Nghiên cứu nấm Phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 2008-2009 tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------eêf---------- TrÇn yÕn chi NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA INFESTANS GÂY BỆNH MỐC SƯƠNG HẠI CÀ CHUA, KHOAI TÂY VỤ ĐÔNG XUÂN NĂM 2008-2009 TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh: b¶o vÖ thùc vËt M· sè: 60.62.10 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: ts. ng« thÞ xuyªn Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Yến Chi LỜI CẢM ƠN T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi TS. Ng« ThÞ Xuyªn, ng­êi ®· h­íng dÉn, chØ b¶o tËn t×nh vµ gióp ®ì t«i trong suèt qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi vµ hoµn chØnh luËn v¨n cña m×nh. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c thÇy, c« gi¸o trong Bé m«n BÖnh c©y, c¸c thÇy c« trong Khoa N«ng häc, Khoa Sau ®¹i häc, Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi, ®· t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi, gióp ®ì t«i trong suèt thêi gian thùc hiÖn luËn v¨n nµy. T«i còng xin ch©n thµnh c¶m ¬n th¹c sÜ Lª Hång VÜnh, ViÖn Nghiªn cøu Sinh häc Nauy, ®· gióp ®ì h­íng dÉn tËn t×nh trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi còng nh­ hoµn ch×nh luËn v¨n. §Ó hoµn thµnh luËn v¨n, t«i cßn nhËn ®­îc sù ®éng viªn, khÝch lÖ cña b¹n bÌ vµ nh÷ng ng­êi th©n trong gia ®×nh. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n tÊt c¶ nh÷ng t×nh c¶m cao quý ®ã. Hµ Néi, ngµy 22 th¸ng 09 n¨m 2009 T¸c gi¶ luËn v¨n TrÇn YÕn Chi MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1. Các isolate nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 24 4.1. Tình hình bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây tại các tỉnh phía bắc Việt Nam vụ đông xuân năm 2008-2009. 38 4.2. Chủng nấm của các isolate nấm P.infestans thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 tại các tỉnh phía bắc Việt Nam. 41 4.3. Ảnh hưởng của ánh sáng đối với khả năng nảy mầm của P.infestans trong các điều kiện khác nhau trong những thời điểm khác nhau trong ngày. 43 4.4. Ảnh hưởng của ánh sáng tới khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc sương trong khoảng thời gian từ 12-13 giờ trong ngày. 46 4.5. Thời kì tiềm dục (ngày) của các isolate nấm P.infestans trên một số giống cà chua. 48 4.6. Thời kì tiềm dục của các isolate nấm P.infestans trên một số giống khoai tây. 50 4.7. Tốc độ phát triển của nấm P.infestans trên lá một số giống cà chua 52 4.8. Tốc độ phát triển của nấm P.infestans trên lá một số giống khoai tây. 53 4.9. Số lượng bào tử phân sinh nấm P.infestans/cm2 vết bệnh trên các giống khoai tây, cà chua. 56 4.10a. Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa lá trên một số giống cà chua 59 4.10b. Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa lá trên một số giống khoai tây 60 4.11. Khả năng tồn tại của bào tử mốc sương P.infestans trong đất canh tác 63 4.12. Thành phần tác nhân gây bệnh trên củ khoai tây giống và khoai tây thương phẩm. 66 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới sự xuất hiện của các tác nhân gây bệnh hại trên mắt củ khoai tây giống. 68 4.14. Tính kháng thuốc metalaxyl của nấm P. infestans trong thí nghiệm đĩa củ khoai tây 71 4.15. Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P. infestanstrong thí nghiệm đĩa lá cà chua. 73 4.16. Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P. infestanstrong thí nghiệm lá nguyên cà chua. 74 4.17. Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với nâm P.infestans 77 4.18. Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối với nấm P.infestans 78 4.19. Khả năng kháng nhiễm của một số giống khoai tây, cà chua trong thí nghiệm chậu vại 80 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1. Một số ảnh triệu chứng bệnh mốc sương trên cà chua, khoai tây 40 4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đối với khả năng nảy mầm của P.infestans trong các điều kiện khác nhau trong những thời điểm khác nhau trong ngày với điều kiện thời tiết khác nhau. 44 4.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới khả năng nảy mầm của bào tử nấm trong khoảng thời gian từ 12-13 giờ trong ngày 46 4.4. Sự nảy mầm của bào tử phân sinh nấm mốc sương trên môi trường WA trong thí nghiệm ảnh hưởng của ánh sáng tới sự nảy mầm bào tử 47 4.5. Thời kì tiềm dục (ngày) của các isolate nấm P.infestan trên một số giống cà chua. 49 4.6. Thời kì tiềm dục của các isolate nấm P.infestans trên một số giống khoai tây. 50 4.7. Tốc độ phát triển của nấm P.infestans (mm2/24 giờ) trên một số giống cà chua. 52 4.8. Tốc độ phát triển của nấm P.infestans trên lá một số giống khoai tây 54 4.9. Số lượng bào tử phân sinh nấm P.infestans/cm2 vết bệnh trên các giống khoai tây, cà chua. 55 4.10. Một số ảnh ttrong thí nghiệm độc tính của nấm P.infestans trên các giống khoai tây cà chua 58 4.11. Ngưỡng xâm nhiễm của bào tử P.infestans trong thí nghiệm đĩa lá trên một số giống khoai tây 61 4.12. Khả năng tồn tại của bào tử mốc sương P.infestans trong đất canh tác 64 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới sự xuất hiện của các tác nhân gây bệnh hại trên mắt củ khoai tây giống. 69 4.14. Thí nghiệm bệnh trên mắt củ khoai tây giông. 70 4.15. Tính kháng thuốc metalaxyl của nấm P.infestans trong thí nghiệm khoanh củ khoai tây. 72 4.16. Tính kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P. infestans trong thí nghiệm đĩa lá cà chua. 73 4.17. Một số ảnh trong thí nghiệm kháng thuốc metalaxyl và metalaxyl M của nấm P.infestans 75 4.18. Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với nâm P.infestans 77 4.19. Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối với nấm P.infestans 78 4.20. Một số ảnh thí nghiệm kháng nhiễm nấm P.infestans trên củ khoai tây. 79 4.21. Một số ảnh của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo nấm P.infestans trên một số giống khoai tây, cà chua 81 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.), khoai tây (Solanum tuberosum L.) là hai loại cây họ cà được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Trên thế giới khoai tây là loại cây lương thực có diện tích trồng đứng thứ 4 sau lúa nước, lúa mì và ngô [51]với diện tích hơn 18 triệu ha vào năm 2007. Khoai tây, cà chua là hai loại cây ngắn ngày, năng suất cao có vai trò quan trọng trong hệ thống luân canh cây trồng nhất là tại miền Bắc Việt Nam nơi có một mùa đông lạnh. Hiện nay ngành nông nhiệp Việt Nam mới cung cấp được 80% nhu cầu tiêu dùng khoai tây trong nước hiện chúng ta vẫn phải nhập khẩu gần 100.000 tấn khoai tây/năm. Hiện nay sản xuất khoai tây ở nước ta chủ yếu phục vụ nhu cầu trong nước, số lượng xuất khẩu không nhiều, thị trường trong nước của khoai tây là khá rộng lớn.Đặc biệt một số nước lân cận như Lào, Campuchia, Malaysia, Singapore... lại không có khả năng sản xuất khoai tây vì vậy tiềm năng suất khẩu của khoai tây Việt Nam là rất lớn. Diện tích trồng cà chua của nước ta năm 2001 khoảng 12 - 14 ngàn ha, khoai tây khoảng 32 - 40 ngàn ha (Tạ Thu Cúc, 2001) [1] và tiếp tục tăng thêm. Trong những năm gần đây các vùng chuyên canh rau ngày càng mở rộng thêm về diện tích và được chú ý đầu tư công nghệ cao tuy vậy sản lượng khoai tây chỉ đạt 10-11 tấn/ha thấp hơn so với năng suất trung bình trên thế giới (16.8 tấn/ha) và khu vực (15.7 tấn/ha), năng suất cà chua đạt 30-40 tấn/ha xấp xỉ với mức trung bình chung của thế giới và khu vực (30 tấn/ha). Có điều này là do sản xuất khoai tây, cà chua ở nước ta còn có nhiều yếu tố bất lợi kìm hãm năng suất như: bệnh hại, sâu hại, trình độ canh tác của người nông dân... Trong các yếu tố hạn chế năng suất của sản xuất khoai tây cà chua bệnh hại là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất. Bệnh hại trên cà chua khoai tây rất đa dạng về thành phần và nguyên nhân gây bệnh. Cà chua, khoai tây bị rất nhiều loại dịch hại tấn công như: nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng....Thành phần bệnh trên cây khoai tây và cà chua cũng khá đa dạng: bệnh mốc sương, bệnh héo rũ gốc mốc trắng, bệnh héo vàng, bệnh đốm lá, bệnh héo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus, bệnh sưng rễ do tuyến trùng nốt sưng...Trong đó bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh. Các nghiên cứu về phân bố cũng như tác hại của bệnh cũng đã được tiến hành từ rất sớm. Theo đánh giá tác hại của bệnh mốc sương gây hại ở vùng ngoại thành Hà Nội những năm 1965 thiệt hại trung bình từ 30-70%, ở mức độ cao có thể gây mất năng suất hoàn toàn.Trong những năm gần đây mức độ bệnh hại vẫn ở mức khá cao. Vụ xuân 1996 tỉ lệ bệnh tại Hà Nội là 40-60% . Vụ đông xuân 1996-1997 tại vùng Gia Lâm, Đông Anh- Hà Nội vào giai đoạn cuối tháng 3 đầu tháng 4 tỉ lệ bệnh lên tới 51% với chỉ số bệnh 28,6% và thiệt hại tới 60% năng suất. Phân bố của bệnh mốc sương cũng khá rộng theo các nghiên cứu cho thấy bệnh phổ biến ở các vùng Hà Nội, Lào Cai, Bắc Giang, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng, Lâm Đồng (Vũ Hoan, 1973; Nguyễn Văn Viên, 1998). Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế tác hại của bệnh mốc sương gây ra như sử dụng tập đoàn giống mới cho các vùng nhiễm bệnh, sử dụng các thuốc hoá học nhưng chưa đem lại kết quả như mong đợi. Bên cạnh đó do việc sử dụng thuốc hoá học để phòng hay trừ bệnh lại thường hay không đúng cách người nông dân tăng nồng độ thuốc lên nhiều lần gia tăng áp lực của thuốc làm cho tính kháng thuốc đã bắt đầu xuất hiện ở loài nấm này. Hơn nữa do tình hình biến động về chủng quần, điều kiện sống tự nhiên loài nấm này đã hình thành các chủng nấm khác nhau A1và A2. Theo các nghiên cứu gần đây về sự phân bố của các chủng nấm, chủng quần mới A2 đã xuất hiện ở các nước lân cận như: Hàn Quốc, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc...và gây hại nghiêm trọng trong sản xuất (Nishimura et all, 1999). Chủng quần mốc sương cuả Việt Nam là chủng quần cũ (chủng nấm A1) nếu có sự biến đổi chủng quần hoặc có thêm chủng quần mới chủng nấm A2 sẽ gây tổn thất rất lớn tới sản xuất khoai tây cà chua nước ta. Trước những nguy cơ về tính kháng thuốc cũng như sự thay đổi về chủng quần nấm mốc sương P. infestans chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nấm Phytophthora infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây vụ đông xuân năm 2008-2009 tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam” 1.2 Mục đích, yêu cầu nghiên cứu của đề tài. 1.2.1 Mục đích Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học của nấm mốc sương P. infestans như khả năng tồn tại trong đất, trong điều kiện ánh nắng trực xạ…; khả năng lây nhiễm của nấm trên một số giống khoai tây, cà chua từ đó đưa ra các biện pháp phòng chống thích hợp. 1.2.2 Yêu cầu - Thu thập được các mẫu bệnh mốc sương từ các địa phương trong vụ đông xuân 2008-2009. - Nghiên cứu các đặc tính sinh học của nấm P. infestans (khả năng tồn tại dưới ánh sáng , chủng nấm....) - Nghiên cứu các đặc tính về khả năng lây nhiễm của nấm P. infestans trên một số giống khoai tây, cà chua. - Nghiên cứu về sự tồn tại nguồn bệnh mốc sương trong đất tại các vùng trồng cà chua khoai tây, vùng Hà Nội và phụ cận. - Nghiên cứu sự tồn tại của bệnh mốc sương cũng như các bệnh hại khác trên củ (thương phẩm và giống) khoai tây. - Nghiên cứu khả năng kháng thuốc Metalaxyl, Metalaxyl M, Mancozeb của các mẫu nấm phân lập được. 