Thị Tuyết đã đánh giá sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây hẹ (Allium tuberosum Roxb. et Spreng) trên 8 chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. Kết quả nghiên cứu cao hẹ có khả năng ức chế trên tất cả các chủng vi khuẩn thí nghiệm (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml). 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1.3.5.1. Khái niệm - Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration (MIC)) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. - Khi cho vi khuẩn tiếp xúc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) ở các liều lƣợng nồng độ khác nhau, vi khuẩn bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Một số vi khuẩn có 31 Đồ án tốt nghiệp thể nhạy cảm với một ít hoặc với rất nhiều chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh). Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) phù hợp với từng loại vi khuẩn gây bệnh. Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu MIC, đồng thời xác định đƣợc nồng độ tối ƣu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc. 1.3.5.2. Phương pháp xác định Tùy theo phƣơng pháp áp dụng mà có nhiều cách xác định chỉ số MIC khác nhau. Các phƣơng pháp phổ biến nhƣ: phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch, phƣơng pháp pha loãng, phƣơng pháp đặt khoanh giấy. Sau đó ta có thể xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tăng trƣởng của vi khuẩn bằng cách quan sát với mắt thƣờng. 1.4. Ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật Tách chiết bằng dung môi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn - lỏng. Quá trình này sẽ sử dụng một số dung môi thích hợp để hoà tan các hợp chất tan có trong thực vật, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan. Phần dung môi hoà tan các chất tan đƣợc gọi là dịch chiết, phần không tan đƣợc gọi là bã thực vật. Dung môi sẽ đƣợc loại khỏi dịch chiết bằng nhiều phƣơng pháp và sau đó tiến hành thu hồi lƣợng cao có chứa nhiều hợp chất khác nhau của mẫu thực vật. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn ly trích, từ đó lựa chọn dung môi tách chiết thích hợp: - Trong dịch chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các thành phần của tinh dầu nhƣ monoterpen, các chất không phân cực nhƣ chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật, chlorophyl - Trong dịch chiết nƣớc sẽ có các glycoside, tannin - Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt quinone, các aglycol do glycoside thủy phân, sesquiterpen, diterpen - Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế clo. Ngƣời ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, 32 Đồ án tốt nghiệp hòa tan đƣợc các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác, nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn thành phần các hợp chất tự nhiên.  Yêu cầu đối với dung môi: - Dễ thấm vào dƣợc liệu: dung môi có độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ. - Hoà tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất. - Có tính trơ về mặt hoá học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn trong quá trình bảo quản, không bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao. - Dễ dàng đƣợc loại bỏ, phải bay hơi đƣợc khi cần cô đặc dịch chiết. - Không làm cao có mùi đặc biệt, khó chịu. - Cần có độ tinh khiết nhất định để không làm ảnh hƣởng đến hiệu quả và chất lƣợng của quá trình chiết cao. - Rẻ tiền, dễ kiếm. 1.5. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 1.5.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 1.5.1.1. Đặc điểm hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). Trực khuẩn E. coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4 ; phát triển đƣợc ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 1997). Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm. 33 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) 1.5.1.2. Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết đƣợc súc vật. 34 Đồ án tốt nghiệp 1.5.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 1.5.2.1. Đặc điểm hình thái Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thƣớc trung bình 3,0 x 0,5 µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có khả năng di động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005). Là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 - 9, nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2. Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trƣờng đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa. Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) 1.5.2.2. Khả năng gây bệnh Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy , co thắt da ̣dày , đau đầu, sốt, nôn mƣ̉ a và mất nƣớc (mất dic̣ h cơ thể ). Triêụ chƣ́ ng có thể tiến triển tƣ̀ 12 – 72 giờ sau khi nhiêm̃ khuẩn . Các triệu chứng thƣờng kéo dài 35 Đồ án tốt nghiệp trong vòng tƣ̀ 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục . Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013). Salmonella spp. còn gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S. typhii gây thƣơng tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạchCác bệnh khác (không phải thƣơng hàn) thƣờng là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S. typhimurium, S. enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thƣơng ở ngoài đƣờng tiêu hóa nhƣ viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi... Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể bệnh: bệnh thƣơng hàn, phó thƣơng hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc, S. choleraesuis chủng Kunzendorf và S. typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó thƣơng hàn cho heo, S. enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thƣơng hàn cho bò, bê, S. abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S. gallinarum – pullorum gây bệnh thƣơng hàn cho gà (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). 1.5.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. 1.5.3.1. Đặc điểm hình thái Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đƣờng ruột) là trực khuẩn gram âm, nhỏ, dài với kích thƣớc 0.5-0.6 x 1-3 µm, không sinh bào tử, không di động, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhƣng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur. - Trong môi trƣờng lỏng, sau 18-24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục đều môi trƣờng. - Trên môi trƣờng đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đƣờng kính khoảng 1mm, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều. 36 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 1.5.3.2. Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn Shigella spp. thƣờng chỉ giới hạn ở đƣờng tiêu hóa. Chỉ cần số lƣợng nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp biểu mô niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ngày và kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thƣờng kéo dài dƣới 7 ngày (Nguyễn Văn Minh Hoàng, 2013). Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết,... theo Nguyễn Đức Hiền (2013). 1.5.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp 1.5.4.1. Đặc điểm hình thái Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dƣơng, có kích thƣớc ngắn (0,4 – 0,5 x 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 200C chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhƣng sự di dộng không quan sát đƣợc ở 370C. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có thể sinh trƣởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 450C (tối ƣu là 30 – 360C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là 37 Đồ án tốt nghiệp rất chậm. Chúng có thể mọc ở pH 9,6, nhƣng đạt điều kiện tối ƣu ở pH hơi kiềm hoặc môi trƣờng trung tính (Nguyễn Hữu Liêm, 2013). Hình 1.17. Vi khuẩ n Listeria spp. 1.5.4.2. Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở ngƣời với các triệu chứng rất nguy hiểm và có tỷ lệ tử cong cao. Ngƣời nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ nhƣ sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi ngƣời mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống nhƣ bị cảm cúm nhƣng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp .tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 1.5.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 1.5.5.1. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thƣớc 38 Đồ án tốt nghiệp 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trƣờng bổ sung muối (NaCl) và không sinh H2S. Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) 1.5.5.2. Khả năng gây bệnh Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời. Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013). Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã đƣợc công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tƣợng thủy sản (Austin & Austin 1993). Một số bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra nhƣ sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh 39 Đồ án tốt nghiệp khác nhƣ: gây chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đƣờng ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác(Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 1.5.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. 1.5.6.1. Đặc điểm Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc; có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1–5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ phát triển tối ƣu ở 370C, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trƣờng đặc, thƣờng có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Hình 1.19. Vi khuẩn Pseudomonas 1.5.6.2. Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho ngƣời: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có điều kiện nhƣ khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thƣơng hở, 40 Đồ án tốt nghiệp Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân nhƣ nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng đƣờng tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xƣơng Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1 –0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần đƣợc hình thành những ổ mủ. 1.5.