Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan vũ nữ oncidium kozumit delight in vitro

tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Hồng Nhung i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Trịnh Thị Lan Anh – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Phan Hồng Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...i LỜI CÁM ƠNii MỤC LỤC.iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...vi DANH MỤC BẢNGvii DANH MỤC HÌNH......ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ...xi MỞ ĐẦU1 1. Đặt vấn đề..1 2. Mục đích nghiên cứu.3 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.....3 4. Phương pháp nghiên cứu...3 5. Kết quả đạt được....3 6. Kết cấu của đề tài...4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..5 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro..5 1.2. Nguồn carbon.......5 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon.6 1.3.1. Glucose.6 1.3.2. Fructose8 1.3.3. Lactose9 1.3.4. Manitol...11 1.3.5. Sorbitol...12 1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro...14 iii 1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro13 1.4.2. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro..16 1.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro18 1.6. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam20 1.6.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới.20 1. 6.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam21 1.6.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ..23 1.7. Giới thiệu về lan Vũ nữ..23 1.7.1. Phân loại khoa học..23 1.7.2. Nguồn gốc và sự phân bố24 1.7.3. Đặc điểm hình thái sinh học25 1.7.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ...27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..30 2.1. Địa điểm tiến hành đề tài30 2.2. Vật liệu nghiên cứu30 2.2.1. Vật liệu30 2.2.2. Môi trường nuôi cấy30 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm...30 2.3. Phương pháp...31 2.3.1. Cách pha môi trường...31 2.3.2. Hấp khử trùng..31 2.4. Bố trí thí nghiệm.32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight..33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).33 iv 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)34 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi.36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu...36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.37 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).37 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).44 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)..51 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).58 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.73 4.1. Kết luận..73 4.2. Kiến nghị73 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................75 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EU European Union Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh DNA Deoxyribonucleic acid P Phường Q Quận MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthyl acetic acid BA 6-benzylaminopurine 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)..32 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)..33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight)..35 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight).35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy..38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi45 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy59 vii Bảng 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy..66 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lan Vũ nữ..24 Hình 1.2. Rễ của lan Vũ nữ...25 Hình 1.3. Thân của lan Vũ nữ...26 Hình 1.4. Hoa lan Vũ nữ...27 Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)40 Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)..41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)48 Hình 3.5. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với ix nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)55 Hình 3.6. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)..56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)61 Hình 3.8. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)62 Hình 3.9. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)68 Hình 3.10. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)...69 x DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)39 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)..46 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)..54 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)60 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l)67 xi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tình hình kinh tế trên thế giới trong những năm gần đây biến động khá phức tạp. Nền kinh tế của Việt Nam cũng chịu nhiều ảnh hưởng. Đến năm 2015, nền kinh tế nước ta mới có sự chuyển biến. Trong đó, ngành nông nghiệp là ngành phát triển mạnh mẽ. Trong đầu năm 2015, ngành nông nghiệp đã tăng đáng kể và chiếm tỷ trọng lớn nhất (71%) trong nền kinh tế Việt Nam. Cùng với những thành tựu đạt được trong nền sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan cũng có những bước tiến đáng kể. Hiện nay lan Vũ nữ nói chung và các loại lan khác nói riêng đang được xem là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan là loại cây mang lại nhiều lợi nhuận cho các trung tâm, doanh nghiệp cũng như nhiều hộ gia đình nhờ việc cung cấp trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài. Nhiều nước trên thế giới kinh doanh xuất khẩu hoa lan như: Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Indonesia, Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,... Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya,... Ở Việt Nam, các vùng trồng hoa lan phổ biến như Tây Nguyên, Đà Lạt, Yên Bái, Sa Đéc, Tp. Hồ Chí Minh, nhưng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt (Địa Lan), Tp. Hồ Chí Minh (Denrobium, Mokara, Vanda, Oncidium,) với diện tích khá khiêm tốn khoảng 200 ha chỉ bằng 5,4% so với Thái Lan. Thái Lan xuất khẩu đến 38 nước trên thế giới trong đó có Việt Nam, đạt giá trị 104 triệu USD (2009). Trong khi đó Tp. Hồ Chí Minh với 168 ha Lan, sản lượng hàng năm mới chỉ giải quyết được khoảng 30% nhu cầu tại chỗ. Một vài công ty cũng xuất khẩu đến Mỹ, Nhật với Mokara cắt cành, tuy chất lượng đạt yêu cầu nhưng giá thành khá cao nên khó có thể cạnh tranh với Thái Lan. Nếu phải xuất một lượng lớn trong thời gian dài theo hợp đồng thì nước ta không thể đáp ứng được. 1 Nhân giống in vitro đã được chứng minh là một công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad et al., 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Lan Vũ nữ là loại lan có hoa nhỏ mọc thành từng chùm, đẹp, bền với nhiều màu sắc và hoa văn phong phú, nhưng lại là loài sinh trưởng chậm và là loài rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp trong vườn ươm và rất dễ nhiễm bệnh. Để có số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm nhằm đem đến sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ lai. Tuy nhiên, việc nhân giống bằng phương pháp gieo hạt này mang tính ngẫu nhiên, thu được cây có tính trạng không yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng cây ổn định về mặt di truyền. Trong nuôi cấy in vitro, đường là nguồn carbon quan trọng đối với quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài và kích thước mô cấy nhỏ vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào, để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Nó đã được chứng minh rằng nồng độ đường ban đầu có thể ảnh hưởng đến các thông số khác nhau trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật, như tỷ số tăng trưởng, năng suất của sự trao đổi chất thứ cấp. Mô thực vật có khả năng hấp thụ một số đường khác nhau như đường sucrose, glucose, fructose, malnose, galatose, lactose, manitol, sorbitol, thậm chí tinh bột cũng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy mô. Vì vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro” nhằm tìm ra nguồn carbon và nồng độ thích hợp cho việc nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh và gia tăng chất lượng cây giống. 