Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterrium Tumefaciens

Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterrium Tumefaciens: ... Ebook Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterrium Tumefaciens

pdf186 trang | Chia sẻ: huyen82 | Ngày: 09/12/2013 | Lượt xem: 607 | Lượt tải: 7download
Tóm tắt tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterrium Tumefaciens, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Bé GI¸O DôC Vµ §µO T¹O TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI Bïi ThÞ Lan H−¬ng Nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng bÖnh nÊm vµo mét sè gièng cµ chua th«ng qua vi khuÈn agrobacterium tumefaciens LUËN ¸N TIÕN SÜ N¤NG NGHIÖP Chuyªn ngµnh: Di truyÒn vµ chän gièng c©y trång M· sè : 62 62 05 01 Ng−êi h−íng dÉn: PGS. TS. Lª ThÞ ¸nh Hång PGS.TS. NguyÔn Hång Minh Hµ NéI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... i Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... i Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan r»ng sè liÖu vµ kÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn ¸n nµy lµ trung thùc vµ ch−a ®−îc sö dông ®Ó b¶o vÖ mét häc vÞ nµo. T«i xin cam ®oan r»ng mäi sù gióp ®ì cho viÖc thùc hiÖn luËn ¸n nµy ®0 ®−îc c¶m ¬n vµ c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn ¸n ®Òu ®0 ®−îc chØ râ nguån gèc. T¸c gi¶ Bïi ThÞ Lan H−¬ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ii Lêi c¶m ¬n T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c ®Õn PGS.TS. NguyÔn Hång Minh - Tr−ëng Bé m«n Di truyÒn Chän gièng c©y trång- Tr−êng §¹i häc N«ng NghiÖp Hµ Néi vµ PGS.TS. Lª ThÞ ¸nh Hång - Nguyªn lµ Phã ViÖn Tr−ëng ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp lµ nh÷ng ng−êi thÇy ®0 tËn t×nh gióp ®ì, h−íng dÉn, t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi vµ chia sÎ nh÷ng khã kh¨n cïng t«i trong suèt 5 n¨m liÒn thùc hiÖn vµ hoµn thµnh luËn ¸n nµy. T«i còng xin bµy tá lßng lêi c¸m ¬n ch©n thµnh ®Õn GS.TS. TrÇn Tó Ngµ ng−êi ®0 hÕt lßng gióp ®ì chØ b¶o t«i nh÷ng kiÕn thøc vÒ di truyÒn häc, nh÷ng tµi liÖu tham kh¶o chuyªn m«n quý gi¸ vµ còng lu«n ®éng viªn t«i trong suèt qu¸ tr×nh nghiªn cøu vµ hoµn thµnh luËn ¸n. Trong thêi gian qua, t«i ®0 nhËn ®−îc sù gióp ®ì quý b¸u cña Ban l0nh ®¹o ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, c¸c c¸n bé, c¸c b¹n bÌ ®ång nghiÖp trong Phßng BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt vµ Bé m«n Di truyÒn vµ C«ng nghÖ Lóa lai - ViÖn Di TruyÒn N«ng NghiÖp, ban l0nh ®¹o ViÖn M«i Tr−êng N«ng NghiÖp, Bé m«n M«i Tr−êng N«ng Th«n. Nh©n dÞp nµy t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n sù gióp ®ì quý b¸u ®ã. T«i xin c¶m ¬n c¸c thÇy c« gi¸o ViÖn §µo t¹o Sau ®¹i häc, Khoa N«ng häc vµ Bé m«n Di truyÒn vµ Chän gièng C©y trång - Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®0 t¹o ®iÒu kiÖn gióp t«i hoµn thµnh tèt mäi môc tiªu nghiªn cøu vµ mäi thñ tôc ®Ó cã thÓ hoµn thµnh luËn ¸n nµy. T«i rÊt biÕt ¬n nh÷ng ng−êi th©n trong gia ®×nh t«i ®0 lu«n bªn t«i quan t©m vµ t¹o ®iÒu kiÖn tèt cho t«i häc tËp vµ nghiªn cøu. Mét lÇn n÷a t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n sù gióp ®ì quý b¸u cña c¸c tËp thÓ vµ c¸ nh©n ®0 dµnh cho t«i. T¸c gi¶ Bïi ThÞ Lan H−¬ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iii Môc lôc Lêi cam ®oan i Lêi c¶m ¬n ii Môc lôc iii Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vii Danh môc b¶ng ix Danh môc h×nh xi Më ®Çu 1 1 TÝnh cÊp thiÕt cña ®Ò tµi 1 2 Môc tiªu cña ®Ò tµi 2 3 ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña luËn ¸n 2 4 Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n 3 5 §èi t−îng vµ ph¹m vi nghiªn cøu 3 Ch−¬ng 1 Tæng quan tµi liÖu 4 1.1 C¬ së khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi 5 1.2 Nguån gèc, ph©n lo¹i vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng c©y cµ chua 6 1.2.1 Nguån gèc c©y cµ chua 6 1.2.2 Ph©n lo¹i c©y cµ chua 7 1.2.3 Gi¸ trÞ cña cµ chua 8 1.3 Sù ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua 9 1.3.1 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua trªn thÕ giíi 9 1.3.2 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua ë ViÖt Nam 10 1.4 Mét sè nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua 11 1.4.1 Nh÷ng nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua theo c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng 11 1.4.2 Nghiªn cøu chän gièng b»ng ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen 15 1.5 ChiÕn l−îc phßng chèng bÖnh nÊm 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iv Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iv 1.6 ChuyÓn n¹p gen ë thùc vËt 29 1.6.1 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn n¹p gen ë thùc vËt 29 1.6.2 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen ë thùc vËt 29 1.7 Kü thuËt nu«i cÊy in vitro øng dông trong c«ng nghÖ chuyÓn gen 33 1.7.1 øng dông nu«i cÊy in vitro trong x©y dùng c¸c hÖ thèng t¸i sinh m¹nh phôc vô cho thao t¸c gen 33 1.7.2 øng dông c«ng nghÖ in vitro trong viÖc nh©n nhanh gièng c©y trång mang gen chuyÓn vµ l−u gi÷ c¸c nguån gen quý hiÕm 35 1.8 Mét sè thµnh tùu vÒ thu nhËn c©y trång chuyÓn gen vµ kh¶ n¨ng øng dông 36 1.8.1 Mét sè thµnh tùu vÒ c©y trång chuyÓn gen 36 1.8.2 M«i tr−êng ph¸p lý ®èi víi c©y trång chuyÓn gen 37 Ch−¬ng 2 VËt liÖu, néi dung vµ ph−¬ng ph¸p 40 2.1 VËt liÖu nghiªn cøu 40 2.2 Néi dung nghiªn cøu 41 2.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 44 2.4 Ph−¬ng ph¸p xö lý sè liÖu 50 Ch−¬ng 3 KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 51 3.1 Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu quy tr×nh t¸i sinh c©y cµ chua phôc vô cho c«ng t¸c chuyÓn gen 51 3.1.1 øng dông kü thuËt DAS-ELISA ®Ó kiÓm tra t×nh h×nh søc khoÎ h¹t cµ chua tr−íc khi ®−a vµo nu«i cÊy In vitro 51 3.1.2 Nghiªn cøu quy tr×nh t¸ i sinh c©y cµ chua phôc vô cho c«ng t¸c chuyÓn gen 53 3.2 Nh÷ng kÕt qu¶ ban ®Çu vÒ chuyÓn gen kh¸ng nÊm Glucanase vµo 3 gièng (dßng) cµ chua 84 3.2.1 Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña hai gièng cµ chua Balan, H18 vµ dßng d¹i L. pennelli trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 84 3.2.2 TiÒn biÕn n¹p 86 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... v Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... v 3.2.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen kh¸ng nÊm Glucanase 86 3.2.4 Nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c mÉu cÊy trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 87 3.2.5 §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ biÕn n¹p 95 3.2.6 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña c¸c gen chuyÓn 98 3.3 KÕt qu¶ chuyÓn gen defensin vµo cµ chua 103 3.3.1 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y in vitro cña hai gièng cµ chua H18 vµ L. pennelli trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 104 3.3.2 TiÒn nu«i cÊy vµ biÕn n¹p 104 3.3.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen Defensin 105 3.3.4 C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c mÉu cÊy trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 106 3.3.5 §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ biÕn n¹p 112 3.3.6 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña c¸c gen chuyÓn 114 3.4 KÕt qu¶ chuyÓn gen Chitinase vµo cµ chua p375 vµ Ph¸p lïn 118 3.4.1 Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña hai gièng cµ chua P375 vµ Ph¸p lïn trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 118 3.4.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen Chitinase 119 3.4.3 C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c gièng sau khi biÕn n¹p gen Chitinase 120 3.4.4 HiÖu qu¶ biÕn n¹p Chitinase vµo cà chua P375 vµ Ph¸p lïn 125 3.4.5 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña gen chuyÓn 127 KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 129 KÕt luËn 129 §Ò nghÞ 130 C¸c c«ng tr×nh ®· c«ng bè cã liªn quan ®Õn luËn ¸n 131 Tµi liÖu tham kh¶o 132 Phô lôc 143 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vii Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t Ch÷ viÕt t¾t Ch÷ viÕt ®Çy ®ñ ABA Abcisic acid BA Benzyladenine BAP 6-benzyl aminopurine BD§ BÊt dôc ®ùc BHPTTV BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt bp Base pair (cÆp nucleotide) CAMBIA Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture CaMV Cauliflower Mosaic Virus CchCG Cµ chua chuyÓn gen Cd Kim lo¹i nÆng Cadmi Chi 11 Chitinase (gen) CP Coat Protein CPMV Virus kh¶m ®Ëu m¾t cua (Cowpea mosaic virus) DAS Double Antibody SADNwich DCCh Dßng cµ chua DCChCG Dßng cµ chua chuyÓn gen ELISA Enzym linked Immuno Sorbent Assay EtBt Ethidium bromide GA3 Gilberic Acid FEC M« sÑo ph«i xèp HCN Acid Cyanhydric HNL Hydroxynitrile lyase IAA Indolleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IgG kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu kb Kilobase (s) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... viii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... viii kDa KiloDalton (S) INT-violet Iodonitrotetrazolium violet Ki Kinetin KLN Kim lo¹i nÆng LMV Lecttus mosaic virus MTF Metalloth ioneins MS Murashige ADN Skoog NAA Naphthalenacetic Acid NADP Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PCR Polymerase Chain Reaction PNPP ParanitrophÐnyl phosphate PPO Polyphenol oxidase PVDF PolyVinylidene Dilfluoride PVX Potato Virus X PVY Potato Virus Y Sd §é lÖch chuÈn SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophores TBC TÕ bµo chÊt ToMV Tomato Mosaic Virus TMV Tobacco Mosaic virus vir Virulence (gen) v/v Thể tích / thể tích Z Zeatin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ix Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ix Danh môc b¶ng STT Tªn b¶ng Trang 3.1 KÕt qu¶ kiÓm tra virus ToMV vµ TMV b»ng kü thuËt DAS- ELISA 52 3.2 HiÖu qu¶ cña thêi gian xö lý lªn tû lÖ sèng sãt cña h¹t cµ chua 54 3.3 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Kinetin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 57 3.4 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Zeatin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 59 3.5 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña BA víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 62 3.6 ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é Kinetin lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 65 3.7 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é BA lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 67 3.8 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é Zeatin lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 69 3.9 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Kinetin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi. 72 3.10 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp kh¸c nhau cña BA víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi 74 3.11 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Zeatin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi. 77 3.12 ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp kh¸c nhau cña NAA kÕt hîp víi mét sè Cytokinin (Kinetin, Zeatin vµ BA) lªn qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh 80 3.13 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng IAA kÕt hîp víi mét sè Cytokinin (Kinetin, Zeatin vµ BA) lªn qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... x Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... x 3.14 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña Balan, H18, vµ dßng L. pennelli (tr−íc khi biÕn n¹p gen) 85 3.15 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian xö lý kh¸c nhau ở cà chua Balan, H18 vµ dßng L. pennelli. 