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU TRONG  VÀ NGOÀI NƯỚC 2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Bệnh mốc sương cà chua, khoai tây do nấm P. infestans là một trong những bệnh được nghiên cứu nhiều nhất, lịch sử nghiên cứu lâu dài nhất, tuy vậy bệnh vẫn là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trong lịch sử nhân loại. Có nhiều tác giả nghiên cứu về trung tâm phát sinh của nấm P. infestans nhưng vẫn chưa có kết luận chính xác về trung tâm phát sinh của nấm này. Theo những nghiên cứu của những nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về bệnh này là Berkelay và De Bary thì trung tâm phát sinh của bệnh là dãy Andes Nam Mỹ cũng là trung tâm phát sinh của khoai tây kí chủ chính của nấm mốc sương. Reddick (1939) cho rằng nấm mốc sương có trung tâm phát sinh ở cao nguyên miền trung Mexico. Các nghiên cứu gần đây về trung tâm phát sinh của bệnh này cho rằng Mexico là trung tâm đa dạng sinh học của loài nấm P. infestans nhưng vẫn chưa kết luận rằng Mexico hay dãy Andes là trung tâm phát sinh của nấm này (Abad, 1998) [21]. Mizubuti và Fry (2006) cũng kết luận rằng Mexico là trung tâm đa dạng sinh học của loài nấm này. Mexico cũng là nơi đầu tiên phát hiện ra chủng nấm A2. Chủng quần ở hầu hết các nước trên thế giới là vô tính, phần lớn thuộc vào chủng nấm A1 (Goodwin et all, 1994) trong khi đó tại trung tâm đa dạng sinh học này xuất hiện hai loại chủng nấm A1 và A2 với tỉ lệ ngang bằng nhau (Gallegly và Ganlido, 1958;Tooley et all, 1985; Nierderhauster,1991) tạo ra một quần thể nấm hữu tính (Tooley et all, 1985; Fernandez-pavia, 2004) hoàn toàn khác biệt với các quần thể nấm khác trên thế giới (B. M. Cooke, D. Gareth Jones, B. Kaye, 2006) Cùng với cây khoai tây bệnh mốc sương từ trung tâm đa dạng sinh học ở Mexico đã lan truyền ra khắp các vùng trồng khoai trên thế giới. Có nhiều giả thiết khác nhau về con đường phát tán của bệnh ra các vùng trồng khoai tây ở Mỹ và Châu Âu vào thập niên 40 thế kỉ 19. Giả thiết thứ nhất là bệnh lan truyền từ Mexico tới Mỹ sau đó lan truyền tới châu Âu (Fry, 1993); giả thiết thứ 2 là bệnh lan truyền từ dãy Andes tới Mỹ và Châu Âu (Tooley, 1989); giả thiết thứ 3 là bệnh lan truyền từ trung Mexico tới Andes sau đó lan truyền tới Mỹ và châu Âu (Andrivon, 1996) [22]. Bệnh xuất hiện đầu tiên ở phía đông nước Mỹ (Fry et all, 2002) [39]. Có những bằng chứng về sự xuất hiện của bệnh ở phía nam nước Mỹ vào năm 1842 trong củ khoai tây dại, cùng thời điểm này cũng có nhiều ghi nhận bệnh mốc sương trên khoai tây tại các nước châu Âu. Năm 1841 bệnh được ghi nhận tại một số vùng ở Nauy (Westrern), Bỉ. Năm 1842 Bệnh xuất hiện ở 6 nước thuộc châu Âu là: Bỉ, Hà Lan, Đức, Đan Mạch, Ireland, Anh, Scotland. Con đường lan truyền sang Châu Âu được cho là thông qua củ khoai tây bị bệnh vì các vật liệu mang bệnh khác như lá, thân rất nhanh bị mục nát do vận chuyển. Nguồn mốc sương lan truyền chủ yếu là từ Mỹ vì Mexico vào thế kỉ 19 khoai tây không phải loại lương thực được trồng rộng rãi. Cùng với sự phát tán của khoai tây tới các vùng trồng trọt ở châu Âu và châu Mỹ một thời gian ngắn sau bệnh mốc sương cũng nhanh chóng lan truyền và gây hại nặng ở các vùng trồng trọt này. Bệnh mốc sương đã gây ra mất mùa khoai tây ở vụ đông năm 1845 và năm 1846 tại Ireland làm hơn 1.5 triệu người chết đói và gần 1 triệu người chết trong khi di cư sang Mỹ để tránh nạn đói này. Bệnh mốc sương cũng gây nạn đói thứ 2 xảy ra ở nước Đức năm 1919. Nấm P. infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm sương mai (Peronosporales) lớp nấm này thuộc một giới (Kingdom) khác hẳn với nấm (true fungi), thực vật, động vật và procaryote. Một số tác giả cho rằng lớp nấm trứng thuộc về giới Protoctista một số khác thì cho rằng nó thuộc giới Chromista. Nấm gây hại trên khoai tây cà chua tạo ra các triệu chứng đa dạng tuỳ thuộc vào giống và điều kiện thời tiết. Trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những điểm nhỏ màu xanh tái hình dạng không đều sau biến thành màu nâu và xanh nhạt vết bệnh không có giới hạn rõ rệt (Stevenson, 1993). Lúc đầu bệnh thường xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau đó lan rộng vào phiến lá tạo thành những đám mô bị thối nâu, khi trời ẩm ướt mặt dưới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nấm trắng xốp như sương muối (Drenth, Janssen và Govers ,1995) đó là đám cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh của nấm gây bệnh. Còn ở trên thân, bị bệnh từng đoạn dài, vỏ và ruột phần thân thối ướt màu nâu đen. Chỗ bị bệnh nhỏ tóp lại có khi chỉ một phía thân bị thối. Khi ẩm ướt, trên vết bệnh có lớp nấm trắng như sương muối bao phủ khi thời tiết khô vết bệnh tóp lại. Cành thân bị bệnh rễ gãy gục làm tan cây xơ xác. Trên củ khoai tây bị bệnh, vết bệnh thường bị nhầm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn, mặt củ có vết màu nâu lõm xuống, to nhỏ khác nhau. Khi cắt ngang củ ở chỗ bị bệnh, từ ngoài vỏ vào trong ruột có thấy màu nâu xám lan rộng vào phía trong. Để trong điều kiện 200C và ẩm độ bão hoà sẽ thấy xuất hiện lớp nấm trắng mịn trên phần bị bệnh. Theo Vander Zaag (1994) sự lây nhiễm trên củ thường ở các vết sần, mắt củ, khe nứt trên vỏ củ. Sự lây nhiễm có thể xảy ra