2 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (lactose) và đường đa (manitol, sorbitol) lên sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong nhân giống in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). Phạm vi nghiên cứu: bố trí thí nghiệm với các nồng độ khác nhau của các nguồn carbon (glucose, fructose, lactose, manitol và sorbitol) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của lan Vũ nữ. 4. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.0 và chương trình Microsoft Excel 2010®. 5. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ đường glucose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường fructose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường lactose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường manitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường sorbitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. 3 6. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ khoa học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 1.2. Nguồn carbon Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbonhydrate, với những loại đường phổ biến như saccharose và glucose. Chất nền carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng đòi hỏi cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Nó cũng cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành sản phẩm thông qua trao đổi trung gian Sự chuyển hóa của carbonhydrate bởi tế bào thực vật bao gồm con đường pentose phosphate, glycolysis và chu trình acid citric, mà cuối cùng sản xuất các tiền thân của các hợp chất thứ cấp. Nguồn carbon thông dụng nhất là saccharose, nồng độ thích hợp 2 – 3%. Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường 5 saccharose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, ở một số trường hợp đặc biệt cũng có thể dùng fructose, galactose và maltose để thay thế. Trong nuôi cấy dịch treo tế bào dừa cạn (C. roseus), khi thay đổi hàm lượng đường sucrose cho thấy có hiệu quả kích thích tích lũy alkaloid ở các nồng độ khác nhau Nguồn carbon được xem là yếu tố quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào thực vật, ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid ở nuôi cấy tế bào huyền phù cây mộc hoa trắng (Holarrhena antidysenterica), anthocyanin từ tế bào huyền phù cây nho (V. vinifera), và shikonin khi nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon. Khi nuôi cấy tế bào huyền phù nhân sâm (Panax spp) để sản xuất đồng thời ginseng saponin và ginseng polysaccharide, cả hai chất này đều có khả năng chống ung thư và có hoạt tính miễn dịch, sự thay đổi saccharose trong môi trường nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng lớn đến việc cải thiện hiệu suất của quá trình nuôi cấy. 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon 1.3.1. Glucose Glucose là một monosaccharide có nhiều trong các loại trái cây chín. Glucose được Andreas Marggraf trích ly đầu tiên từ trái nho khô vào năm 1747. Tên glucose được Jean Dumas đặt vào năm 1838, tên glucose xuất phát từ tiếng Hy Lạp Glycos có nghĩa là đường hay ngọt. Cấu tạo của glucose được Emil Fisher khám phá vào khoảng thời gian cuối thế kỉ 19 đầu thế kỉ 20. Được tạo ra nhờ quá trình quang hợp của cây xanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Là thành phần quan trọng cố định trong máu (0,1 g/l), cung cấp năng lượng. Cơ thể dự trữ ở gan dưới dạng glycogen, nếu dư còn có thể tích trữ ở da dưới dạng mỡ nhờ chuyển hóa của insulin. Khi cơ thể hoạt động, dạng dự trữ sẽ chuyển hóa ngược lại thành glucose đồng thời phóng năng lượng. ➢ Tính chất vật lý - Khả năng kết tinh khó hơn saccharose - Tỉ trọng 1,54 g/cm3 6 - Dạng nóng chảy 146 – 150 độ C - Tinh thể không màu - Cấu trúc tinh thể - Hút ẩm mạnh hất thu 15% nước - Tồn tại chủ yếu ở dạng vòng pyran do sự nối vòng xảy ra giữa nhóm CHO (C1) và OH (C6). Do sự nối vòng này làm xuất hiện 1 trung tâm chiral nên tạo thêm 2 đồng phân quang học mới. 2 đồng phân này có thể chuyển đổi qua lại với nhau và thực tế trong không gian chúng không phẳng nên Haworth đã đề nghị không gian dang ghế và dạng thuyền cho glucose, trong đó thường gặp nhất là dạng ghê. - Trong dung dịch nước, glucose có thể tồn tại và chuyển hóa qua lại giữa 3 dạng (một dạng thẳng và 2 dạng vòng). Trong đó dạng vòng chiếm nhiều hơn. ➢ Tính chất hóa học a. Phản ứng oxi hóa khử Các tác nhân oxi hóa thường gặp: HIO4 dung dịch thuốc thử fehling, dung dịch brom, acid nitric b. Tham gia phản ứng khử Glucose có khả năng tham gia phản ứng khử tạo sorbitol hay acid glucose c. Phản ứng thế Glucose có thể tác dụng với 3 phân tử phenyl hydrazine tạo osazone Dựa vào hình dạng tinh thể oaone có thể xác định có mặt của glucose d. Phản ứng tạo liên kết glycoside Nhóm OH của glucose dễ dàng tham gia tạo liên kết với nhóm OH của các rượu khác nên được gọi là nhóm OH glycoside và liên kết tạo thành được gọi là liên kết glycoside. Ngoài ra các phân tử đường đơn còn có thể tạo ra liên kết dạng S-glycoside, O-glycoside, N-glycoside. Điều này giúp tạo các chất có hoạt tính hóa học khác nhau như protein, cellulose 7 e. Phản ứng lên men f. Phản ứng caramel g. Phản ứng với nito ➢ Nguồn gốc Có trong hoa quả chín và đặc biệt là nho chính nên đặc biệt được gọi là đường nho Phổ biến ở cả động vật lẫn thực vật. 1.3.2. Fructose ➢ Giới thiệu về fructose - Có cùng công thức phân tử với glucose nhưng khác về công thức cấu tạo - Là loại đường có nhiều trong trái cây - Khi ăn nhiều fructose và không có mặt glucose, fructose sẽ gây hiện tượng thẩm thấu (hút nước qua thành ruột non), vì thế fructose có tác dụng như một loại thuốc xổ. - Fructose có thể hấp thu trực tiếp qua cơ thể mà không cần đến insulin như glucose ➢ Tính chất vật lý fructose - Kết tinh trong H2O thì fructose có hình kim, tinh thể 2C6H12O6.H2O - Dễ tan trong nước - Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái, D-Fructose = -92 và beta D- - Fructose = -133.5 - Tỉ trọng 1.047 g/cm3 o - Tnc = 102 – 104 C - Là gluxit có độ ngọt cao nhất - Hút ẩm rất mạnh hấp thu 30% nước. ➢ Tính chất hóa học - Cũng là đường khử như glucose nên tính chất hóa học giống nhau - Fructose dễ bị caramel hóa hơn glucose 8 - Một phân tử fructose có thể kết hợp với một phân tử glucose để tạo một phân tử saccharose và loại phân tử H2O ➢ Nguồn gốc - Hình thành do sự thủy phân của saccharose dưới tác dụng của enzyme invertase - Hình thành do sự chuyển hóa glucose - Có trong mật hoa, quả 1.3.3. Lactose ➢ Giới thiệu Lactose được tìm thấy trong sữa, các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua. Lactose là một dạng đường có trong sữa động vật. Lactose khi vào đến ruột sẽ chia ra thành đường glucose và galactose nhờ vào một yếu tố có tên là Lactose (tên khoa học là Beta-D-galactosidase hay Lactase-phlorizin hydrolase), yếu tố này thường có tại thành của ruột non. ➢ Cấu tạo Lactose là một disacaride bao gồm một β-D-galactose và một β-D- glucose được liên kết với nhau qua liên kết β 1-4 glicozide. Lactose chiếm khoảng 2-8% về khối lượng. Công thức phân tử: C12H22O11 Tên hệ thống của nó là β-D-galactopiranozyl-(1↔4) β-D-glucopiranose. Dạng bền nhất của lactose là : C12H22O11.H2O (α-lactose monohydrate) Lactose tồn tại ở 2 dạng α và β. Ở 20oC, α-lactose chiếm 40% và β- lactose chiếm 60%. Lactose tồn tại ở 2 dạng tự do và liên kết với các gluxit và protein khác. Tỷ lệ lactose tự do/lactose liên kết là 8/1. ➢ Tính chất vật lý • Độ hòa tan 9 Ở nhiệt độ thường, lactose hòa tan trong nước ít hơn saccarose 10 lần, nhưng ở 100oC thì độ hòa tan của nó xấp xỉ saccarose Lactose có độ hòa tan là 1/4,63 tức là 0,216 g lactose tan hoàn toàn trong 1 ml nước. Độ tan trong nước là 18,9049 ở 25oC, 25,1484 ở 40oC và 37,2149 ở 60oC trong 100 g dung dịch Độ tan của lactose trong etanol là 0,0111g ở 40oC và 0,0270 ở 60oC trong 100g dung dịch. • Nhiệt độ nóng chảy α-lactose: 201,6oC β-lactose: 252,2oC • Độ quay cực α-lactose: 89,4oC β-lactose: 35oC • Độ kết tinh Lactose kết tinh chậm, tinh thể cứng và có nhiều dạng tinh thể. Vitamin B2 có thể ức chế sự kết tinh của lactose. • Độ ngọt Độ ngọt của lactose chỉ bằng 1/6 saccarose ➢ Tính chất hóa học • Phản ứng thủy phân Khi thủy phân cho 2 phân tử đường đơn là galactose và glucose • Sự biến tính của lactose Gia nhiệt đến 100oC không làm thay đổi lactose. Ở nhiệt độ cao hơn, xảy ra sự biến màu do sự xuất hiện các melanoide tạo thành khi các acid amin của sữa tác dụng với lactose. Ngoài ra, khi ở nhiệt độ cao hơn 100oC, lactose bị phân giải một phần, tạo thành các acid lactide, acid formide,mà kết quả làm tăng độ chua của sữa lên 1 - 2o T. 10 Khi gia nhiệt trên 100oC thì lactose sẽ bị biến đổi. Đầu tiên là tạo thành lactulose, sau đó là sự phân giải đường tạo ra một loạt các sản phẩm của sự phân giải này, kết quả làm cho sữa có màu nâu. Sự biến tính này là do phản ứng giữa lactose với protein, với các acid amin tạo thành hợp chất không bền melanoit. Người ta cho rằng, đầu tiên sự tạo thành phức đường-amin. Sau đó có sự chuyển nhóm trong phân tử này, kết quả làm xuất hiện các lactulose. Các chất này không có màu. Tiếp đó phức bị phân giải tạo thành các hợp chất cacbonyl, cuối cùng là các hợp chất cacbonyl này ngưng tụ với các acid amin polypeptide và protein tạo thành hợp chất có màu nâu-melanoide. Sự tạo thành melanoide còn có thể xảy ra khi bảo quản sữa bột thời gian dài ở nơi có độ ẩm cao. Đó là do các nhóm acid amin tự do đã tác dụng với lactose. 1.3.4. Manitol Mannitol là một đồng phân của sorbitol, độ ngọt vào khoảng 50% saccharose, với một số tính chất ưu điểm tương ứng: - Hương vị thơm ngon, vị ngọt tươi mát, dịu nhẹ, dễ chịu, thường được ứng dụng để giảm thiểu vị đắng trong thực phẩm. - Chất tạo ngọt năng lượng thấp chỉ khoảng 1.6 calories/gram - Không gây sâu răng - An toàn sử dụng cho có bệnh nhân tiểu đường trong chế độ ăn của họ. Mannitol tồn tại lượng lớn trong thiên nhiên, ở các dịch tiết từ thực vật, tảo biển và nấm tươi. Nó thường được tổng hợp bởi hydro hóa syrup đường tương ứng. Trên thị trường, mannitol thường được bán ở dạng bột và hạt. Không như sorbitol, mannitol không hút ẩm, vì lý do này, nó thường dùng là bột bụi bao kẹo cao su, tránh kẹo cao su dính vào thiết bị và hàm bao trong quá trình sản xuất. Ngoài ra, mannitol còn thấy trong chocolate, chất tạo mùi cho kem. Ngoài ra, tính ổn định và mùi hương dễ chịu của mannitol thường ứng dụng trong dược phẩm và thuốc nén dạng viên. 11 1.3.5. Sorbitol Sorbitol được phát hiện bởi một nhà hóa học người Pháp trong các quả nho ở tro núi lửa vào năm 1872. Nó là thành phần tự nhiên trong một số loại trái cây. Ngày nay, sorbitol được tổng hợp bằng cách hydro hóa glucose và tồn tại ở cả hai dạng tinh thể và chất lỏng. Sorbitol được sử dụng trong thực phẩm nhằm ngăn cản sự mất độ ẩm. Sự ổn định kết cấu của sorbitol được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh kẹo, chocolate, các sản phẩm cần duy trì tính cứng và giòn. Đặc biệt trong các sản phẩm sấy, sorbitol góp phần duy trì sự tươi mới trong quá trình bảo quản. Sorbitol rất ổn định và khá trơ về mặt hóa học, nó có thể chịu được nhiệt độ cao mà không tham gia phản ứng Millard. Đây là một ưu điểm. Ngoài ra, sorbitol còn kết hợp tốt với các thành phần thực phẩm khác như đường, protein, gel, dầu thực vật, Nó cũng có chức năng trong nhiều sản phẩm như kẹo cao su, kẹo, món tráng miệng đông lạnh, cookies, bánh, cũng như các sản phẩm chăm sóc răng miệng, bao gồm kem đánh răng và nước súc miệng. Với độ ngọt bằng khoảng 60% so với saccharose, cung cấp chỉ bằng 1/3 năng lượng so với đường cát, sorbitol được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm. Sorbitol có vị ngọt mát, dễ chịu, tan mịn trong miệng. Nó là chất làm ngọt hữu ích cho những người mắc bệnh tiểu đường, đồng thời an toàn sử dụng cho các thực phẩm ăn kiêng, năng lượng thấp. Sorbitol cũng được sử dụng tron... cần ẩm độ 50 – 80% nhưng không chịu nhiều nước. Giàn che lan cần phải thích hợp che được 70% nắng. Lan Vũ nữ cần nhiều ẩm hơn nước tưới. ❖ Ánh sáng Lan Vũ nữ cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát. Tuy nhiên không trồng lan Vũ nữ ở nơi quá râm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuếch tán vừa phải rất tốt; nếu chiếu sáng được 12 – 16h mỗi ngày, 12h cho cây lớn và 16h cho cây nhỏ thì cây sẽ phát triển tốt hơn. 27 Trồng Vũ nữ trong nhà kính cần có hệ thống làm mát, ánh sáng nhân tạo thích hợp để lan phát triển tốt; còn trồng trong nhà thì cần để lan ở gần cửa sổ có ánh nắng hoặc không cũng được. ❖ Độ thông thoáng So với các loài lan khác, sự thông thoáng rất cần thiết cho lan Vũ nữ. Lan Vũ nữ hay bị bệnh thối nhũn lá (phỏng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa, lan Vũ nữ tăng trưởng mạnh, nhưng những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt cây; do đó để ngăn ngừa tình trạng trên lan cần phải được che chắn cẩn thận. Cần cung cấp đủ nước cho cây tránh sự héo rũ, nhăn lá vào mùa gió nhiều và mùa nắng. ❖ Nhu cầu nước tưới Lan Vũ nữ là cây thân có giả hành để dự trữ dinh dưỡng và nước, hơn nữa nước thường tập trung ở giả hành vì lan Vũ nữ có giả hành tương đối lớn, có lá nhiều nên diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho cây một lượng nước đầy đủ. Tránh để lan quá khô vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: sáng, trưa, chiều. Chú ý khi tưới nước vào buổi trưa phải tưới thật đẫm đễ tránh nắng sẽ làm sốc cây lan. Mùa mưa thì tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp, có thể khoảng 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá cây sẽ khô, tránh nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết. ❖ Dinh dưỡng Lan Vũ nữ cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ. Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao và đừng tưới lên ngọn cây, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Tùy từng độ tuổi của cây mà ta có lượng phân cần bón với tỷ lệ NPK thích hợp. Ngoài việc dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ loãng có pha thêm thuốc trừ nấm. 28 Lan Vũ nữ cần bón phân với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: Bánh dầu, vitamin B1 kích thích ra rễ,... Các chất dinh dưỡng cần thiết nhất là đạm (N), lân (P), potassium (K) và calcium (Ca). Sự thiếu các chất dinh dưỡng này có thể làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển và làm giảm năng suất hoa. 29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm tiến hành đề tài Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường thuộc Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, 475A Điện Biên Phủ , P. 25, Q. Bình Thạnh, Tp. HCM. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: dùng chồi của lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh làm nguồn mẫu trong nghiên cứu này. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962). Các chất bổ sung bao gồm: - Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzy-aminopurine). - Agar - Nguồn carbon: sucrose, glucose, fructose, lactose, manitol, sorbitol. - Nước dừa - Than hoạt tính 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi riêng với các điều kiện: - Nhiệt độ: 25 ± 2oC. - Độ ẩm trung bình: 80 – 85% - Cường độ ánh sáng: 2500 – 3000 lux 30 - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. 2.3. Phương pháp 2.3.1. Cách pha môi trường ❖ Pha dung dịch mẹ Để tiết kiệm nguyên liệu và thời gian cho đề tài, ta cần pha dung dịch mẹ trước khi pha môi trường nuôi cấy. Pha dung dịch mẹ dựa vào môi trường khoáng MS (Murashine và Skoog, 1962). Các chất điều hòa sinh trưởng: Cân 0,1 g BA pha và hòa tan trong 1 ml NaOH 1N rồi cho vào bình định mức cùng nước cất vô trùng vừa đủ 100 ml, lượng dùng là 1 ml tương ứng cho 1 mg BA. Tương tự cho chất NAA. ❖ Pha môi trường nuôi cấy Bước 1: Tùy theo thể tích cần pha ta hút dung dịch mẹ đã pha sẵn gồm các khoáng đa lượng, vi lượng và nhóm vitamin. Cân đường và hút BA và NAA. Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất đã định sẵn. Bước 2: Định mức và đo pH 5,8 – 5,9 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N). Bước 3: Cân than hoạt tính và agar cho vào môi trường. Bước 4: Khuấy đều phối vào mỗi chai thủy tinh 30 ml cho bình 250 ml mỗi thí nghiệm sử dụng 18 bình. Bước 5: Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn khi hấp khử trùng. 2.3.2. Hấp khử trùng ❖ Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy Môi trường sau khi phân phối vào bình thủy tinh được cho vào nồi hấp vô trùng, chỉnh nhiệt độ ở 121°C và l atm, thời gian hấp khoảng 20 phút. Sau khi hấp xong chuyển môi trường đã hấp khử trùng sang phòng lưu giữ môi trường. Giữ 2 ngày ở 25°C để kiểm tra. ❖ Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy mô như: kẹp lớn, nhỏ, dao, giá để dụng cụ, giấy, khăn lau,... được gói bằng giấy báo và nylon chịu nhiệt. Sau đó được hấp khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở 121°C, l tm trong 20 phút. 31 Dụng cụ cấy sau khi hấp khử trùng được bảo quản trong phòng cấy. Tránh xảy ra sự tái nhiễm, như vậy ta có thể sử dụng mọi lúc khi cần. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ glucose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ glucose khác nhau (bảng 2.1). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính (A0). Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) A0 30 A1 10 A2 20 A3 30 A4 40 A5 50 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ fructose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ fructose khác nhau (bảng 2.2). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt (B0). Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) B0 30 B1 10 B2 20 B3 30 B4 40 B5 50 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ lactose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). 33 ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ lactose khác nhau (bảng 2.3). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt (C0). Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) C0 30 C1 10 C2 20 C3 30 C4 40 C5 50 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ mannitol thích hợp lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ manitol khác nhau (bảng 2.4). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính( D0). 34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) D0 30 D1 10 D2 20 D3 30 D4 40 D5 50 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ sorbitol thích hợp lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ sorbitol khác nhau (bảng 2.5). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt( E0). Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) E0 30 E1 10 E2 20 E3 30 35 E4 40 E5 50 2.5. Chỉ tiêu theo dõi - Số lá (lá/cây) - Đường kính lá (mm) - Chiều dài lá (mm) - Số chồi (chồi/mẫu) - Chiều cao chồi (mm) - Số rễ (rễ/mẫu) - Chiều dài rễ (mm) 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.0. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ glucose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường glucose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức A1; A2 và A3. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức A0, A4 và A5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1; hình 3.1; hình 3.2. 37 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá Dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển bình thường, rễ dài, lá to A0 30 0,41de 0,04de 5,67b 29,67d 10,00bc 3,33a 11,00abc 14, 00b 15, 00ab nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển tốt, lá to và dài. A1 10 0,85b 0,07c 5,00b 50,67bc 13,00b 2,17b 15,00a 24,33a 19, 00a Cây phát triển xanh tốt, chồi nhiều, A2 20 1,38a 0,13a 10,33a 74,00a 23,67a 2,17b 8,00bc 12,00bc 18, 67a nhiều lá, nhiều rễ, rễ dài, lá nhỏ nhưng dày, cây cao. Cây phát triển không đều, ít chồi và lá, A3 30 0,60cd 0, 06cd 5,00b 44,67cd 5,00cd 1,83b 13,33ab 8, 00bc 18, 67a rễ nhiều mà ngắn. Cây phát triển không đều, nhiều A4 40 0,79bc 0,09b 11,67a 64,00ab 11,33b 1,67b 7,00c 9,33bc 17, 00a chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và A5 50 0,20e 0,03e 1,33c 6,67e 3,00d 1,33b 13,33ab 5, 67c 9,67b ít, rễ ngắn, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 38 80 70 60 Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) 50 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/cây) 40 Số rễ (rễ/ mẫu) Đường kính lá (mm) 30 Chiều dài lá (mm) Dài rễ (mm) 20 Chiều cao (mm) 10 0 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 39 Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 40 Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 41 Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, hình 3.1, hình 3.2 sau 12 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Ở nghiệm thức A2, cây phát triển xanh, nhiều chồi, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (18,67 > 15,00 mm), trọng lượng tươi đạt mức cao nhất trong 6 nghiệm thức, trọng lượng tươi của nghiệm thức A2 (1,384 g) gấp 3,34 lần A0 (0,414g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là A2 là (0,132 g) cao hơn 3 lần so với A0 (0,044 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (74,00 lá/cây), lá to và nhiều, rễ nhiều (23,67 rễ/mẫu), rễ dài (12,00mm). Tỷ lệ cây phát triển giảm dần ở các nghiệm thức A0, A1, A3, A4, A5. Ở nghiêm thức A0 cây phát triển bình thường, phát triển ổn định ở các chỉ tiêu. Ở nghiệm thức A1 cây phát triển tốt, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (19,00> 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,845 g cao hơn 2,04 lần so với A0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức A1 là 0,069 g lớn hơn 1,57 lần so với A0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển không đều. Ở nghiệm thức A3 cây phát triển không tốt, lá nhỏ và có nhiều lá úa vàng. Cây phát triển không đồng đều. Ở nghiệm thức A4 cây phát triển tốt, xanh, nhưng lá nhỏ (1,67 mm) và ngắn (7.00 mm). Ở nghiệm thức A5 ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của chồi cây vì nồng độ đường khá cao có khả năng làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường, gây stress cho cây. Nhìn chung cây phát triển chậm ít chồi (1,33 chồi/mẫu), ít lá (6,67 lá/cây), lá nhỏ, rễ ngắn (5,67 mm). Loại và các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy cho thấy những tác động đáng kể về số lượng chồi mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng về chồi, chiều dài và trọng lượng tươi của chồi. glucose được tìm thấy là nguồn carbon hiệu quả hơn so với sucrose. Số lượng chồi cao nhất của mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng, chồi (10,33) và trọng lượng tươi của chồi (1,384 g) thu được khi glucose 42 được sử dụng ở 20 g/l. Ngược lại, sự trao đổi, phát triển trên môi trường sucrose cho thấy phản ứng rất kém như số lượng tối đa chồi mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng, chồi (5,67) và trọng lượng tươi của chồi được tìm thấy là (0,414 g) tương ứng với nồng độ 30 g/l. Tăng nồng độ glucose dẫn đến ức chế khá rõ ràng về số lượng chồi mỗi mẫu cấy, chiều dài và trọng lượng tươi của chồi. Số rễ khác biệt đáng kể với những loại và nồng độ của hai nguồn carbon. Số rễ tối đa (23,67) và rễ dài (12 mm) đã được quan sát trong môi trường có chứa glucose tại 20 g/l trong khi số rễ được tìm thấy trên các môi trường sucrose ở nồng độ 30 g/l chỉ là 10 và dài 14 mm. Glucose và fructose cũng được biết đến là nguồn cung cấp carbon cho sự tăng trưởng tốt của một số mô thực vật. Trong số các loại đường thì sucrose được sử dụng là nguồn carbon chủ yếu trong nuôi cấy in vitro thực vật, vì nó là carbohydrate phổ biến nhất được tìm thấy trong nhựa cây ở mạch libe của nhiều loài thực vật. Mặc dù, sucrose là carbohydrate thường được sử dụng trong ống nghiệm để tạo chồi và phát triển chồi, tuy nhiên nó không phải luôn luôn là nguồn carbon hiệu quả nhất cho sự tái sinh thực vật. Sucrose, không chỉ thuận lợi cho sự phát triển rễ mà sucrose còn thích hợp cho sự tăng trưởng của cây con. Các kết quả tương tự đã thu được khi nuôi cấy Centell asiatica L. (Anwar et al., 2005), Pogostemon cablin Berth (Swamy et al., 2010), Solanum nigrum Linn (Sridhar và Naidu, 2011). Tuy nhiên đối với Rosa rugosa (Xing et al., 2010) kết quả nghiên cứu cho thấy rằng glucose lại là nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển và tăng trưởng của chồi hơn so với sucrose. Sự hiện diện của nguồn sucrose trong môi trường nuôi cấy còn dẫn đến sự vàng lá của cây con ở loài này. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với nghiên cứu của Xing và cộng sự (2010) khi nhân nhanh Rosa rugosa. Kết quả đều cho thấy mẫu cấy trên môi trường bổ sung glucose tăng trưởng tốt hơn trên môi trường bổ sung sucrose. Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy rằng glucose là nguồn carbon thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển của lan Vũ nữ. Glucose giúp lan Vũ nữ phát triển tốt về số lượng lá, số lượng chồi và chiều cao cây. Tuy nhiên nồng độ nghiên cứu của 43 chúng tôi thấp hơn so với nồng độ đường trong nghiên cứu của Võ Châu Tuấn (2014) trên đối tượng Nghệ đen và nghiên cứu của Agnieszka Ilczuk và cộng sự (2013) khi nhân nhanh chồi Ninebark (thuộc họ hoa Hồng) với hàm lượng đường glucose thích hợp từ 40 – 50 g/l. Tóm lại, việc bổ sung đường glucose với nồng độ 20 g/l thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ fructose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường fructose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy, chồi bắt đầu sinh trưởng. Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi sinh trưởng mạnh. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.2; hình 3.3; hình 3.4. 44 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển bình thường, b a b bc b a a b a B0 30 0,41 0,04 5,67 29,67 10,00 3,33 11,00 14,00 15,00 rễ dài,lá to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển không tốt, ít lá và rễ ít và b c b c b a bc c b B1 10 0,17 0,02 2,00 12,00 4,33 3,33 7,67 4,67 7,67 ngắn. cây thấp. b c b b b ab bc c b Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp B2 20 0,28 0,02 4,33 41,67 9,67 3,00 8,00 7,33 9,00 và rễ ngắn. Cây phát triển xanh tốt,chồi nhiều, a b a a a a c a a B3 30 1,72 0,18 29,00 133,67 32,33 3,33 6,33 20,00 15,67 nhiều lá, nhiều rễ, rễ dài, lá nhỏ, cây cao Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp B4 40 0,37b 0,03c 5,33b 29,67bc 5,00b 2,67ab 10,33ab 8,00c 10,33b b c b bc b b bc c b Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và B5 50 0,33 0,02 4,00 24,00 6,33 2,17 8,67 6,00 8,33 ít, rễ ngắn, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 45 160 140 120 Trọng lượng tươi (g) trọng lượng khô (g) 100 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/ cây) 80 Số rễ (rễ/mẫu) Đường kính lá (mm) 60 Chiều dài lá (mm) Dài rễ (mm) 40 Chiều cao (mm) 20 0 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 48 Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.3, hình 3.4 sau 12 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức B0 cây phát triển xanh tốt bình thường, lá to và dài, rễ cây dài. Nghiệm thức B1 cây phát triển thấp hơn so với nghiệm thức B0 với (7,67 < 15,00 mm) trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,173 g nhỏ hơn 2,4 lần so với B0(0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B1 là 0,017 g nhỏ hơn 2,6 lần so với B0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển chậm, ít chồi (2,00 chồi/mẫu), ít lá (12,00 lá/cây). Ở nghiệm thức B2 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0 với (9,00 < 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,277g nhỏ hơn 1,5 lần so với B0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B2 là 0,021 g nhỏ hơn 2,1 lần so với B0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển không đều, ít lá , rễ ngắn, cây thấp. Ở nghiệm thức B3 cây phát triển xanh tốt, chồi cây nhiều, cao hơn so với nghiệm thức B0 với (15,67 >15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 1,715 g cao hơn 4,1 lần so với B0 (0,414 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (133,67 lá/cây), lá to, rễ nhiều (32,33 rễ/mẫu), rễ dài (20 mm). Ở nghiệm thức B4, B5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ, ít chồi, lá của cây có màu xanh nhạt. Loại và nồng độ của nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể về số lượng chồi mỗi mẫu cấy. Fructose có hiệu quả hơn đường sucrose. Số lượng cao nhất của chồi là (29) và chồi dài nhất (15,67 mm) đã thu được trên môi trường có bổ sung 30 g/l fructose. Trên môi trường sucrose cho thấy