95 3.16 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña gièng H18 vµ dßng L. pennelli 104 3.17 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian xö lý kh¸c nhau ë cà chua H18 vµ dßng L. pennelli 112 3.18 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña c¸c gièng cµ chua thÝ nghiÖm (L. esculentum Mill) 118 3.19 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian ®ång nu«i cÊy kh¸c nhau ë cà chua P375 vµ Ph¸p lïn 125 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xi Danh môc h×nh STT Tªn h×nh Trang 2.1 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Glucanase 42 2.2 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Defensin 43 2.3 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Chitinase 44 3.1 Cµ chua ph¸t triÓn trong MT dinh d−ìng in vitro 54 3.2 C¸c mÉu ®−a vµo nu«i cÊy in vitro 60 3.3 C¸c callus ®−îc ph¸t triÓn tõ mÐp c¾t mÉu cÊy 60 3.4 Callus kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi 60 3.5 H×nh ¶nh Callus cña tæ hîp víi Kinetin 60 3.6 Mét sè Callus cña tæ hîp víi Zeatin 60 3.7 H×nh ¶nh Callus cña cña tæ hîp víi BA 61 3.8 ¶nh chåi ë giai ®o¹n cßn non d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö (bar: 1 mm) 70 3.9 Chåi ph¸t triÓn trªn 70 3.10 Chåi hoµn chØnh ph¸t triÓn trùc tiÕp thµnh c©y con ë tæ hîp víi BA 70 3.11 Chåi ph¸t triÓn trùc tiÕp thµnh c©y con ë tæ hîp víi Zeatin 70 3.12 HÖ sè nh©n/mÉu cña cµ chua víi tæ hîp Kinetin (gièng P375) 73 3.13 HÖ sè nh©n/mÉu gièng (P375) víi tæ hîp BA (Benzyladenin) 76 3.14 HÖ sè nh©n chåi /mÉu víi tæ hîp cña Zeatin (gièng P375) 78 3.15 Chåi vµ hÖ sè nh©n chåi trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962)+(2K +1IAA) 78 3.16 Chåi vµ hÖ sè nh©n chåi (L. pennelli) trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962)+ 2 Z +0,1 IAA. 78 3.17 HÖ sè nh©n trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962) + 0,5BA+0,5IAA 78 3.18 C©y cµ chua hoµn chØnh in vitro trªn m«i tr−êng t¹o c©y hoµn chØnh MS (1962 + 2K +1 IAA) 78 3.19 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi 91 3.20 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy lªn tû lÖ t¸i sinh 92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xii 3.21 MÉu trô l¸ mÇm (tr¸i) vµ l¸ mÇm (ph¶i) ®ång nu«i cÊy trong dung dÞch vikhuÈn 93 3.22 C¸c callus tõ l¸ mÇm vµ trô l¸ mÇm cµ chua trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (sau khi ®−îc chuyÓn gen) 93 3.23 Callus cña gièng Balan trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 94 3.24 C¸c chåi cña gièng Balan ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 94 3.25 Callus cña gièng H18 trªn MT t¸i sinh (cã chøa kh¸ng sinh) 94 3.26 Chåi cña gièng H18 ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh) 94 3.27 Callus dßng L. pennelli trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 94 3.28 C¸c phÇn l¸ cña dßng L. pennelli t¸i sinh trªn m«i tr−êng ph¸t triÓn cã chøa kh¸ng sinh 94 3.29 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p 96 3.30 C¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen cña gièng Ba lan 97 3.31 C©y cµ chua (CGBL8) ®−îc ®−a ra chËu theo dâi trong nhµ kÝnh 97 3.32 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen hpt trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen b»ng kü thuËt PCR. 98 3.33 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen Glucanase trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen kh¸ng nÊm b»ng kü thuËt PCR 99 3.34 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen Osmotin (AP) trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen b»ng kü thuËt PCR 100 3.35 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh 109 3.36 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy cÊy lªn Tû lÖ t¸i sinh mÉu 110 3.37 MÉu trô l¸ mÇm (tr¸i) vµ l¸ mÇm (ph¶i) ®ång nu«i cÊy víi vi khuÈn 111 3.38 C¸c callus dßng L. pennelli trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh. HiÖn t−îng b¹ch t¹ng cña m« 111 3.39 C¸c chåi kh«ng hoµn chØnh cña dßng L. pennelli t¸i sinh trªn m«i tr−êng ph¸t triÓn cã chøa kh¸ng sinh 111 3.40 C¸c callus gièng H18 trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 111 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xiii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xiii 3.41 C¸c chåi ph¸t triÓn cña gièng H18 t¸i sinh trªn m«i tr−êng chän läc cã chøa kh¸ng sinh 111 3.42 C©y cµ chua (gièng H18)®0 ®−îc chuyÓn gen Defensin (gièng H18) trong m«i tr−ßng t¹o c©y hoµn chØnh cã chøa Kanamycin 113 3.43 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen nptII trong c¸c c©y cµ chua (H18) ®0 ®−îc chuyÓn gen 114 3.44 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra b»ng kü thuËt PCR sù cã mÆt cña gen Defensin trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen 115 3.45 C¸c trô l¸ mÇm (tr¸i) l¸ mÇm (ph¶i) ®−îc ®ång nu«i cÊy trong dung dÞch vi khuÈn 121 3.46 C¸c m« sÑo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (gièng P375) 121 3.47 C¸c chåi ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng nh©n chåi cã chøa kh¸ng sinh (gièng P375) 121 3.48 C¸c m« sÑo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (gièng Ph¸p lïn) 121 3.49 C¸c chåi ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng nh©n chåi cã chøa kh¸ng sinh (gièng Ph¸p lïn) 121 3.50 Sù kh¸c nhau vÒ tû lÖ t¸i sinh cña 2 gièng P375 vµ Ph¸p lïn tr−íc vµ sau khi biÕn n¹p 123 3.51 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p cña gièng P375 vµ Ph¸p lïn 124 3.52 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p 126 3.53 C©y cµ chua t¸i sinh (P375) sau khi biÕn n¹p gen chitinase trong m«i tr−êng t¹o c©y hoµn chØnh 127 3.54 KÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen chitinase trong c¸c c©y ®0 ®−îc biÕn n¹p gen 128 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 1 Më ®Çu 1 TÝnh cÊp thiÕt cña ®Ò tµi C©y cµ chua (Lycopersicon esculentum Mill) ®−îc nhËp néi vµo n−íc ta h¬n 100 n¨m tr−íc. HiÖn nay, b»ng con ®−êng nhËp néi gièng, chóng ta cßn thu thËp ®−îc mét tËp ®oµn gen kho¶ng 1000 mÉu gièng cµ chua kh¸c nhau, tËp trung ë c¸c ViÖn nghiªn cøu, c¸c tr−êng §¹i häc vµ c¸c tØnh... Víi ®iÒu kiÖn khÝ hËu ViÖt Nam, cµ chua lµ mét c©y rau chñ lùc cã diÖn tÝch trång ngµy cµng t¨ng. Cµ chua ®−îc trång ë hÇu hÕt c¸c tØnh thµnh trªn c¶ n−íc. ë n−íc ta, diÖn tÝch trång cµ chua hiÖn nay ®¹t kho¶ng 20.000 ha víi n¨ng suÊt hiÖn nay kho¶ng 30 tÊn/ ha (TrÇn Kh¾c Thi, 2005)[25]. Vµo nh÷ng n¨m 1980 diÖn tÝch trång cµ chua ®¹t 100.000 ha (Ng« ThÞ H¹nh, 2001)[4]. C©y cµ chua ®−îc trång vµo vô §«ng-Xu©n, Xu©n-HÌ, Thu-§«ng (tõ th¸ng 9 ®Õn th¸ng 4 ë miÒn B¾c vµ th¸ng 11 ®Õn th¸ng 4 n¨m sau ë miÒn Nam). Riªng t¹i L©m ®ång, cµ chua ®−îc trång quanh n¨m, do vô §«ng-Xu©n cã thêi tiÕt thÝch hîp mäi n¬i ®Òu trång ®−îc, ë ®©y n¨ng suÊt cµ chua cã thÓ ®¹t 40-60 tÊn/ha. Ng−îc l¹i vô Xu©n-HÌ, miÒn B¾c cã kho¶ng 6 -7 th¸ng (tõ th¸ng 4 ®Õn th¸ng 9) vµ miÒn Nam cã kho¶ng 7-8 th¸ng (tõ th¸ng 5 ®Õn th¸ng 12) lµ nh÷ng th¸ng rÊt khã trång, do ®iÒu kiÖn thêi tiÕt nãng Èm, m−a nhiÒu lµ nh÷ng ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nhiÒu lo¹i bÖnh ph¸t sinh g©y h¹i c¶ trong ®iÒu kiÖn v−ên −¬m vµ ngoµi ®ång ruéng nh−: Mèc s−¬ng (Phytophtora infestans), thèi Fusarium, thèi cæ rÔ vµ thèi rÔ do Rhizostonia solani vµ Pythium, bÖnh thèi Verticilium, Alternaria, bÖnh ®èm (Stemphylium solani vµ nhiÒu bÖnh nÊm h¹i kh¸c. Ngoµi ra chóng cßn bÞ nhiÒu lo¹i bÖnh vi khuÈn vµ virus g©y h¹i nghiªm träng nh−: Erwinia, Streptomyces, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensÝs, sepedonicus vµ PVY, ToLRV, PVX, PVM, TMV, ToMV, TSWV, CMV, ®Æc biÖt hai bÖnh virus TMV vµ ToMV lµ hai bÖnh lan truyÒn qua h¹t. C¸c lo¹i bÖnh h¹i nµy kh«ng chØ ¶nh h−ëng lªn n¨ng suÊt mµ cßn ¶nh h−ëng nghiªm träng lªn chÊt l−îng qu¶, gi¶m kh¶ n¨ng th−¬ng phÈm. V× thÕ, hµng n¨m nh÷ng ng−êi s¶n xuÊt cµ chua ®0 ph¶i sö dông mét l−îng thuèc b¶o vÖ thùc vËt (BVTV) rÊt lín, ®Ó b¶o vÖ n¨ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 2 suÊt vµ chÊt l−îng s¶n phÈm. ViÖc sö dông thuèc BVTV mét c¸ch thiÕu thËn träng, ®Æc biÖt lµ thuèc trõ nÊm h¹i ®0 g©y ra nhiÒu hËu qu¶ nghiªm träng, lµm « nhiÔm m«i tr−êng sèng g©y ¶nh h−ëng trùc tiÕp ®Õn søc khoÎ ng−êi s¶n xuÊt vµ ng−êi tiªu dïng, lµm huû diÖt c¸c sinh vËt cã Ých trong ®Êt, n−íc vµ lµm cho c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸ng thuèc, bÖnh h¹i tá ra hung h0n h¬n. Nh− vËy viÖc phßng trõ vµ qu¶n lý chóng khã kh¨n h¬n (TrÇn V¨n Lµi, 2005) [10] Nh÷ng gièng cµ chua cã kh¶ n¨ng kh¸ng ®−îc nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau sÏ gióp rÊt nhiÒu cho ngµnh s¶n xuÊt cµ chua nãi chung, ®©y lµ vÊn ®Ò cã ý nghÜa lín trong n«ng nghiÖp. V× vËy, chóng ®−îc sù quan t©m rÊt lín cña nhiÒu nhµ chän gièng cµ chua trªn thÕ giíi ®ång thêi còng cÇn cã sù tham gia ®ãng gãp tÝch cùc cña nhiÒu lÜnh vùc nghiªn cøu khoa häc. ChuyÓn gen lµ mét biÖn ph¸p bæ sung cho chän t¹o gièng truyÒn thèng, cã thÓ gióp cho viÖc më réng c¸c nguån gen cã lîi sang c¸c gièng kh¸c. C«ng nghÖ chuyÓn gen còng cung cÊp lîi thÕ trong viÖc chuyÓn mét gen ®¬n hoÆc thËm chÝ c¸c gen sè l−îng, tr¸nh ®−îc nh÷ng khã kh¨n mµ ph−¬ng ph¸p chän t¹o gièng truyÒn thèng ph¶i ®−¬ng ®Çu. Cho ®Õn nay, c¸c nhµ khoa häc ®0 chuyÓn thµnh c«ng mét sè gen vµo cµ chua nh»m t¹o ra nh÷ng gièng cµ chua cã n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng cao. C¸c vector ®0 ®−îc c¾t, söa ch÷a cã tiÒm n¨ng to lín tiÕp tôc bæ sung cho ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen qua Agrobacterium. (Frary vµ Earle, 1996)[58], ChÝnh v× vËy, chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng bÖnh nÊm vµo mét sè gièng cµ chua th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens” 2 Môc tiªu cña ®Ò tµi X¸c ®Þnh c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy, t¸i sinh c©y, thiÕt lËp hÖ thèng biÕn n¹p c¸c gen th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens nh»m thu nhËn c¸c c©y t¸i sinh mang c¸c gen chuyÓn ë mét sè gièng cµ chua. 3 ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña luËn ¸n 3.1. §0 x¸c ®Þnh ®−îc c¸c ®iÒu kiÖn vµ qui tr×nh t¸i sinh c©y cµ chua in vitro øng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 3 dông cho chuyÓn n¹p gen vµ c¸c môc tiªu nghiªn cøu kh¸c. 3.2. §0 gãp phÇn x¸c ®Þnh ®−îc hiÖu qu¶ sö dông 2 vector ®óp h÷u Ých (Vector mang gen Chitinas-Glucanas vµ vector mang gen Glucanase- Osmotin) trong chuyÓn n¹p gen vµo mét sè gièng cµ chua nghiªn cøu. 3.3. §©y lµ nh÷ng tµi liÖu cã hµm l−îng khoa häc tèt vÒ c«ng nghÖ nu«i cÊy in vitro, chuyÓn n¹p gen ë cµ chua. Chóng cã gi¸ trÞ tham kh¶o trong nghiªn cøu c«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp øng dông