Đồ án Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại viện pasteur thành phố Hồ Chí Minh

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG ---------------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRONG THỰC PHẨM ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. BS. CAO HỮU NGHĨA Họ và tên sinh viên: HUỲNH LÊ TRUNG Mã số sinh viên: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG ---------------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TRONG THỰC PHẨM ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. BS. CAO HỮU NGHĨA Họ và tên sinh viên: HUỲNH LÊ TRUNG Mã số sinh viên: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2016 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1. Họ và tên sinh viên được giao đề tài HUỲNH LÊ TRUNG MSSV: 1211100222 Lớp: 12DSH01 Ngành: Công nghệ sinh học 2. Tên đề tài: Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Các dữ liệu ban đầu: Các mẫu thực phẩm được khách hàng trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh khác đem đến Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh để kiểm nghiệm. 4. Các yêu cầu chủ yếu: - Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. - So sánh tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli với các nghiên cứu trước đó. 5. Kết quả tối thiểu phải có: - Tỷ lệ nhiễm E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. - Tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli so với các nghiên cứu trước đó. Ngày giao đề tài: 27/01/2016 Ngày nộp báo cáo: 15/07/2016 TP. HCM, ngày tháng năm Chủ nhiệm ngành Giảng viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là bài báo cáo nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trong đồ án tốt nghiệp này có được để bàn luận là trung thực, không sao chép đồ án, khoá luận tốt nghiệp khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời can đoan của mình. Tác giả đồ án Huỳnh Lê Trung Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp được hoàn thành với sự giúp đỡ tận tình, quý báu từ các Thầy cô, Anh chị tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. BS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh Học lâm Sàng, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Quý Thầy, Cô giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập ở trường. ThS. Nguyễn Thị Nguyệt và ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Các Cô, các Anh Chị phòng vi sinh Nước – Thực phẩm và phòng vi sinh Bệnh Phẩm, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã giúp đỡ, động viên tôi. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn nuôi dạy, yêu thương, động viên và chỗ dựa vững chắc cho tôi. Tác giả đồ án Huỳnh Lê Trung Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi trường BYT Bộ Y tế CFU Colony Forming Unit DNA Axit Deoxyribo Nucleic E.coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrgenic E.coli EMB Eosin Methylene Blue Agar EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxingenic E.coli I Intermediate: Trung gian ISO International Organization for Standardization KIA Kligler Iron Agar LB Luria Broth MH Mueller Hinton MR Methyl Red Broth pH Độ pH QCVN Quy Chuẩn Việt Nam R Resistant: Kháng RNA Ribonucleic acid S Susceptible: Nhạy cảm SP Sản phẩm STEC Shiga toxin-producing E.coli TBX Tryptone Bile Agar with X-Glucuronide TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLS Trypose Lauryl Sulfate TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh TSA Tryptic Soya agar Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Chữ viết tắt Diễn giải VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VTEC Verocytotoxigenic E.coli WHO World Health Organization Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung MỤC LỤC Trang MỤC LỤC ...................................................................................................................i DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .................................................................................. vi DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vii DANH MỤC SƠ ĐỒ - QUY TRÌNH ..................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 2 2.1. Mục tiêu tổng quát..................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Các khái niệm về an toàn thực phẩm ........................................................ 3 1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ...................................................... 3 1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm các chất hoá học ............................. 3 1.2.2. Ngộ độc do ăn phải thực phẩm có sẵn chất độc ................................ 4 1.2.3. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bị biến chất, thức ăn ôi thiu ................. 4 1.2.4. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn nhiễm vi sinh vật ................ 4 1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm ......................................................... 5 1.4. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ và kinh tế xã hội ............................ 6 1.4.1. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ .................................................. 6 1.4.2. An toàn thực phẩm đối với kinh tế – xã hội ....................................... 7 i Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 1.5. Thực trạng nhiễm E.coli trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam ..... 7 1.5.1. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli trên thế giới ....................................... 7 1.5.2. Tình hình nhiễm khuẩn E.coli ở Việt Nam ......................................... 8 1.6. Mức độ kháng kháng sinh trên thế giới và ở Việt Nam ........................... 9 1.6.1. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli trên thế giới ............................ 9 1.6.2. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli ở Việt Nam ............................. 9 1.7. Tổng quan về Escherichia coli ............................................................... 10 1.7.1. Đặc tính sinh lý ................................................................................. 10 1.7.2. Đặc tính sinh hoá ............................................................................. 10 1.7.3. Định danh E.coli ............................................................................... 11 1.7.4. Đặc tính gây bệnh ............................................................................. 15 1.8. Tổng quan về kháng sinh ........................................................................ 17 1.8.1. Khái niệm .......................................................................................... 17 1.8.2. Phân loại........................................................................................... 18 1.8.3. Cơ chế tác động ................................................................................ 