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. 1.5.7.1. Đặc điểm Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn gram dƣơng thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đƣờng kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 30 – 350C. Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trƣờng, không chịu đƣợc sự thành trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. Không sinh độc tố (Dƣơng Văn Sĩ, 2010). Hình 1.20. Vi khuẩn Enterococcus faecalis. 41 Đồ án tốt nghiệp 1.5.7.2. Khả năng gây bệnh Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thƣờng của ngƣời, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ thể ngƣời khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thƣờng gây nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, gây nhiễm trùng vết thƣơng (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng) và nhiễm khuẩn huyết. 1.5.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.5.8.1. Đặc điểm Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). Hình 1.21. Vi khuẩn Staphylococc us aureus 42 Đồ án tốt nghiệp 1.5.8.2. Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Staphylococcus aureus cƣ trú trên ngƣời và động vật, có trong sữa bò bị bệnh, thịt heo tƣơi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất. Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn nhƣ tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng nhƣ: Nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thƣơng hậu phẩu, tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 43 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ 01/2015 đến 08/2015. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu cây Xidi Klung (cành, lá) đƣợc thu tại Vƣờn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7. - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. - Nhóm vi khuẩn Listeria: L. monocytogenes, L. innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.2.3. Hóa chất, dung môi a. Môi trường nuôi cấy và tăng sinh - Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). 44 Đồ án tốt nghiệp b. Hóa chất - Ciprofloxacin 500 mg (Việt Nam). - H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform. - Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. - Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. - NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%. - Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. c. Dung môi: - Ethanol 50 %, 70 %, 90% (Việt Nam). - Methanol 75%. - Nƣớc cất. - Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc). 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ. - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ (d= 6 mm) - Ống nghiệm lớn, nhỏ - Thƣớc đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không thấm - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 nƣớc ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Bình môi trƣờng 250 ml, 500 - Eppendorf ml, 1000 ml - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao - Que cấy trang chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp - Đèn cồn gấp, muỗng, dao, thun,... 45 Đồ án tốt nghiệp b. Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert - Cân phân tích (Orbital mermany) Germany) - Máy ly tâm (Tuttligen - Bếp từ (Billy – England) Germany) - Máy nƣớc cất (Branstead USA) - Máy cô cách thủy -Thiết bị cô quay chân không 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật đƣợc thu một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận lá và cành mang đi rửa sạch và phơi khô để có đƣợc khối lƣợng không đổi. Mẫu cây khô đƣợc tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lƣợng bột mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói trong túi nhựa và lƣu trữ trong một bình kín hơi dùng để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật đƣợc tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phƣơng pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thƣờng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong lƣợng lớn dung môi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi. Cách tiến hành: ngâm một lƣợng bột mẫu vào lƣợng lớn dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc ngâm trong khoảng 24h, thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, ép bã thu dịch chiết. Tiếp tục cho thêm lƣợng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết đƣợc cô đặc, thu hồi cao bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 400C (đối với dung môi methanol) và cô cách thủy ở 70oC (đối với dung môi ethanol, nƣớc). Các cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 46 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mẫu Xidi Klung ngâm trong ethanol (tỳ lệ 1:20 (w/v)) 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này đƣợc chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này đƣợc lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn đƣợc chuyển đến môi trƣờng mới trƣớc khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, đƣợc bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 47 Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Nhằm hoạt hoá các vi khuẩn đƣợc giữ giống phát triển lại bình thƣờng vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trƣờng. Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland... có khả năng tách chiết đƣợc rất nhiều hợp chất từ cây Xidi Klung bao gồm các hợp chất thông thƣờng và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thƣờng đƣợc tìm thấy trong cao chiết EtOH 70% của cây Xidi Klung thấy có sự hiện diện của hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Benedict đều dƣơng tính) nhƣng không thấy có sự hiện diện của amino acid. Trong 88 Đồ án tốt nghiệp cao chiết Xidi Klung EtOH 70% có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm các loại hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, nhóm các hợp chất phenol, tannin và nhóm steroid. Trong công trình nghiên cứu của Phạm Văn Ngọt và ctv (2015), lá và vỏ của loài Đƣớc xanh (Rhizophora mucronata) và Bần trắng (Sonneratia alba) đƣợc li trích trong nƣớc và ức chế sự sinh trƣởng của P. aeruginosa có chứa các hợp chất tanin và phenol và một số hợp chất khác chƣa đƣợc nhận diện là tác nhân ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn P. aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Xidi Klung nói riêng là do chúng có các thành phần alkaloids, flavonoid, hợp chất phenol, tannin và triterpenoid quyết định. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, trên hợp chất phenolic thấy sự tồn tại của các dẫn chất nhƣ catechol, epicatechin, cinnamic acid, hypericin warfarin hay trong hợp chất của flavonoids có dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật. Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao chiết Xidi Klung từ EtOH 70% có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, phenol, tannin, triterpenoid. Tóm lại, với các kết quả khảo sát ban đầu về hoạt tính sinh học của cây Xidi Klung, nhận thấy rằng đây là một loại thảo dƣợc có hoạt tính sinh học tƣơng đối cao. Tuy dung môi EtOH 50% cho hiệu suất thu hồi cao tốt nhất trong 5 dung môi khảo sát nhƣng với các thí nghiệm sau nhận thấy rằng cao chiết từ EtOH 70% cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn cả thể hiện qua khả năng ức chế tốt nhất ở cả 6/6 nhóm vi khuẩn gây bệnh khảo sát đặc biệt là đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột E. coli, Salmonella spp., Shigella spp, Vibrio spp. Đồng thời chỉ số MIC 89 Đồ án tốt nghiệp của cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh cũng tƣơng đối thấp càng chứng minh đƣợc hiệu quả kháng khuẩn mạnh của chúng. Trong cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có sự hiện diện của rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học: hợp chất phenol, alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, triterpenoid, glycoside; những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của cây Xidi Klung. Do đó, cây Xidi Klung cần phải đƣợc tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học nói chung và khả năng trị bệnh tiêu chảy nói riêng nhằm tìm ra phƣơng thuốc mới, hiệu quả nhằm thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh. 90 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Từ mẫu cây Xidi Klung thực hiện tách chiết để thu hồi cao với 5 loại dung môi khác nhau MeOH 75%, EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 90% và nƣớc trong đó hiệu suất thu hồi cao từ EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 90% cho kết quả tƣơng đƣơng nhau và có hiệu suất cao nhất. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 5 loại cao chiết Xidi Klung trên 20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết Xidi Klung có phổ hoạt động rộng và có ức chế tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời, đặc biệt là cao chiết từ EtOH 70% luôn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với đƣờng kính vòng kháng từ 9,83 mm – 12,83 mm. - Tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Xidi Klung từ EtOH 70% trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh có kết quả là 50 mg/ml với 3 chủng S. flexneri, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus và 25 mg/ml đối với 17 chủng còn lại. - Thử nghiệm xác định thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Xidi Klung thấy sự hiện diện của các hợp chất: carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, nhóm các hợp chất phenol, tannin và nhóm steroid. 4.2. Đề nghị - Tiến hành định danh cho cây Xidi Klung. - Đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Xidi Klung với nhiều vi sinh vật gây bệnh khác. - Đánh giá khả năng trị bệnh tiêu chảy của cao chiết từ cây Xidi Klung trên mô hình ở động vật. - Định lƣợng các thành phần hóa học chủ yếu của cao chiết từ Xidi Klung. 91 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội. Trần Trƣờng Hận (2010). Hợp chất thiên nhiên. Nguyễn Thị Hằng và ctv (2015). Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của loài tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe Pentandra (L.) MIQ.). Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012). Phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Hà Nội. GV Bùi Thi Hải Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc Tố E.coli, Viện Đại học Mở Hà Nội. TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol, Đại học Y dƣợc TPHCM. BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM. cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/ Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate. Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2011). Bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium sativum) đối với một số vi khuẩn ngây bệnh ở người. Trần Công Khánh (2008). Cây thuốc trong xoá đói giảm nghèo. Tuyển tập công trình KH của VACNE về “Bảo vệ môi trƣờng & Phát triển bền vững”, 1988- 2008, tr. 371-374. TS. Phan Văn Kiệm (2008). Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số cây thuốc dân tộc Việt Nam nhằm tạo sản phẩm thuốc có giá trị cao phục vụ cuộc sống. 92 Đồ án tốt nghiệp Phạm Thanh Kỳ (1998). Bài giảng dược liệu – tập II. Nhà xuất bản Trung tâm thông tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của carbohydrate. Đỗ Tất Lợi (1992), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXBKHKT. Hoàng Ngân (2013), Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Tạp chí sức khỏe và đời sống. Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng đại học Công Nghệ TP.HCM. Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông tin KH&CN TPHCM. Phạm Minh Nhựt (2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Th.s Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv (2010), Báo công nghệ và chế biến rau trái, Trƣờng đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh. Dƣơng Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Chyên đề tốt nghiệp, Trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh- chieu-29121/ Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM. Lâm Phạm Huệ Tâm (2015). Đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Medinilla sp. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM. 93 Đồ án tốt nghiệp Lƣơng Văn Tiến và ctv (2015), Kết quả nghiên cứu bước đầu về thành phấn hóa học của dầu hạt lai (Aleurites moluccana), Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Trần Thị Ngọc Thanh (2012). Nghiên cứu tách chiết và định danh một số Phytoncid chủ yếu từ củ nén ở Quảng Nam, Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học, Trƣờng Đại Học Đà Nẵng. Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng, Trƣờng đại học công nghệ TPHCM. cay-luoc-vang-callisia-fragrans-lindl-wood-52390/ Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013). Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM. Đái Thị Xuân Trang và ctv (2015). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao methanol cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas MERR.). TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abba D., Inabo, H. I., Yakubu, S. E. and Olonitola, O. S. (2009), Phytochemical analysis and antibacterial activity of some powered herbal preparations marketed in Kaduna metropolis, Full Lengh Research Article. Abou-Karam, M., and W. T. Shier (1990), A simplified plaque reduction assay for antiviral agents from plants, Demonstration of frequent occurrence of antiviral activity in higher plants. J. Nat. Prod. 53:340–344. Aibinu I.E., Akinsulire O.R., Adenipekun T. and Odugbemi T.A.T. (2007). In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants bryophyllum pinnatum and kalanchoe crenata, Afr. J. Traditional Complementary and Alternative Medicines, 4 (3), 338-344. 94 Đồ án tốt nghiệp Anonymous (1996). The Indian Pharmacopoeia. 3rd edition. Government of India, New Delhi. Ministry of Health and family welfare. Babuselvam M., Farook K.A.M., Abideen S., Mohamed M.P. and Uthiraselvam M. (2012). Screening of antibacterial activity of mangrove plant extracts against fish and shrimp pathogens, International Journal of Applied Microbiology Science, 1 (3), 20-25. Burt S (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods – a review. Int J Food Microbiol. 2004;94(3):233-53. Cowan MM (1999). Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev. 1999; 12(4):564-82. Hadacek F., Greger H., (2000). Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice. Phytochem Anal., 11: 137-147. Kris-Etherton, P,M,; Hecker, K.D., Bonanome, A., Coval, S.M., Binkoski, A.E., Hilpert, K.F., Griel, A.E. & Etherton TD (2002). Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. American Journal of Medicine. 113:71S–88S. Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M., Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770. Kotzekidou, P.; Giannakidis, P., Boulamatsis, A. (2008). Antimicrobial activity of some plant extracts and essential oils against foodborne pathogens in vitro and on the fate of inoculated pathogens in chocolate. LWT41: 119–127 Manson, M.M. (2003). Cancer prevention – the potential for diet to modulate molecular signalling. Trends in Molecular Medicine. 