phản ứng rất nghèo, với số lượng thấp của chồi. Tăng nồng độ của fructose làm ức chế về số lượng chồi mỗi mẫu cấy độ dài chồi trong nghiệm thức. Những kết quả này cho thấy carbohydrate khác nhau, và nồng độ của chúng, ảnh hưởng đáng kể tỷ lệ 49 thành công của chồi. Số rễ khác biệt đáng kể với những loại và nồng độ của hai nguồn carbon. Số rễ tối đa (32,33) và rễ dài (20 mm) đã được quan sát trong môi trường có chứa fructose tại 30 g/l trong khi số rễ được tìm thấy trên các môi trường sucrose ở nồng độ 30 g/l chỉ là 10 và dài 14 mm. Tuy nhiên, không có khác biệt đáng kể giữa các nồng độ khác nhau của fructose. Mỗi giai đoạn nuôi cấy khác nhau thì cần nguồn đường khác nhau (Kozai, 1992). Nồng độ và loại nguồn carbon ngoại sinh bổ sung vào môi trường đóng vai trò là nguồn năng lượng và để duy trì áp suất thẩm thấu (De Neto và Otoni, 2003). Mặc dù đường fructose có tác dụng tốt cho sinh trưởng tế bào của nhiều loài thực vật, tuy nhiên trong thí nghiệm 3.2 nếu dùng ở nồng độ cao sẽ gây ra ức chế sinh trưởng, tương tự với trường hợp nuôi cấy tế bào cây thuốc lá và cây Cinchona succirubrum (Nigra et al., 1990). Preethi và cộng sự (2011) quan sát thấy rằng fructose đã cho kết quả tốt hơn so với sucrose, maltose và glucose được sử dụng để vi nhân Stevia rebaudiana. Chồi kéo dài là một bước quan trọng trong hệ thống vi nhân giống, liên quan chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng của môi trường (Chen et al., 2003). Sự gia tăng chiều dài chồi trên môi trường bổ sung fructose có hiệu quả trong việc phát triển của tế bào, được điều khiển bởi áp suất trương, và fructose có thể là một trong những chất tạo áp suất thẩm thấu được sử dụng để tạo ra sự trương (Bianco và Rieger, 2002). Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy rằng fructose có hiệu quả đối với sự phát triển chồi của lan Vũ nữ hơn so với sucrose. Sự tăng trưởng của chồi của cây mọng nước không được phát huy bởi sucrose, nhưng có thể được thúc đẩy bởi fructose, maltose hoặc glucose (Oka và Ohyama, 1982). Steinitz (1999) và Da Silva (2004) đưa ra giả thuyết rằng carbohydrate được các tế bào hiểu như là các tín hiệu hóa học, với nồng độ rất cao trong ống nghiệm là tác nhân gây stress. Chồi nuôi cấy trên môi trường không có nguồn carbon đã không tạo rễ, cho thấy tầm quan trọng của đường trong sự hình thành rễ. Thorpe (1982) cho rằng rễ muốn tăng trưởng tốt đòi hỏi năng lượng cao mà năng lượng chỉ có thể lấy từ các chất chuyển hóa có sẵn, mà chủ yếu là carbohydrate. Nguồn cacbon như fructose, glucose, lactose, maltose và sucrose ở nồng độ 3% được dùng để tạo rễ ở loài Somnifera Withania 50 và thấy rằng sucrose đã cho kết quả tốt nhất vì 100% mẫu cấy tạo rễ trong khi fructose chỉ cho 65% số mẫu cấy cảm ứng tạo rễ (Sivanesan và Murugesan, 2008). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với nghiên cứu của Preethi và cộng sự (2011) khi vi nhân giống Stevia rebaudiana đều thấy rằng fructose đã cho kết quả tốt hơn so với sucrose. Đối với nghiên cứu của chúng tôi nguồn fructose thích hợp cho lan Vũ nữ nhân chồi hơn so với sucrose. Fructose giúp cho lan Vũ nữ tăng trưởng tối đa về số lượng chồi trong nhân nhanh giống. Bên cạnh đó nồng độ nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn nồng độ nghiên cứu của Abdullah và cộng sự (1998) khi nuôi cấy tế bào cây Morinda elliptica đã cho thấy fructose 5% giúp tăng khả năng sinh trưởng của tế bào, ở cây Solanum eleagnifolium (Nigra et al., 1990) và Ficus deltoide (Ling et al., 2008). Tóm lại, việc bổ sung đường fructose nồng độ 30 g/l thích hợp cho nhân chồi cây lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ lactose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường lactose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ. 51 Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức C0, C1 và C2. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức C3, C4 và C5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3; đồ thị 3.3; hình 3.5; hình 3.6. 52 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm...333333 0.44444444 Corrected Total 17 44.44444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.880000 27.27273 0.666667 2.444444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sochoilac 5 39.11111111 7.82222222 17.60 < 0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.444444 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 1.6627 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sochoilac A 5.6667 3 C1 B 2.3333 3 C2 B B 2.0000 3 C3 B B 1.6667 3 C1 B B 1.6667 3 C4 33 B B 1.3333 3 C5 ❖ Số lá The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values solalac 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 1199.333333 239.866667 14.20 0.0001 Error 12 202.666667 16.888889 Corrected Total 17 1402.000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.855445 22.83116 4.109609 18.00000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F solalac 5 1199.333333 239.866667 14.20 0.0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y 34 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 16.88889 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 10.249 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N solalac A 29.667 3 C0 A B A 23.000 3 C1 B A B A 20.667 3 C2 B B 17.333 3 C3 B B 14.000 3 C4 C 3.333 3 C5 ❖ Số rễ The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorelac 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure 35 Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 91.7777778 18.3555556 5.80 0.0060 Error 12 38.0000000 3.1666667 Corrected Total 17 129.7777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.707192 25.83164 1.779513 6.88888 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sorelac 5 91.77777778 18.35555556 5.80 0.0060 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3.166667 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 4.4381 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorelac A 10.000 3 C0 A A 10.000 3 C1 A B A 6.333 3 C4 B B 5.333 3 C3 36 B B 5.000 3 C5 B B 4.667 3 C2 ❖ Đường kính lá The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values duongkinhlalac 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 8.56666667 1.71333333 14.76 < 0001 Error 12 1.39333333 0.11611111 Corrected Total 17 9.96000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.860107 17.93425 0.340751 1.900000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F duongkinhlalac 5 8.56666667 1.71333333 14.76 < 0001 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 37 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.116111 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.8498 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N duongkinhlalac A 3.3333 3 C0 B 1.8333 3 C1 B B 1.8333 3 C2 B B 1.8333 3 C3 B B 1.4000 3 C5 B B 1.1667 3 C4 ❖ Chiều dài rễ The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudairelac 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 38 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 163.1666667 32.6333333 8.64 0.0011 Error 12 45.3333333 3.7777778 Corrected Total 17 208.5000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.782574 19.76594 1.943651 9.833333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudairelac 5 163.1666667 32.6333333 8.64 