21 1.9. Sự đề kháng kháng sinh .......................................................................... 25 1.9.1. Hình thức đề kháng kháng sinh ........................................................ 25 1.9.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh ............................................................ 26 1.9.3. Một số biện pháp hạn chế nguy cơ kháng kháng sinh ..................... 28 CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................... 29 2.1. Đối tượng – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu ....................................... 29 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 29 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 29 ii Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.1.3. Thời gian nghiên cứu........................................................................ 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 29 2.2.1. Cỡ mẫu .............................................................................................. 29 2.2.2. Đánh giá kết quả .............................................................................. 29 2.2.3. Dụng cụ – Thiết bị – Môi trường – Hoá chất .................................. 30 2.2.4. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát ............................................. 31 2.2.5. Tiến trình nghiên cứu ....................................................................... 33 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 40 3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong thực phẩm ............................................ 40 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm ................................................. 40 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong các nhóm thực phẩm ................................ 41 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các nhóm thực phẩm ..................... 43 3.2. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli ........................ 50 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli trong thực phẩm ....................... 50 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt ..................................................................................................... 52 3.2.3. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm rau và các sản phẩm rau 53 3.2.4. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản ......................................................................................... 55 3.2.5. So sánh mức độ kháng của E.coli với một số nghiên cứu trước đây .... 56 3.3. Khảo sát mức độ đa kháng của các chủng E.coli phân lập được ........... 57 3.3.1. Mức độ đa kháng của E.coli trong thực phẩm .................................... 57 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 59 iii Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 4.1. Kết luận ................................................................................................... 59 3.3.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các mẫu thực phẩm ....................... 59 3.3.3. Mức độ kháng kháng sinh của E.coli ............................................... 60 4.2. Kiến nghị ................................................................................................. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 61 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 65 iv Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm β-lactams ............................................ 18 Bảng 1.2. Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm Non β-lactams .................................... 19 Bảng 2.3. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát ....................................................... 32 Bảng43.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trong thực phẩm .......................................... 40 Bảng53.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli theo nhóm thực phẩm ................................. 41 Bảng63.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. .... 43 Bảng73.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản ............................................................................................................................... 45 Bảng83.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. ........ 47 Bảng93.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau......................... 48 Bảng103.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm ........... 51 Bảng113.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt .......................................................................................................... 52 Bảng123.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối rau và các sản phẩm rau ............................................................................................................................... 54 Bảng133.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản ........................................................................................................ 55 Bảng143.11. So sánh tỷ lệ kháng Ampicillin của E.coli với một số nghiên cứu trước đây ..................................................................................................................... 56 Bảng153.10. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của E.coli phân lập được .......................... 57 Bảng164.4. Kết quả vòng vô khuẩn ghi nhận được khi tiến hành kháng sinh đồ với 35 chủng E.coli ........................................................................................................... 73 Bảng174.5. Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ........................................................... 82 Bảng184.6. QCVN số 8-3/2011/QĐ-BYT ................................................................ 82 v Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ13.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm ..................................................... 40 Biểu đồ23.2. Tỷ lệ nhiễm của E.coli trong các nhóm thực phẩm ............................. 42 Biểu đồ33.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. 43 Biểu đồ43.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. ...................................................................................................................... 45 Biểu đồ53.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. .... 47 Biểu đồ63.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. ................... 49 Biểu đồ73.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm .......... 51 Biểu đồ83.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt .......................................................................................................... 53 Biểu đồ93.9. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm rau và các sản phẩm rau ............................................................................................................... 