9: 11–18. Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia. 95 Đồ án tốt nghiệp Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica. Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology. Saxena Mamta and Saxena Jyoti (2012), Phytochemical screening of Acorus calamus and Lantana Camara, Interational Research Journal of Pharmacy. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, NiţăSultana và Colceriu Svetlana (2011). Antioxidant and Antimicrobial Activities of Ethanol Extracts ofCynara Scolymus(Cynarae folium, Asteraceae Family), Tropical Journal of Pharmaceutical Research December 2011; 10 (6): 777-783. Yadav P. D., Bharadwaj N. S. P.,Yedukondalu M., Methushala C. H., Ravi K. (2013), Phytochemical evaluation of nyctanthes arbortristis, nerium oleander and catharathnus roneus, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology. 96 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT THU HỒI CAO CHIẾT TỪ XIDI KLUNG VỚI CÁC LOẠI DUNG MÔI KHÁC NHAU. A.1. Kết quả đánh giá hiệu suất cao chiết Xidi Klung với các loại dung môi khác nhau ETHANOL Nƣớc HIỆU SUẤT MeOH 75% EtOH EtOH EtOH (%) 50% 70% 90% 1 10.78 16.39 15.84 16.13 12.45 2 12.12 16.96 14.97 16.84 11.92 3 11.78 15.76 16.64 15.34 11.60 A.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê hiệu suất cao chiết Xidi Klung với các loại dung môi khác nhau Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 67.9733 4 16.9933 37.10 0.0000 Within groups 4.58093 10 0.458093 Total (Corr.) 72.5542 14 Bảng Multiple range tests Method: 95,0 percent Tukey HSD Dung môi Count Mean Homogeneous Groups MeOH 3 11.56 X NUOC 3 11.99 X EtOH70 3 15.8167 X EtOH90 3 16.1033 X EtOH50 3 16.37 X 1 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT TỪ XIDI KLUNG ĐỐI VỚI CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH B.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli (d = 6 mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc chỉ thị (500 µg/ml) E. coli O157:H7 10 10 9 11 12 11 12,5 13 13 13,5 14 13 - - - 13 13 13,5 E. coli 0208 10 9,5 10,5 9 11 10 10,5 10,5 10,5 9,5 10 10 9,5 9 9 12,5 12 12,5 E.coli 12 12,5 12,5 10 11 10 10 9,5 10,5 11 10 11 9,5 9,5 9 13 13 13,5 ETEC 10 9,5 9 10 11 11 11,5 11,5 12 10 10 10,5 11,5 11 11 30,5 31 31,5 B.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc (500 µg/ml) L. innocua 13 12,5 11,5 11 11 12 11,5 12 12 11 12 11 10 10 10 11,5 12 12,5 L. monocytogenes 9,5 9 8 9 11 10 10 13 12 11 10 10,5 - - - 12 12 12,5 2 Đồ án tốt nghiệp B.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. (d = 6mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin chỉ thị MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc (500 µg/ml) S. dublin - - - 11 11 10 10 10 10 9,5 10,5 10 - - - 12 11,5 13 S. enteritidis 10 10 10 11 12 12 12,5 12 12 10 10 11 - - - 13,5 13 12,5 S. typhii 9 9 9 10 11 10 10,5 11,5 11 10 10,5 10,5 11 11 11 13 12 12,5 S. typhimurium 11 11 11 11 11 10 9,5 10 10 10,5 11,5 11 11 12,5 11 11 11 11 B.4. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc (500 µg/ml) S. boydii 8,5 9 9 10 10 11 11 10 10,5 8,5 9,5 9 - - - - - - S. flexneri 9 8 9 11 12 10 11,5 11,5 12,5 10 11 10,5 9,5 9,5 9 13 13 13,5 S. sonnei 9,5 8 8 13 13 13 11,5 11 12 10 9,5 9,5 9 8,5 8 33,5 33 32,5 3 Đồ án tốt nghiệp B.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (8 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc (500 µg/ml) V. alginolyticus 9 9 - 11 11 11 10,5 11 10 10,5 11 10 - - - 16,5 16 16 V.cholerae 10 10,5 12 12 13 12 12 12 12 10,5 11 10,5 - - - 13 13 14 V. harveyi 10,5 10 11 11 11 10 10 10 10 10 10 9,5 - - - 17,5 18 18,5 V. parahaemolyticus 9,5 9 9,5 11 11 12 9 10,5 11,5 10 9 10,5 - - - 11,5 11,5 11 B.6. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết Xidi Klung từ các loại dung môi khác nhau (nồng độ 100 mg/ml) và Ciprofloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da (d= 6 mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin MeOH 75% EtOH 50% EtOH 70% EtOH 90% Nƣớc chỉ thị (500 µg/ml) P. aeruginosa 9,5 10 10 12 12 12 11,5 10,5 12 10 9 10 - - - 12.5 11.5 12.5 S. aureus 9,5 9,5 9 11 12 12 11,5 12,5 11 10,5 11 12 - - - 12 12 12.5 E. feacalis 9,5 8 8 10 10 11 11,5 11 11 9 9,5 9,5 - - - 12 11.5 12.5 4 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT TỪ XIDI KLUNG ĐỐI VỚI CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH C.1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn Escherichia coli. C.1.1. E.coli O157:H7 Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 396.458 5 79.2917 439.15 0.0000 Within groups 2.16667 12 0.180556 Total (Corr.) 398.625 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD E0157H7 Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 9.66667 X EtOH50 3 11.3333 X EtOH70 3 12.8333 X CIP 3 13.1667 X EtOH90 3 13.5 X C.1.2. E. coli 0208 Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 17.5694 5 3.51389 14.06 0.0001 Within groups 