vµ trong c«ng t¸c gi¶ng d¹y ë c¸c tr−êng ®¹i häc. 4 Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n 1. LuËn ¸n ®0 x¸c ®Þnh ®−îc c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy nh»m thu nhËn c©y cµ chua t¸i sinh ®èi víi c¸c gièng P375, H18, Ba lan vµ gièng Ph¸p lïn, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c loµi cµ chua d¹i L. pennelli 2. LÇn ®Çu tiªn ë ViÖt nam ®0 thùc hiÖn thµnh c«ng c¸c quy tr×nh chuyÓn gen kh¸ng nÊm Chitinas-Glucanas vµ Glucanase-Osmotin th«ng qua vi khuÈn Agrobacterrium tumefaciens vµo mét sè dßng, gièng cµ chua nh− P375 vµ H18 ®Ó t¹o gièng kh¸ng nÊm. 3. §0 t¹o ®−îc mét sè dßng cµ chua mang gen kh¸ng nÊm nh− Defensin (gièng H18), Chitinase (gièng P375), Glucanase (gièng Balan). Sù cã mÆt cña gen chuyÓn ®0 ®−îc kiÓm tra b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh (sinh häc) vµ ph©n tö. 5 §èi t−îng vµ ph¹m vi nghiªn cøu 5.1 §èi t−îng nghiªn cøu - §Ò tµi ®0 sö dông 2 chñng vi khuÈn: + Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens EHA 105 + Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 - C¸c gièng cµ chua: Ba lan, Ph¸p lïn, P375, H18 vµ dßng cµ chua d¹i L. pennelli 5.2 Ph¹m vi nghiªn cøu - Nghiªn cøu ®−a ra c¸c m«i tr−êng t¹o callus vµ t¸i sinh c©y cã hiÖu qu¶ phôc vô cho thÝ nghiÖm chuyÓn n¹p gen. - Thùc hiÖn c¸c qui tr×nh chuyÓn n¹p gen, nh»m thu ®−îc c¸c c©y cµ chua t¸i Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 4 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 4 sinh mang gen chuyÓn. ThÈm ®Þnh sù cã mÆt cña chóng b»ng ph−¬ng ph¸p chØ thÞ ph©n tö. 5.3 §Þa ®iÓm nghiªn cøu Phßng thÝ nghiÖm cña Phßng BÖnh Häc Ph©n Tö - ViÖn Di TruyÒn N«ng nghiÖp - Tõ Liªm Hµ Néi vµ Tr¹i Thùc nghiÖm cña ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp - V¨n Giang - H−ng Yªn Thêi gian nghiªn cøu: 2004 - 2008 Ch−¬ng 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 5 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 5 Tæng quan tµi liÖu 1.1 C¬ së khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi Cµ chua trång (Licopersicon esculentum Mill.) thuéc hä Solannaceae chi Lycopersicon. Cµ chua lµ c©y rau cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao ®−îc ph¸t triÓn ë hÇu hÕt c¸c n−íc trªn thÕ giíi tõ c¸c n−íc hµn ®íi ®Õn c¸c n−íc nhiÖt ®íi (Rick,1978) [116]; (T¹ Thu Cóc,1994) [1] C©y trång bÞ tÊn c«ng bëi c¸c lo¹i vi sinh vËt vµ c«n trïng g©y h¹i lµ mét th¸ch thøc to lín trong s¶n xuÊt n«ng nghiÖp. Hµng n¨m, trªn thÕ giíi, s¶n l−îng c©y trång gi¶m sót ®¸ng kÓ do chóng bÞ nhiÔm nhiÒu lo¹i s©u, bÖnh h¹i kh¸c nhau nh−: virus, viroid, vi khuÈn, nÊm còng nh− tuyÕn trïng vµ c«n trïng g©y h¹i kh¸c. §ã lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n g©y nªn sù ®ãi kÐm cña ng−êi n«ng d©n nãi riªng vµ ®e do¹ trÇm träng nÒn kinh tÕ cña céng ®ång x0 héi nãi chung. Song chóng ta còng biÕt r»ng: “Nh÷ng c©y trång kh«ng thÓ ch¹y trèn c¸c vÊn ®Ò cña chÝnh m×nh, chóng cÇn ph¶i ®èi mÆt víi c¸c vÊn ®Ò ®ã”. Trong tù nhiªn, c¸c lo¹i c©y trång ®0 thÝch øng ®−îc víi m«i tr−êng xung quanh nhê ph¸t triÓn nh÷ng c¬ chÕ kú l¹ vµ c¸c c¬ chÕ liªn quan (Jeon,1998) [67]. C¸c ¸p lùc do m«i tr−êng g©y ra th−êng lµ: nãng, l¹nh, mÆn, chua, c¸c lo¹i kim lo¹i nÆng ®éc h¹i, ¸nh s¸ng v. v. vµ c¸c yÕu tè sinh häc nh−: viroid, micoplasma, virus, vi khuÈn vµ nÊm (Hu K.l, 2002) [64]. Mét vµi c¬ chÕ trong chóng x¶y ra rÊt nhanh, cã nghÜa lµ ph¶n øng chØ x¶y ra sau vµi gi©y hoÆc vµi phót sau khi bÞ kÝch thÝch vµ dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi trong ho¹t ®éng cña gen. Mét sè ph¶n øng x¶y ra chØ trong kho¶nh kh¾c, sau vµi phót hoÆc vµi giê (vÝ dô khi cã sù tÊn c«ng cña c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh). Nh÷ng ph¶n øng thø cÊp, cã thÓ x¶y ra trong nh÷ng phÇn c¸ch biÖt cña c©y, sau mét hoÆc hai ngµy khi g©y chÊn th−¬ng ban ®Çu. Nh×n chung, nh÷ng ph¶n øng muén nµy lµ kÕt qu¶ tõ nh÷ng thay ®æi trong c¸c ho¹t ®éng cña gen, lµm s¶n sinh ra nh÷ng protein mµ b×nh th−êng c©y trång kh«ng s¶n sinh ra ®−îc hoÆc chØ s¶n sinh ra mét sè l−îng Ýt ái trong c¸c c¬ quan ®Æc thï. Thªm vµo ®ã, do kh«ng cã c¸c bé phËn t−¬ng øng cña ®éng vËt, nªn c©y trång kh«ng cã kh¶ n¨ng nhËn biÕt rÊt nhiÒu tÝn hiÖu t¸c ®éng tõ m«i tr−êng xung quanh. (Bennett,1993) [38] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 6 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 6 HiÖn nay, víi sù ph¸t triÓn v« cïng nhanh chãng cña c«ng nghÖ di truyÒn, ng−êi ta ®0 biÕt ®Õn c¸c tiÕn bé cña c«ng nghÖ nµy, øng dông trong c«ng t¸c gièng c©y trång (NguyÔn Nh− Khanh, 2002) [8]. C¸c tiÕn bé vÒ c«ng nghÖ gen ®0 ®¹t tíi viÖc nhËn ra c¬ chÕ ph©n tö ®Çy ®ñ gi÷a c©y chñ víi c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh vµ chiÕn l−îc tù vÖ tù nhiªn cña c©y chñ. MÆt kh¸c c«ng nghÖ nµy còng ®−îc sö dông ®Ó kiÓm tra vµ t¸i sinh cã hiÖu qu¶ sù ®a d¹ng di truyÒn. ChÝnh c«ng nghÖ di truyÒn cho phÐp nhanh chãng nhËn d¹ng, t¸ch dßng vµ kiÓm tra nh÷ng t¸i tæ hîp gen trong in vitro vµ kh¶ n¨ng ®Ó nhËn biÕt c¸c kiÓu gen −a thÝch, v−ît xa kh¶ n¨ng cña ph−¬ng ph¸p chän gièng cæ ®iÓn (ph−¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh vµ lai dßng soma) (Stanton B, 1994) [106]. Thö nghiÖm thµnh c«ng ®Çu tiªn thùc hiÖn trªn sù c¶i t¹o tÝnh kh¸ng ®èi víi bÖnh virus, vi khuÈn, nÊm vµ c«n trïng b»ng thiÕt kÕ c©y chuyÓn gen. PhÇn lín c¸c chiÕn l−îc nµy ®−îc dùa trªn c¬ së chñ yÕu lµ sù thÓ hiÖn c¸c protein ®¬n m0 hoÆc g©y ®éc ®èi víi t¸c nh©n g©y bÖnh, c«n trïng hoÆc g©y trë ng¹i cho chu tr×nh t¸i sinh cña chóng. ChÝnh v× vËy, gi÷a nh÷ng n¨m 1987-1991 côc Liªn bang Quèc gia N«ng nghiÖp Mü ®0 nhËn ®−îc trªn 100 ®Ò nghÞ cho thö nghiÖm ngoµi ®ång c¸c c©y ®−îc chuyÓn gen. PhÇn lín c¸c thö nghiÖm nµy lµ dù tÝnh thö c¸c gièng ®0 ®−îc t¨ng kh¶ n¨ng chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt do c¸c yÕu tè sinh häc (biotic) vµ v« sinh (abiotic) g©y ra. §ång thêi, mét sè thÝ nghiÖm kh¸c song song cã liªn quan ®Õn vÊn ®Ò chÊt l−îng s¶n phÈm nh−: Lµm chËm thêi gian chÝn, biÕn ®æi hµm l−îng protein cña h¹t, t¨ng hµm l−îng carbonhydrate ë cñ, biÕn ®æi hµm l−îng dÇu ®Ó gi¶m sù g©y mïi, vÊn ®Ò mµu s¾c cña hoa.v.v.[31]; [32]. Cã nhiÒu ®Þnh nghÜa vÒ c©y trång biÕn n¹p gen, ®©y lµ mét ®Þnh nghÜa cã tÝnh bao qu¸t nhÊt:“C©y biÕn n¹p gen lµ c©y ®−îc chuyÓn mét hay nhiÒu gen míi tõ ®ã ta ®M thu ®−îc thªm mét hay nhiÒu ®Æc ®iÓm míi. C¸c gen ®−îc chuyÓn vµo c©y kh«ng ph¶i b»ng con ®−êng lai h÷u tÝnh gi÷a hai bè mÑ, mµ ®−îc chuyÓn b»ng c¸c kÜ thuËt di truyÒn (mét c©y chuyÓn gen mang nh÷ng ®o¹n ADN thu ®−îc b»ng nh÷ng thao t¸c trong in vitro). KÕt qu¶ còng gièng nh− tÊt c¶ c¸c c¬ chÕ khi cã mét gen l¹ th©m nhËp vµo tÝnh di truyÒn ®−îc biÕn ®æi (OGM-Organismes Genetiquement Modifiees)” (Macheix, 1997) [73] 1.2 Nguån gèc, ph©n lo¹i vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng c©y cµ chua 1.2.1 Nguån gèc c©y cµ chua Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 7 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 7 C©y cµ chua thuéc chi Lycopersicon, loµi esculentum (Rick, 1978) [97] cã xuÊt xø tõ Trung vµ Nam Mü, ®−îc ph©n bè tõ B¾c Chilª ®Õn Nam Colombia, phÝa T©y ®Õn Th¸i B×nh D−¬ng vµ phÝa §«ng ®Õn vïng nói Anner (Peru, Chilª vµ Ecuador) (Rick, 1983) [98]. Kh«ng cã bÊt cø mét chi hoang d¹i Lycopersicon nµo cã thÓ t×m thÊy bªn ngoµi ch©u Mü, ngo¹i trõ Lycopersicon esculentum var cerasiforme (cherry tomato). Theo Rick (1983), nguån hoang d¹i cña cµ chua trång hiÖn nay ch¾c ch¾n ph¶i lµ Lycopersicon esculentum var cerasiforme (cherry tomato), tr−íc ®©y nã ®−îc di tró tõ Trung t©m d0y nói ADNer xuyªn qua Nam-B¾c Mü, däc theo eo biÓn Panama ®Õn Trung Mü vµ Nam Mexico råi di c− ®i kh¾p c¸c ch©u lôc kh¸c. HÇu hÕt c¸c b»ng chøng vÒ nguån gèc cµ chua thuÇn ho¸ ®Òu chØ ra r»ng ®ã lµ tõ Mexico (Taylor, 1986) [109]. §iÒu nµy chøng tá cµ chua tr¶i qua mét giai ®o¹n tiÕn ho¸ rÊt l©u tr−íc khi ®−îc du nhËp vµo ch©u ©u. Gièng cµ chua ®Çu tiªn ®−îc du nhËp vµo ch©u ¢u n¨m 1519 lµ gièng cµ chua qu¶ to, v× vËy ë ý ng−êi ta gäi cµ chua lµ pomid’oro (t¸o vµng), cßn loµi thuû tæ ban ®Çu cã qu¶ nhá nh− c¸c b¸o c¸o tr−íc ®©y cña Rick n¨m 1978 ®0 miªu t¶ vÒ h×nh d¸ng, mÇu s¾c cña c¸c gièng cµ chua. Cµ chua ®−îc du nhËp vµo Mü kh«ng ph¶i tõ ch©u Mü Latinh mµ tõ ch©u ¢u. Nh÷ng tµi liÖu m« t¶ ®Çu tiªn vÒ cµ chua ®−îc t×m thÊy vµo nh÷ng n¨m 1700, ®Çu nh÷ng n¨m 1800 lµ cña c¸c nhµ nghiªn cøu thùc vËt William Salmon vµ Thomas Jeferson (Rick, 1976) [99]; (Rick, 1978) [97]. Cµ chua ®−îc ®−a vµo ViÖt nam tõ nh÷ng nhµ truyÒn gi¸o ®Õn tõ ph¸p tõ trªn 100 n¨m nay. 1.2.2 Ph©n lo¹i c©y cµ chua Hä (Family): Solanaceae. Chi (Genus): Lycopersicon Chi phô (Subgenus): Eulycopersicon Loµi (Species): esculentum Chi Lycopersicon thuéc hä Solanaceae. Hä nµy lµ mét trong nh÷ng hä quan träng nhÊt phôc vô con nguêi vµ bao gåm rÊt nhiÒu lo¹i rau qu¶ quan träng. Trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 8 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 8 khu«n khæ hä._. Solanaceae, Lycopersicon thuéc hä phô (subfamily) Solanoidae thuéc t«ng (tribus) Solaneae (Rick,1978) [97]. Ngoµi chi Licopersicon cßn cã mét sè loµi trong chi Solanum cã quan hÖ rÊt gÇn gòi víi d¹ng cµ chua trång hiÖn nay. Trong khi chi Solanum vµ Licopersicon cã cïng sè nhiÔm s¾c thÓ c¬ b¶n (x=12), nh−ng rµo c¶n vÒ kh¶ n¨ng lai kh¸c loµi ®0 lµm gi¶m rÊt nhiÒu kh¶ n¨ng t¸i tæ hîp cña chóng trõ mét vµi tr−êng hîp h0n h÷u. Mét sè nhµ chän gièng ®0 thµnh c«ng trong viÖc lai gi÷a Licopersicon esculentum vµ Solanum licopersicoides vµ Solanum rickii, tuy nhiªn ph¶i nhê vµo kü thuËt cøu ph«i, nh−ng nh×n chung c¸c con lai cã tû lÖ bÊt dôc rÊt cao (Stevens vµ cs, 1986)[131]. Cßn víi c¸c loµi Solanum corneliomuelleri, Solanum ochranthum vµ Solanum sitiens ch−a cã c¸c c«ng bè vÒ sù thµnh c«ng trong viÖc lai t¹o gi÷a chóng víi c¸c loµi cña L. esculentum (Peralta, 2005) [92]; (Peres, 2001) [93]. Riªng ®èi víi loµi Solanum nigrum th× ch−a cã mét nhµ chän gièng nµo thµnh c«ng trong khi lai t¹o nã víi Licopersicon esculentum (Taylor, 1986) [109], (Peralta, 2005) [90]. 