54 Biểu đồ103.10. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm cá, thuỷ sản và sản phẩm từ thuỷ sản. ...................................................................................... 55 vi Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung DANH MỤC CÁC HÌNH Hình11.1. Vị trí tác động của kháng sinh .................................................................. 21 Hình21.2. Sự ức chế tổng hợp protein ở tế bào vi khuẩn của kháng sinh ................. 24 Hình31.3. Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ............................................... 26 Hình44.1. Phản ứng IMViC dương tính của E.coli ................................................... 69 Hình54.2. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB ........ 69 Hình64.3. Khuẩn lạc đặc trưng tím ánh kim của E.coli trên môi trường EMB ........ 70 Hình74.4. Khuẩn lạc đặc trưng của E.coli trên môi trường BCP .............................. 70 Hình84.5. Một vài hình ảnh thể hiện khả năng kháng kháng sinh của E.coli trên môi trường MH .................................................................................................................. 71 DANH MỤC SƠ ĐỒ - QUY TRÌNH • Sơ đồ1phân lập E.coli ............................................................................................ 33 • Quy trình1kháng sinh đồ ........................................................................................ 37 vii Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngày càng sâu sắc trên phạm vi mỗi quốc gia và quốc tế bởi sự liên quan trực tiếp của nó đến sức khỏe và tính mạng con người. Nó ảnh hưởng đến sự duy trì và phát triển nòi giống, cũng như quá trình phát triển và hội nhập kinh tế quốc tế [12], [20]. Cùng với xu hướng phát triển của xã hội và toàn cầu hóa, bệnh truyền qua thực phẩm và ngộ độc thực phẩm đang đứng trước nhiều thách thức mới, diễn biến mới về cả tính chất, mức độ và phạm vi ảnh hưởng [23]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các nước phát triển bị ảnh hưởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm [33]. Các vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) có xu hướng ngày càng tăng. Nước Mỹ mỗi năm vẫn có 76 triệu ca NĐTP với 325.000 người phải vào viện và 5.000 người chết [21]. Ở các nước phát triển khác như EU, Hà Lan, Nga, Trung Quốc, Hàn Quốc... có hàng ngàn trường hợp người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và phải chi phí hàng tỉ USD cho việc ngăn chặn nhiễm độc thực phẩm [19], [34]. Tại các nước đang phát triển, tình trạng ngộ độc thực phẩm lại càng trầm trọng hơn nhiều. Năm 1998, khoảng 1,8 triệu trẻ em bị tử vong do nhiễm độc thực phẩm (tiêu chảy), và đến bây giờ con số đó là hơn 2,2 triệu người tử vong hàng năm, trong đó cũng hầu hết là trẻ em [16], [18]. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc thực phẩm chiếm 1/3 đến 1/2 tổng số trường hợp tử vong [31]. Ở khu vực châu Phi (2004) có khoảng 800.000 trẻ em tử vong do tiêu chảy [17]. Ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, trung bình mỗi năm có 1 triệu trường hợp bị tiêu chảy. Riêng trong năm 2003, có 956.313 trường hợp tiêu chảy cấp, 23.113 ca bị bệnh lỵ, 126.185 ca ngộ độc thực phẩm. Trong 9 tháng đầu năm 2007, ở Malaysia, đã có 11.226 ca ngộ độc thực phẩm, trong đó có 67% là học sinh, tăng 100% so với cùng kỳ năm trước. Tại Ấn Độ 400 ngàn trẻ em bị tử vong do tiêu chảy mỗi năm [22],[36]. Theo Tổ chức Y tế thế giới, trong khoảng 2,5 triệu lượt trẻ em bị tiêu chảy hàng năm trên thế giới, có 8% bị tử vong . Năm 2014, có khoảng 1.100 trẻ em Việt Nam dưới 5 tuổi tử vong do tiêu chảy [40]. 1 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Escherichia coli là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường gặp và điều đáng chú ý nhất là sự gia tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn này. Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển [30]. Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện nhiệt đới trung ương tỉ lệ kháng Ampicilin của E.coli lên tới 81,4%; kháng Amoxicillin/Clavunanic và Ampicillin/Sulbactam khoảng 40%. Các kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm Fluoro- quinolon cũng bị kháng khoảng 45% [2]. Qua các kết quả khảo sát của các tác giả trong nước và trên thế giới cho thấy: tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm khuẩn E.coli và khả năng kháng sinh của các loài vi khuẩn này ngày càng tăng. Xuất phát từ tình hình trên, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập trong thực phẩm được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát - Khảo sát tình hình nhiễm E.coli trong thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM. - Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được từ các mẫu thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur TP. HCM. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong các mẫu thực phẩm. - Đánh giá mức độ kháng các loại kháng sinh của vi khuẩn E.coli trong thực phẩm. - So sánh tính đề kháng kháng sinh của E.coli với các nghiên cứu đã thực hiện trước đây. 2 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Các khái niệm về an toàn thực phẩm Thực phẩm là sản phẩm mà con người ăn, uống ở dạng tươi sống hoặc đã qua sơ chế, chế biến, bảo quản. Thực phẩm không bao gồm mỹ phẩm, thuốc lá và các chất sử dụng như dược phẩm. [15] An toàn thực phẩm là việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [15]. Chế biến thực phẩm là quá trình xử lý thực phẩm đã qua sơ chế hoặc thực phẩm tươi sống theo phương pháp công nghiệp hoặc thủ công để tạo thành nguyên liệu thực phẩm hoặc sản phẩm thực phẩm [15]. Kinh doanh thực phẩm là việc thực hiện một, một số hoặc tất cả các hoạt động giới thiệu, dịch vụ bảo quản, dịch vụ vận chuyển hoặc buôn bán thực phẩm [15]. Ô nhiễm thực phẩm là sự xuất hiện tác nhân làm ô nhiễm thực phẩm gây hại đến sức khỏe, tính mạng con người [15]. Nguy cơ ô nhiễm thực phẩm là khả năng các tác nhân gây ô nhiễm xâm nhập vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, kinh doanh [15]. Ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính do ăn, uống phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng triệu chứng dạ dày – ruột, thần kinh hoặc những triệu chứng khác tùy theo tác nhân gây ngộ độc [1]. 1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Nguyên nhân rất đa dạng và biểu hiện cũng rất phức tạp. Tuy nhiên các nhà khoa học phân chia ngộ độc ra 4 nhóm nguyên nhân chính sau: [1]. 1.2.1. Ngộ độc thực phẩm do ô nhiễm các chất hoá học Do ô nhiễm các kim loại nặng: thường gặp do ăn các thức ăn đóng hộp hay ăn thực phẩm được nuôi trồng từ những vùng đất nước ô nhiễm kim loại nặng. Các kim loại thường gây ô nhiễm như: Chì, Đồng, Asen, Thuỷ ngân, Cadimi... 