ở giai đoạn trồng hay thu hoạch củ. Nấm có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 4-260C nhưng tối thích ở khoảng 16-200C, ẩm độ thích hợp là từ 91-100% (Jean, 1985). Bào tử nấm có kích thước trung bình khoảng 36 x 22 µm - 29 x 19 µm (Erwin và Ribeiro, 1996) [39] đường kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo có thể đạt kích thước từ 7,0 - 16 µm. Trên mô bệnh nấm hình thành các bào tử phân sinh hình ôvan, elíp hoặc hình quả chanh yên, bào tử ngắn, đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thước bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm (Stevenson, 1993). Nấm kí sinh chuyên tính nhưng vẫn có khả năng sống trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo như : Soybean agar, carrot agar, rye agar, PDA, Bean agar, V8, CMA, Lima bean agar, Pea agar... (Sato &Kato, 1993; Erwin & Ribeiro, 1996; Hartman, 1995). Nghiên cứu của các tác giả trên cũng cho rằng nấm phát triển mạnh nhất là trên môi trường Pea-agar (Hartman, 1995; Vinh, 2003) và Rye agar (Hartman, 1995). Trên môi trường nhân tạo nấm có khả năng sinh bào tử trứng, thành phần môi trường có ảnh hưởng lớn tới sự hình thành bào tử trứng của nấm và khả năng sinh sản hữu tính. Theo nghiên cứu của Fry (2000) trong 116 isolate thu thập được ở Bỉ, Belorussia, Nga, Canada, Ecuador, Israel, Nhật Bản, Mexico, Peru, Phillipin, Ba Lan, Hàn Quốc, Uganda, Anh và Mỹ trong thời kì từ năm 1980-1997 các isolate thuộc chủng nấm A2 có khả năng sinh sản hữu tính trên môi trường hỗn hợp giữa rye B/V8 với tỉ lệ 50:50, các isolate thuộc chủng nấm A1 không có khả năng sinh bào tử trứng trên môi trường này. Thử nghiệm trên môi trường Rye B các isolate đều không sản sinh bào tử trứng. Cũng trong nghiên cứu này tác giả cũng cho rằng các môi trường khác như oatmeat agar, tomato juice agar, V8 juice agar... cũng làm cho A2 sản sinh bào tử trứng, còn A1 thì không. Các nhân tố khác như pH, CaCO3 cũng không làm thay đổi khả năng sinh bào tử trứng của các isolate thu thập được. Thử nghiệm trên lá cà chua, khoai tây trong điều kiện invivo cũng cho thấy ngay cả thuốc trừ bệnh cũng không làm thay đổi khả năng này (Fry, 2000) [43]. Nấm mốc sương có chu kì phát triển hoàn toàn với hai giai đoạn sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính bằng bào tử phân sinh (Croisier, 1934), dưới hai hình thức nảy mầm trực tiếp và gián tiếp nảy mầm thông qua bào tử động (hình thành trong điều kiện lạnh, có giọt nước). Nấm mốc sương có 2 chủng nấm A1, A2 và một dạng hữu tính. Sinh sản hữu tính phần lớn sảy ra ở các vùng lạnh ẩm và phải có đủ cả 2 chủng nấm A1, A2 hoặc có dạng hữu tính lúc này sẽ sinh ra bào tử trứng. Bào tử trứng được hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao nhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31 x 50 mm (Erwin và Ribeiro, 1996). Khi ở vùng khí hậu không thuận lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nấm thì nấm mốc sương chỉ sinh sản theo kiểu vô tính. Khả năng tồn tại của bào tử vô tính cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Bào tử và sợi nấm gần như không có khả năng qua đông. Bào tử có thể tồn tại từ vài ngày tới vài tuần trong đất ẩm (Adrivon, 1995) [24] nhưng không có khả năng tồn tại trong thời gian rất dài đặc biệt là không có khả năng sống sót trong đất khô (Fernandez, 2004). Tuy vậy khi bào tử hoặc sợi nấm nếu đã tấn công và kí sinh vào củ khoai tây thì lại có khả năng qua đông cao. Khoai tây bị bệnh ở trong điều kiện kho chứa có khống chế nhiệt độ, trong các điều kiện bảo quản thông thường hay các củ khoai tây nằm trong vùng đất không bị đóng băng đều là nguồn bệnh cho mùa vụ sau (Kirk, 2001) [42] theo nghiên cứu của Kirk (2003) [43]ợi nấm và bào tử khi được nuôi cấy và bảo quản trong môi trường nhân tạo vẫn có khả năng chịu được nhiệt độ thấp. Khi nhiệt độ môi trường -20 tới -100C sợi nấm chỉ có khả năng tồn tại trong 1 giờ. Khi nhiệt độ môi trường -5 đến -30C trong 24 giờ nấm vẫn còn khả năng lây nhiễm. Sau khi đặt ở nhiệt độ 00C khả năng gây bệnh của nấm không bị ảnh hưởng. Nấm có thể tồn tại ở nhiệt độ -30C trong vòng 3 ngày nhưng ở nhiệt độ -50C chỉ trong 1 ngày. Bào tử ít có khả năng tồn tại trong không khí (Mizubuti, 2000; Sunseri, 2001). Trong không khí có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới khả năng sống sót của bào tử như độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng mặt trời. Theo nghiên cứu của Fry bào tử nấm có khả năng tồn tại ở ẩm độ cao tốt hơn ở ẩm độ thấp, nhiệt độ từ 15-200C khả năng tồn tại tốt hơn ở 300C. Bào tử có thể tồn tại từ 2 đến 6 giờ ở nhiệt độ từ 15-300C độ ẩm tương ứng từ 40-88% (Fry, 1981). Ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời tới sự nảy mầm của bào từ khá rõ ràng. Khi bào tử chịu ảnh hưởng của trực xạ trong 1 giờ ngày nắng tỉ lệ nảy mầm có thể giảm 70-3%. Bào tử có thời gian tồn tại trong nước khá lâu. Khi bào tử ở bề mặt đất bão hoà nước trong điều kiện trực xạ có thể tồn tại tới 16 ngày, trong điều kiện bóng râm có thể tồn tại tới 20 ngày. Nếu trong điều kiện chỉ có nước không có đất khả năng sống của bào tử giảm rõ rệt chỉ từ 2-6 ngày (Porter và Johnson, 2004). Chủng nấm A1 phân bố khá rộng rãi. Theo thống kê của Cabi 1982 trên thế giới đã có 121 quốc gia và vùng lãnh thổ có xuất hiện chủng nấm này. Đây là chủng nấm đầu tiên phát tán ra khỏi vùng đa dạng sinh học của nó ở Mexico. Chủng nấm A2 được coi là chủng quần mới do tính chất mới xuất hiện của chủng quần này trên các vùng trông khoai tây và cà chua trên thế giới. Chủng quần A2 được