1.2.3 Gi¸ trÞ cña cµ chua Gi¸ trÞ dinh d−ìng Cµ chua ®0 ®−îc trång lµm thøc ¨n tõ hµng tr¨m n¨m nay, cho ®Õn nh÷ng n¨m 1900 cµ chua ch−a ®−îc trång vµ tiªu thô nhiÒu v× thêi ®ã cµ chua chØ ®−îc dïng nh− mÆt hµng ¨n t−¬i vµ muèi d−a (nh÷ng qu¶ xanh) nh−ng tõ nh÷ng n¨m sau 1900 cµ chua ®−îc dïng nh− mét lo¹i s¶n phÈm hµng ho¸ th−¬ng m¹i ®a d¹ng vÒ ph−¬ng thøc sö dông vµ c¸ch chÕ biÕn nh−: ¨n t−¬i c¶ qu¶ víi muèi, lµm sµ l¸t, nÊu chÝn (nÊu canh, sµo, lµm ph¸t xÝu cµ chua, sèt cµ chua víi trøng...), chÕ biÕn ®å hép (paste, cµ chua qu¶ hép, ®å uèng cµ chua, ®Æc biÖt cµ chua ketchup ¨n víi b¸nh m× vµ c¸c lo¹i spageti rÊt ngät do vÞ cña loµi cµ chua L. pennelli), lµm møt, cµ chua kh«, phô gia thùc phÈm, ®Æc biÖt lµ thµnh phÇn trong nhiªu lo¹i b¸nh nh− Pizza. Gi¸ trÞ y häc Cµ chua lµ mét lo¹i thøc ¨n kiªng, chøa rÊt nhiÒu n−íc (trªn 90%) vµ rÊt nghÌo calo (18 kcal/100g), rÊt giÇu c¸c nguyªn tè kho¸ng vµ vitamin (A, C vµ E). Nã bao gåm: Kali: Kho¶ng 280 mg/100 g qu¶, Lycopen: ChÊt lµm cho qu¶ cµ chua Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 9 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 9 cã mµu ®á (carotenoide) lµ mét chÊt chèng «xyho¸ chøa mét tû lÖ rÊt cao: 30mg/200 ml n−íc sèt cµ chua. Qu¶ cµ chua cßn chøa ®ùng mét lo¹i ancaloide ®ã lµ solanin còng nh− saponin, liªn kÕt víi hitadin vµ lµm cho dÔ tiªu ho¸. Vµ cµ chua chÝnh lµ mét lo¹i d−îc liÖu cã gi¸ trÞ trªn toµn thÕ giíi, nhê hµm l−îng lycopen vµ chÊt mÇu caroteinoide (chÊt chèng «xy ho¸), theo c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy Lycopen ®Æc biÖt trong cµ chua nÊu chÝn cã thÓ phßng ngõa ®−îc ung th− tuyÕn tiÒn liÖt, ung th− tuyÕn tuþ (pancrÐas) vµ phßng ngõa ®−îc ung th− d¹ dÇy (Rick, 1978) [97], [62]. Míi ®©y trung tâm Nghiên cứu John Innes, ñược Chính phủ Anh tài trợ, vừa công bố kết quả này trên tạp chí Nature Biotechnology ngày 26-10. Một giống cà chua do biến ñổi gien trở thành màu tím và chứa nhiều chất chống ô xy hóa anthocyanins giúp chống ung thư. 1.3 Sù ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua 1.3.1 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua trªn thÕ giíi Cµ chua lµ lo¹i c©y rau quan träng thø hai trªn thÕ giíi, chØ ®øng sau c©y khoai t©y, ®−îc ph©n bè hÇu nh− kh¾p c¸c n−íc trªn thÕ giíi. §ã lµ mét lo¹i c©y rau ¨n qu¶ dÔ trång vµ cã gi¸ trÞ dinh d−ìng cao, hµng n¨m trªn thÕ giíi trång kho¶ng 3,7 triÖu ha cµ chua cho s¶n l−îng kho¶ng trªn 120 triÖu tÊn (Database, 2008) [32]. Trung quèc lµ n−íc cã diÖn tÝch vµ s¶n l−îng cµ chua lín nhÊt trªn thÕ giíi víi kho¶ng 1 255 100 ha vµ s¶n l−îng t−¬ng øng 31 644 040 tÊn (n¨m 2005) vµ Ên §é lµ n−íc t¨ng nhanh c¶ vÒ diÖn tÝch (300%) vµ n¨ng suÊt (54%) so víi n¨m tr−íc. S¸u n−íc ®øng ®Çu s¶n xuÊt cµ chua trªn thÕ giíi ®ã lµ: Trung quèc, Mü, Thæ NhÜ Kú, Ai cËp Ên ®é vµ ý. Ngoµi ra c¸c n−íc t¨ng nhanh vÒ diÖn tÝch cßn cã óc (15%), Indonexia, Brazil vµ Mexico. Hµ lan vµ BØ lµ hai n−íc ®øng ®Çu vÒ n¨ng suÊt cµ chua trªn thÕ giíi (4.961, 513 kg/ha) Sè liÖu vÒ diÖn tÝch c©y trång trong nhµ l−íi, cã hÖ thèng t−íi tiªu, ch¨m sãc hiÖn ®¹i, tù ®éng ho¸ sau ®©y cho thÊy ®−îc møc ®é ®Çu t− cña c¸c n−íc ph¸t triÓn Muigai,2003 [84]: Hµ Lan cã 4.300 ha cµ chua, ý cã 3.500 ha, Anh cã 1.640 ha, Ph¸p cã 1.500 ha vµ hµng tr¨m ha trång cµ chua thuû canh [62]. Mét sè n−íc chÝnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 10 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 10 trong hÖ thèng c¸c n−íc Franc«ph«ne cã s¶n l−îng cµ chua lÇn l−ît nh− sau: (s¶n l−îng cµ chua tÝnh theo tÊn n¨m 2006 (FAOSTAT-DataBase) [56]: Ph¸p: 843 220 tÊn, Canada: 805 090 tÊn V−¬ng quèc BØ: 245 900 tÊn, Thuþ Sü: 29 600 tÊn. Nh×n chung, nh÷ng n−íc cµng ph¸t triÓn th× cho n¨ng suÊt cao. Ng−îc l¹i nh÷ng n−íc nghÌo th× s¶n xuÊt cho n¨ng suÊt rÊt thÊp. Vµ ®Æc biÖt, c¸c n−íc Ch©u ¸ chÝnh lµ n¬i trång cµ chua nhiÒu nhÊt trªn thÕ giíi, vÝ dô: Trung Quèc: 1 255 100 ha, Ên §é: 350.000 ha, Philippine: 165.000, Th¸i lan; 12.000 ha, ViÖt Nam: 10 - 12.000 ha… Trong vïng nhiÖt ®íi, Trung Quèc vµ Ên §é lµ hai n−íc cã diÖn tÝch trång cµ chua cao nhÊt cßn NhËt B¶n vµ §µi Loan lµ hai n−íc lu«n dÉn ®Çu vÒ n¨ng suÊt [63], (Massaaki,2005) [76]. 1.3.2 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua ë ViÖt Nam VÒ t×nh h×nh s¶n xuÊt cµ chua ë n−íc ta hiÖn nay cã thÓ ®iÓm ra mét sè nÐt chÝnh sau: S¶n xuÊt vµ tiªu thô: Cµ chua ®−îc trång ë hÇu hÕt c¸c tØnh thµnh trªn c¶ n−íc. Cho ®Õn nay cµ chua ë n−íc ta s¶n xuÊt ra gÇn nh− chØ ®Ó tiªu thô t¹i chç mµ vÉn ch−a thÓ xuÊt khÈu do s¶n xuÊt ch−a nhiÒu, mÉu m0, chÊt l−îng cµ chua nãi chung ch−a cao. Gièng: Tr−íc nh÷ng n¨m 1990, chñ yÕu lµ gièng ®Þa ph−¬ng thÝch hîp víi ®iÒu kiÖn canh t¸c vµ tiªu thô tõng n¬i. Nh×n chung gÇn ®©y nhiÒu gièng míi ®0 ®−îc chän läc, ®−a vµo s¶n xuÊt víi n¨ng suÊt víi chÊt l−îng ®0 ®−îc c¶i thiÖn. MiÒn B¾c cã c¸c gièng, Hång Lan, P375, H18, MV1, v.v... miÒn Nam cã gièng 5901386, VL 2100, Red Crown. §Æc biÖt cã nh÷ng gièng tr¸i vô: T12, RaMuna, KBT4, 386, Red Crown. Theo kÕt qu¶ ®iÒu tra cña Ph¹m §ång Qu¶ng vµ cs n¨m 2004 c¶ n−íc ta cã 115 gièng cµ chua ®−îc gieo trång trong ®ã cã 22 gièng chñ lùc, 10 gièng cã diÖn tÝch gieo trång lín nhÊt trªn c¶ n−íc ®øng ®Çu lµ M368 tiÕp ®Õn lµ gièng cµ chua Ph¸p, VL2000, TN002, c¸c gièng cµ chua Mü, Ba lan, Red Crow, T42, VL2910 vµ gièng cña c¸c c«ng ty Trang N«ng (Ph¹m Hång Qu¶ng, 2005)[17], (D−¬ng Kim Thoa,2005) [27], (D−¬ng Kim Thoa, 2005) [28]. Kü thuËt canh t¸c: ë c¸c vïng cã lÞch sö trång cµ chua l©u ®êi th× kü thuËt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 11 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 11 canh t¸c cµ chua cña n«ng d©n lµ kh¸ cao. VÝ dô nh− t¹i Hµ Néi, H¶i Phßng, Hµ B¾c, H¶i H−ng, Hµ T©y, L©m §ång. Cßn t¹i c¸c vïng rau xa trung t©m th× ng−êi d©n thiÕu kinh nghiÖm, c¸c biÖn ph¸p canh t¸c cßn nhiÒu l¹c hËu. §iÒu nµy dÉn ®Õn sù chªnh lÖch vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng cña c©y cµ chua. Nh×n chung, vÒ kü thuËt hiÖn nay cßn cã nh÷ng khã kh¨n trong viÖc: phßng trõ s©u bÖnh, cá d¹i vµ ®iÒu kiÖn m«i tr−êng kh¾c nghiÖt (Ng« ThÞ Hanh, 2001) [4], (Lª ThÞ Kh¸nh, 2005)[9]. Quan s¸t thùc tÕ, chóng t«i nhËn thÊy viÖc trång cµ chua hiÖn nay ë n−íc ta cã mét sè thuËn lîi vµ khã kh¨n chÝnh sau: VÒ mÆt thuËn lîi: Nh×n chung n−íc ta cã vô §«ng Xu©n thêi tiÕt kh¸ thuËn lîi cho viÖc s¶n xuÊt cµ chua, nhÊt lµ c¸c tØnh phÝa B¾c kÐo dµi ®Õn B×nh §Þnh, Phó Yªn. Ngoµi ra, ë n−íc ta hiÖn ®ang cã mét sè gièng míi vµ mét sè biÖn ph¸p canh t¸c tèt cã thÓ ®¹t n¨ng suÊt 40-50 tÊn/ha/vô. (NguyÔn V¨n Th¾ng vµ cs, 2000)[24] VÒ mÆt khã kh¨n: Chóng ta gÆp ph¶i hÇu hÕt nh÷ng khã kh¨n mµ vïng nhiÖt ®íi gÆp ph¶i nh− gièng, s©u bÖnh, kü thuËt canh t¸c, thÞ tr−êng c«ng nghÖ sau thu ho¹ch vµ s¶n xuÊt tr¸i vô… HiÖn nay mét vÊn ®Ò ph¸t sinh n÷a lµ tån d− kim lo¹i nÆng (KLN) trong ®Êt, n−íc vµ kh«ng khÝ... §èi víi sù nghiªn cøu, s¶n xuÊt c©y cµ chua vÉn cßn nhiÒu vÊn ®Ò cÇn ®−îc ®Çu t− vµ nghiªn cøu. (TrÇn Kh¾c Thi vµ cs, 2001) [25], (§µo Xu©n Th¶ng vµ cs, 2003) [23]. 1.4 Mét sè nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua 1.4.1 Nh÷ng nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua theo c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng Chän gièng −u thÕ lai HiÖu qu¶ −u thÕ lai cña cµ chua ®−îc ph¸t hiÖn tõ ®Çu thÕ kû 20. Sö dông −u thÕ lai ®−îc phæ biÕn trong s¶n xuÊt nhê cã −u thÕ lai cña F1 vÒ n¨ng suÊt, chØ sè chÝn sím, chÊt l−îng qu¶, ®é ®ång ®Òu cña qu¶ vµ kh¶ n¨ng chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi tèt h¬n bè mÑ. Con lai F1 cho phÐp n©ng n¨ng suÊt c©y trång lªn tíi 25- 30% vµ cao h¬n. (KiÒu ThÞ Th−, 1998) [26]; (Verna, 1990) [54]. Mét lo¹t c¸c nghiªn cøu vÒ −u thÕ lai, n¨ng suÊt, hµm l−îng chÊt kh«, ®é dµy cña qu¶ vµ mèi quan hÖ gi÷a −u thÕ lai vµ ®a d¹ng di truyÒn ®−îc nghiªn cøu rÊt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 12 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 12 c«ng phu, cã nh÷ng thµnh c«ng nhÊt ®Þnh. HiÖn nay, hµng lo¹t c¸c gièng lai ®ang ®−îc s¶n xuÊt ®¹i trµ cã n¨ng suÊt cao, phÈm chÊt tèt. DV 2962 lµ gièng cµ chua lai F1 cã nguån gèc tõ Ên §é, ®−îc h0ng Seminis nhËp vÒ ViÖt Nam vµ do Cty TNHH TM & SX h¹t gièng c©y trång §Êt ViÖt ®éc quyÒn ph©n phèi. Sau 2 n¨m (2005-2006) trång thö nghiÖm thµnh c«ng ë mét sè tØnh vïng §ång B»ng S«ng Hång (§BSH) víi nhiÒu thêi vô kh¸c nhau, ®Çu n¨m nay, c«ng ty §Êt ViÖt ®0 ®−a ra khuyÕn c¸o bµ con n«ng d©n nªn trång gièng cµ chua cã nhiÒu −u ®iÓm nµy. øng dông −u thÕ lai trong chän gièng cµ chua ®−îc tiÕn hµnh trªn nhiÒu n−íc. Bungary lµ n−íc ®Çu tiªn sö dông −u thÕ lai ë cµ chua, hiÖn nay hÇu nh− trªn toµn bé diÖn tÝch gieo trång ®ang sö dông phæ biÕn lµ c¸c gièng lai F1. Hµng n¨m c¸c c«ng ty rau hoa qu¶ ë Hµ lan ®0 ®−a ra hµng lo¹t c¸c con lai cã −u thÕ lai cao ra thÞ tr−êng. Ngoµi ra, cã c¸c c«ng ty ë NhËt, Ph¸p… ®0 giíi thiÖu nhiÒu gièng cµ chua cã n¨ng suÊt cao, phÈm chÊt tèt, chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr−êng, cã d¹ng qu¶ vµ mµu s¾c hÊp dÉn. (MacuaJ.I,2002) [74] Tõ tr−íc n¨m 1995, c¸c nghiªn cøu vÒ t¹o gièng cµ chua −u thÕ lai ë n−íc ta ®0 ®−îc ®Ò cËp. Sau 1995, vÊn ®Ò nµy míi ®−îc ph¸t triÓn m¹nh, nghiªn cøu c¸c c«ng nghÖ s¶n xuÊt h¹t gièng cµ chua lai kh¸c nhau, tíi n¨m 1998 §¹i häc N«ng nghiÖp I - Hµ néi ®0 ®−a ra quy tr×nh s¶n xuÊt h¹t gièng cµ chua lai trªn quy m« ®¹i trµ (NguyÔn Hång Minh, 2006)[11], còng tõ n¨m ®ã gièng cµ chua lai HT7 ®−îc ®−a ra. Sau ®ã n¨m 2000, ph¸t triÓn diÖn tÝch lín nhiÒu n¨m liªn tôc (NguyÔn Hång Minh vµ cs)[12]. N¨m 2004, ®−a ra s¶n xuÊt gièng cµ chua HT21(NguyÔn Hång Minh, 2006) [13] vµ tiÕp theo lµ c¸c gièng HT42, HT160... c¸c gièng trªn cã nhiÒu −u ®iÓm vÒ ng¾n ngµy, n¨ng suÊt chÊt l−îng tèt, chÞu nãng... c¹nh tranh ®−îc víi c¸c gièng nhËp néi ®Ó ph¸t triÓn s¶n xuÊt (NguyÔn Hång Minh, 2006)[11]. Bªn c¹nh c¸c gièng cµ chua lai trªn mét sè gièng chän läc kh¸c ®−îc ®−a ra nh− PT18 (D−¬ng Kim Thoa vµ cs, 2005) [28], C95 (§µo Xu©n Th¶ng vµ cs, 2003) [23], VT3 (§µo Xu©n Th¶ng vµ cs, 2003) [22] vµ mét sè gièng kh¸c... Chän läc giao tö VÊn ®Ò chän läc giao tö vµ hîp tö trong chän t¹o gièng cµ chua còng ®−îc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 13 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 13 ®Æt ra trong nh÷ng n¨m cña cuèi thÓ kû 20, nh»m t¹o nhanh c¸c gièng thÝch øng víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr−êng, ®Æc biÖt lµ nhiÖt ®é cao vµ mét sè c¸c yÕu tè kÝch thÝch kh¸c. Mét trong nh÷ng ph−¬ng ph¸p thay ®æi c−êng ®é chän läc giao tö lµ lµm t¨ng søc sèng cña giao tö, b»ng kÝch thÝch tia cùc tÝm. Thô phÊn b»ng phÊn ®−îc kÝch thÝch lµm t¨ng sè l−îng h¹t trong qu¶ vµ lµm t¨ng träng l−îng qu¶ so víi ®èi chøng Thô phÊn b»ng sè l−îng phÊn h¹n chÕ lµ mét trong nh÷ng ph−¬ng ph¸p lµm gi¶m c¹nh tranh giao tö. Tõ ®ã lµm gi¶m sù ®µo th¶i cña h¹t phÊn t¸i tæ hîp. Thay ®æi cÊu tróc quÇn thÓ ph©n ly cã thÓ b»ng kÝch thÝch søc sèng cña h¹t F1. Xö lý h¹t b»ng dung dÞch CuSO4 (0,2%), axit boric (0,02%), tia cùc tÝm... ®0 ®−îc nghiªn cøu bëi Garbuz tõ nh÷ng n¨m 1987. Søc sèng giao tö cña h¹t phÊn cã thÓ t¨ng lªn nhê sö dông c¸c chÊt ho¹t tÝnh sinh häc nh− vitamin B1, B6, IAA, GA vµ c¸c glycozid. Víi cµ chua, b»ng c¸ch chän läc h¹t phÊn chèng chÞu víi nhiÖt ®é cao cã thÓ lµm t¨ng sù chèng chÞu ë giai ®o¹n sinh d−ìng. Sù chän läc nµy cÇn ®−îc tiÕn hµnh b¾t ®Çu tõ c©y F1 trong lai kh¸c loµi, cïng loµi gièng nh− lai gi÷a c¸c gièng. Nh− vËy, b»ng ph−¬ng ph¸p chän läc giao tö vµ hîp tö cã thÓ lµm t¨ng phæ biÕn dÞ, di truyÒn, phôc vô cho chän läc vµ t¹o c¸c kiÓu gen chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt thuËn, ®Æc biÖt lµ yÕu tè nhiÖt ®é. Ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch tæng hîp Cã hiÖu qu¶ nhÊt trong thùc tÕ chän gièng cµ chua lµ ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch tæng hîp, tøc lµ lai t¹o kÕt hîp víi chän läc liªn tôc nh÷ng c©y cã Ýt nhÊt c¸c tÝnh tr¹ng kh«ng cã lîi. Trong chän mÉu ®Ó lai cÇn chó ý ®Õn c¸c tÝnh tr¹ng bæ sung cho nhau gi÷a hai bè mÑ. C¸c tÝnh tr¹ng ®ã cÇn cã trong gièng míi vµ trong gièng lai. ChÝnh v× vËy, cÇn ®−a vµo trong ch−¬ng tr×nh lai t¹o kh«ng nh÷ng c¸c gièng, c¸c dßng chän läc, c¸c d¹ng cµ chua trång, c¸c d¹ng b¸n hoang d¹i mµ c¶ c¸c loµi kh¸c cña chi Lycoppersicon. Chän läc c¸ thÓ Trong chän gièng cµ chua th−êng sö dông chän läc c¸ thÓ nhiÒu lÇn. Ph−¬ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 14 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 14 ph¸p nµy cho phÐp nghiªn cøu di truyÒn c¸c tÝnh tr¹ng cã hiÖu qu¶ trong chän gièng thùc nghiÖm. ë ®a sè c¸c trung t©m nghiªn cøu khoa häc ë Liªn x« (cò), sù lai c¸c gièng cµ chua chän läc víi c¸c gièng ®Þa ph−¬ng, c¸c dßng kh¸c nhau vÒ tÝnh tr¹ng quý ®−îc tiÕn hµnh trªn quy m« lín. B»ng ph−¬ng ph¸p nµy ®0 t¹o ra nhiÒu gièng míi: Maiac 12/24-4, padarok 105, kolkhowui 34... Lai mét lÇn c¸c gièng cµ chua vµ c¸c dßng kh¸c nhau vÒ n¨ng suÊt, c¸c tÝnh tr¹ng kh¸c th−êng kh«ng nhËn ®−îc kiÓu gen mong muèn. Sö dông lai nhiÒu lÇn, ®Æc biÖt kÕt hîp chän läc ë c¸c giai ®o¹n trung gian ®0 thóc ®Èy hoµn thiÖn c¸c tÝnh tr¹ng cÇn thiÕt. Trong chän gièng cµ chua ph−¬ng ph¸p mét h¹t tõ chän läc c©y −u tó (SSDES) hiÖu qu¶ h¬n ph−¬ng ph¸p chän läc hçn hîp, chän läc dßng thuÇn vµ chän läc nhãm theo tÝnh tr¹ng: Sè qu¶ trªn c©y, n¨ng suÊt c¸ thÓ, ra hoa sím, träng l−îng qu¶ vµ kh¸ng hÐo vi khuÈn Lai h÷u tÝnh Nh×n chung, c¸c gièng cµ chua míi ®−îc t¹o ra phÇn lín lµ sö dông ph−¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh. So s¸nh víi c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c, ph−¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh vÉn hiÖu qu¶ h¬n ë trªn ®èi t−îng c©y cµ chua. B»ng ph−¬ng ph¸p nµy ®0 phôc tr¸ng nhiÒu tÝnh tr¹ng n«ng häc quý hiÕm nh− n¨ng suÊt, chÝn sím, kÝch th−íc qu¶, hµm l−îng c¸c chÊt sinh häc quý... lµ tÝnh tr¹ng ®a gen. (TrÇn V¨n Lµi vµ cs,2005) [10] Bªn c¹nh ph−¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh lµ ph−¬ng ph¸p dung hîp tÕ bµo trÇn kÕt hîp ®−îc tÝnh chèng chÞu cña L.peruvianum víi dung l−îng t¸i sinh c©y cña L.esculentum ë con lai cña chóng. §a sè c¸c con lai nµy lµ tø béi (xn=4x=48) cã mét sè con lai lôc béi, chøa 2 genom cña L.esculentum vµ 4 genom cña L.peruvianum Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 15 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 15 1.4.2 Nghiªn cøu chän gièng b»ng ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen Cµ chua lµ mét c©y m« h×nh vÒ kiÓu di truyÒn trong c¸c nghiªn cøu c¶i t¹o gièng cho nhiÒu lo¹i c©y trång 2 l¸ mÇm (Mc Cormick vµ céng sù,1986);[78]. Nh÷ng nghiªn cøu c¬ b¶n vµ øng dông thµnh c«ng trong vÊn ®Ò chuyÓn gen c©y cµ chua lµ rÊt cÇn thiÕt. §0 cã nhiÒu thµnh c«ng trong chän t¹o gièng cµ chua b»ng con ®−êng chuyÓn gen vµ c¸c gièng míi nµy ®0 ®−îc phª chuÈn lµ an toµn cho ng−êi tiªu dïng vµ cho m«i tr−êng vµ ®0 ®−îc ®−a ra s¶n xuÊt. Tuy nhiªn, c¸c nghiªn cøu nµy ®èi víi c©y cµ chua ch−a ®¹t ®Õn møc thuÇn thôc vµ hiÖu qu¶ cao nh− mét sè c©y kh¸c (Van Roekel et al. 1993) [111], (Frary ADN Earle 1996)[58],.... B¸o c¸o ®Çu tiªn vÒ chuyÓn gen vµo cµ chua lµ cña McComick vµ cs. (1986)[78] vµ tõ ®ã mét sè bµi b¸o vÒ chuyÓn gen ®0 ®−îc c«ng bè: Chyi ADN Phillips 1987[48], Fillatli vµ cs. 1987[57], Fischoff vµ cs. 1987, Dellannay vµ cs. 1989, Van Roakel vµ cs. 1993 [111], Agharbaoui vµ cs. 1995, Frary vµ Earle 1996 [58], Ling vµ cs. 1998, Tabaeizadeh vµ cs. 1999, Vidya vµ cs. 2000 [113], Hu vµ Phillips 2001[66]; (McComick vµ cs,1991)[79].v.v...Trong c¸c tµi liÖu tham kh¶o ®0 cã rÊt nhiÒu bµi b¸o chØ ra nh÷ng khã kh¨n ®èi víi qu¸ tr×nh chuyÓn gen vµo c©y cµ chua. C«ng nghÖ chÝn chËm (DR-Delayed Ripening) ®0 ®−îc ¸p dông cho cµ chua, ®u ®ñ vµ d−a hÊu. Mét øng dông ®¸ng chó ý cña c«ng nghÖ DR lµ hiÖn trong nghÒ trång hoa ®ang ¸p dông c«ng nghÖ nµy ®Ó thö nghiÖm nh»m lµm chËm qu¸ tr×nh hÐo cña hoa. C¸c nhµ khoa häc ®0 nghiªn cøu ®Ò ra ph−¬ng ph¸p lµm chËm qu¸ tr×nh chÝn cña qu¶ gióp n«ng d©n cã thÓ chñ ®éng tiªu thô n«ng s¶n vµ ®¶m b¶o cho ng−êi tiªu dïng cã thÓ sö dông nh÷ng s¶n phÈm cßn t−¬i. C¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®0 dïng c«ng nghÖ biÕn ®æi gen ®Ó ®iÒu khiÓn sù tæng hîp ethylene. L−îng ethylene ®−îc t¹o ra cã thÓ ®−îc ®iÒu khiÓn b»ng c¸ch “®ãng” hoÆc lµm gi¶m sù t¹o thµnh ethylene trong qu¶ theo nhiÒu c¸ch. HoÆc còng cã thÓ ®iÒu khiÓn viÖc nhËn ethylene hay øc chÕ ho¹t tÝnh cña polygalacturonase (PG). (Bleecker, 2000) [42] C©y trång GM ®Çu tiªn ®−îc chÊp nhËn trªn thÞ tr−êng lµ dßng cµ chua CGN- 89564-2 (FlavrSavr). Chóng ®−îc t¹o ra bëi C«ng ty Calgene-Mü, ®−îc phª chuÈn lµ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 16 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 16 kh«ng ¶nh h−ëng ®Õn m«i tr−êng vµo n¨m 1992 vµ vµo n¨m 1994, ®−îc phª chuÈn sö dông lµ thøc ¨n cho nguêi vµ ®éng vËt. ë Mexic« dßng cµ chua nµy ®−îc phª chuÈn lµ thøc ¨n cho ng−êi vµ ®éng vËt còng nh− an toµn cho m«i tr−êng vµo n¨m 1995, Canada phª chuÈn lµ thùc phÈm còng vµo n¨m 1995. NhËt B¶n phª chuÈn an toµn m«i tr−êng n¨m 1996 vµ sö dông lµ thùc phÈm n¨m 1997. Dßng cµ chua nµy ®−îc ®−a vµo mét gen lµm cho qu¶ cµ chua mÒm chËm h¬n so víi c¸c gièng cµ chua th«ng th−êng (chÝn chËm), gen ®−îc dïng lµ gen m0 ho¸ polygalacturonase (PG) thuéc anti-sens, gen nµy cã kh¶ n¨ng lµm gi¶m ho¹t ho¸ cña enzyme polygalacturonase (PG), chÝnh enzyme PG chÞu tr¸ch nhiÖm cho viÖc ph©n gi¶i pectin, lµ chÊt duy tr× ®é cøng cho thµnh tÕ bµo thùc vËt. ViÖc ph©n gi¶i pectin x¶y ra lóc b¾t ®Çu qu¸ tr×nh chÝn, lµm cho mÒm qu¶. §Ó t¹o ra qu¶ chÝn chËm b»ng ph−¬ng ph¸p nµy, c¸c nhµ khoa häc ®0 chuyÓn gen anti-sens hoÆc mét ®o¹n b¶n sao cña gen PG vµo trong bé gen cµ chua dÉn ®Õn sù øc chÕ sù t¹o ra enzyme polygalacturonase (PG). Gen ®¸nh dÊu kh¸ng kh¸ng sinh ®−îc dïng trong qu¸ tr×nh chuyÓn gen nµy lµ gen neo gi¶i m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (cã nguån gèc tõ Escherichia coli). Promotor ®−îc sö dông lµ CaMV 35S vµ manopine synthase (A. tumefaciens). (Frary. 1996) [58]; Hu, 2002 [64]… Sau khi tiÕn hµnh nghiªn cøu c«ng nghÖ chÝn chËm vµ c¸c s¶n phÈm cña nã, c¸c c¬ quan qu¶n lý cña Hoa kú ®0 kÕt luËn r»ng c«ng nghÖ chÝn chËm lµ an toµn. Cµ chua t¹o ra nhê c«ng nghÖ nµy cã thµnh phÇn dinh d−ìng gièng nh− cµ chua th«ng th−êng vµ kh«ng cã sù sai kh¸c vÒ møc ®é dÞ øng còng nh− ®éc tè so víi qu¶ cµ chua b×nh th−êng. Ngoµi ra c¸c thö nghiÖm ®ång ruéng còng cho thÊy cµ chua chÝn chËm kh«ng g©y ra bÊt kú mét sù ®e do¹ nµo tíi nh÷ng sinh vËt cã Ých kh¸c. Gièng cµ chua nµy ®−îc d¸n nh0n lµ cµ chua chuyÓn gen vµ cã gi¸ cao h¬n v× nã ®−îc c¶i thiÖn cã mïi vÞ th¬m, ngon h¬n. §o¹n gen ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ biÕn ®æi gen lµ æn ®Þnh, tuy nhiªn vµo thêi ®iÓm nµy, C«ng ty Calgene ch−a cã c¸c kü thuËt ®Ó cµ chua FlavrSavr gi÷ nguyªn chÊt l−îng æn ®Þnh nh− c¸c nh0n m¸c ®0 qu¶ng c¸o. V× vËy nã chØ tån t¹i trong thêi gian vµ råi kh«ng thÊy cã mÆt trªn thÞ tr−êng (Agbios GM-Database, 2008)[32]. Sau cµ chua FlavrSavr c¸c dßng (gièng) cµ chua chÝn chËm (DR) kh¸c còng ®−îc chÊp nhËn ë Hoa kú, Canada, NhËt vµ Mexico, cã Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 17 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 17 mét s¶n phÈm cµ chua purÐe còng ®0 ®−îc chÊp nhËn ë thÞ tr−êng ch©u ©u trong mét thêi gian. Còng dùa trªn c«ng nghÖ chÝn chËm (Delayed Repening - DR), dßng cµ chua chuyÓn gen 1345-4 (Lycopersicon esculentum) ®−îc t¹o ra bëi C«ng ty DNA Plantt Technology Corporation (Mü). Dßng nµy ®−îc t¹o ra tõ dßng cµ chua ban ®Çu cã tªn lµ: 91103-114 th«ng qua kü thuËt chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê vi khuÈn Agrobacterium. Dßng cµ chua nµy cã chøa gen tæng hîp ACC m0 ho¸ 1- Aminocycloproparane -1-Carboxyllic Axit, gen nµy ®−îc t¸ch tõ cµ chua. Enzyme néi sinh nµy chÞu tr¸ch nhiÖm viÖc chuyÓn ho¸ S-adenosylmethionin (SAM) thµnh ACC, lµm chËm qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ethylene. Gen ®¸nh dÊu kh¸ng kh¸ng sinh ®−îc dïng trong qu¸ tr×nh chuyÓn gen nµy lµ gen neo gi¶i m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (cã nguån gèc tõ Escherichia coli). Promotor ®−îc sö dông lµ CaMV 35S vµ nopaline synthase (nos) (cã nguån gèc tõ A. tumefaciens). Dßng cµ chua 1345-4 ®0 ®−îc Mü cho thö nghiÖm ngoµi ®ång ruéng n¨m 1992, cã kh¶ n¨ng vËn chuyÓn xa vµ b¶o qu¶n l©u h¬n c¸c lo¹i cµ chua kh¸c v× qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ethylene bÞ chËm l¹i. Chóng ®−îc c¬ quan Qu¶n lý Thuèc vµ l−¬ng thùc Mü (US FDA) phª chuÈn lµm thùc phÈm 1994 vµ phª chuÈn lµ an toµn m«i tr−êng n¨m 1995. ë Canada phª chuÈn lµm thùc phÈm n¨m 1995 vµ ë Mexico ®−îc phª chuÈn nh− mét thùc phÈm n¨m 1998 (Agbios GM-Database, 2008). [32] Mét dßng cµ chua cã kh¶ n¨ng chÝn chËm kh¸c lµ dßng 35-1N (Lycopersicon esculentum) còng ®−îc ra ®êi nhê c«ng nghÖ DR. Dßng nµy ®0 ®−îc t¹o ra tõ dßng cµ chua Chery ®á, qu¶ to, th«ng qua kü thuËt chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê vi khuÈn Agrobacterium, sö dông vect¬ nhÞ nguyªn tõ c«ng ty Agritope Inc Mü. Dßng cµ chua nµy cã chøa b¶n dÞch cña gen sam-K ®0 söa ®æi ë vïng 5’ víi tr×nh tù liªn øng Kozac. Gen sam-K ®−îc t¸ch tõ E.coli bacteriophage T3, gen nµy m0 ho¸ enzyme hydrolaza S-adenosylmethionin (SAMase), enzyme néi sinh nµy chÞu tr¸ch nhiÖm viÖc chuyÓn ho¸ S-adenosylmethionin (SAM) thµnh ACC, lµm chËm qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ethylene. SAM ®ãng mét vai trß trung t©m trong rÊt nhiÒu b−íc cña qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ë thùc vËt. Sù biÓu hiÖn cña gen sam-K d−íi sù kiÓm so¸t cña mét c¬ quan ®Æc biÖt ë qu¶ vµ mét promotor t¹m thêi. Gen ®¸nh dÊu ®−îc dïng trong tr−êng hîp nµy còng lµ gen neo (t¸ch tõ E. coli), promoter sö dông cho gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 18 nµy nopaline synthase (nos) (A. tumefacien). N¨m 1996 dßng cµ chua nµy ®−îc Mü phª chuÈn sö dông nh− nguån thøc ¨n vµ an toµn vÒ m«i tr−êng. Gen kh¸ng c«n trïng Mét s¶n phÈm cµ chua n÷a còng ®0 ®−îc t¹o ra nhê c«ng nghÖ biÕn ®æi gen ®ã lµ dßng cµ chua 5345 do C«ng ty Monsanto t¹o ra. Dßng cµ chua 5345 (Lycopersicon esculentum) ®0 ®−îc t¹o ra tõ gièng cµ chua UC82B b»ng kü thuËt chuyÓn gen gi¸n tiÕp th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens. Chóng ®−îc c¬ quan qu¶n lý Thuèc vµ L−¬ng thùc Mü (US FDA) cho phÐp trång vµ thö nghiÖm ë Mü vµo n¨m 1994. Dßng cµ chua nµy cã chøa gen cry 1 Ac (gen nµy ®−îc t¸ch tõ vi khuÈn ®Êt Bacillus thuringiensis subsp. Kursta (Bt.k), train HD73), gen nµy m0 ho¸ protein kh¸ng s©u bä Cry1Ac delta-endotoxin. Gen ®¸nh dÊu lµ gen kh¸ng kh¸ng sinh (neo) gi¶i m0 enzyme neomycin phosphotransferase II (NPTII) (cã nguån gèc tõ Escherichia coli) vµ sö dông mét enzyme kh¸c nh− lµ mét marker chän läc vi khuÈn, 3’’ (9)-O-"(9)-O-aminoglycoside adenylyltransferase (AAD). Gen m0 ho¸ AAD kh«ng biÓu hiÖn trong thùc vËt, nã ®−îc sö dông trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn chän läc c¸c dßng vi khuÈn mµ ®0 ®−îc biÕn n¹p víi c¸c ADN cña plasmid ®0 ®−îc t¸i tæ hîp. Promotor ®−îc dïng trong tr−êng hîp nµy lµ CaMV35S, nos promotor vµ promotor vi khuÈn. Protein Cry1Ac tá ra ho¹t tÝnh kh¸ng cã tÝnh chän läc cao, dßng 5345 cã kh¶ n¨ng kh¸ng ®−îc 1 sè loµi trong hä s©u bä c¸nh vÈy vµ kh«ng h¹n chÕ víi s©u ®ôc ngän thuèc l¸ (tobacco budworm), s©u ®ôc qu¶ c©y b«ng (cotton bollworm) vµ s©u h¹i c©y hoa cÈm ch−íng (pink bollworm). Dßng cµ chua nµy ®−îc phª chuÈn ë Mü vÒ an toµn m«i tr−êng vµ lµm thùc phÈm 1998 vµ phª chuÈn ë Canada nh− mét thùc phÈm n¨m 2000 (Agbios GM Database, Product Description 5345, 2008)[36]. MÆc dï cã nh÷ng thµnh c«ng trong chuyÓn