3.0 12 0.25 Total (Corr.) 20.5694 17 5 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD E0208 Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 9.16667 X EtOH90 3 9.83333 X EtOH50 3 10.0 X MeOH 3 10.0 X EtOH70 3 10.5 X CIP 3 12.3333 X C.1.3. E. Coli Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 32.4028 5 6.48056 33.33 0.0000 Within groups 2.33333 12 0.194444 Total (Corr.) 34.7361 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD ECOLI Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 9.33333 X EtOH70 3 10.0 XX EtOH50 3 10.3333 XX EtOH90 3 10.6667 X MeOH 3 12.3333 X CIP 3 13.1667 X C.1.4.ETEC Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 1045.57 5 209.114 1158.17 0.0000 Within groups 2.16667 12 0.180556 Total (Corr.) 1047.74 17 6 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD ETEC Count Mean Homogeneous Groups MeOH 3 9.5 X EtOH90 3 10.1667 XX EtOH50 3 10.6667 XX NUOC 3 11.1667 XX EtOH70 3 11.6667 X CIP 3 31.0 X C.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp. C.2.1. L. innocua Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 10.0694 5 2.01389 7.63 0.0019 Within groups 3.16667 12 0.263889 Total (Corr.) 13.2361 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD LISINNO Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 10.0 X EtOH50 3 11.3333 XX EtOH90 3 11.3333 XX EtOH70 3 11.8333 X CIP 3 12.0 X MeOH 3 12.3333 X C.2.2. L. Monocytogene Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 303.903 5 60.7806 85.81 0.0000 Within groups 8.5 12 0.708333 Total (Corr.) 312.403 17 7 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD LISMONO Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 8.83333 X EtOH50 3 10.0 XX EtOH90 3 10.5 XX EtOH70 3 11.6667 X CIP 3 12.1667 X C.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn Salmonella spp. C.3.1. S. dublin Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 468.069 5 93.6139 481.44 0.0000 Within groups 2.33333 12 0.194444 Total (Corr.) 470.403 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SDUBLIN Count Mean Homogeneous Groups MeOH 3 0.0 X NUOC 3 0.0 X EtOH70 3 10.0 X EtOH90 3 10.0 X EtOH50 3 10.6667 X CIP 3 12.1667 X 8 Đồ án tốt nghiệp C.3.2. S. enteritidis Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 330.111 5 66.0222 297.10 0.0000 Within groups 2.66667 12 0.222222 Total (Corr.) 332.778 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SENTER Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 10.0 X EtOH90 3 10.3333 X EtOH50 3 11.6667 X EtOH70 3 12.1667 X CIP 3 12.1667 X C.3.3. S. typhii Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between groups 19.7361 5 3.94722 25.84 0.0000 Within groups 1.83333 12 0.152778 Total (Corr.) 21.5694 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD STYPHII Count Mean Homogeneous Groups MeOH 3 9.0 X EtOH50 3 10.3333 X EtOH90 3 10.3333 X EtOH70 3 11.0 X NUOC 3 11.0 X CIP 3 12.5 X 9 Đồ án tốt nghiệp C.3.4. S. typhimurium Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 4.66667 5 0.933333 3.95 0.0237 Within groups 2.83333 12 0.236111 Total (Corr.) 7.5 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD STYPHIMURIUM Count Mean Homogeneous Groups EtOH70 3 9.83333 X EtOH50 3 10.6667 XX CIP 3 11.0 XX MeOH 3 11.0 XX EtOH90 3 11.0 XX NUOC 3 11.5 X C.4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn Shigella spp. C.4.1. S. boydii Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 380.611 5 76.1222 498.25 0.0000 Within groups 1.83333 12 0.152778 Total (Corr.) 382.444 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SHIBOYDII Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X CIP 3 0.0 X MeOH 3 8.83333 X EtOH90 3 9.0 X EtOH50 3 10.3333 X EtOH70 3 10.5 X 10 Đồ án tốt nghiệp C.4.2. S. flexneri Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 40.4583 5 8.09167 23.30 0.0000 Within groups 4.16667 12 0.347222 Total (Corr.) 44.625 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SHIFLEXNERI Count Mean Homogeneous Groups MeOH 3 8.66667 X NUOC 3 9.33333 XX EtOH90 3 10.5 XX EtOH50 3 11.0 X EtOH70 3 11.8333 XX CIP 3 13.1667 X C.4.3. S. sonnei Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 1342.57 5 268.514 1017.53 0.0000 Within groups 3.16667 12 0.263889 Total (Corr.) 1345.74 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SHISONNEI Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 8.5 X MeOH 3 8.5 X EtOH90 3 9.66667 X EtOH70 3 11.5 X EtOH50 3 13.0 X CIP 3 33.0 X 11 Đồ án tốt nghiệp C.5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn Vibrio spp. C.5.1. V. algino Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 449.569 5 89.9139 19.56 0.0000 Within groups 55.1667 12 4.59722 Total (Corr.) 504.736 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD VALGINO Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 6.0 X EtOH70 3 10.5 XX EtOH90 3 10.5 XX EtOH50 3 11.0 XX CIP 3 16.1667 X C.5.2.V. cholerea Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 364.736 5 72.9472 238.74 0.0000 Within groups 3.66667 12 0.305556 