coi là xuất phát từ trung tâm đa dạng sinh học của nấm mốc sương ở Mexico. Nhưng theo nghiên cứu của Ko thì A2 có thể hình thành do sự thay đổi để thích nghi với điều kiện khí hậu thời tiết của nấm mốc sương. Chủng nấm A2 theo thống kê của Cabi (1996) đã xuất hiên ở 21 quốc gia và vùng lãnh thổ trong đó phần lớn các nước ở châu Mỹ, châu Âu tuy vậy ở một số nước châu Á như Ấn Độ, Hàn Quốc, Nhật Bản đã xuất hiện cả 2 chủng nấm bao gồm A1, A2. Trong những nghiên cứu sau này chủng quần bao gồm cả A1 và A2 còn đuợc phát hiện thêm ở Thái Lan, Nepal và Trung Quốc (Koh, 1999; Nishimura, 1999). Ở một số nước tây Âu, Mỹ, Canada đã phát hiện giai đoạn sinh sản hữu tính (Drenth, 1996). Vì nấm mốc sương có tốc độ phát triển nhanh và có ảnh hưởng lớn tới năng suất nên việc phòng chống bệnh là hết sức cần thiết. Hiện nay phuơng pháp phòng bệnh thường được bà con nông dân sử dụng là phòng trừ bằng thuốc hoá học. Thuốc hoá học đầu tiên được sử dụng phòng chống bệnh là các thuốc có chứa đồng như Boocdo. Sau này các thuốc hoá học khác được tổng hợp như manconeb có tác dụng ức chế sự phóng bào tử ra khỏi bọc bào tử làm giảm sự xâm nhiễm ban đầu của nấm. Hoạt chất metalaxyl có khả năng ức chế sự hình thành vòi hút cũng như sự phát triển của sợi nấm trong lá. Các hoạt chất này đã mang lại hiệu quả phòng trừ bệnh tương đối cao như ở miền trung của Đài Loan thuốc metalaxyl được sử dụng 1-2 lần/tuần làm giảm tỉ lệ bệnh hại và đồng thời tăng năng suất (Hartman&Huang, 1995). Metalaxyl cũng mang lại hiệu quả cao khi phòng trừ bệnh mốc sương khoai tây, cà chua ở Hà Lan (Erwin, 1987). Do sự bùng nổ của bệnh dịch mốc sương nên thuốc hoá học được sử dụng với số lượng lớn, thời gian phun cách nhau ngắn điều đó đã gia tăng áp lực trong quần thể mốc sương và làm cho tính kháng của nấm đối với thuốc hoá học tăng cao. Trong những năm 1989-1990 tại vùng đông bắc Washington đã có những ruộng xuất hiện tính kháng thuốc metalaxyl sau 2-4 vụ phun thuốc này. Trong 73 isolate thu thập được thử nghiệm tính kháng metalaxyl trong phòng thí nghiệm tỉ lệ kháng cao lên tới 81% số isolate còn mức kháng thuốc của quần thể đồng ruộng trung bình là 19%. 40 isolate thu thập được trên cà chua tỉ lệ kháng cũng đạt trên 60% số isolate. Nghiên cứu tính kháng của P. infestans tại Estonia với 138 isolate thu thập được từ năm 2003-2005 các tác giả nhận thấy tính kháng tăng dần theo năm, và đặc biệt là ở các vùng sử dụng nhiều metalaxyl. Tỉ lệ isolate kháng lên tới 66.7% số isolate thu thập được vào hai năm 2004 và 2005 (Runno, 2006) [45]. Tại Hàn Quốc chủng quần bao gồm cả hai loại chủng nấm A1 và A2 nghiên cứu trên 260 isolate thu thập trong từ năm 2000-2003 nhận thấy số isolate có tính kháng đối với metalaxyl khá cao chiếm tới hơn 70% tuy vậy tính kháng không tăng lên (Zhang ,2005). Tính kháng thuốc metalaxyl cũng đã xuất hiện tại các vùng trồng cà chua của Israel (Cohen, 1982). Ngoài biện pháp hoá học để phòng chống bệnh mốc sương biện pháp giống chống cũng đã được nghiên cứu và tìm hiểu nhằm tạo ra các giống có gen kháng đối với bệnh này. Các nghiên cứu và lai tạo giống của trường đại học Cornell (Mỹ) đã đưa ra giống khoai tây NewYork 128 có khả năng kháng bệnh mốc sương và còn có khả năng kháng tuyến trùng ánh vàng hại khoai tây cung cấp cho ngành nông nghiệp nước Nga. Một số giống cà chua như Legend cũng được công bố có khả năng kháng mốc sương nhưng các thử nghiệm đồng ruộng đã cho thấy giống kháng kém khi áp lực bệnh lên quá cao. Một số giống cà chua bi như sweetie, red cherry có khả năng chịu bệnh tốt. 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Nấm P. infestans trong giai đoạn đầu có tên là bênh dịch muộn bệnh hại trên lá, thân, quả cà chua vào các tháng 1-4, 6,7,11,12 trong năm tại các tỉnh Bắc Thái, Hà Giang, Hà Nội, Hà Tây, Hải Hưng, Hải Phòng, Hoà Bình, Lào Cai, Nam Hà ; trên khoai tây bệnh hại trên lá, thân, củ vào các tháng từ 1-3 và tháng 12 trong năm bệnh gây hại ở các tỉnh Hà Nội, Hà Tây, Hải Phòng (Kết quả điều tra bệnh cây, 1967-1968) [19]. Bệnh cũng xuất hiện ở miền Nam với tên gọi cháy lá và quả trên cà chua với tỉ lệ không cao gặp vào mùa lạnh; bệnh hại trên khoai tây với tên gọi bệnh úa muộn với tỉ lệ hại rất nặng (Hoàng Thị Mỹ, 1959) [9]. Theo điều tra cơ bản bệnh hại cây trồng tại các tỉnh nam bộ 1977-1978 [20] bệnh mốc sương cà chua hại trên lá, thân quả khoai tây hại trên lá, thân. Bệnh gây hại chủ yếu ở vùng Lâm Đồng với thời gian gây hại trong năm từ tháng 5 đến tháng 10 đối với cà chua, từ tháng 5 đến tháng 11 đối với khoai tây Theo nghiên cứu của Vũ Hoan (1973) và Nguyễn Văn Viên (1995-1998) bệnh xuất hiện ở cả hai vụ động và đông xuân của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Hải Phòng với tỉ lệ bệnh trung bình là 40,6%, riêng vùng Hà Nội tỉ lệ bệnh đạt 40% (Nguyễn Kim Vân, 1997) [4,5,8] . Bệnh xuất hiện vào tháng 12 vụ đông năm trước và có thể kéo dài tới tháng 4 của vụ xuân năm sau (Nguyễn Văn Viên, 1998). Bệnh có nhiều đợt phát sinh, các nhà nghiên cứu cho rằng bệnh có 4 đợt phát sinh: đợt 1 xuất hiện vào giữa tháng 12 đầu tháng 1; đợt 2 xuất hiện vào đầu cho đến cuối tháng 1; đợt 3 từ đầu tháng đến giữa tháng 2; đợt 4 từ cuối tháng 2 đến đầu tháng 3. Trong các đợt phát sinh này chủ yếu trên cà chua, đợt 2 và 3 hại nặng trên cà chua chính vụ (Nguyễn Duy Nghi, Trương Quang Tám,1975) Những năm gần đây bệnh xuất hiện và gây hại nặng ở một số vùng trồng rau chuyên canh như Lâm Đồng, Bắc Giang, Bắc Ninh....Trong các vùng trồng khoai tây vùng Thường Tín (Hà Nội) bệnh không xuất hiện ở vụ đông