gen vµo cµ chua, cã nhiÒu kÕt qu¶ vµ nhiÒu nghiªn cøu rÊt c«ng phu, nh−ng hÇu hÕt c¸c quy tr×nh tõ nu«i cÊy m« ®Õn chuyÓn gen ®Òu rÊt cång kÒnh, nÆng nÒ vµ hÇu nh− dùa qu¸ nhiÒu vµo yÕu tè kh¸c nh− c¸c dung dÞch huyÒn phï cña thuèc l¸, hay c¸c líp máng tÕ bµo cña hoa d¹ yÕn th¶o. Nh÷ng c«ng thøc vÒ m«i tr−êng nu«i cÊy rÊt mÊt thêi gian, hoÆc liªn tôc ph¶i cÊy chuyÓn, nÕu kh«ng sÏ cã nhiÒu biÕn dÞ ®¸ng kÓ xÈy ra. C¸c ®iÒu kiÖn tèi −u cho Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 19 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 19 chuyÓn gen còng rÊt t¶n m¹n, ch−a ®−îc hÖ thèng ho¸. V× vËy n¨m 2003, Park vµ cs. ®0 b¸o c¸o c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ chuyÓn gen víi 5 gièng cµ chua th−¬ng m¹i th«ng qua vi khuÈn agrobacterium tumefaciens. T¸c gi¶ ®0 sö dông nhiÒu lo¹i mÉu cÊy kh¸c nhau: l¸ mÇm, trô l¸ mÇm vµ l¸ thËt víi tuæi c©y rÊt non, ®Æc biÖt sö dông nhiÒu m«i tr−êng t¸i sinh kh¸c nhau. Môc ®Ých lo¹i bít nh÷ng b−íc kh«ng cÇn thiÕt, nghiªn cøu c¸c m«i tr−êng lµm ®¬n gi¶n h¬n vµ hiÖu qu¶ h¬n quy tr×nh t¸i sinh c©y con tr−íc vµ sau chuyÓn gen ®Ó cã thÓ t¨ng hiÖu qu¶ gen chuyÓn vµ mong muèn t×m ra ®−îc m«i tr−êng t¸i sinh c©y cµ chua hiÖu qu¶. T¸c gi¶ ®−a ra ®−îc mét quy tr×nh t−¬ng ®èi hÖ thèng cã thÓ ¸p dông cho c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen c©y cµ chua nãi chung. MÆc dï c¸c nghiªn cøu cña Park vµ cs. 2003 [107] rÊt hÖ thèng vµ tÇn sè biÕn n¹p cao ë c¶ 5 gièng ®−îc sö dông trong nghiªn cøu trªn 20%. §iÒu ®Æc biÖt ë m«i tr−êng t¸i sinh kh«ng cÇn ph¶i cã nh÷ng phô gia nh− c¸c dÞch huyÒn phï cña cµ chua hay c¸c líp máng tÕ bµo cña c©y thuèc l¸ vµ c©y d¹ yÕn th¶o. C¸c quy tr×nh nµy cã thÓ thùc hiÖn réng tíi 5 gièng cµ chua th−¬ng m¹i, nh−ng ®ã lµ c¸c gièng cô thÓ cña tõng vïng s¶n xuÊt, tõng kiÓu gen riªng biÖt. Tuy nhiªn Park vµ cs. ch−a ®Ò cËp ®Õn c¸c d¹ng hoang d¹i, ®ã lµ mét nguån gen v« cïng phong phó cho c«ng t¸c chän t¹o gièng cµ chua, nghiªn cøu cña t¸c gi¶ lµ chuyÓn gen chØ thÞ GUS, víi chñng vi khuÈn LBA4404 mang vector pBI121. ViÖc sö dông c¸c kü thuËt kh¸c nhau ®Ó kiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña gen chuyÓn lµ mét trong nh÷ng kh©u cÇn thiÕt ®Ó x¸c nhËn sù thµnh c«ng cña chuyÓn gen vµ nh©n nhanh c¸c vËt liÖu ®−îc chuyÓn gen còng nh− x¸c ®Þnh c¸c hiÖu qu¶ cña gen chuyÓn trong c©y cµ chua ®−îc chuyÓn gen. Theo c¸c nghiªn cøu cña Z.K. Punja, 2001; Schlumbaum, A. vµ cs, 1986: gen Chitinase cã nguån gèc kh¸c nhau khi cã mÆt trong c©y cµ chua lµm gi¶m møc ®é g©y bÖnh cña nhiÒu lo¹i nÊm nh− Botrytis cinerea, Rhizoctonia, chóng còng lµm gi¶m sù ph¸t triÓn cña Verticillium dahliae chñng 1 vµ 2. Sù biÓu hiÖn cña Glucanase ë c¸c c©y chuyÓn gen còng gÇn gièng nh− sù biÓu hiÖn cña Chitinase. Sù kÕt hîp gi÷a Chitinase vµ Glucanase cho hiÖu suÊt cao h¬n trong viÖc phßng ngõa sù ph¸t triÓn cña c¸c nÊm g©y bÖnh víi phæ réng h¬n so víi dïng tõng gen ®¬n lÎ (Lawrence vµ cs, 2000) [70]. Osmotin lµ mét protein 24- kDa thuéc hä PR - 5, nã cã ho¹t tÝnh kh¸ng nÊm, khi kÕt hîp víi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 20 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 20 Chitinase vµ β - 1,3 - Glucanase th× gi¶m sù mÉn c¶m víi nÊm Fusarium oxysporum f.sp. (Van Roekel et al, 1993) [111]. Sù cã mÆt cña Osmotin trong cµ chua chuyÓn gen lµm chËm sù ph¸t triÓn cña nÊm g©y bÖnh Phytophthora infestans. Cho ®Õn nay, ë ViÖt Nam c¸c nghiªn cøu vÒ chuyÓn n¹p gen vµo c©y trång chñ yÕu ®−îc tiÕn hµnh ë ViÖn Di TruyÒn N«ng NghiÖp, ViÖn C«ng NghÖ Sinh Häc, ViÖn Lóa §ång B»ng S«ng Cöu Long, ViÖn Sinh Häc NhiÖt §íi vµ mét sè c¬ quan kh¸c. Mét sè dù ¸n quèc gia vµ quèc tÕ còng ®0 vµ ®ang tµi trî cho h−íng nghiªn cøu chuyÓn n¹p gen. Chóng ta ®0 b−íc ®Çu thµnh c«ng trong viÖc chuyÓn mét sè gen cã ý nghÜa kinh tÕ nh− kh¸ng thuèc diÖt cá, kh¸ng s©u, bÖnh, pro- vitaminA,… vµo c©y lóa, b¾p c¶i, ng«, ®u ®ñ, c©y hoa. Tuy nhiªn nh÷ng thµnh c«ng nµy míi chØ ®¹t tíi thµnh c«ng ë thÝ nghiÖm, nh−ng ch−a ra triÓn khai trong s¶n suÊt. Phßng BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp víi sù gióp ®ì cña ViÖn Nghiªn cøu Khoa häc N«ng nghiÖp Ph¸p (INRA), ®0 thu ®−îc vector cã chøa gen Capside Protein (CP) kh¸ng virus, ®0 chuyÓn thµnh c«ng vµo c©y cµ chua, khi cã mÆt cña gen nµy trong c©y cµ chua th× nã cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh virus Y khoai t©y. (Astier,2001) [37]. ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®0 thu thËp ®−îc vector mang gen Glucanase, Chitinase, CP, Cry ... vµ c¸c vËt liÖu nµy ®ang ®−îc l−u gi÷ t¹i Phßng BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt - ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp. L0 TuÊn NghÜa vµ cs n¨m 1995 [15], ®0 x©y dùng quy tr×nh chuyÓn gen chØ thÞ th«ng qua Agrobacterium, c¸c t¸c gi¶ còng ®0 chän ®−îc chñng Agrobacterium LBA 4404 lµ chñng thÝch hîp cho viÖc chuyÓn gen chØ thÞ vµo 7 gièng cµ chua ViÖt nam. §0 thu ®−îc tÇn sè biÕn n¹p cao: 7,98% ®èi víi mÉu lµ m« l¸, cßn ®èi víi mÉu lµ m« l¸ mÇm ®¹t 59,12%. ChuyÓn gen lµ mét c«ng cô bæ sung cho chän t¹o gièng truyÒn thèng vµ cã thÓ gióp cho viÖc më réng c¸c nguån gen cã lîi sang c¸c gièn._.t vµ b¶o vÖ thùc vËt, NXB chÝnh trÞ Quèc gia, Hµ néi 26. KiÒu ThÞ Th− (1998), “Nghiªn cøu kh¶ n¨ng chÞu nãng cña tËp ®oµn c«ng t¸c cµ chua vµ øng dông trong chän t¹o gièng trång tr¸i vô”, LuËn v¨n tiÕn sü N«ng nghiÖp 27. D−¬ng Kim Thoa (2005),” Nghiªn cøu ®Æc ®iÓm N«ng sinh häc cña c¸c tæ hîp lai cµ chua ®ªt phôc vô chÕ biÕn vô Thu §«ng vµ Xu©n hÌ t¹i Gia l©m-Hµ néi”, LuËn v¨n Th¹c sü N«ng nghiÖp 28. D−¬ng Kim Thoa; TrÇn, Kh¾c Thi vµ cs. (2005). “KÕt qu¶ chän t¹o gièng cµ chua chÕ biÕn PT 18”. T¹p chÝ N«ng nghiÖp vµ PTNT, 2005, N0 7, Tr. 33-35 29. §ç N¨ng VÞnh (2002). C«ng nghÖ sinh häc c©y trång. Nxb N«ng nghiÖp Hµ Néi. 30. §ç N¨ng VÞnh (2005), C«ng nghÖ thùc vËt tÕ bµo øng dông, Nxb N«ng nghiÖp Hµ Néi. Tµi liÖu tiÕng n−íc ngoµi 31. AFP, 2005, Reuters, 2005). 32. Agbios GM-Database (2008), Product Descreption 33. Amarijit A. and Basts S., (2001) “Plant Growth Regulators in Agriculture Role and Commercial Uses”, Haworth Press, Inc, 34. Ankenbauer RG., and Nester EW., (1990).“Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides”. Journal of Bacteriology 172: 6442-6446. 35. Applewhite PB., Kaur SR., and Galston AW., (1994), “Isatin as an auxin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 135 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 135 source favoring floral and vegetative shoot regeneration from callus produced by thin layer explants of tomato pedicel”. Plant Growth Regul 15: 17-21. 36. Asakura N., Misoo S., Kamijima O. and Sawano M (1995), “High frequency regeneration of diploids from apical end of cultured hypocotyls tissue in tomato”. Breed. Sci. 45: 455-459. 37. Astier S., Albouy J., Maury Y. and Lecoq H. (2001), “Principes de virology VÐgÐtal (Genom, Pouvoir pathogÌne, Ðcologie des virus”, INRA Editions, 5/2001. 38. Bennett J., (1993), “Genes for crop improvement Genetic Engineering”, Vol. 15, 1993; Edited by J. K Setloz Plenum Press, New York, Pg 165 - 187 39. Bhat S., Srinivasan R., (2002). “Molecular and genetic analyses of transgenic plants: Consideration and approaches”. Plant Science, 163: 673-681 40. Bhatia P., and Nanjappa A., (2008), “Improving the Quality of in vitro Cultured Shoots of Tomato”, Biotechnology 7 (2), p.188-193. 41. Binns A.N., and Thomashow M.F., (1988). “Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants”. Annual Review of Microbiology 42: 575-606. 42. Bleecker A.B. and.Kende H. (2000). “Ethylene: a gaseous signal molecule in plants”. Annu.Rev. Cell Dev. Biol.16:-18. 43. Broadbent L., (1976). “Epidemiologiy and control of tomato mosaic virus. Annu”. Rev Phytopathol. 14, p. 75-96 44. Campbell N.A. and Reece J.B. (2002): Biology, Benjamin Cummins,1247pp 45. Cangelosi, G.A., Ankenbauer, R.G., and Nester E.W., (1990) “Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein”. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 6708-6712. 46. Cangelosi, G.A., Best E.A., Martinetti C., and Nester E.W., (1991).” Genetic analysis of Agrobacterium tumefaciens”. Methods in Enzymology 145: 177-181. 47. Carrington JC. (1990).” Expression of the initation codon of plum pox Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 136 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 136 potyvirus genomic RNA”. Virology, 185, 544-552 48. Chyi YS. and Phillips GC., (1987). “High efficiency Agrobacterium- mediated transformation of Lycopersicon based on conditions favorable for regeneration”. Plant cell Rep. 49. Clark M.F., and Adams AM. (1977) “Characteristics of the microplate method of Enzyme- Linked Immunosorbent Assay for the detection of plant virus”. Gen. Virol. 34, 1977, p. 475-483. 50. Cohen C.K. , Garvin, D.F. and Kochian, L.V. (1998). “The role of iron- deficiency stress responses in stimulating heavy metal transport in plants”. Plant Physiol. 116, 1063-1072 51. Datta, K., Tu J., Oliva N., Ona I., Velazahahan R., Mew TW., Muthukrishnan S., Datta SK (2001) “Enhanced resistance to sheath blight by constitutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars”. Plant Sci. 160(3): 405-414. 52. Davis M. E., Lineberger R.D. and Miller A.R., (1991) “Effects of tomato cultivar, leaf age, and bacterial strain on transformation by Agrobacterium tumeffaciens”. Plant cell, Tiss. Org. Cult: 115-121 53. De Haan P., De Rover A.R, Van Schepen A., (1996) ‘Transgenic Strategies to Obtain Resistance to Cucumber Mosaic Virus (CMV) in Tobacco and Tomato Plants’. S&G Seeds B.V., Dept. of Technology, 1600 AA Enkhuizen, the Netherlands. 54. De Verna J., Rick C., Chetelat R., Lanini B., Alpert K. (1990) “Sexual hybridization of Lycopersicon esculemtum and Solanum rickii by means of a sesqidiploid bridging hybrid”. Peoc. NAtl. Acad. Sci. USA. 87:9486-9490 55. De Vleesschauwer D., Cornelis P., Hofte M., (2006) “Redox-active pyocyanin secreted by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 triggers systemic resistance to Magnaporthe grisea but enhances Rhizoctonia solani susceptibility in rice”. Mol Plant Microbe Interact, 19(12) 1406-1419. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 137 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 137 56. FAOSTAT Database 11/2006. 57. Fillati J., Kiser J., Rose R., and Comai L., (1987) “Eficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using binary Agrobacterium tumefaciens vector”. Bio/technology. 5: 726-730. 58. Frary A., ED.Earle, (1996) “An examination of factor affecting the efficiency of Agrobacterium - mediated transformation of tomato”. Plant Cell Rep. 59. Gubis J. Zuzana L., Jurai F., Zuzana J., (2004), “Effect of growth regulators on shoot induction and plant regerenation in tomato”, Biologia, Brastislava, 59/3, p405-408. 60. Hamilton C.M., (1997) “A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA”. Gene 200: 107-116. 61. Hooykaas P.J.J., and Shilperoort R.A., (1992). “Agrobacterium and plant genetic engineering”. Plant Molecular Biology 19: 15-38. 62. (2008) 63. (2008) 64. Hu K.L., Fu Q., Wang G., Hu Z., (2002).