0.0011 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3.777778 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 4.8475 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudairelac A 14.000 3 C0 A 39 B A 12.000 3 C1 B A B A 10.667 3 C2 B B C 9.000 3 C5 B C B C 9.000 3 C4 C C 4.333 3 C3 ❖ Chiều cao The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieucaolac 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 398.5000000 79.7000000 4.88 0.0115 Error 12 196.0000000 16.3333333 Corrected Total 17 594.5000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.670311 21.45904 4.041452 18.83333 40 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieucaolac 5 398.5000000 79.7000000 4.88 0.0115 The SAS System 15:45 Thursday, July 25, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 16.33333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 7.1897 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieucaolac A 29.000 3 C1 B 18.333 3 C4 B B 18.333 3 C5 B B 16.333 3 C3 B B 16.000 3 C2 B B 15.000 3 C0 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ❖ TL Tươi 41 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values trongluongtuoiman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 3.70788378 0.74157676 100.26 < 0001 Error 12 0.08876000 0.00739667 Corrected Total 17 3.79664378 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.976621 10.91266 0.086004 0.788111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F trongluongtuoiman 5 3.70788378 0.74157676 100.26 < 0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.007397 42 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.2145 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N trongluongtuoiman A 1.72367 3 D1 B 0.96800 3 D2 C 0.59200 3 D5 C C 0.54033 3 D3 C C 0.49100 3 D4 C C 0.41367 3 D0 ❖ TL khô The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Trongluongkhoman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 43 Model 5 0.03803761 0.00760752 214.97 < 0001 Error 12 0.00042467 0.00003539 Corrected Total 17 0.03846228 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.988959 6.638525 0.005949 0.089611 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Trongluongkhoman 5 0.03803761 0.00760752 214.97 < 0001 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.000035 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.0148 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Trongluongkhoman A 0.181333 3 D1 B 0.113000 3 D2 C 0.071667 3 D3 C C 0.064333 3 D5 C C 0.063000 3 D4 D 0.044333 3 D0 44 ❖ Số chồi The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sochoiman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 205.7777778 41.1555556 18.07 <.0001 Error 12 27.3333333 2.2777778 Corrected Total 17 233.1111111 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.882745 20.89704 1.509231 7.222222 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sochoiman 5 205.7777778 41.1555556 18.07 <.0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 45 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2.277778 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 3.7641 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sochoiman A 12.667 3 D1 A B A 10.000 3 D2 B B C 8.000 3 D3 C D C 5.667 3 D0 D D 4.000 3 D4 D D 3.000 3 D5 ❖ Số lá The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Solaman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 46 Number of Observations Used 18 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 7557.11111 1511.42222 5.69 0.0064 Error 12 3187.33333 265.61111 Corrected Total 17 10744.44444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.703351 38.39744 16.29758 42.44444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Solaman 5 7557.111111 1511.422222 5.69 0.0064 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 265.6111 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 40.647 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Solaman A 82.67 3 D1 A B A 50.33 3 D2 47 B B 41.33 3 D3 B B 32.00 3 D4 B B 29.67 3 D0 B B 18.67 3 D5 ❖ Số rễ The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values soreman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 359.6111111 71.9222222 13.35 0.0001 Error 12 64.6666667 5.3888889 Corrected Total 17 424.2777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.847584 24.15327 2.321398 9.611111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 48 soreman 5 359.6111111 71.9222222 13.35 0.0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 5.388889 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 5.7896 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N soreman A 16.000 3 D1 A B A 15.000 3 D2 B B C 10.000 3 D0 C C 6.000 3 D4 C C 5.667 3 D5 C C 5.000 3 D3 ❖ Đường kính lá The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 49 Dklaman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 8.45833333 1.69166667 9.37 0.0008 Error 12 2.16666667 0.18055556 Corrected Total 17 10.62500000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.796078 22.16965 0.424918 1.916667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Dklaman 5 8.45833333 1.69166667 9.37 0.0008 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.180556 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 1.0598 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Dklaman A 3.3333 3 D0 50 B 2.0000 3 D5 B B 1.8333 3 D1 B B 1.6667 3 D2 B B 1.5000 3 D4 B B 1.1667 3 D3 ❖ Dài lá The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Dailaman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 181.1111111 36.2222222 10.52 0.0005 Error 12 41.3333333 3.4444444 Corrected Total 17 222.4444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 51 0.814186 19.65093 1.855921 9.444444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Dailaman 5 181.1111111 36.2222222 10.52 0.0005 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3.444444 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 4.6287 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Dailaman A 14.333 3 D4 A A 12.000 3 D5 A B A 11.000 3 D0 B B C 7.000 3 D1 C C 6.333 3 D3 C C 6.000 3 D2 ❖ Dài rễ The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure 52 Class Level Information Class Levels Values daireman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 182.6666667 36.5333333 4.24 0.0187 Error 12 103.3333333 8.6111111 Corrected Total 17 286.0000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.638695 20.47304 2.934469 14.33333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F daireman 5 182.6666667 36.5333333 4.24 0.0187 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 8.611111 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.2204 53 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N daireman A 20.000 3 D1 A B A 17.000 3 D2 B B C 14.000 3 D0 B C B C 12.000 3 D5 C C 11.667 3 D4 C C 11.333 3 D3 ❖ Chiều cao The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Chieucaoman 6 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 80.2777778 16.0555556 1.65 0.2206 54 Error 12 116.6666667 9.7222222 Corrected Total 17 196.9444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.407616 17.37612 3.118048 17.94444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Chieucaoman 