3 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Do thuốc bảo vệ thực vật: thường là các loại thuốc diệt côn trùng, thuốc trừ động vật ăn hại, thuốc diệt mối, mọt. Nguyên nhân thường do ăn rau xanh, hoa quả...có lượng tồn dư thuốc bảo vệ thực vật quá cao. Do các loại thuốc thú y: thường gặp là các loại thuốc kích thích tăng trưởng, tăng trọng, các loại kháng sinh dùng để điều trị bệnh cho vật nuôi. Do các loại phụ gia thực phẩm: thường gặp là các loại thuốc dùng bảo quản thực phẩm (cá, thịt, rau, quả...), các loại phẩm màu độc đùng trong chế biến thực phẩm. Do các chất phóng xạ. 1.2.2. Ngộ độc do ăn phải thực phẩm có sẵn chất độc Bản thân chất độc có sẵn trong thực phẩm nên khi chúng ta ăn các thực phẩm có chứa sẵn các chất độc này rất có thể bị ngộ độc. Động vật độc: Thường do ăn phải các loại nhuyễn thể, cá nóc độc, gan cóc, mật cá trắm... Thực vật độc: Nấm độc, khoai tây mọc mầm, sắn, một số loại đậu quả, lá ngón... 1.2.3. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bị biến chất, thức ăn ôi thiu Một số loại thực phẩm khi để lâu hoặc bị ôi thiu thường sinh ra các chất độc như: các chất amoniac, hợp chất amin sinh ra trong thức ăn nhiều đạm (thịt, cá, trứng...) hay các peroxit có trong dầu mỡ để lâu hoặc rán đi rán lại nhiều lần, là các chất độc hại trong cơ thể. Các chất độc này thường không bị phá huỷ hay giảm khả năng gây độc khi được đun sôi. 1.2.4. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn nhiễm vi sinh vật Do vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn: đây là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều và phổ biến nhất. Thường gặp do vi khuẩn gây bệnh thương hàn (Salmonella), vi khuẩn gây bệnh lỵ (Shigella), vi khuẩn gây tiêu chảy ở trẻ em (E.coli) hoặc nhiễm các độc tố của vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gây bệnh tả (V. cholerae). 4 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Do virut: thường gặp do các loại virus gây viêm gan A (Hepatitis virus A), virus gây bệnh bại liệt (Polio Picornavirus), virus gây tiêu chảy (Rota virus). Do kí sinh trùng: Sán lá gan, sán bò, ấu trùng sán lợn, các loại đơn bào (Amip, trùng lông...), các loại giun và ấu trùng giun. Do nấm mốc và nấm men: Thường gặp do loài Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Candida... Nguy hiểm hơn là một số loài nấm Aspergillus có khả năng sinh độc tố như Aflatoxin gây ung thư. 1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm Buồn nôn và nôn: xuất hiện sớm nhất trong ngộ độc thực phẩm, là phản ứng của cơ thể nhằm loại bỏ độc chất. Bệnh nhân thường nôn ra hết thức ăn trong dạ dày, sau nôn ra cả dịch mật hoặc nôn khan. Đau bụng cũng là triệu chứng xuất hiện sớm, vị trí đau thường ở trên rốn hoặc quanh rốn, mức độ đau bụng từ nhẹ, âm ỉ đến đau dữ dội, toát mồ hôi, mặt tái mét. Tiêu chảy phân lỏng thường xuất hiện muộn hơn với đặc điểm: đi ngoài nhiều lần, phân nhiều nước, thể ngộ độc nặng, bệnh nhân đi ngoài không tự chủ, phân tự chảy. Màu sắc phân thường màu vàng, mùi tanh nếu tác nhân gây bệnh là virus, độc tố, hóa chất nếu do vi khuẩn hay amip thì có màu nâu, nhầy có máu, mùi khẳn. Một số trường hợp ngộ độc thực phẩm không hề có triệu chứng tiêu chảy phân lỏng do khi bệnh nhân nôn đã thải trừ hết tác nhân gây ngộ độc. Dấu hiệu mất nước: tùy theo mức độ nôn và tiêu chảy phân lỏng mà bệnh nhân có các biểu hiện khác nhau, nếu nhẹ thì thấy khát nước, môi miệng khô, chân tay lạnh, tiểu tiện ít, nặng thì có triệu chứng hoa mắt chóng mặt, mệt lã, da nhăn nheo mất đàn hồi, mắt trũng, vô niệu, mạch nhanh nhỏ, huyết áp tụt hoặc mạch và huyết áp không đo được. Bệnh nhân bị mất nước nặng có thể vào sốc mất nước rồi tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời. Có thể xuất hiện dấu hiệu tê bì, chuột rút một hoặc nhiều cơ, giảm trương lực cơ, chướng bụng do sự thiếu hụt của các chất điện giải như Kali, Canxi bị mất ra ngoài theo phân. 5 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Ngoài ra còn có các triệu chứng khác tùy theo nguyên nhân gây bệnh như Sốt: thường gặp trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm có nhiễm vi khuẩn gây bệnh. Đau đầu hay gặp trong ngộ độc thực phẩm do các tác nhân là độc tố hay hóa chất. Ngộ độc do ăn phải đồ hộp bị nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum có thể gây yếu, liệt chi, nuốt khó, liệt cơ hô hấp gây khó thở [2]. 1.4. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ và kinh tế xã hội 1.4.1. An toàn thực phẩm đối với sức khoẻ An toàn thực phẩm ảnh hưởng quan trọng trực tiếp đến sức khỏe con người và liên quan chặt chẽ đến tình hình phát triển kinh tế, an sinh xã hội, là gánh nặng lớn cho chi phí chăm sóc sức khỏe cộng đồng và phát triển bền vững trên phạm vi toàn cầu [6], [11]. Tổ chức Y tế Thế giới ước tính các bệnh tiêu chảy liên quan đến thực phẩm và nước uống giết chết 2,2 triệu người mỗi năm, trong đó có 1,9 triệu trẻ em [35]. Ngay cả ở các nước phát triển vẫn có tới 30% dân số hàng năm bị mắc các bệnh truyền qua thực phẩm. Tại Mỹ hàng năm cũng có tới 9,4 triệu lượt người mắc; 55.961 người phải nằm viện và 1.351 ca tử vong. Hàng năm Hà Lan có 4,5 triệu người mắc bệnh đường ruột; 300.000 đến 750.000 ca mắc mới ngộ độc thức ăn, tử vong từ 20 - 200 người [20]. Gioocdani có khoảng 4,4 triệu lượt người bị tiêu chảy mỗi năm (không tính trẻ dưới 24 tháng), trong đó 1,3 triệu người phải điều trị. Tính theo nguyên nhân gây bệnh có ít nhất khoảng 16.260 ca mắc Shigella; 6.612 Salmonella, và 6.912 ca do Brucella. Đôi khi còn có các vụ ngộ độc bùng phát, ví dụ ở Mỹ năm 1994 xảy ra vụ Salmonella nhiễm vào kem làm khoảng 224.000 người ngộ độc; Trung Quốc năm 1988 bùng phát dịch viêm gan A do ăn phải trai hến nhiễm loại vi rút này với khoảng 300.000 người mắc. Ở các nước đang phát triển, gánh nặng bệnh tật do bệnh truyền qua thực phẩm còn trầm trọng hơn 6 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung nhiều. Tuy nhiên, thường ở các nước nghèo các tài liệu, báo cáo, nghiên cứu về lĩnh vực này thường không đầy đủ [34], [36]. Theo số liệu từ Chương trình Mục tiêu quốc gia về An toàn thực phẩm, hàng năm có khoảng 150 - 250 vụ ngộ độc thực phẩm được báo cáo với từ 3.500 đến 6.500 người mắc, 37 - 71 người tử vong [3]. Tuy nhiên trong thực tế con số này có thể cao hơn nhiều. Ngày nay, có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại các bếp ăn tập thể của các nhà máy, xí nghiệp liên doanh, khu công nghiệp hoặc tại các đám cưới, đám tang Ngộ độc thực phẩm...a kháng sinh: β-lactam, Rifampicin, Quinolone, Tetracycline - Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn, gọi là tính không thấm: β-lactam, Quinolone, Tetracycline - Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn: β-lactam, Tetracycline - Thay đổi đường chuyển hóa làm mất tác dụng của thuốc. - Biến đổi các enzyme. 1.9.2.1. Khả năng gây bất hoạt của enzyme Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng có thể phá hủy hoạt tính của kháng sinh. Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng β-lactam, biến 26 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Penicillinase thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc. Chloramphenicol được biết đến với sự bất hoạt kháng sinh bởi enzyme acetyltransferase acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của Chloramphenicol. Các kháng sinh thuộc Aminoglycosides và Macrolides cũng bị đề kháng bằng cơ chế này [8]. 