“Studies on transformation of Lycopersicon esculentum with cucumber mosaic virus coat virus coat protein gene“. South China Agri. Uni., 23: 34-36 65. Hu S., Lau, K.W.K., and Wu, M.,(2001). “Cadmium sequestration in Chlamydomonas reinhardtii.” Plant Sci. 161, 987-996 66. Hu W. and Philips GC., (2001) “A combination of overgrowth- control and antibiotics improves Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformation efficiency for cultivated tomato (L. esculentum)”. In vitro cell Bio-Plant. 67. Jeon G.A., et al (1998). “The role of inverted repeat (IR) sequence of the virE gene expression in Agrobacterium tumefaciens pTiA6”. Molecules and Cells 8: 49-53. 68. Kagi J.H.R. (1991) Methods Enzymol. Page 613-626 69. Kaparakis G., Alderson PG., (2002) “Influence of high concentration of cytokinins on the production of somatic embryos by germinating seeds of Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 138 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 138 tomato”, aubergine and pepper.J. Hort. Sic. Biotechnol. 70. Lawrence CB., et al (2000) “Constitutive hydrolytie enzymes are associated with polygenic resistance of tomato to Altermania solani and may function as an elicitor release mechanism.” Physiol. Mol. Plant Pathol 57: 211-220. 71. Lecomte L., Hosptital F., Buret M., and Causse M., (2004). “Recent advances in molecular Breeding; the example of tomato breeding for flavor traits”. Acta hort.637:231-242 72. Lercari B., Manetti A., Bertram L (2002) “Temporal and spatial patterm of ligh- dependent acquisition of competence for shoot formation in tomato hypocotyl” I light pulse condition. Adv. Hort. Sci. 73. Macheix J., (1997) “Les plantes transgeniques”; Cente national de la recherech scientifique Pg 1-9 74. Macua J.I., (2002) “Variety trials in Spain, Tomato news: Tomato paste lines”, Food Engineering Co.Spaon, pp.31-34 75. Martin MT. and Garci, (1991). “Plum pox potyvirus RNA replication in a crude membrane fraction from infected Nicotiana clevelandii leaves”. J. Gen. Virol.,72, 755-790. 76. Massaaki H., (2005), “Vegetable growing under proteced cultivation”, Farming Japan, Vol.39/1/2005, pp 30-36. 77. Maury Y., Duby C., Bossennec J.M., Boudazin G., (1985). “Group analysis using ELISA: Determination of the level of transmission of Soybean mosaic virus in soybean seed”. Agronomie, 5, 405-415. 78. McCormick S., Niedermeyer J., Fry J., Barnason A., Horsch R, Fraley R. (1986). “Left disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens”. Plant Cell Rep., 5: 81-84 79. McCormick S., (1991). “Transformation of tomoto with Agrobacterium tumefaciens.” In: Lindsey K, ed. Plant tissue manual. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, B6, 1-9 80. Meerovitch K., Nicholson R., Sonnenberg N. (1991), “In vitro mutational Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 139 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 139 analysis of cis-acting RNA translational elements within the poliovirus type 25’ untranslated region”. J. vitrol., 65, 5895-5901. 81. Melchers L S., and Stuiver M H. (2000) “Novel genes for disease resistance breeding”. Curr. Opin. Plant. Biol 3: 147-162. 82. Moghaieb R., Saneoka H., Fujita K. (2004). “Shoot regeneration from GUS- transformed tomato (Lycopersicon esculentum) hair rooot”. Cell. Mol. Biol. Lett., 9: 439-449. 83. Moore, S., Payton, P., Wrigth, M., Tanksley, SD., and Giovannoni, J. (2005). “Utilization of tomato microarrays for comparative gene expression analysis in the Solanaceace”. J. exp Bot. 56: 2885-2895 84. Muigai, S.G., Bassett, M.J., Schuster, D.J., Scott, J.W., (2003). “Greenhouse and field screening of wild lycopersicon germplasm for resistance to the whitefly Bemisia argentifolii”. Phytoparasitica 31:1-12 85. Murashige T., and Skoog F. (1962) “A revised medium for rapid growth and bioassayas with tobacco tissue cultures”. Physiol. Plant 15, pp. 473-497. 86. Nedkovska M., Gorinova N., Rodeva A. (2002). “Heavy metal tolerancer in tomato plants”. Roll Copany, Sofia, Bulgaria, pp.37. 87. Nora G., Medkovska M.; Todorovska E., Todorovska E., Velitchka R., Stanislava G., (2005) “Development of genetically engineered tomato forms resistant to heavy metals”. Genetics and Breeeding.N0 Sofia. 88. Orbach MJ., (2007), “Agrobacterium-mediated transformation to create an insertion library in Magnaporthe grisea”. Methods Mol Biol. 354: 57-68. 89. Ovecka M, Bobak M. and Samaj J. (2002) “A comparative structural analysis of direct and indirect shoot regeneration of papaver somniferum L. in vitro”. J. Plant Physiol. 90. Peralta I.E., Knapp S., and Spooner D.M., (2005). ”Relationships and morphological characterisation of wild tomatoes (Solanum L. Section Lycopersion Mill”. Wettst. Subsection Lycopersion). Monogr. Syst. Bot. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 140 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 140 Missour Bot. Garden: 227-257 91. Peralta, I.E., Knapp S., and Spooner D.M., (2006). “The taxonomy of tomatoes. Arevision of wild tomatoes, Solanum L. section Juglandifolium (Rydb). Child and Lycopersicoides (child) Peralta. Monogr. Syst. Bot. Missouri Bot”. Garden: (in press) 92. Peralta, I.E., Knapp S., and Spooner D.M., (2005). “New species of wild tomatoes, Solanum Section lycopersion: Solanaceae from Northern Peru”. Syst. Bot.30: 424-434. 93. Peres L., P. Morgante, C.Vecchi, J Kraus, M. Van Sluys. (2001). “Shoot regeneration capacity from roots and transgenic hairy roots of tomato cultivars and wild related species”. Plant Cell. Tiss. Org. Cult., 65: 37-44 94. Poojrez-MI., Rodriguez-Moreno L., Matas I.M., Ramos C., (2007) “Strain selection and improvement of gene transfer for genetic manipulation of Pseudomonas savastanoi isolated from olive knots”. Res Microbiol. Jan- Feb;158(1):60-69. 95. Ramiah M. and Rajappan K., (1996) “Direct shoot regeneration from excised cotyledonary leaf of tomato”, South Indian Hort. 96. Rho HS, Kang S. and Lee YH., (2001) “Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the plant pathogenic fungus, Magnaporthe grisea”. Mol Cells. 12(3): 407-411. 97. Rick C. M., (1978). “The Tomato”, Scientific Amer. 239: 76-87 98. Rick C. M., (1983). “Genetic variability in tomato species”, Plant Molecular Biology Reporter 1: 81-87. 99. Rick C. M., 1976. Tomato. In Evolution of Crop Plants N. W. Simmonds, ed. Longman, NY. pp. 268-272. 100. Rick C.M., (1982). “The potential of exotic germplasm for tomato improvement. In Plant Improvement and Somatic Cell Genetics “. D. Evans, R. Sharp, eds. Academic Press NY. pp. 1-27. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 141 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 141 101. Rick C.M., and Forbes J.F., (1975). “Allozyme of Galapagos tomatoes: Polymorphism, geographic distribution, and affinities”. Evolution 29: 443-457. 102. Romero et.al. (2001). “Enhanced regeneration of tomato and and pepper seedling explants for Agrobacterium - mediated transformation”. Plant Cell Tissue and Organ Culture 67: 173-180 103. Rosen R., Matthysse A., Becher D., Biran D., Yura T., Hecker M., Ron E., (2003). “Proteome analysis of plant-induced proteins of Agrobacterium tumefaciens”. FLMS Microbiology Ecology, 44: 355-360. 104. Shan H.Y., Li X.W., Li D., Shao S.D., Liu B. (2004), “Differential expression of specific protein in vitro tomato orgagenesis”, Russian Journal of Plant Physiology, vol.51, p.379-385. 105. Shen L., Sheng J., Luo Y. (1998). “Tomato transgenatic [transgenic] system with Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens”. J. China Agri. Uni., 5: 101-105. 106. Stanton B., (1994), “Transgenic plants to investigate responses to the enviroment”, 1994; National Science Foundation, Pg 1-8 107. Sung HP., Jay L. M., Jung Eun P., Kendal D. H., Roberta H. S., (2003). ‘Efficinet and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation’. Journal of Plant Physiol. 160: 1253-1257. 108. Suzane E., Mar S., Mark C., (2001) “Identification and characterization of chitinase antigen Pseudomonas aeruginosa strain 385”. Appl.Entomol.Zool. EnviroMicrobiol. 67(9): 4001-4008. 109. Taylor I. B., (1986) “Biosystematics of the Tomato, In: The Tomato crop. A Scientific Basis for Improvement” (J. Atherton and C. Rudich, ed). New York, Chapman and Hall, p. 1-34. 110. Terras G., et al. (1995), “In vitro Anti-fungal Activity of a Radish (Raphanus sativus L.). Seed Protein Homologous to Nonspecific Lipid Transfer Proteins”. Plant Physiol. 100: 1055-1058. 111. Van Roekel J.S., Damm L.S., Melchers A. (1993). “Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum)”. Plant Cell Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 142 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 142 Rep., 12: 644-647. 112. Veluthambi K., Gupta A., Sharma A. (2003). “The current status of plant transformation technologyes”. Current Sci, 84: 368-380. 113. Vidya CSS., Manhaaron, M., Kumar C.T.R., Savithri H.S., Sita G.L. (2000) “Agrobacterium - mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum var. Pusa Ruby) with coat- protein gene of Physalis mottle tymovirus”. J Plant Physiol. 114. Zang S.Q., Ye Z. and Wu C. (1999). “Genetic transformation of isopentenyl transferase gene to tomato and regeneration of transgenic plants”. Acta Hort. Sinica, 26: 376-379 115. Zupan J.R., and Zambryski P.C. (1995). “Transfer of T-DNA from grobacterium to the plant cell”. Plant Physiology 107: 1041.1047. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 143 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 143 Phô lôc Phô lôc 1 1. C¸c b−íc thùc hiÖn cña phÐp thö DAS-ELISA: gåm 5 b−íc B−íc 1: §Æt kh¸ng thÓ (antibody) ®Æc hiÖu vµo giÕng plaque: 100 ul/giÕng, ñ trong 2 h ë 370C. Röa ®Üa 3 lÇn b»ng dung dÞch ®Öm P.B.S. B−íc 2: Cho dÞch mÉu cÇn kiÓm tra vµo ®Üa plate: 100 ul/giÕng, ñ ë 370C trong 2 h hoÆc 1 ®ªm ë 4 0C. Röa ®Üa 3 lÇn b»ng dung dÞch ®Öm P.B.S. B−íc 3: §Æt kh¸ng thÓ cã g¾n enzyme (Phosphatase Alcaline), ñ ë 370C trong 2,5 h. Röa ®Üa 3 lÇn b»ng dung dÞch ®Öm P.B.S. B−íc 4: Cho chÊt hiÖn mµu (substrat): 100 ul/giÕng, ñ ë 370C trong 30 phót ®Õn 2h. Cã thÓ dïng 50 ul dung dÞch NaOH 3M ®Ó dõng ph¶n øng. B−íc 5: §äc kÕt qu¶ b»ng m¸y ®o mµu quang häc ë b−íc sãng 405 nm. ChØ sè quang häc O.D thÓ hiÖn kÕt qu¶ cña ph¶n øng O.D lín gÊp 2 lÇn O.D ®èi chøng s¹ch bÖnh lµ c©y ®0 bÞ nhiÔm virót. ChuÈn bÞ mÉu cho phÐp thö ELISA: - H¹t thu thËp tõ c¸c nguån kh¸c nhau. Mçi nguån thu thËp ®−îc ph©n 5 l«/gièng (12000 h¹t/l«), mçi l« 3 nhãm 4000/nhãm, mçi nhãm lÊy 3 mÉu (3 lÇn nh¾c l¹i), mçi lÇn nh¾c l¹i 150 h¹t vµ nghiÒn trong dung dÞch ®Öm P.B.S.-T + P.V.P - Kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu vµ kh¸ng thÓ cã g¾n enzyme ®−îc pha lo0ng trong dung dÞch P.B.S.-T + 2% P.V.P. theo tû lÖ cho s½n cña h0ng. - ChÊt hiÖn mµu: hoµ 1 viªn /5 ml dung dÞch ®Öm Substrat. - TÊt c¶ c¸c chÊt trªn chØ chuÈn bÞ tr−íc khi cÇn sö dông. 2. M«i tr−êng MS c¬ b¶n (Murashige-Skoog, 1962) • Thµnh phÇn kho¸ng ®a l−îng nh− sau: Muèi o KNO3 o KH2PO4 o NH4NO3 o CaCl2.2H2O Mg/l 1900 170 1650 440 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 144 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 144 o MgSO4.7H2O o Na2EDTA o FeSO4.7H2O 370 37.7 27.8 • Thµnh phÇn kho¸ng vi l−îng: Muèi o H3BO4 o MnSO4.7H2O o ZnSO4. 