xuân chính và vụ đông xuân muộn. Tỉ lệ bệnh của Hải Phòng vào vụ xuân 2002 khá cao nhưng tới vụ đông 2002 bệnh chỉ xuất hiện gây hại nhẹ ở vùng An Hải còn vùng Tiên Lãng bệnh không gây hại trên khoai tây. Bệnh gây hại nặng tại các vùng như Đông Anh-Hà Nội, Cam Đường và thị xã Lào Cai-Lào Cai, Đức Trọng-Lâm Đồng với tỉ lệ bệnh có thể lên tới 70%. Các vùng trồng cà chua khoai tây tại các tỉnh Hưng Yên, Hà Tây, Bắc Ninh, Bắc Giang tỉ lệ nhiễm ở mức trung bình 20,5-34,7%. Bệnh chủ yếu xuất hiện chủ yếu vào vụ đông và đông xuân ở các tỉnh phía Bắc, riêng tại cao nguyên Di Linh- Lâm Đồng bệnh xuất hiện quanh năm trên hầu hết các giống khoai tây, cà chua trên đồng ruộng. Bệnh gây thiệt hại nặng tới sản lượng, năng suất cũng như phẩm chất của sản phẩm, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 40%, có khi đạt tới 90% (Viện khoa học kĩ thuật nông nghiệp Việt Nam,1990). Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao nhiệt độ ban đêm tương đối thấp, độ nhiệt ban ngày tương đối cao (Đường Hồng Dật, 1976). Nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát sinh ban đầu vào khoảng 18 - 22°C, nếu trong điều kiện ẩm độ cao nhưng nhiệt độ lại thấp hơn 10°C hoặc lớn hơn 28°C thì khó có khả năng xuất hiện bệnh trên đồng ruộng, ẩm độ thích hợp nhất cho bào tử P. infestans nảy mầm và xâm nhập vào cây phải đạt từ 90% cho đến độ ẩm bão hoà, ẩm độ thích hợp nhất cho sự phát triển bệnh là 76%, đặc biệt nếu thời tiết có thêm mưa phùn và sương mù thì bệnh sẽ phát triển rất nhanh, cây có thể bị tàn lụi trong vòng 7 - 10 ngày (Nguyễn Duy Nghi, 1975; Nguyễn Kim Vân, 1997; Vũ Triệu Mân & Lê Lương Tề, 2001). Ở điều kiện 11-18°C bào tử phân sinh nảy mần gián tiếp hình thành bọc bào tử động, giải phóng bào tử động và hình thành sợi nấm khi nhiệt độ > 18°C một bào tử nấm có thể nảy mần trực tiếp thành ống mầm phát triển thành sợi nấm. Nấm mốc sương có khả năng gây hại trên nhiều giống khoai tây, cà chua với các tỉ lệ hại khác nhau.Nghiên cứu của Đào Mạnh Hùng và CTV (1995) thì trên các giống Ba Lan, giống Hồng Lan bị bệnh mốc sương phá hại nặng, giống HP1, HP5 có khả năng chống chịu bệnh khá lớn Còn theo Vũ Tuyên Hoàng và CTV (1982) [6] các giống nhập nội từ châu Âu như: Hungari, Bungari, Liên Xô cũ thường bị nặng và tốc độ phát triển bệnh cũng khá nhanh, một số giống khoai tây Đức nhập nội như: Cardia, Mariella, Giống khoai tây Pháp (Ackesergen), giống Thường Tín…đều là những giống nhiễm bệnh nặng. Một số giống khoai tây nhập nội từ trung tâm khoai tây quốc tế (CIP) bao gồm: LBR1-2, LBR1-5, LBR1-9, LBR1-12, LBR1-13,và LBR1-14 là những giống chống bệnh mốc sương (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 1998) [9] . Đặc điểm nấm P. infestans tác giả Nguyễn Kim Vân(1997) cho rằng nấm có thể phất triển trên môi trường nhân tạo PDA và kích thước của cành bào tử phân sinh biến động trong khoảng 137,8 – 389,6µm x 5,67 - 7,83 µm. Nấm có khả năng phát triển tốt trên môi trường Pea agar nhưng trên môi trường V8 nấm có khả năng sinh bào tử cao hơn (Hoàng Văn Thọ, Ngô Thị Xuyên, 2003) [17]. Nghiên cứu về đặc tính sinh học của quần thể nấm vào năm 2003 trong toàn bộ 130 isolate nấm thu thập được trên cà chua và khoai tây đều thuộc ._.chủng nấm A1. Tính kháng thuốc đã xuất hiện trong quần thể và ở mức trung bình, 4% các isolate thu được trên cà chua biểu hiện tính kháng cao đối với metalaxyl (Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, 2003) [18] . 254 isolate thu được trong năm 2005 cũng thuộc chủng nấm A1, thử nghiệm tính kháng với metalaxyl trên 126 isolate thu được thì 11% kháng ít, 85,8% kháng trung bình và 4,2% kháng cao. Các isolate có tính kháng từ trung bình tới cao phần lớn thu thập được trên cà chua. Tính kháng xuất hiện ở hầu hết các isolate thu thập được từ Lâm Đồng nơi có áp lực sử dụng thuốc hoá học là cao nhất trong các vùng trồng cà chua, khoai tây thu thập mẫu (Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, 2005) [18] . Nghiên cứu về cấu trúc gen của quần thể nấm P. infestans tại Việt Nam bằng mt-DNA haplotype và nhận dạng vùng GR57 cũng khẳng định rằng chủng quần nấm tại Việt Nam vẫn là chủng quần cũ (Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, 2003) [17]. Biện pháp hữu hiệu nhất để phòng chống bệnh mốc sương cho tới thời điểm hiện tại là biện pháp hoá học. Trước khi bệnh xuất hiện có thể phun phòng bằng các loại thuốc như zineb 80WP nồng độ 0,2-0,3%; thuốc Alliet, Boocdo với nồng độ 1% (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 2001). Nếu bệnh đã xuất hiện trên đồng ruộng và trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự phát triển của bệnh nên phun các thuốc trừ nấm như Ridomil 5G, Ridomil MZ72...để diệt trừ nấm bệnh. Phun thuốc clorua đồng với lượng 2,5kg/ha phun 5 lần với khoảng cách 5 ngày/lần hoặc Zineb với lượng 3,0kg/ha phun 3 lần với khoảng cách 8 ngày/lần kể từ khi xuất hiện bệnh cho hiệu quả tốt đối với việc phòng bệnh trong tháng 3-4 (Nguyễn Văn Viên,1998) [15]. 