1.9.2.2. Thay đổi điểm tác động Mỗi kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn. Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào hoặc tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi là penicillin binding protein (PBP). Staphylococus aureus đề kháng Methicillin có một yếu tố di truyền gọi là SCCmec (Staphylococcal cassette chromosome mec) chứa gene mecA mã hóa cho sự sản xuất một PBP biến đổi (PBP2a), không bị tác động bởi sự gắn kết của kháng sinh β- lactam. Những vi khuẩn có gene này có khả năng đề kháng nhiều kháng sinh nhóm β-lactam, ngay cả Carbapenem. Các vi khuẩn Gram âm mất receptor P10 trên tiểu đơn vị 30S của ribosome nên Aminoglycosides không còn tác động được nữa [8]. 1.9.2.3. Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn Đây là một cơ chế quan trọng của sự đề kháng ở vi khuẩn Gram âm. Thuốc đi vào tế bào vi khuẩn thông qua kênh ở ngoài màng, sự đột biến dẫn tới đóng hoặc làm giảm kích thước của kênh, thường đem lại đề kháng kháng sinh với mức độ thấp. Những thay đổi ở thành tế bào vi khuẩn Gram âm dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng. Cơ chế này xảy ra với các kháng sinh nhóm β-lactam, Quinolones, Aminoglycosides, Sulfamethoxazole và Trimethoprim [8]. 1.9.2.4. Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn Hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào vi khuẩn. Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế chính của vi khuẩn đề kháng với các kháng sinh Tetracycline mã hóa bởi gene Tet (Tet-pumb). Hiện nay cơ chế này được đề cập đến 27 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh (đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi các gene MefA/E (Macrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (Aminoglycosides), MexAB-OprM (nhóm β-lactam), [8]. 1.9.2.5. Thay đổi đường chuyển hóa làm mất tác dụng của thuốc Sulfonamides bị kháng do vi khuẩn tìm được đường khác tổng hợp folic acid mà không cần dùng PABA ở ngoài tế bào nữa [8]. 1.9.2.6. Biến đổi enzyme Enzyme bị thay đổi vẫn còn thực hiện được chức năng biến dưỡng , nhưng ít bị ảnh hưởng của thuốc so với enzyme ở vi khuẩn nhạy cảm. Ví dụ: ở vi khuẩn nhạy cảm Sulfonamides, tetrahydropteroic acid synthetase có ái lực với Sulfnamides cao hơn nhiều so với PABA, còn ở vi khuẩn kháng Sulfonamides do đột biến thì ngược lại. Một số cơ chế trên có ở những vi khuẩn Gram dương và cả vi khuẩn Gram âm: do enzyme gây bất hoạt kháng sinh, thay đổi đích của vi khuẩn. Ngược lại giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh chỉ thuộc về vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Gram dương không có màng ngoài nên rất dễ thấm ở lớp peptidoglycan nên thường cho phép kháng sinh đi qua). Hiện tượng thải trừ tích cực đã được mô tả ở các vi khuẩn Gram dương như một hệ thống thải trừ thuộc ATP bơm Macrolides ra khỏi tế bào vi khuẩn ở các Staphylococcus spp [8]. 1.9.3. Một số biện pháp hạn chế nguy cơ kháng kháng sinh - Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra. - Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ; nên ưu tiên những kháng sinh có hoạt phổ hẹp có tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh. - Dùng kháng sinh đủ liều lượng và đủ thời gian. - Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, hạn chế lan truyền vi khuẩn đề kháng. - Liên tục giám sát sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn [8]. 28 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng – Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn E.coli phân lập được từ thực phẩm do khách hàng gửi tới kiểm nghiệm tại Phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. HCM. Chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC®* 25922 (Dùng làm đối chứng trong phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ). 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP. HCM. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/01/2016 đến tháng 30/06/2016. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Cỡ mẫu Được tính theo công thức sau: Trong đó: - N: Cỡ mẫu cần thiết cho nghiên cứu - Z: trị số tra từ bảng phân phối chuẩn, mà z = 1-α/2 - α: mức ý nghĩa thống kê - p: tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm E.coli - d: độ chính xác mong muốn 2.2.2. Đánh giá kết quả - Ghi nhận và xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2013, SAS. - Dựa vào quy định số 46/2007/BYT và QCVN 8-3:2012/BYT của Bộ Y tế để đánh giá kết quả đạt hay không đạt tiêu chuẩn vi sinh. 29 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Dựa theo tiêu chuẩn CLSI 2015 để xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được. 2.2.3. Dụng cụ – Thiết bị – Môi trường – Hoá chất Dụng cụ: ống nghiệm, giá ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp, thước đo đường kính (mm), pipette điện tử, Thiết bị: dùng trong nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ - Kính hiển vi dùng để soi: Olympus CH20, kiểu loại CH20bIMF200, Nhật. - Tủ an toàn sinh học - Tủ ấm 44oC - Tủ ấm 37oC - Máy vortex Heidolph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức. - Máy đo độ đục McFarland. - Tủ đông sâu giữ chủng -20oC, Nhật. - Tủ lạnh bảo quản môi trường • Môi trường - Nước peptone đệm. - Tryptic Soya Agar (TSA). - Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose Agar (EMB). - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL). - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: ✓ Simmons Citrate ✓ Trypton water (canh trypton) ✓ Môi trường Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP) ✓ Môi trường Kligler iron agar (KIA) - Môi trường làm kháng sinh đồ MHA (MUELLER - HINTON AGAR) - Môi trường dùng để tăng sinh chủng vi khuẩn: Thạch Trypticase Soy Agar. - Môi trường LB + 25% Glycerol dùng để bảo quản chủng vi khuẩn. 30 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Hoá chất: dùng định danh E.coli và làm kháng sinh đồ Nước muối sinh lý, dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch safarin; dung dịch Methyl red; dung dịch KOH 40%; dung dịch Kovac; dầu soi cedre; khoanh giấy kháng sinh của BioRad. 2.2.4. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát Dựa theo CLSI (2015), mà ta chọn các loại kháng sinh sau để khảo sát [29]. 