7H2o o KI o CuSO4.5H2O o CoCl2.6H2O o Na2MoO4.H2O Mg/l 6,2 170 10,5 0,83 0,025 0,025 0,25 • Vitamin: o Glycin o Nicotinic acid o Pyridoxin HCl o Myo-inositol o Thiamine.HCl mg/l 2 0,5 0,5 100 1 • Thµnh phÇn h÷u c¬ bæ sung: o §−êng o Th¹ch o N−íc dõa 30g/l 8g/l 15% • C¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng: o NAA: o BAP: o KIN P: ( Napthenele acetic acid) ( 6- benzylaminopurin ) ( Kinetin ) 3. M«i tr−êng LB láng (Luria vaf Bertani) (theo Ausubel vaf cs., 1987) Bacto-Trypton: 10g/l Bacto-Yeast extract: 5g/l NaCl: 10g/l Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 145 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 145 pH : 7,0 chØnh pH b»ng 5N NaOH H2O : bæ sung tíi thÓ tÝch 1000 m1 M«i tr−êng ®Æc: cho thªm 15g/l Bacto-agar (15 g/l) TiÒn nu«i cÊy L¸ mÇm vµ trô l¸ mÇm ®−îc c¾t nhá ®Æt vµo ®Üa petri ®0 ®−îc khö trïng cã chøa m«i tr−êng MS1, tiÒn nu«i cÊy trong phßng tèi 24 giê. Sau ®ã mÉu ®−îc lÊy ra dïng vµo biÕn n¹p gen. 4. Nu«i chủng Agrobacterium tumefaciens và ñồng nu«i cấy. Nu«i chủng Agrobacterium tumefaciens cã chøa gen Glucanase và ñồng nu«i cấy. - Nu«i vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens trong 50 ml dung dÞch LB láng cã chøa 50mg/l Ryfamicin vµ 50 mg/l Hygromycin, nu«i l¾c 180 vßng/ phót ë 280C+1 trong 1 ngµy ®ªm. ChuyÓn 5 ml dÞch nu«i vµo 25ml m«i tr−êng LB cã chøa 50 mg/l Rifamycin vµ 50 mg/l Hygromycin, nu«i l¾c 200 vßng/phót ë 280C + 1 nu«i qua ®ªm (nu«i qua ®ªm sau ®ã ®o mËt ®é vi khuÈn ë b−íc sãng 600nm cã OD = 0,5-0,6 - ChuyÓn dÞch tÕ bµo vi khuÈn sang èng ly t©m 50 ml vµ lµm l¹nh trong ®¸ 15’. Ly t©m dung dÞch ë 3000 vßng/phót trong 30 phót. Bá líp dÞch bªn trªn, röa cÆn b»ng 20 ml dung dÞch MgSO4 (10mM). Röa l¹i mét lÇn n÷a b»ng chÝnh dung dÞch MgSO4 (10mM). - HuyÒn phï ho¸ cÆn vi khuÈn b»ng mét l−îng nhá m«i tr−êng láng MS1 cã chøa 250 mg/l acetosyringone. - §o mËt ®é quang häc ë b−íc sãng 600 nm, khi mËt ®é quang häc OD=0,5- 0,6. Dung dÞch vi khuÈn ®−îc hoµ lo0ng víi 3 nång ®é huyÒn phï kh¸c nhau thÝch hîp cho chuyÓn gen (1:10; 1:15 vµ 1:20). - Cho mÉu vµo dung dÞch vi khuÈn l¾c nhÑ kho¶ng 5-7 phót, thÊm kh« mÉu b»ng giÊy thÊm whatman vµ chuyÓn chóng sang m«i tr−êng MS1 cøng cã chøa 250 mg/l Acetosiringone ®Ó ®ång nu«i cÊy. Qu¸ tr×nh ®ång nu«i cÊy duy tr× ë nhiÖt ®é 240C+1oC, trong tèi víi 3 thêi gian kh¸c nhau: 36 tiÕng 48 tiÕng vµ 60 tiÕng. Nu«i chủng Agrobacterium tumefaciens cã chøa gen Defensin và ñồng nu«i cấy. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 146 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 146 - Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens cã chøa gen Defensine ®−îc nu«i 18 giê trong m«i tr−êng LB láng víi 50 mg/l Kanmicyne vµ 50mg/l Rifamicine ë 280C. - Ly t©m dung dÞch ë 3000 vßng/phót trong 20 phót. - §o mËt ®é quang häc ë b−íc sãng 600 nm, khi mËt ®é quang häc OD=0,5- 0,6. Dung dÞch vi khuÈn ®−îc hoµ lo0ng víi 3 nång ®é huyÒn phï kh¸c nhau thÝch hîp cho chuyÓn gen (1:10; 1:15 vµ 1:20). - Trén lÉn dÞch huyÒn phï tÕ bµo vi khuÈn víi c¸c mÉu l¸ mÇm vµ trô l¸ mÇm (in vitro) ®−îc c¾t nhá. L¾c nhÑ tõ 3-5 phót sau ®ã thÊm kh« mÉu b»ng giÊy thÊm whatman ®0 ®−îc khö trïng vµ chuyÓn chóng sang m«i tr−êng ®ång nu«i cÊy MS1 bæ sung 250 mg/l Acetosiringone trong 36 g׬, 48 giê vµ 60 giê ë ®iÒu kiÖn tèi. 5. Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen kh¸ng nÊm (Dùa theo quy tr×nh cña Datta vµ cs., 2003 [62], cña Sung Park vµ cs, 2003[132] vµ N. Gorinova (2005) [106]. C¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm sau khi kÕt thóc tiÒn nu«i cÊy, chóng ®−îc g©y nh÷ng vÕt th−¬ng míi t¹o ®iÒu kiÖn cho sù tiÕp xóc cña vi khuÈn. ®Æt c¸c mÉu cÊy vµo dung dÞch vi khuÈn vµ m«i tr−êng MS1 láng trong ®Üa petri víi 3 nång ®é kh¸c nhau (1:10; 1:15 vµ 1:20), l¾c nhÑ kho¶ng 5-7 phót ®Ó lµm t¨ng kh¶ n¨ng tiÕp xóc cña tÕ bµo chñ vµ vi khuÈn. Sau khi c¸c mÉu l¸ ®−îc lµm kh« b»ng giÊy thÊm whatman (qu¸ tr×nh nµy nh»m lo¹i bá bít vi khuÈn b¸m qu¸ nhiÒu trªn bÒ mÆt cña mÉu, øc chÕ sù t¸i sinh cña mÉu) råi chuyÓn chóng sang m«i tr−êng cã chøa 250 mg/l Acetosiringone ®Ó ®ång nu«i cÊy (h×nh 17). Qu¸ tr×nh ®ång nu«i cÊy duy tr× ë nhiÖt ®é 25 oC +1, trong tèi víi 3 thêi gian kh¸c nhau: 36 tiÕng 48 tiÕng vµ 60 tiÕng. C¸c mÉu ®èi chøng còng ®−îc tiÕn hµnh ®ång thêi c¸c b−íc lo¹i trõ c«ng ®o¹n l©y nhiÔm vµ nu«i chung víi vi khuÈn. Trong qu¸ tr×nh ®ång nu«i cÊy ho¹t ®éng biÕn n¹p ®0 ®−îc xÈy ra theo c¬ chÕ: b¶n chÊt tù nhiªn cña Agrobacterium tumefaciens lµ chØ nhiÔm vµo c¸c tÕ bµo bÞ th−¬ng ®ang ph©n chia m¹nh, m«i tr−êng giµu auxin, t¹o kh¶ n¨ng ph©n chia tÕ bµo cña c©y ®ång thêi kÝch thÝch c¸c tÕ bµo cña mét sè loµi thùc vËt cã kh¶ n¨ng tiÕt ra c¸c hîp chÊt c¶m øng phenolic nh− acetosyringone, -Hydroacetosyringone. (Kaji J.H.R vµ cs., 1991), ®ã lµ mét hîp chÊt cÇn thiÕt dÉn dô, l«i cuèn ho¹t ®éng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 147 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 147 cña vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens. C¬ chÕ kÕt hîp gi÷a phenol vµ ®−êng ®0 lµm t¨ng c−êng sù biÓu hiÖn cña gen vir, mÆt kh¸c, nh÷ng yÕu tè di truyÒn ®−îc m0 ho¸ bëi Agrobacterium tumefaciens ®Ó truyÒn T-ADN cña nã lµ c¸c tr×nh tù ë 2 ®Çu ranh giíi T-ADN, nh÷ng bé lÆp l¹i trùc tiÕp cña 25 cÆp bas¬ nit¬ linh ®éng gióp cho viÖc chuyÓn T-ADN cña nã dÔ dµng. V× thÕ, vïng T-ADN kÓ c¶ 2 ®Çu ranh giíi, ®o¹n ADN m¹ch ®¬n t¸ch ra khái Ti-plasmid vµ chuyÓn vµo tÕ bµo. Sau khi ®0 qua mµng tÕ bµo, sîi ®¬n T-ADN ®i vµo nh©n tÕ bµo vµ kÕt hîp víi ADN trong nh©n ë nh÷ng vÞ trÝ ngÉu nhiªn, chÝnh trong qu¸ tr×nh ®ã cã mét sè locus trªn chromosome cña tÕ bµo thùc vËt ®−îc ph©n chia n»m trong mèi t−¬ng t¸c gi÷a vi khuÈn vµ thùc vËt, v× vËy qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®−îc thùc hiÖn. T¹i ®ã c¸c gen trªn T-ADN b¾t ®Çu ho¹t ®éng nhê sù kÝch thÝch cña c¸c tÕ bµo chñ. ChÝnh v× lÏ ®ã c¸c mÉu cÊy sau tiÒn nu«i cÊy ph¶i t¹o thªm c¸c vÕt th−¬ng míi lµm t¨ng sù tiÕp xóc víi vi khuÈn, nh−ng kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mÉu. Bªn c¹nh c¸c mÉu biÕn n¹p chóng t«i còng tiÕn hµnh thÝ nghiÖm ®èi chøng víi c¸c mÉu l¸ kh«ng biÕn n¹p trªn m«i tr−êng t¹o callus vµ t¹o chåi. 6. C¸c chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp C¸c chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp (ChuyÓn gen Glucanase-Osmotin) Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho gen hpt Denaturation Denaturation Annealing Extention 95 0C 5 phót 930C 1 phót 40C 720C 1 phót 550C-1 phót 30 chu kú Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 148 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 148 Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho gen Glucanase Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho gen Osmotin (AP) C¸c chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp (ChuyÓn gen Defensi)) Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho gen nptII Denaturation Denaturation Annealing Extention 95 0C 5 phót 940C 1 phót 40C 720C 1 phót 30 chu kú 580C-1 min Denaturation Denaturation n Annealing Extention 950C 5 phót 940C 1 phót 40C 720C 1 phót 600C-1 phót 35 chu kú Denaturation Denaturation Annealing 95 0C 5 phót 950C 1 phót 40C 720C 1 phót 650C-1 35 chu kú Extention Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 149 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 149 Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho Defensin C¸c chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp (ChuyÓn gen Chitinase) Chu tr×nh ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR cho gen Chitinase 7. Ph©n tÝch PCR Kü thuËt t¸ch ADN l¸ - C¾t 200 mg l¸ vµ nghiÒn l¸ trong 1 ml dung dÞch ®Öm 2x CTAB vµ 4 ml 2- Mercaptoethanol. ChuyÓn mÉu nghiÒn sang èng eppendof 1,5 ml, - ñ mÉu ë 650C trong 45-50 phót. Ly t©m mÉu víi tèc ®é 13.000 vßng/phót trong 15 Denaturation Denaturation Annealing Extention 95 0C 5 phót 940C 1 phót 40C 720C 1 phót 35 chu kú 630C-1 min Denaturation Denaturation Annealing Extention 95 0C 5 phót 940C 1 phót 40C 720C 30secons 30 chu kú 520C-30 seonns 720C 2 phót Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 150 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 150 gi©y. ChuyÓn phÇn næi sang èng eppendorf míi. - Thªm l−îng hçn hîp (Chloroform - Isoamyl alcohol) b»ng 2 lÇn thÓ tÝch phÇn næi. L¾c trén kü ®Õn khi ®Õn khi dÞchcã mÇu tr¾ng ®ôc. Ly t©m víi tèc ®é 13.000 vßng/phót trong 5 phót. LÊy phÇn næi vµ chuyÓn sang èng eppendorf míi. - Thªm 70% thÓ tÝch cña Isopropanol l¹nh vµ trén thËt kÜ b»ng c¸ch ®¶o lén èng nghiÖm. §Ó yªn ë -200C trong 30 phót. - Ly t©m mÉu víi tèc ®é 13.000 vßng/phót trong 10 phót. Bá phÇn næi. - §Ó phÇn kÕt tña trong tñ hót ch©n kh«ng ë 500C trong kho¶ng 15-20 phót. - Hßa tan phÇn kÕt tña trong 20-40 ul dung dÞch ®Öm TE ( Tïy theo kÝch th−íc phÇn kÕt tña). - Ch¹y 5ul mÉu DNA thu ®−îc trªn gen agarose 1% ®Ó kiÓm tra chÊt l−îng. Thµnh phÇn ph¶n øng: Thµnh phÇn 1 èng 20 èng 10 X PCR buffer 1 mM dNTPs Primer 1 (50ng/ul) Primer(50ng/ul) Taq polymerase 15 mM MgCl2 Template DNA (100ng/ul) N−íc cÊt 2,50ul 4,00ul 1,00ul 1,00ul 0,20ul 0,75ul 1,00ul 14,55ul 50ul 80ul 20ul 20ul 4,0ul 1,75ul 20ul Tæng sè 25ul 500ul Sau khi cho ®ñ c¸c thµnh phÇn ph¶n øng, l¾c tréng nhÑ, ly t©m. Nhá mét giät dÇu kho¸ng phñ mÆt hçn hîp. Ph©n tÝch s¶n phÈm: - ChuÈn bÞ gen Agarose 1,5%: lµm tan (dïng tñ vi ba ) 5,25 g Agarose trong 350ml 1X TAE buffer. - §Ó nguéi Agarose láng ®Õn 600C, cho 6-8 ul Ethidium bromide vµo vµ trén ®Òu. §æ vµo khay gel vµ ®Ó nguéi. Cho dung dÞch ®Öm 1X TAE (hoÆc TBE) ngËp b¶n gel tõ 1-2 mm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 151 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 151 - Trén 10 ul mÉu DNA (qua PCR) víi 2 ul 6X loading buffer. Cho mÉu vµo giÕng gel. Sö dông thang ADN chuÈn ®Ó nhËn biÕt träng l−îng ph©n tö b¨ng ADN ®−îc khuÕch ®¹i. - Ch¹y 50V. LÊy gel ra, quan s¸t mÉu d−íi ®Ìn UV vµ chôp h×nh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 152 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 152 Phô lôc 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 TR A2 (0. 1N AA +0 . 5B A) TR A3 (0. 2N AA ) TR A3 (O . 5N AA +0 . 05 K) TR A4 (0. 5N AA +0 . 02 Z) TR A7 (1N AA +2 K) TR C2 (0. 2IA A+ 2. 5K ) TR C3 (O . 5I AA +0 . 1B A TR C4 (0. 5IA A+ 0.0 5K ) TR C6 (1. 5IA A+ 0.0 2Z ) TR C8 (1I AA + 2K ) Trụ lá mầm Lá thật Lá mầm BiÓu ®å. ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp vµ nång ®é chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng NAA vµ IAA ®Õn qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh. Qua kÕt qu¶ biÓu ®å III.4, cho thÊy tÊt c¶ c¸c c«ng thøc trªn ®Òu cho ra rÔ. Nh−ng c«ng thøc víi 0,5 NAA + 0,02 Z vµ c«ng thøc víi 1 IAA + 2mg/l Kinetin lµ 2 c«ng thøc t¹o rÔ cao nhÊt. Nh−ng víi víi c«ng thøc cã nång ®é 1mg/l IAA + 2mg/l Kinetin cho rÔ khoÎ, dµi vµ tr¾ng, biÎu hiÖn rÔ cã chÊt l−îng nhÊt. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 153 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 153 Phô lôc 3 kÕt qu¶ xö lý thèng kª ._.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfCH2665.pdf
Tài liệu liên quan