2.3 Cơ sở lý luận và thực tiễn 2.3.1 Cơ sở lý luận. Cà chua, khoai tây là các cây trồng ngắn ngày cho năng suất cao, giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị hàng hoá là rất lớn. Cùng với xu thế phát triển dân số cũng như tình hình thu hẹp đất đai nông nghiệp các cây cho thu hoạch củ như khoai tây sẽ là nguồn cung cấp lương thực quan trọng cho con nguời. Chính vì điều này năm 2008 đã được chọn là năm của khoai tây (The year of Potato). Có giá trị cao về kinh tế cũng như dinh dưỡng nhưng cây khoai tây và cà chua lại kháng mẫn cảm với các loại bệnh hại. Đây cũng là nguyên nhân chính dẫn tới sự giảm sút chất lượng cũng như sản lượng hai loại cây trồng này. Trong các đối tượng gây hại nặng trên cà chua, khoai tây bệnh mốc sương do nấm P. infestans là một trong những bệnh hại nặng nhất, bệnh có khả năng bùng phát thành dịch gây giảm trầm trọng năng suất đôi khi mất mùa, nấm gây bệnh còn có khả năng tồn dư trong đất trong nhiều năm. Chủng quần nấm có khả năng thay đổi như thêm mới chủng nấm hoặc thay đổi tính kháng thuốc hoá học làm cho việc phòng trừ bệnh càng thêm khó khăn. Bệnh có quan hệ chặt chẽ với thời tiết nên việc tìm hiểu các yếu tố thời tiết ảnh hưởng trực tới khả năng tồn dư, khả năng lan truyền cũng như tồn tại của nấm bệnh cũng góp phần phòng chống bệnh có hiệu quả và tiết kiệm hơn. Trong khuôn khổ này chúng tôi nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm P. infestans. 2.3.2 Lịch sử phát hiện. Bệnh mốc sương cà chua khoai tây lần đầu tiên ghi nhận tại Mêxicô đây cũng được coi là trung tâm đa dạng sinh học của nấm mốc sương. Triệu chứng bệnh được mô tả chi tiết năm 1845 trên cây khoai tây, trên cây cà chua bệnh được mô tả vào năm 1847. Bệnh được xác định nguyên nhân là do nấm, ban đầu Montagne đặt tên nấm là Botrytis infestans (1845) tới năm 1854 nấm được đổi tên thành Peronospora infestans cho đến năm 1876 nấm được Montagne và Anton de Bary đặt lại là Phytophthora infestans và tên gọi này được tiếp tục gọi tới ngày nay. Sự phát tán của nấm ra thế giới được chia làm hai giai đoạn giai đoạn giữa thế kỉ 19 và giai đoạn thế kỉ 20 cho đến nay. Giai đoạn giữa thế kỉ 19 lúc này khoai tây bắt đầu xuất hiện và được phổ biến rộng rãi trên các nước bắc Mỹ và châu Âu. Cùng với sự phổ biến của khoai tây nấm mốc sương cũng phát tán ra các vùng trồng đầu tiên là Mỹ theo nguồn bệnh trên khoai tây dại sau đó từ Mỹ lan sang châu Âu theo đường củ giống. Giai đoạn thứ 2 vào thế kỉ 20 lúc này do toàn cầu hoá về thương mại cũng như vận chuyển hàng hoá bệnh mốc sương theo củ khoai tây phát tán ra hầu như tất cả các vùng có xuất hiện cây khoai tây và cà chua. Bệnh hại nặng có thể mất mùa và dẫn tới nạn đói như ở Ireland năm 1845-1846 và ở Đức năm 1919. Bệnh mốc sương có thể coi là một trong những căn bệnh có sức tàn phá lớn nhất trong lịch sử con người. 2.3.3 Phạm vi phân bố Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trên thế giới nơi có điều kiện lạnh đủ để trồng khoai tây. Theo thống kê của CABI 1982 nấm P. infestans đã xuất hiện trên hầu hết các châu lục. Tại châu Á bệnh xuất hiện tại 26 nước trong đó có những nước lân cận và láng giềng nước ta như Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Phillipin, Hàn Quốc, Nhật, Ấn Độ...và bao gồm cả Việt Nam. Do tính chất phức tạp của giai đoạn phát tán thứ 2 của nấm P. infestans không chỉ chủng quần cũ mang chủng nấm A1 phát tán mà cả chủng quần mới A2 cũng phát tán đi toàn thế giới CABI năm 1996 cũng đưa ra thống kê các nước đã xuất hiện chủng quần mới này. Theo kết quả trên chủng nấm A2 đã xuất hiện ở 26 nước và vùng lãnh thổ trong đó châu Á có 5 nước là Ấn Độ, Indonesia, Hàn Quốc, Nhật, Israel. Quần thể ở Hàn Quốc, Nhật, Ấn Độ đã xuất hiện cả hai loại chủng nấm. Theo những công bố mới đây có thể chủng nấm A2 đã xuất hiện ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc giáp với biên giới nước ta. Ở nước ta bệnh phân bố trên hầu hết các vùng trồng khoai tây và cà chua. Bệnh gây hại mạnh và quanh năm ở các vùng có khí hậu mát mẻ như Lâm Đồng, Lào Cai; gây hại vào vụ đông và đông xuân ở các tỉnh đồng bằng bắc bộ và bắc trung bộ nơi có 1 mùa đông lạnh. 2.3.4 Triệu chứng Bệnh gây hại toàn cây. Đối với cà chua bệnh hại trên thân, lá, quả; khoai tây bệnh hại trên thân, lá, củ (Kết quả điều tra bệnh hại 1967-1968, Viện Bảo vệ Thực vật). Triệu chứng của bệnh rất đa dạng tuỳ thuộc vào điều kiện thời tiết. Triệu chứng bệnh trên lá: Vết bệnh ban đầu là những điểm nhỏ màu xanh thẩm sau đó lan rộng ra có màu nâu thẫm, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ không rõ ràng. Bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá sau đó lan rộng vào phiến lá (Stevenson, 1993). Phần giữa vết bệnh hoá nâu đen do các đám mô bị chết hoá nâu, xung quanh vết bệnh thường có đám cành bào tư và bào tử phân sinh màu trắng. Khi thời tiết ẩm ướt hoặc buổi sáng sớm có sương các đám bào tử phân sinh này dày và xốp tạo ra một lớp trắng như sương muối ở mặt dưới lá bệnh (Drenth et all, 1996). Triệu chứng trên cuống lá, cành và thân cây. Các vết bệnh lúc dầu nâu hoặc thâm đen sau đó lan rộng ra xung quanh kết hợp với nhau tạo thành đoạn dài. Trên thân vết bệnh kéo dài thành từng đoạn vỏ và thân cây thâm đen thối ướt. Khi điều kiện ẩm độ xuống thấp vết bệnh chết tóp lại , khi độ ẩm cao trên vết bệnh có lớp cành bào tử và bào tử phân sinh trắng như sương muối bao phủ. Bệnh làm cho thân cành bị thối, mềm có mùi mốc. Triệu chứng trên củ khoai tây: Triệu chứng bệnh mốc sương có thể nhầm lẫn với một số bệnh thối củ do vi khuẩn vì có chung các đặc điểm như có vết màu nâu lõm xuống. Tuy vậy khi cắt ngang củ sẽ thấy các mô bệnh có màu nâu xám lan rộng vào phía trong đôi khi còn ăn sâu vào trong lõi củ. Các củ bị bệnh hoặc các lát củ này khi đặt ở nhiệt độ <200C và ẩm độ bão hoà có thể quan sát thấy một lớp nấm trắng và cành bào tử phân sinh cũng như bào tử phân sinh trên bề mặt của củ (Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, 2001). Triệu chứng trên quả cà chua: quả cà chua bị bệnh tạo thành các vết bệnh thâm đen, cứng, bề mặt không bằng phẳng, quả không chín được. Bệnh lan truyền trong cây có thể từ lá tới thân rồi quả,củ. Nhưng cũng có thể lan truyền từ củ, hạt nhiễm bệnh lên hệ thân lá. Khi bệnh xuất hiện nếu gặp điều kiện thời tiết phù hợp như nhiệt độ 80% cây sẽ nhanh chóng tàn lụi có thể gây thành dịch làm giảm năng suất nghiêm trọng. 