Luận án Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn

chất; phương pháp: phân loại vi sinh vật; xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật; xác định hiện trạng chất thải chăn nuôi; thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Chương 3. Kết quả và thảo luận: thực trạng chất thải tại một số cơ sở chăn nuôi; nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi; nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi hiệu quả sử dụng phân hữu cơ từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng. Keywords. Sinh học; Vi sinh vật học; Xử lý chất thải; Phế thải chăn nuôi Content MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN Việt Nam là nước nông nghiệp, trong thời kỳ đổi mới ngành chăn nuôi có những bước phát triển nhanh chóng, mô hình trang trại chăn nuôi tập trung được nhân rộng trong toàn quốc. Mỗi năm cả nước có khoảng 60 triệu tấn chất thải vật nuôi, trong đó chỉ có khoảng 50% được xử lý, số còn lại được sử dụng trực tiếp bón cho cây trồng hoặc làm thức ăn cho cá. Do chỉ tập trung đầu tư để nâng cao năng suất và chất lượng vật nuôi, phần nhiều các trang trại chưa chú trọng đến công tác kiểm soát, quản lý chất thải nên làm phát sinh dịch bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng trực tiếp đến việc phát triển bền vững của ngành chăn nuôi. Tại nhiều địa phương người dân còn coi chất thải chăn nuôi là phân bón, không quan tâm đến việc xử lý hoặc nếu có cũng chỉ ủ đống để chờ bón cho cây trồng theo mùa vụ. Đây là một trong các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường và lây truyền các dịch bệnh cho người, vật nuôi và cây trồng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN - Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật (VSV) thuộc nhóm an toàn, sinh trưởng mạnh, cạnh tranh được với VSV trong chất thải, chuyển hóa nhanh các hợp chất hữu cơ và ức chế hiệu quả các vi khuẩn (VK) gây bệnh, gây thối, làm giảm ô nhiễm môi trường từ chất thải chăn nuôi. - Tạo được chế phẩm VSV để xử lý chất thải chăn nuôi thành phân hữu cơ đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng cây trồng, thay thế một phần phân vô cơ, góp phần phát triển nông nghiệp an toàn, bền vững. 3. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, từ hiện trạng chất thải dạng rắn ở trang trại chăn nuôi tập trung đến sản xuất và ứng dụng thành công chế phẩm VSV xử lý có hiệu quả chất thải chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trường và rút ngắn thời gian chuyển hóa các chất hữu cơ từ 3- 4 tháng xuống còn 21- 30 ngày, đánh giá đựơc hiệu quả của phân hữu cơ chế biến từ chất thải chăn nuôi đối với cây trồng. - Là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách tổng hợp và chứng minh được hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic sinh các chất kháng khuẩn (axit lactic và bacterioxin) để xử lý mùi hôi thối và ức chế vi khuẩn gây bệnh trong chất thải chăn nuôi. - Xây dựng được qui trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn làm phân bón hữu cơ thay thế phân chuồng và tiết kiệm được 25% lượng phân khoáng góp phần phát triển sản xuất nông nghiệp an toàn, bền vững. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN - Cung cấp 4 chủng vi sinh vật an toàn, có hoạt tính sinh học cao trong sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi, tạo phân hữu cơ góp phần giảm lượng phân hoá học và nâng cao hiệu quả sản xuất của nông dân. - Đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi qui mô trang trại góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi. BỐ CỤC LUẬN ÁN: Luận án bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); vật liệu và phương pháp (17 trang); kết quả và thảo luận (71 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang); danh mục công trình liên quan đến luận án; danh mục 122 tài liệu tham khảo và các phụ lục. Luận án có 45 bảng, 42 hình. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chất thải chăn nuôi và biện pháp xử lý 1.1.1. Chất thải chăn nuôi và nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng  Chất thải chăn nuôi: Là chất thải ra trong quá trình chăn nuôi, gồm ba dạng chủ yếu: Chất thải rắn (bao gồm chủ yếu là phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa và đôi khi là xác gia súc, gia cầm chết hàng ngày); chất thải lỏng (bao gồm nước rửa chuồng, nước tắm cho vật nuôi, nước tiểu, một phần phân); chất thải bán lỏng (gồm cả chất thải rắn và chất thải lỏng).  Nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng: - Ô nhiễm do kim loại nặng: Các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng, vật nuôi không tiêu hoá hết bài tiết ra ngoài theo đường phân làm thoái hoá đất, ức chế hoạt động của VSV, ô nhiễm nước ngầm, tích tụ trong nội tạng người và vật nuôi là nguyên nhân gây các loại bệnh tật. - Ô nhiễm do khí độc: Trong phân, nước thải của lợn có khoảng 40 loại khí độc khác nhau sinh ra từ quá trình thối rữa thức ăn thừa và xác động thực vật do hoạt động sống của vi khuẩn yếm khí. Các khí thải H2S, NH3, CH4, CO2, N2O...gây mùi hôi thối khó chịu, kích thích trung khu hô hấp của người và vật nuôi, có thể gây ngộ độc hoặc tử vong. - Ô nhiễm do vi sinh vật và ký sinh trùng gây bệnh: Theo tài liệu của FAO có khoảng 90 loại bệnh liên quan giữa người và gia súc mà phần lớn do các vi sinh vật và ký sinh trùng (KST) lan truyền từ chất bài tiết của vật nuôi bị bệnh vào không khí, nguồn nước, đất, nông phẩm, trong đó phổ biến và nguy hiểm nhất là nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột. 1.1.2. Tình hình sử dụng chất thải chăn nuôi ở Việt Nam Mỗi ngày đàn gia súc, gia cầm của Việt Nam thải ra khoảng 539.733.15 tấn chất thải rắn, khoảng 25-30 triệu khối chất thải lỏng, ước tính mỗi năm có trên 60 triệu tấn phân vật nuôi các loại. Trong số đó chỉ có khoảng 50% được xử lý bằng phương pháp ủ trước khi sử dụng. 1.1.3. Các biện pháp xử lý chất thải chăn nuôi - Phƣơng pháp vật lý: Bao gồm phương pháp lắng cặn; sử dụng máy tách chất rắn; lọc. - Phƣơng pháp hoá học: Bơm và trộn các chất điện ly đơn giản hoặc các chất điện ly polyme cùng với hỗn hợp chất thải trước khi tách cơ học làm tăng 82% hiệu quả tách chất rắn. - Phƣơng pháp sinh học: + Sử dụng thảm thực vật, hồ thuỷ sinh + Sử dụng vi sinh vật: Là biện pháp chính trong phương pháp sinh học. Dựa trên cơ sở tối ưu hoá các điều kiện môi trường cho hệ vi sinh vật tự nhiên hoặc vi sinh vật khởi động phát triển để phân giải các hợp chất hữu cơ trong phân trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí tạo sản phẩm cuối cùng ổn định, có giá trị kinh tế, giảm hàm lượng chất rắn tổng số, giảm mùi, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Biện pháp chủ yếu xử lý chất thải lỏng là biogas, xử lý chất thải rắn là composting. 1.2. Vi sinh vật tham gia quá trình xử lý chất thải hữu cơ Hệ vi sinh vật trong chất thải chăn nuôi gồm nhiều nhóm VSV có hoạt tính sinh học khác nhau giữ vai trò hết sức quan trọng trong chu trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành các chất mùn mà cây trồng có thể sử dụng được. Ở đây chúng tôi chỉ đề cập các nhóm VSV có khả năng phân huỷ các hợp chất phổ biến, là thành phần chính trong chất thải chăn nuôi gồm xenluloza, tinh bột, protein và VSV có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn gây thối. 1.2.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong tự nhiên khu hệ VSV có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza phân giải xenluloza vô cùng phong phú, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm. Xenlulaza là một phức hệ 3 enzym (Endo-1,4-glucanaza, Exo- 1,4-gluconaza, -1,4-glucozidaza) hoạt động cùng nhau để thuỷ phân xenluloza tạo ra các loại đường có thể đi qua thành tế bào VSV. 1.2.2. Vi sinh vật phân giải tinh bột Amylaza là hệ enzym rất phổ biến đối với VSV. Cơ chất xúc tác của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bột, phân biệt amylaza thành các loại: -amylaza, -amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza. -amylaza gặp ở hầu hết các loại VSV như nấm sợi, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử và xạ khuẩn. 1.2.3. Vi sinh vật phân giải protein VK có khả năng sinh ra cả hai loại proteaza (endopeptidaza và exopeptidaza), do đó proteaza của VK có tính đặc hiệu cơ chất cao. Các VK có khả năng tổng hợp proteaza mạnh nhất. Nhiều loại nấm mốc cũng có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza còn xạ khuẩn ít được nghiên cứu hơn. 1.2.4. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axit lactic và bacterioxin Vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit lactic làm tăng sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, là chất tiệt trùng được ứng dụng nhiều trong bảo quản, chế biến thực phẩm, trong y, dược và xử lý môi trường. Gần đây vi khuẩn lactic còn được đặc biệt quan tâm nghiên cứu về khả năng sinh bacterioxin là các chất diệt khuẩn thế hệ mới có phổ kháng khuẩn đa dạng, tính đặc hiệu tế bào đích cao, an toàn với người, vật nuôi, cây trồng và môi trường là giải pháp cho vấn đề kiểm soát các nguồn bệnh Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Mẫu thu thập: 50 mẫu nghiên cứu gồm phân ủ, thức ăn chăn nuôi, các phụ phẩm nông nghiệp và chất thải sinh hoạt, chất thải chăn nuôi, phụ phẩm chế biến thực phẩm và sản phẩm lên men truyền thống được thu thập trên địa bàn Hà Nội, Nghệ An, Đăklac. - Vi sinh vật gồm: VK lactic: Lactobacillus agilis JCM 1230,L. salivarius JCM 5804, L. plantarum JCM 1048 và JCM1149, Leuconostos mesenteroides, L. fermentum, Streptocccus spp do Phòng Công nghệ Vật liệu Sinh học- Viện CNSH cung cấp. Chủng VK gây thối nhũn khoai tây Erwinia carotovora KT03 do Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp. Chủng VK gây bệnh cho người và vật nuôi: E. coli PA2, E. coli NC, S. typhimurium, Shigella flexneri, Enterococcus faecalis, S. aureus ATCC 29213 do Phòng VK hiếm gặp- Viện Vệ sinh dịch tễ TW và Viện CNSH cung cấp. - Các hoá chất, thiết bị máy móc: Được sản xuất tại các nước Mỹ, Nhật Bản, Thụy Điển và Đức. 2.2. Phƣơng pháp - Các phương pháp nghiên cứu VSV học thông thường: Phương pháp nuôi cấy, lên men, xác định đăc điểm sinh hóa - Phân loại: Theo truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa) và bằng kỹ thuật sinh học phân tử (lập cây phả hệ dựa trên kết quả giải trình tự gien ADNr 16S. Xác định trình tự ADNr 16S của các chủng VK theo phương pháp của Sakiyama và cs năm 2009). - Các phương pháp xác định hoạt tính: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, điện di tricin SDS-PAGE, phương pháp Thener, Anson cải tiến, Micro-bertrand - Phân tích lý hoá và thí nghiệm đồng ruộng theo TCN, TCVN, xử lý số liệu theo thống kê sinh học. Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THỰC TRẠNG CHẤT THẢI TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ CHĂN NUÔI Số liệu khảo sát trung bình về sử dụng chất thải chăn nuôi dạng rắn tại 6 cơ sở chăn nuôi tập trung ở thành phố Hà Nội, tỉnh Nghệ An, Đắklắc cho thấy: Phần lớn (52%) chất thải chăn nuôi được bán cho các cơ sở thu mua, có 21% lượng chất thải được dùng để bón cho cây, 17% dùng làm thức ăn cho cá và 10% được thải ra hệ thống nước thải công cộng. Kết quả xác định nồng độ trung bình một số khí thải và vi sinh vật gây bệnh tại các điểm điều tra đều vượt ngưỡng cho phép (bảng 