31 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng 2.3. Các loại kháng sinh dùng để khảo sát Tên kháng STT Nhóm kháng sinh Tên viết tắt Hàm lượng Nhạy Trung gian Kháng sinh 1 Penicillins Ampicillin AMP 10 µg ≥ 17 mm 14 - 16 mm ≤ 13 mm Β-lactam/β- Amoxicillin- 2 AMC 20/10 µg ≥ 18 mm 14 - 17 mm ≤ 13 mm lactamase clauvulanate Cephems 3 Ceftazidime CAZ 30 µg ≥ 21 mm 18 - 20 mm ≤ 17 mm (Parenteral) Ertapenem ETP10 10 µg ≥ 22 mm 19 - 21 mm ≤ 18 mm 4 Carbapenems Meropenem MEM10 10 µg ≥ 23 mm 20 - 22 mm ≤ 19 mm Gentamicin CN 10 µg ≥ 15 mm 13 - 14 mm ≤ 12 mm 5 Aminoglycosides Amikacin AK 30 µg ≥ 17 mm 15 - 16 mm ≤ 14 mm Netilmicin NET 30 µg ≥ 15 mm 13 - 14 mm ≤ 12 mm 7 Fluoroquinolones Ciprofloxacin CIP 5 µg ≥ 21 mm 16 - 20 mm ≤ 15 mm 8 Nitrofurans Nitrofurantoin F 300 µg ≥ 17 mm 15 - 16 mm ≤ 14 mm 32 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.2.5. Tiến trình nghiên cứu - Lấy mẫu. - Phân lập và định lượng vi khuẩn E.coli trong thực phẩm. - Định danh lại vi khuẩn E.coli bằng quan sát hình thái và bằng các phản ứng sinh hoá. - Bảo quản chủng vi khuẩn E.coli. - Xác định khả năng kháng kháng sinh của E.coli bằng thử nghiệm kháng sinh đồ. 2.2.5.1. Phương pháp lấy mẫu - Nguồn gốc mẫu thí nghiệm: mẫu thực phẩm do khách hàng gởi tới kiểm nghiệm tại Viện Pasteur trong thời gian từ 12/2015 đến tháng 05/2016. - Lấy mẫu: lấy đại diện khoảng 500g mẫu thực phẩm đã chọn, bảo quản trong túi nylon vô trùng và bảo quản lạnh (4 – 8)oC trong suốt thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu phải được phân tích ngay trong vòng 24 giờ. 2.2.5.2. Phương pháp phân lập và định lượng vi khuẩn E.coli trong thực phẩm Phương pháp nuôi cấy cổ điển ISO 7251:2005 [10]. • Nguyên lý Tăng sinh những vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose và sinh gas trong môi trường TLS. Tiếp tục tăng sinh chọn lọc trong môi trường EC. Khẳng định E.coli giả định bằng phản ứng Indol trong môi trường canh tryptone bằng cách nhỏ thuốc thử Kovac`s  xuất hiện vòng đỏ cánh sen. Sau đó khẳng định E.coli trên môi trường EMB với khuẩn lạc đặc trưng là tròn, bờ đều và có ánh kim tím. Rồi kiểm tra lại bằng các phản ứng sinh hoá IMViC với kết quả lần lượt là (+)(+)(-)(-). • Sơ đồ1phân lập E.coli 33 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 34 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Cách tiến hành Pha loãng mẫu: - Đối với mẫu rắn: cân chính xác 25g mẫu  pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 với peptone đệm hoặc nước muối sinh lý  nghiền mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút  ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1  Ta tiếp tục pha loãng các nồng độ tiếp theo 10-2, 10-3, - Đối với mẫu lỏng: sử dụng trực tiếp  dung dịch nồng độ 100  Ta tiếp tục pha loãng các nồng độ tiếp theo 10-1, 10-2, Cấy mẫu - Từ mỗi nồng độ pha loãng: ✓ Hút 10ml dung dịch có độ pha loãng 10-1 vào ống TLS kép. ✓ Hút 1ml dung dịch vào ống TLS đơn. - Đem ủ ở 37°C / (24-48)giờ. - Quan sát những ống sinh hơi và mờ đục. Cấy chuyển sang môi trường trypton Đem ủ ở 44°C / 48h. - Sau thời gian ủ các ống môi trường trypton, nhỏ thuốc thử Kovac’s và chờ 1- 2 giây. ✓ (+): vòng tròn đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường. ✓ (-): không xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt môi trường.  Xác định được số E.coli giả định bằng phương pháp MPN Cấy chuyển sang môi trường EMB và ủ ở (37±1)oC / (24±2)giờ để khẳng định chắc chắn E.coli với khuẩn lạc có hình thái là tròn, bờ đều, có ánh kim tím, Ø khoảng 0,5mm. Sau đó ta kiểm tra lại bằng các phản ứng sinh hoá IMViC  lần lượt là (+)(+)(-)(-). 2.2.5.3. Phương pháp giữ chủng Sau khi định danh, môi trường LB (20% glycerol) được dùng để giữ chủng, ta cấy chủng đã định danh từ môi trường KIA sang thạch dinh dưỡng TSA, sau đó ta gặt chủng, tube giữ chủng được bảo quản ở tủ -20oC. Chủng được lưu giữ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 35 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 2.2.5.4. Phương pháp kháng sinh đồ • Nguyên lý Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuller – Hinton (MH) có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. 36 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Quy trình1kháng sinh đồ 37 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung • Cách tiến hành - Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ khoanh giấy kháng sinh. - Đĩa thạch MH lấy ra từ tủ lạnh (4 – 8oC) được ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. ✓ Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: cấy vi khuẩn vào môi trường BHI, ủ ở 37oC, để qua đêm. Dùng pipet lấy 2 giọt huyền dịch vi khuẩn cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo độ đục McFarland bằng máy đo độ đục. Điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn tương đương với độ đục 0,5 McFarland (1 – 2 x 108 CFU/ml). ✓ Pha loãng 100 lần huyền dịch trên để được huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml. ✓ Láng vi khuẩn lên đĩa thạch: Sử dụng ngay huyền dịch nống độ 106 CFU/ml dịch pha loãng (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller – Hinton. Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh. ✓ Đặt khoanh giấy kháng sinh: Khoang giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch, sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk – dispensing apparatus) để phân phối kháng sinh lên đĩa thạch. Sau đó dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất giữ, bảo đảm vô trùng. - Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh được đặt từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ở 35±2oC/24h. ✓ Đọc và phân tích kết quả: Sau khi ủ lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước kẹp đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vòng vô khuẩn của 38 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung chủng thử nghiệm với vòng ức chế theo tiêu chuẩn CLSI 2015, sau đó ghi lại kết quả đường kính vòng ức chế vi khuẩn của từng loại kháng sinh được thử nghiệm: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R). Lưu ý: Luôn luôn phải làm song song thủ nghiệm với các chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC®* 25922 để kiểm tra chất lượng của quy trình. Giữ các chủng chuẩn ở - 20oC trong môi trường canh thang có chứa 20% glycerol trong vòng 3 năm. Trước khi sử dụng phải cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn. Các chủng chuẩn có thể được giữ trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2 – 8oC trong vòng 2 tuần. 39 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E.coli trong thực phẩm Trong thời gian từ 01/01/2016 đến 30/06/2016, chúng tôi đã phân tích 250 mẫu thực phẩm do khách hàng gửi đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur Tp. HCM. Qua quá trình phân lập và định danh, chúng tôi thu được kết quả như sau: 3.1.1. Tỷ lệ nhiễmE.coli trong thực phẩm Bảng43.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trong thực phẩm Kết quả Số mẫu kiểm nghiệm Không nhiễm E.coli Nhiễm E.coli 250 215 (86%) 35 (14%) Biểu đồ13.1. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong thực phẩm Kết quả từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1, cho thấy từ 01/01/2016 đến 30/06/2016 có 86% mẫu (215/250 mẫu) thực phẩm không nhiễm E.coli và có 14% mẫu (35/250 mẫu) thực phẩm bị nhiễm E.coli. Nếu người tiêu dùng sử dụng các mẫu thực phẩm bị nhiễm vi E.coli này sẽ có nguy cơ bị ngộ độc thực phẩm, điều này gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng. 40 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 3.1.2. Tỷ lệ nhiễmE.coli trong các nhóm thực phẩm Trong thời gian thực hiện nghiên cứu, các mẫu thực phẩm được khách hàng gửi đến kiểm nghiệm tại Viện Pasteur gồm 4 nhóm như sau: - Thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. - Rau và các sản phẩm rau. - Cá, thuỷ sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. - Ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc. Bảng53.