5 80.27777778 16.05555556 1.65 0.2206 The SAS System 09:47 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 9.722222 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.547 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Chieucaoman A 21.000 3 D1 A B A 20.333 3 D4 B A B A 17.667 3 D3 B A B A 17.333 3 D5 B A B A 16.333 3 D2 B B 15.000 3 D0 55 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ❖ Trong lượng tuoi The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Trongluongtuoisor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 4.18007133 0.83601427 132.29 <.0001 Error 12 0.07583267 0.00631939 Corrected Total 17 4.25590400 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.982182 12.12424 0.079495 0.655667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Trongluongtuoisor 5 4.18007133 0.83601427 132.29 <.0001 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 56 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.006319 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.1983 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Trongluongtuoisor A 1.69567 3 E2 B 0.71433 3 E3 C 0.42600 3 E4 C C 0.41367 3 E0 C C 0.35700 3 E5 C C 0.32733 3 E1 ❖ Trọng lượng khô The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Trongluongkhosor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y 57 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 0.03421561 0.00684312 154.16 <.0001 Error 12 0.00053267 0.00004439 Corrected Total 17 0.03474828 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.984671 10.81379 0.006662 0.061611 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Trongluongkhosor 5 0.03421561 0.00684312 154.16 <.0001 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.000044 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.0166 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Trongluongkhosor A 0.154667 3 E2 B 0.066333 3 E3 C 0.046000 3 E4 C C 0.044333 3 E0 C D C 0.035333 3 E5 58 D D 0.023000 3 E1 ❖ Số chồi The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Sochoisor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 49.61111111 9.92222222 8.12 0.0015 Error 12 14.66666667 1.22222222 Corrected Total 17 64.27777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.771824 19.70272 1.105542 5.611111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Sochoisor 5 49.61111111 9.92222222 8.12 0.0015 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y 59 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 1.222222 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 2.7572 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Sochoisor A 8.0000 3 E2 A A 7.3333 3 E3 A B A 5.6667 3 E0 B A B A 5.3333 3 E1 B B 4.0000 3 E4 B B 3.3333 3 E5 ❖ Số lá The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values solasor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure 60 Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2854.444444 570.888889 11.24 0.0003 Error 12 609.333333 50.777778 Corrected Total 17 3463.777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.824084 20.89012 7.125853 34.11111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F solasor 5 2854.444444 570.888889 11.24 0.0003 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 50.77778 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 17.772 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N solasor A 58.333 3 E2 A B A 42.000 3 E3 B B C 29.667 3 E0 B C B C 27.667 3 E1 61 B C B C 26.333 3 E4 C C 20.667 3 E5 ❖ Số rễ The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values soresor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 3466.666667 693.333333 66.38 <.0001 Error 12 125.333333 10.444444 Corrected Total 17 3592.000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.965108 26.93155 3.231787 12.00000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F soresor 5 3466.666667 693.333333 66.38 <.0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure 62 t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 10.44444 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 8.0601 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N soresor A 42.667 3 E2 B 10.000 3 E0 B B 6.333 3 E1 B B 5.667 3 E3 B B 3.667 3 E4 B B 3.667 3 E5 ❖ Đường kính lá The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Dklasor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 63 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 14.79166667 2.95833333 8.19 0.0014 Error 12 4.33333333 0.36111111 Corrected Total 17 19.12500000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.773420 18.49001 0.600925 3.250000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Dklasor 5 14.79166667 2.95833333 8.19 0.0014 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedur t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.361111 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 1.4987 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Dklasor A 4.6667 3 E2 A A 4.1667 3 E3 A 64 B A 3.3333 3 E0 B B 2.6667 3 E5 B B 2.5000 3 E4 B B 2.1667 3 E1 ❖ Dài lá The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Dailasor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 240.2777778 48.0555556 16.02 <.0001 Error 12 36.0000000 3.0000000 Corrected Total 17 276.2777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.869696 11.09499 1.732051 15.61111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 65 Dailasor 5 240.2777778 48.0555556 16.02 <.0001 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 4.3198 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Dailasor A 22.667 3 E2 B 16.667 3 E3 B B 16.000 3 E4 B C B 14.000 3 E5 C B C B 13.333 3 E1 C C 11.000 3 E0 ❖ Dài rễ The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values dairesor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 66 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 907.8333333 181.5666667 27.01 <.0001 Error 12 80.6666667 6.7222222 Corrected Total 17 988.5000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.918395 17.88086 2.592725 14.50000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F dairesor 5 907.8333333 181.5666667 27.01 <.0001 The SAS System 11:17 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 6.722222 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 6.4663 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dairesor A 29.333 3 E2 B 14.000 3 E1 67 B B 14.000 3 E0 B B 13.333 3 E3 B B 8.667 3 E4 B B 7.667 3 E5 ❖ Chiều cao The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Chieucaosor 6 E0 E1 E2 E3 E4 E5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 147.3333333 29.4666667 5.47 0.0075 Error 12 64.6666667 5.3888889 Corrected Total 17 212.0000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.694969 16.58141 2.321398 14.00000 68 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Chieucaosor 5 147.3333333 29.4666667 5.47 0.0075 The SAS System 10:28 Thursday, July 26, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 5.388889 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 5.7896 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N Chieucaosor A 18.333 3 E2 A A 15.000 3 E0 A A 14.667 3 E4 A B A 14.000 3 E3 B A B A 13.333 3 E1 B B 8.667 3 E5 69