3.1.). Bảng 3.1. Môi trƣờng không khí tại các trang trại chăn nuôi Nơi đánh giá Chỉ tiêu đánh giá (số liệu trung bình 3 nơi đánh giá) Độ nhiễm khuẩn không khí (CFU/m3) Nồng độ H2S (mg/m 3 ) Nồng độ NH3 (mg/m 3 ) 1. Khu tập kết chất thải nuôi lợn 5,8 ± 0,45 x 106 0,36 ± 0,05 (4,5 a ) 3,12 ± 0,06 (15,6 b ) 2. Khu tập kết chất thải nuôi gà 7,2 ± 0,38 x 106 0,32 ± 0,04 (4a) 2,94 ± 0,08 (14,7 b ) Giới hạn tối đa 106 0,08 * 0,2 ** (*): Theo TCVN 5937/95; (**): Theo TCVN 5938/95; a,b: số lần tăng so với giới hạn cho phép Nồng độ H2S tại các trang trại chăn nuôi gà và lợn cao gấp 4- 4,5 lần so với giới hạn. Nồng độ NH3 ở trang trại nuôi lợn và gà cũng đều cao hơn mức giới hạn 15 lần. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn kết quả điều tra trong báo cáo của Cục Chăn nuôi, trong đó nồng độ H2S trong chuồng nuôi gà cao gấp 83,4 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi lợn gấp 64,4 lần; Nồng độ NH3 trong chuồng nuôi gà cao gấp 30,6 lần so với giới hạn và trong chuồng nuôi lợn gấp 24,15 lần. Sở dĩ có sự sai khác là do khác nhau về thời điểm nghiên cứu, mô hình chăn nuôi và địa điểm lấy mẫu trong chuồng nuôi và ngoài khu vực tập kết chất thải. Bảng 3.2. Mật độ vi sinh vật gây bệnh và ký sinh trùng trong chất thải chăn nuôi Chất thải chăn nuôi Mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/g) Trứng giun/g VKTS * E. coli Salmonella sp 1. Chất thải nuôi lợn 6,58±0,6 x 106 2,20±0,5x 105 1,2±0,2x 103 105± 4,8 2. Chất thải nuôi gà 7,10 ±0,4x 107 8,06±0,3x 105 2,4±0,1x 103 120± 3,5 Mức cho phép 104 (-)** (*): VK tổng số ); (-)**: Không được có trong 25 g mẫu Theo qui định thì chất thải chăn nuôi sử dụng cho nông nghiệp không chứa Salmonella trong 25 g mẫu tuy nhiên kết quả phân tích đều cho thấy các mẫu chất thải chăn nuôi lợn và gà đều chứa Salmonella sp với nồng độ 103 CFU/g và E. coli cao hơn 20- 80 lần giới hạn cho phép. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cục Chăn nuôi và Viện Chăn nuôi. 3.2. NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI 3.2.1. Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật Từ 28 mẫu phân ủ; thức ăn và chất thải chăn nuôi; phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm đã phân lập được 17 chủng VSV có khả năng phân giải xenluloza, 12 chủng phân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein. Trong đó, sàng lọc được 15 chủng sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đa hoạt tính chúng tôi tuyển chọn được chủng xạ khuẩn ký hiệu XK112 có khả năng phân giải xenluloza cao nhất (kích thước VPG đạt 34mm); chủng VK B20 có hoạt tính phân giải tinh bột mạnh nhất (kích thước VPG đạt 38mm); chủng VK B15 có hoạt tính phân giải protein mạnh nhất (kích thước VPG đạt 30 mm). Từ 22 mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội đã phân lập được 7 chủng VK lactic, lựa chọn chủng LH19 sinh bacterioxin và ức chế chủng VK gây thối Erwinia carotovora KT03. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế chéo trên môi trường thạch cho thấy 4 chủng LH19, XK112, B20 và B15 không ức chế nhau, 4 chủng VSV trên được tuyển chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.7. Hoạt tính sinh học của 4 chủng vi sinh vật tuyển chọn Kí hiệu chủng Kích thước vòng phân giải (D-d) mm Hàm lượng axit lactic (mg/ml) Kháng E. carotovora KT03 (D-d, mm) Xenluloza Tinh bột Protein XK112 34 20 - - - B20 26 38 - - - B15 - 21 30 - - LH19 27,9 22 Hình 3.2. Hoạt tính phân giải xenluloza của chủng XK112 Hình 3.3. Hoạt tính phân giải tinh bột của chủng B20 Hình 3.4. Hoạt tính phân giải protein của chủng B15 Hình 3.5. Hoạt tính kháng E. carotovora KT03 của chủng LH15 3.2.2. Định tên và xác định độ an toàn sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn 3.2.2.1. Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống Chủng XK112: Sau 48- 72 giờ nuôi cấy trên môi trường Gauze ở 35- 370C, khuẩn lạc chủng XK112 có hình tròn, bề mặt khô, nhăn, đường kính 2- 2,5 mm, màu trắng xám, chân khuẩn lạc bám sâu vào môi trường thạch. Chuỗi bào tử dạng thẳng, mỗi chuỗi có từ 15 đến 35 bào tử. Hình 3.6. Hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của chủng XK112 Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc của chủng XK112 Chủng B20: Chủng VK B20 thuộc Gram (+), kỵ khí không bắt buộc. Nuôi cấy trên môi trường King B ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ khuẩn lạc khô, màu nâu nhạt, mép có thùy, có đường kính 0,5-1 mm. Tế bào chủng B20 hình que, ngắn, kích thước 5,2 x 0,8 m. Bào tử hình ovan Hình 3.7. Hình dạng tế bào của chủng B20 Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng XK112 Chủng B15: Chủng VK B15 thuộc Gram (+), hiếu khí. Trên môi trường KingB ở 300C, sau 48 giờ, khuẩn lạc khô, lan trên bề mặt thạch, màu vàng nhạt, lồi ở tâm, mép xẻ thùy, có đường kính 0,7-1 mm. Tế bào hình que nhỏ, đứng riêng rẽ kích thước 444 nm x 2,02 m. Tạo bào tử hình bầu dục. Hình 3.8. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng B15 Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng B15 Chủng LH19: Trên môi trường thạch đĩa MRS ở 32-350C, sau 48 giờ, khuẩn lạc nhỏ, tròn lồi màu trắng sữa, bề mặt mịn, mùi chua thơm, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch MRS có bổ sung 0,5% CaCO3. Chủng LH19 không di động, không sinh bào tử, bắt màu Gram (+), thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, kích thước 514 nm  2,44 m. Hình 3.9. Hình dạng, kích thước tế bào của chủng LH19 Hình 3.13. Hình thái khuẩn lạc của chủng LH19 Cả 4 chủng đều có khả năng đồng hóa đa dạng với các nguồn hydratcacbon, trong đó có chủng vừa có khả năng phân giải CMC hoặc tinh bột vừa có khả năng thuỷ phân gelatin, cazein. Đặc tính này thuận lợi cho việc lựa chọn môi trường nhân sinh khối sản xuất đồng thời phù hợp với mục đích sử dụng VSV để xử lý chất thải chăn nuôi giàu các hợp chất hydratcacbon và protein. Căn cứ vào tất cả các kết quả về đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hoá của 4 chủng VSV, dựa vào khoá phân loại của Bergey, có thể sơ bộ khẳng định chủng XK112 thuộc chi Streptomyces, có đặc điểm tương tự như loài S. griceosporeus; chủng B20 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm tương tự như loài B. licheniformis; chủng B15 thuộc chi Bacillus, có đặc điểm tương tự như loài B. subtilis; chủng LH19 thuộc chi Lactobacillus, có đặc điểm tương tự như loài L. plantarum. 3.2.2.2. Định tên vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử Kết quả giải trình tự gien cho thấy: Chủng XK112 có trình tự gien ARNr 16S tương đồng tới 99,7% (1245/1250 bp) so với trình tự của chủng XK S. griseosporeus có ký hiệu AB184419. Chủng B20 có trình tự gen ARNr 16S tương đồng 99,9 % (1429/1430 bp) với trình tự gien của chủng B. licheniformis_X68416. Trình tự gien ARNr 16S của chủng B15 tương đồng 99,9% (1449/1451 bp) với đoạn 16S của Bacillus subtilis. Chủng LH19 có trình tự ARNr 16S tương đồng 99,9% với các loài của nhóm Lactobacillus plantarum, nằm cùng vị trí với Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum.  Căn cứ vào kết quả định danh theo phương pháp truyền thống và bằng kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định chủng XK112 là Streptomyces griseosporeus, chủng B20 là Bacillus licheniformis, chủng B15 là Bacillus subtilis, chủng LH19 là Lactobacillus plantarum.  Cả 4 chủng VSV nghiên cứu đều thuộc nhóm 1, đảm bảo độ an toàn sinh học đối với người, vật nuôi, cây trồng và môi trường, được phép sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. 3.2.3. Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng phân giải chất hữu cơ của các VSV 3.2.3.1. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng XK112 * Ảnh hưởng của nhiệt độ Chủng XK112 được nuôi cấy trong môi trường Gauze, sau 72 giờ ở các điều kiện nhiệt độ từ 25 đến 650C, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất xenluloza trên thạch đĩa. Bảng 3.10. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của XK112 Nhiệt độ nuôi ( 0 C) Mật độ tế bào (x 10 6 CFU/ml) Kích thước VPG (D-d, mm) Hoạt tính tương đối (%) CMC Bột giấy 25 0,53 10 +/- 29,5 30 180 18 11 52,8 35 5400 31 15 91,2 40 6200 34 16 100 45 5600 32 16 94,1 50 3600 31 15 92,2 55 440 31 14 92,0 60 22 19 11 56,0 65 0,26 +/- +/- 26,0 Chú thích: (+/-) Vòng phân giải mờ, kích thước VPG<10 mm Chủng XK112 có khả năng thích nghi ở dải nhiệt độ tương đối rộng (25- 600C), nhiệt độ thích hợp là 35- 550C, trong đó sinh trưởng và hoạt tính xenlulaza cao nhất ở nhiệt độ 400C. Khoảng nhiệt độ này hoàn toàn phù hợp với sự biến động nhiệt độ trong quá trình ủ, đặc biệt là từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 15, khi nhiệt độ đống ủ tăng cao phù hợp cho VSV ưa nhiệt phát triển và phân giải xenluloza * Ảnh hưởng của pH Nuôi cấy chủng XK112 ở 370C trong môi trường Gauze với các pH khác nhau từ 4,0 đến 9,0. Sau 72h nuôi cấy, xác định mật độ tế bào và kích thước vòng phân giải cơ chất xenluloza. Bảng 3.11. Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng và khả năng phân giải xenluloza của chủng XK112 pH ban đầu pH cuối Mật độ tế bào (x 10 6 CFU/ ml) Kích thước VPG (D-d, mm) Hoạt tính tương đối (%) CMC Bột giấy 4 5,0 0,18 20 11 58,0 5 5,4 6,4 22 12 64,3 6 6,8 320 26 14 76,5 7 7,3 5600 34 16 100 8 7,6 2800 29 15 85,3 9 8,2 3,4 24 14 70,0 pH thích hợp cho chủng XK112 sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza là pH6- 8, trong đó pH7 là tối thích. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả Trần Đình Toại, tăng Thị chính cho rằng pH ban đầu thích hợp nhất cho sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza của xạ khuẩn là pH 7- 7,5. Chất thải chăn nuôi thường có pH ban đầu trong khoảng 5- 8 và đạt mức trung tính sau khi xử lý cơ chất, do đó chủng XK112 phù hợp cho sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi. Chủng XK112 có khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzym xenlulaza trong phạm vi nhiệt độ 25- 600C, pH 4,0- 9,0. Nhiệt độ thích hợp là 35- 550C, pH 6,0- 8,0, điều kiện này là phù hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn. 3.2.3.2. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải tinh bột của chủng B20 * Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chủng B20 được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau 30, 37, 40, 50, 550C. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza trên môi trường thạch đĩa chứa tinh bột tan, nhuộm màu với thuốc thử Lugon. Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20 Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp amylaza trong dải nhiệt độ 30-550C nhưng thích hợp ở 30- 500C, sinh khối và hoạt tính đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 370C. Khoảng nhiệt độ này là phù hợp với giai đoạn 15 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi đó quá trình phân giải tinh bột trong khối ủ sẽ diễn ra mạnh nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ashger và cs, Nadia riaz và cs cho rằng nhiệt độ tối ưu cho khả năng tổng hợp amylaza của Bacillus subtilis là 400C. Ngô Xuân Mạnh và cs đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu nuôi cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 420C, cao hơn nhiệt độ tối ưu của chủng B20. * Ảnh hưởng của pH Chủng B20 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường dịch thể với các pH khác nhau gồm: 4,0, 5,0 , 6, 6,5, 7,0, 7,5 và 9,0. Sau 48h xác định mật độ tế bào và hoạt tính amylaza của dịch nuôi. Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và khả năng phân giải tinh bột của chủng B20 Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp enzym phân giải tinh bột thích hợp ở pH 6,0- 8,0. Khoảng pH này hoàn toàn thích hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả khác (Đỗ Bích Thuỷ và cs xác định pH thích hợp cho chủng B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-7,5 với pH tối ưu là 7; Ashger và cs chọn pH nuôi cấy tối ưu để chủng B. subtilis JS2004 tổng hợp amylaza là pH7; Nadia riaz và cs kết luận pH thích hợp để B. subtilis tổng hợp -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5. Ngô Xuân Mạnh và cs lựa chọn được khoảng pH thích hợp nuôi cấy chủng B. licheniformis BCRP để thu nhận enzym -amylaza là 6-8 với pH tối ưu là 7,5). * Ảnh hưởng của ion kim loại Nuôi cấy chủng B20 trong môi trường và điều kiện thích hợp, ly tâm thu dịch enzym, bổ sung CaCl2 với các nồng độ 2và 4 mM, xử lý nhiệt ở 85 oC trong 15 và 30 phút. Xác định ảnh hưởng của Ca2+ trong môi trường tới hoạt tính amylaza của chủng B20. Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của ion Ca2+ đến độ bền nhiệt của amylaza do chủng B20 tổng hợp Nồng độ Ca2+ (mM) Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính tương đối (%) 0 15 21,2 30 4,5 2 15 92,2 30 29,5 4 15 40,3 Nồng độ Ca2+ (mM) Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính tương đối (%) 30 20,5 Nồng độ Ca2+ thích hợp là 2 mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. Kết quả thử nghiệm này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố cho rằng Ca2+ làm ổn định hoá cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao (Nguyễn Thị Hoài Hà; Kwak và Akiba). Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym amylaza của chủng B20 hoạt động trong dải nhiệt độ 30-550C; pH 4,0-8,0, điều kiện thích hợp là 37- 500C, pH 6,0- 8,0. Sự có mặt của ion Ca 2+ làm tăng hoạt tính và độ bền nhiệt của amylaza. 3.2.3.3. Ảnh hƣởng đến khả năng phân giải protein của chủng B15 * Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 25 đến 550C. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ enzym proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.20 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng B15 Chủng B15 có khoảng nhiệt độ thích hợp tương đối rộng (30-500C), nhiệt độ 35-450C là thích hợp nhất (OD>0,2 và PA>0,8HP/ml). Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của B15 là ở 35 0C (OD 2,8) còn PA đạt mức cao nhất ở 400C (1,02 HP mg/l). Nhiệt độ này hoàn toàn phù hợp với giai đoạn 2-10 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Sản phẩm của quá trình phân giải protein tạo các axit amin là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho các VSV trong quá trình chuyển hoá tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác (Kim J. M và cs xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là 400C. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 350C). * Ảnh hưởng của pH Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện pH khác nhau trong khoảng từ 5 đến 9. Xác định khả năng sinh trưởng (OD) và hoạt độ enzym proteaza trong dịch nuôi cấy (PA), kết quả thể hiện trên hình 3.21 Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và khả năng phân giải protein của chủng B15 Hình 3.21 cho thấy: Sinh khối đạt mức cao nhất ở pH 7,0 (OD 2,6), pH tối ưu cho tổng hợp proteaza là 7,5 (đạt 0,98 HP/ml). Khoảng pH thích hợp cho chủng B15 sinh trưởng và tổng hợp enzym proteaza là 6,0-8,0 hoàn toàn phù hợp với quá trình xử lý chất thải chăn nuôi. Trong một số nghiên cứu khác, tác giả Kim J. M và cs xác định pH nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn B. subtilis tổng hợp proteaza là từ 5 đến 6, pH tối ưu là 7. Nghiên cứu của Đỗ Bích Thuỷ và cs lại cho thấy chủng B. subtilis có hoạt tính proteaza cao nhất khi nuôi ở pH 8. * Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại được sử dụng là: Ca2+, Ba2+, Mg2+, Cu2+, Fe 2+ , Zn 2+, với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng bằng 10-3 M. Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính proteaza của chủng B15 Ion Mật độ quang (OD) Hoạt độ tương đối (%) Lần 1 Lần 2 Giá trị TB Ca 2+ 0,622 0,675 0,649 95,018 Ba 2+ 0,683 0,702 0,693 101,47 Mg 2+ 0,682 0,704 0,693 101,54 Cu 2+ 0,334 0,311 0,323 47,253 Fe 2+ 0,629 0,647 0,638 93,48 Zn 2+ 0,294 0,382 0,338 49,524 ĐC 0,664 0,701 0,683 100,00 Số liệu bảng 3.13 cho thấy proteaza của chủng B15 khá ổn định với sự có mặt của ion Ca 2+ ; bị giảm hoạt tính mạnh bởi Cu2+, Zn2+; ngược lại ion Ba2+, Mg2+ lại làm tăng hoạt độ enzym. Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy enzym proteaza của chủng B20 hoạt động trong khoảng nhiệt độ 30-550C, pH 6,0- 9,0. Điều kiện thích hợp của enzym là 35- 500C, pH 6,0- 8,0. Hoạt tính enzym tăng hoặc tương đối ổn định với sự có mặt của các ion Ca2+, Ba2+ và Mg 2+ 3.2.4. Hoạt tính đối kháng của chủng LH19 3.2.4.1. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh, gây thối rữa * Đối kháng vi khuẩn gây bệnh Các chủng VK được nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trường dịch thể ở điều kiện thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp VK lactic với từng chủng VK kiểm định. Xác định khả năng tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định. Bảng 3.14. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và vật nuôi của chủng LH19 Chủng kiểm định Mật độ ban đầu (CFU/ml) Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời gian (CFU/ml) 6h 24h 48h 72h E. coli 4,8 x 10 6 6,3 x 10 4 1,8 x 10 4 1,4 x 10 4 - Salmonella 3,5 x 10 6 2,7 x 10 4 1,5 x 10 4 1,0 x 10 4 - Shigella 3,8 x 10 6 7,0 x 10 3 - - - S. aureus 3,6 x 10 6 6,2 x 10 3 - - - (-): Không xác định được ở nồng độ pha loãng 10-1 Kết quả cho thấy chủng LH19 đối kháng được cả 4 chủng VK gây bệnh thử nghiệm, thời gian ức chế nhanh (sau 6h tiếp xúc, nồng độ tế bào các VK gây bệnh đều giảm mạnh, Shigella, Staphylococcus giảm từ 106 xuống 103 CFU/ml; E. coli và Salmonella giảm từ 106 xuống 104 CFU/ml). Khả năng kháng khuẩn nhanh, mạnh nhất với Shigella, Staphylococcus aureus (ở 24h tiếp xúc), kháng E. coli và Salmonella ở 72h tiếp xúc trực tiếp. * Đối kháng vi khuẩn gây thối rữa Chủng VK lactic LH19 và VK gây thối E. carotovora KT03 được nuôi cấy riêng rẽ sau 48h trong môi trường dịch thể đặc hiệu và điều kiện sinh trưởng phù hợp với mỗi chủng. Cho tiếp xúc dịch thể ở nồng độ 106 và 108 CFU/ml. Xác định mật độ tế bào của mỗi chủng trong hỗn hợp. Bảng 3.15. Khả năng đối kháng E. carotovora KT03 của chủng LH19 Nồng độ tiếp xúc Chủng vi khuẩn Mật độ ban đầu (CFU/ml) Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LH19 theo thời gian (CFU/ml) 24h 48h 72h 10 8 E.carotovora KT03 1,6 x 10 8 3,6 x 10 4 - - LH19 1,4 x 10 8 2,2 x 10 8 4,6 x 10 8 3,08 x 10 8 10 6 E.carotovora KT03 3,2 x 10 6 1,06 x 10 4 - - LH19 3,0 x 10 6 6,8 x 10 6 1,52 x 10 7 1,4 x 10 7 (-): Không tìm thấy khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng 10-1 Kết quả thử nghiệm cho thấy, chủng LH19 đối kháng mạnh với VK gây thối rữa thực vật, sau 24h tiếp xúc mật độ tế bào chủng E. carotovora KT03 đã giảm mạnh từ 108 hoặc 106 xuống 104, sau 48h không xác định được VK E. carotovora KT03 trong hỗn hợp. Kết quả tại các bảng 3.14 và 3.15 cho thấy chủng LH19 có hoạt tính kháng khuẩn nhanh (sau 6-48 giờ) nên giai đoạn đầu khi nhiệt độ tăng ở mức phù