Total (Corr.) 368.403 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD VCHOLEREA Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X EtOH90 3 10.6667 X MeOH 3 10.8333 XX EtOH70 3 12.0 XXX EtOH50 3 12.3333 XX CIP 3 13.3333 X 12 Đồ án tốt nghiệp C.5.3. V. Harveyi Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 493.667 5 98.7333 646.25 0.0000 Within groups 1.83333 12 0.152778 Total (Corr.) 495.5 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD VHARVEYI Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X EtOH90 3 9.83333 X EtOH70 3 10.0 X MeOH 3 10.5 X EtOH50 3 10.6667 X CIP 3 18.0 X C.5.4.V.para Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 281.736 5 56.3472 126.78 0.0000 Within groups 5.33333 12 0.444444 Total (Corr.) 287.069 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD VPARA Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 9.33333 X EtOH90 3 9.83333 XX EtOH70 3 10.3333 XX EtOH50 3 11.3333 X CIP 3 11.3333 X 13 Đồ án tốt nghiệp C.6. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Xidi Klung đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da C.6.1. P. aeruginosa Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 319.333 5 63.8667 287.40 0.0000 Within groups 2.66667 12 0.222222 Total (Corr.) 322.0 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD PSEU Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X EtOH90 3 9.66667 X MeOH 3 9.83333 X EtOH70 3 11.3333 X EtOH50 3 12.0 X CIP 3 12.1667 X C.6.2. S. aureus Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 328.167 5 65.6333 236.28 0.0000 Within groups 3.33333 12 0.277778 Total (Corr.) 331.5 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD SAUREUS Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 9.33333 X EtOH90 3 11.1667 X EtOH70 3 11.6667 X EtOH50 3 11.6667 X CIP 3 12.1667 X 14 Đồ án tốt nghiệp C.6.3. E.feacalis Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 286.944 5 57.3889 229.56 0.0000 Within groups 3.0 12 0.25 Total (Corr.) 289.944 17 Bảng Multiple range test Method: 95.0 percent Tukey HSD EFEACALIS Count Mean Homogeneous Groups NUOC 3 0.0 X MeOH 3 8.5 X EtOH90 3 9.33333 XX EtOH50 3 10.3333 XX EtOH70 3 11.1667 XX CIP 3 12.0 X 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D. CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ D.1. Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml. D.2. Thuốc thử Fehling * Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O đƣợc hòa tan hoàn toàn vào nƣớc cất, sau đó tiếp tục định mức đến 500ml . * Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào nƣớc cất và định mức cho đến 500ml. D.3. Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml acid acetic glacial và 1000ml nƣớc cất. Hỗn hợp trên đƣợc mang đi đun và khuấy đến khi tan hoàn toàn. D.4.Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nƣớc cất. Tiếp tục cân 5g KI hòa tan trong 10ml nƣớc cất. Sau đó tiến hành trộn 2 dung dịch trên lại với nhau và định mức bằng nƣớc cất đến100 ml. D.5. Thuốc thử Dragendroff: Gồm 2 dung dịch: -Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. -Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan trong nƣớc cất. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nƣớc cất. D.6. Thuốc thử Hager Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nƣớc cất, sau đó lọc dung dịch trên và thu dịch lọc. D.7. Thuốc thử Wagner Hòa tan 2g I2 và 6g KI vào nƣớc cất và định mức đến 100ml. Thuốc thử là dung dịch tan hoàn toàn, tránh sự tiếp xúc ánh sáng. D.8. Natri nitro prusside Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nƣớc cất. 16 Đồ án tốt nghiệp D.9. Thuốc thử Resazurin Resazurin có dạng viên nén, nghiền nhuyễn 1 viên Resazurin hòa tan với 100 ml nƣớc cất vô trùng, bảo quản trong tủ lạnh. 17 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E. KẾT QUẢ HÌNH ẢNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ XIDI KLUNG TỪ ETHANOL 70%. E.1. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Carbohydrate A B C A. Thử nghiệm Molisch; B. Thử nghiệm Fehling; C. Thử nghiệm Benedict E.2. Kết quả dƣơng tính của thử nghiệm định tính Saponin Thử nghiệm Foam 18 Đồ án tốt nghiệp E.3. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Alkaloids A B C D A. Thử nghiệm Mayer; B. Thử nghiệm Dragendroff C. Thử nghiệm Hager; D. Thử nghiệm Wagner E.4. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Cardiac Glycosides A B A. Thử nghiệm Legal; B. Thử nghiệm Keller Killiani 19 Đồ án tốt nghiệp E.5. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Flavonoids A. Thử nghiệm Alkaline a) trƣớc khi cho HCl vào; b) sau khi cho HCl vào; B. Thử nghiệm Shinoda; C. Thử nghiệm Ferric chloride E.6. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính hợp chất Phenolic A B A. Thử nghiệm Lead Acetate; B. Thử nghiệm Gelatin 20 Đồ án tốt nghiệp E.7. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Tannin A. Thử nghiệm Ferric chloride; B. Thử nghiệm Lead acetate E.8. Kết quả dƣơng tính của các thử nghiệm định tính Steroid Thử nghiệm Libermann Burchard 21