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli theo nhóm thực phẩm Tổng Kết quả STT Nhóm thực phẩm số Không nhiễm Nhiễm E.coli mẫu E.coli Thịt và các sản phẩm chế 1 100 76 (76%) 24 (24%) biến từ thịt 2 Rau và các sản phẩm rau 50 46 (92%) 4 (8%) Cá, thuỷ sản và các sản 3 50 44 (88%) 6 (12%) phẩm từ thuỷ sản Ngũ cốc và các sản phẩm 4 50 49 (98%) 1 (2%) từ ngũ cốc 41 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ23.2. Tỷ lệ nhiễm của E.coli trong các nhóm thực phẩm Nhận xét: Theo trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2, các nhóm thực phẩm được kiểm nghiệm có kết quả như sau: - Nhóm thịt và các sản phẩm thịt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 76% (76/100 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 24% (24/100 mẫu). - Nhóm cá, thuỷ sản và các sản phẩm từ thuỷ sản có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 88% (44/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 12% (6/50 mẫu). - Nhóm rau và các sản phẩm rau có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 92% (46/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 8% (4/50 mẫu). - Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 98% (49/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 2% (1/50 mẫu). Qua xử lý thống kê trong giữa các nhóm thực phẩm với nhau (phụ lục), có xác xuất p = 0,0012 < 0,05  khác biệt có ý nghĩa thống kê. 42 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm khuẩnE.coli trong các nhóm thực phẩm 3.1.3.1. Nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt Qua phân tích 100 mẫu thực phẩm thuộc nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 3 nhóm nhỏ sau: - Thịt tươi, đông lạnh. - Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt - Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt dùng trực tiếp đã qua xử lý nhiệt. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: Bảng63.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Thịt tươi, đông lạnh 13 2 (15.39%) 11 (84.61%) Thịt và SP chế biến từ 2 37 30 (81.08%) 7 (18.92%) thịt không xử lý nhiệt Thịt và SP chế biến từ 3 50 44 (88%) 6 (12%) thịt đã qua xử lý nhiệt Biểu đồ33.3. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt. 43 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Nhận xét: Qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.3, nhóm thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt có tỷ lệ nhiễm E.coli khá cao: - Nhóm thịt tươi, đông lạnh có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 15,39% (2/13 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 84,61% (11/13 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt không xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 81,08% (30/37 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 18,92% (7/37 mẫu). - Nhóm thịt và sản phẩm chế biến từ thịt đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 88% (44/50 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 12% (6/50 mẫu). Qua số liệu trên, ta thấy được nhóm thịt tươi, đông lạnh là nhóm có tỷ lệ nhiễm E.coli cao nhất: 84,61%, chứng tỏ nhóm này có nguy cơ bị E.coli nhiễm vào thực phẩm rất cao. Nhóm thực phẩm này có mức độ nhiễm E.coli cao có thể là do những người chăn nuôi, các cơ sở giết mổ, buôn bán và những người chế biến, bảo quản, đã không tuân thủ các quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm. Qua xử lý thống kê trong các nhóm thịt với nhau (phụ lục), có xác xuất p < 0,0001 < 0,05  khác biệt rất có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.2. Nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 3 nhóm nhỏ sau: - Cá và thuỷ sản tươi. - Sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản. - Thuỷ sản khô sơ chế. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: 44 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng73.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Cá và thuỷ sản tươi 12 11 (91,67%) 1 (8,33%) SP chế biến từ cá và 25 21 (84%) 4 (16%) 2 thuỷ sản 3 Thuỷ sản khô sơ chế 13 12 (92,31%) 1 (7,69%) Biểu đồ43.4. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản. Nhận xét: Qua bảng 3.4 và biểu đồ 3.4, nhóm cá, thuỷ hải sản và các sản phẩm từ thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli tương đối cao: - Nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 91,67% (11/12 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 8,33% (1/12 mẫu). 45 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 84% (21/25 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 16% (4/25 mẫu). - Nhóm thuỷ sản khô sơ chế có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 92,31% (12/13 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 7,69% (1/13 mẫu). Qua số liệu trên, ta thấy nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản có tỷ lệ nhiễm E.coli cao nhất: 16%. Nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ thấp hơn nhóm sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản đến 7,67%. Lẽ ra nhóm cá và thuỷ sản tươi là nhóm có nguy cơ nhiễm E.coli cao hơn các nhóm khác, thế nhưng kết quả ở đây thì ngược lại. Nguyên nhân có thể là do khả năng ngoại nhiễm, nhiễm trong quá trình sơ chế, bảo quản, nhiễm từ người chế biến, nhiễm từ dụng cụ vào, Phân nhóm cá và thuỷ sản tươi có tỷ lệ bị nhiễm E.coli khá cao (8,33%) có thể là do nguyên nhân người nuôi bắt, chế biến, mua bán,... không tuân thủ các quy tắc an toàn vệ sinh thực phẩm nên dẫn đến việc vi khuẩn xâm nhập từ các nguồn khác vào thực phẩm. Điểu này có thể gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiếp xúc với thực phẩm nhiễm E.coli, gây thiệt hại về kinh tế cho người đánh bắt và nuôi thuỷ hải sản. Ở phân nhóm thuỷ sản khô sơ chế cũng có tỷ lệ nhiễm E.coli đáng lo ngại (7,69%). Nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện, quy trình bảo quản và quá trình vận chuyển không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Qua xử lý thống kê trong các nhóm cá, thuỷ sản với nhau (phụ lục), có xác xuất p = 0,6839 > 0,05  khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.3. Nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc. Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 2 nhóm nhỏ sau: - Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp. - Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: 46 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng83.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli Sản phẩm chế biến từ 32 31 (96,87%) 1 (3,13%) 1 ngũ cốc dùng trực tiếp Sản phẩm chế biến từ 2 ngũ cốc phải qua xử lý 18 18 (100%) 0 (0%) nhiệt trước khi sử dụng Biểu đồ53.5. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc. Nhận xét: Qua bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, nhóm nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc có tỷ lệ nhiễm E.coli: - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 96,87% (31/32 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 3,13% (1/32 mẫu). 47 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (18/18 mẫu). Qua số trên, ta thấy nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng không bị nhiễm E.coli, chứng tỏ rằng quá trình xử lý nhiệt đủ để E.coli không còn tồn tại và quá trình chế biến đã đảm bảo an toàn vệ sinh. Nhóm sản phẩm chế biến từ ngũ cốc dùng trực tiếp có tỷ lệ nhiễm không quá cao: 3,13%. Nguyên nhân có là do quá trình sản xuất, vận chuyển, bảo quản, tiêu thụ, không đảm bảo vệ sinh an toàn nên vi khuẩn E.coli xâm nhập vào thực phẩm từ nhiều nguồn khác nhau như từ người chế biến, từ máy móc thiết bị, Chính vì vậy, ta cần phải chú ý hơn đến vệ sinh an toàn thực phẩm để có được thực phẩm tươi, sạch và an toàn. Qua xử lý thống kê trong các nhóm ngũ cốc và các sản phẩm từ ngũ cốc (phụ lục), có xác xuất p = 0,4487 > 0,05  khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.4. Nhóm rau và các sản phẩm rau Qua phân tích 50 mẫu thực phẩm thuộc nhóm rau và các sản phẩm rau được gửi đến kiểm nghiệm, chúng tôi chia thành 2 nhóm nhỏ sau: - Rau tươi. - Sản phẩm chế biến từ rau đã qua xử lý nhiệt. Kết quả số mẫu nhiễm E.coli trong từng nhóm như sau: Bảng93.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. Kết quả STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu Không Nhiễm E.coli nhiễm E.coli 1 Rau tươi 23 23 (100%) 0 (0%) Sản phẩm chế biến từ 27 23 (84,19%) 4 (14,81%) 2 rau đã qua xử lý nhiệt 48 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ63.6. Tỷ lệ nhiễm E.coli trong nhóm rau và các sản phẩm rau. Nhận xét: Qua bảng 3.6 và biểu đồ 3.6, nhóm nhóm rau và các sản phẩm rau có tỷ lệ nhiễm E.coli: - Nhóm sản phẩm rau tươi có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 100% (23/23 mẫu) và nhóm này không bị nhiễm E.coli. - Nhóm sản phẩm chế biến từ rau đã qua xử lý nhiệt có tỷ lệ không nhiễm E.coli là 84,19% (23/27 mẫu) và tỷ lệ nhiễm E.coli là 14,81% (4/27 mẫu). Số liệu trên cho thấy rằng ở nghiên cứu này thì nhóm rau tươi lại an toàn hơn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt. mặc dù, thực tế thì nhóm rau tươi chính là nhóm có nguy cơ nhiễm E.coli cao hơn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt vì nhóm rau tươi dễ bị nhiễm E.coli từ nguồn nước bị nhiễm phân, từ phân động vật, Còn nhóm rau đã qua xử lý nhiệt thì sẽ có nguy cơ nhiễm E.coli thấp hơn do đã qua xử lý nhiệt. Kết quả ở nghiên cứu này đã cho thấy có thể khả năng bị nhiễm E.coli của nhóm rau đã qua xử lý nhiệt là do ngoại nhiễm. Có thể do quy trình sơ chế, chế biến, bảo quản, chưa đạt vệ sinh an toàn. Hoặc có thể do quy trình xử lý nhiệt chưa đạt đến nhiệt độ tối thiểu để tiêu diệt E.coli. Phân nhóm này thể hiện tỷ lệ cao như vậy là điều đáng 49 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung lo ngại vì thực phẩm rau đã qua xử lý nhiệt là để dùng ngay, dùng trong các nhà máy, bếp ăn cho công nhân, học sinh, sinh viên, chính vì vậy khả năng ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng rất cao. Qua xử lý thống kê trong các nhóm rau và các sản phẩm rau (phụ lục), có xác xuất p = 0,0543 > 0,05  khác biệt không có ý nghĩa thống kê. 3.2. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli 3.2.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli trong thực phẩm Sau khi phân lập và định danh 35 chủng vi khuẩn E.coli từ 250 mẫu thực phẩm, chúng tôi tiếp tục làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauer để khảo sát mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli. Trong đó: - Nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt: 24 chủng. - Nhóm rau và các sản phẩm rau: 4 chủng. - Nhóm cá và thuỷ sản: 6 chủng. - Nhóm ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc: 1 chủng. Chúng tôi đã khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập được với 10 loại kháng sinh sau: AMP: Ampicillin CN: Gentamicin AMC: Amoxicillin-clauvulanate AK: Amikacin CAZ: Ceftazidime NET: Netilmicin ETP: Ertapenem CIP: Ciprofloxacin MEM: Meropenem F: Nitrofurantoin Qua quá trình khảo sát, phân tích và tổng hợp kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi ghi nhận kết quả theo bảng sau: 50 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Bảng103.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 45,71 0 8,57 0 2,86 8,57 0 0 14,29 I 0 5,71 0 0 0 0 2,86 0 0 31,43 S 100 48,58 100 91,43 100 97,14 88,57 100 100 54,28 Biểu đồ73.7. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli trong thực phẩm Nhận xét: Qua bảng 3.7 và biểu đồ 3.7, tỷ lệ kháng kháng sinh của 35 chủng E.coli đã phân lập được như sau: - Đối với Ampicillin: 45.71% (16/35 chủng); Amoxicillin-clauvulanate: 14,29% (5/35 chủng); Gentamicin: 8.57% (3 chủng); Ciprofloxacin: 8.57% (3 chủng); Nitrofurantoin: 2.86% (1 chủng). 51 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung - 100% các chủng E.coli nhạy cảm với Ceftazidime; Ertapenem; Meropenem; Amikacin; Netilmicin. Như vậy 35 chủng E.coli phân lập từ thực phẩm có tỷ lệ kháng cao với Ampicillin, Amoxicillin-clauvulanate, Ciprofloxacin và Gentamicin; 4 loại kháng sinh này đại diện cho nhóm là Penicillins, β-Lactam/β-Lactamase; Fluoroquinolones và Aminoglycosides; 4 nhóm này thường được sử dụng nhiều trong chăn nuôi để kích thích tăng trưởng cũng như phòng ngừa bệnh cho vật nuôi, đây có thể là nguyên nhân đưa đến tỷ lệ kháng cao. 3.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Qua 24 chủng phân lập được từ nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt, chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau Bảng113.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Kháng sinh AK AMP NET CIP MEM F CN ETP CAZ AMC Kết quả R 0 62,5 0 12,5 0 4,17 12,5 0 0 20,83 I 0 8,33 0 0 0 0 4,17 0 0 29,17 S 100 29,17 100 87,5 100 95,83 83,33 100 100 50 52 Đồ án tốt nghiệp SV: Huỳnh Lê Trung Biểu đồ83.8. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E.coli đối với nhóm thịt và các sản phẩm từ thịt Nhận xét: Qua bảng 3.8. và biểu đồ 3.8., có thể nhận thấy rằng các chủng E.coli đã kháng các loại kháng sinh với tỷ lệ khá cao: - Kháng với Ampicillin: 62,5% (15/24 chủng), Amoxicillin-clauvulanate: 20,83% (5/24 chủng), Gentamicin: 12,5% (3/24 chủng), Ciprofloxacin: 12,5% (3/24 chủng). - Tỷ lệ trung gian của Amoxicillin-clauvulanate, Ampicillin cao, lần lượt là 29,17 (7/24 chủng)% và 8,33% (2 chủng). Điều này cho thấy chúng đang có xu hướng kháng các loại kháng sinh này rất cao. Nguyên nhân có thể là do người dân đã sử dụng các loại kháng sinh này một cách bừa bãi, không định hướng trong chăn nuôi nhằm phòng ngừa, điều trị bệnh cho vật nuôi, hoặc dùng để kích thích tăng trưởng nhằm thu được lợi nhuận cao mà không quan tâm đến những hậu quả mà nó để lại. 3.2.3. Tỷ