2.3.5 Nguyên nhân gây bệnh. Bệnh mốc sương cà chua khoai tây được Anton de Bary cà Montagne xác định là do nấm Phytophthora infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm sương mai (Peronosporales). Nấm có cấu tạo dạng sợi đơn bào.Sinh sản theo hai phương thức vô tính và hữu tính Phương thức sinh sản vô tính là phương thức sinh sản quan trọng nhất trong việc phát tán tạo thành dịch bệnh trên đồng ruộng. Nấm sinh sản vô tính bằng bào tử phân sinh tạo ra bởi các cành bào tử phân sinh nằm lộ trên bề mặt vết bệnh đặc biệt là dưới vết bệnh. Cành bào tử phân sinh không màu phân nhiều nhánh cấp 1 sole với nhau, trên mỗi đỉnh nhánh có nhiều chỗ phình lồi lõm, đây chính là đặc điểm riêng biệt của cành bào tử nấm P. infestans so với các loài Phytophthora khác. Bào tử phân sinh hình quả chanh yên kích thước trung bình là 22-23x16-2µm. Bào tử có 2 kiểu nảy mầm trực tiếp và gián tiếp. Nếu nhiệt độ môi trường trong khoảng 20-240C bào tử phân sinh sẽ trực tiếp hình thành ống mầm sau đó tạo thành sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây kí chủ. Nếu nhiệt độ môi trường từ 12-180C trong điều kiện ẩm cao hoặc có giọt nước bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du động bào tử (zoospore) có 2 roi. Các du động bào tử này có khả năng chuyển động nhờ có giọt nước sẽ tìm tới các lỗ khí khổng nảy mầm tạo ra các sợi nấm và xâm nhập vào cây kí chủ. Dù là phương thức nảy mầm trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi khi xâm nhập sợi nấm đều dùng phương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặc hình cầu để xâm nhập vào mô lá. Bệnh lan truyền từ cây này sang cây khác do gió lan truyền bào tử phân sinh, có thể do nước rửa trôi bào tử. Bào tử vô tính có khả năng tồn tại trong đất ẩm từ vài ngày tới vài tuần tuy vậy trong đất khô khả năng này khá hạn chế. Trong điều kiện tồn tại trên bề mặt nước có đất bào tử cũng có thể tồn tại tới vài tuần nhưng trong điều kiện không có đất bào tử chỉ tồn tại được vài ngày. Khả năng qua đông của bào tử trong đất là hạn chế nhất là các tầng đất có phủ băng giá. Khả năng chịu lạnh của bào tử vô tính khá tốt khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo bào tử nấm có thể chịu được nhiệt độ tới -50C trong vòng 1 ngày. Nếu bào tử nấm có khả năng nảy mầm và xâm nhập vào củ khoai tây thì khả năng qua đông của nấm lại rất cao, bào tử cũng có thể sống sót qua đông nếu nằm trên đất bám vào bề mặt củ trong quá trình bảo quản qua đông và là mầm bệnh cho vụ sau. Phương thức sinh sản hữu tính có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sự tồn dư của bệnh. Bào tử trứng hình thành khi có sự kết hợp giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium), và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao nhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31x50 mm (Erwin và Ribeiro, 1996). Bào tử trứng có khả năng tồn tại lâu trong đất mà không mất đi khả năng nảy mầm và độc tính. Đặc biệt oospore có khả năng tồn tại trong hạt cà chua là nguồn bệnh đặc biệt nguy hiểm cho vụ sau. Tuy vậy chỉ khi đủ cả 2 chủng nấm cùng với điều kiện lạnh ẩm mới sảy ra hiện tượng sinh sản hữu tính. Hiện tượng này chưa tìm thấy sảy ra ở nước ta. P. infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau tuỳ thuộc vào vùng sinh thái cũng như chế độ phòng trừ của từng vùng. Mỗi chủng khác nhau có độc tính khác nhau và khả năng xâm nhiễm trên mỗi giống cà chua, khoai tây là khác nhau chính vì vậy việc xác định chủng nấm tại các vùng sinh thái sẽ đưa ra cơ cấu giống cây trồng thích hợp để giảm tối đa tác hại của bệnh. 2.4 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Nghiên cứu một cách có hệ thống về nấm P. infestans gây bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố khí tượng, kí chủ đối với nấm mốc sương góp phần nâng cao hiểu biết về thời điểm phòng trừ bệnh, giảm chi phí bảo vệ thực vật. 3. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Nấm mốc sương hại cà chua khoai tây (P. infestans) hại cà chua khoai tây tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam vụ đông xuân 2008-2009. 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu Điều tra thu thập lấy mẫu của một số tỉnh phía Bắc Việt Nam : Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Nội. Nghiên cứu trong phòng và nhà lưới tại khu thí nghiệm bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội. 3.2 Vật liệu nghiên cứu  3.2.1 Các giống cà chua, khoai tây Các giống cà chua : Money maker, Santa clara, UC 82b (Trung tâm nghiên cứu cây trồng chuyển gen; University of California Riverside, Mỹ) ; TL 10, T620, TL 19, T6 (Bộ môn di truyền giống), Rachal, VL 2500, CNL Các giống khoai tây : Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel (Viện cây lương thực), PO3, Taurus,Atlantic (Viện nghiên cứu rau khoai tây và hoa Đà Lạt) 3.2.2 Thuốc bảo vệ thực vật 3.2.2.1 Thane-M 80WP. Tên hoạt chất : Mancozeb 3.2.2.2 Thuốc trừ nấm Rampart 55SC Tên hoạt chất : Metalaxyl 3.2.2.3 Thuốc trừ nấm Ridomil Gold 68PW Tên hoạt chất : metalaxyl M 3.2.3 Các loại vật liệu nhân nuôi nấm P. infestans Các môi trường nuôi cấy nhân tạo : Môi trường Pea-agar Môi trường Rye B Môi trường Mix RyeB: Pea-agar. Môi trường tự nhiên: Củ khoai tây sạch bệnh, lá khoai tây sạch bệnh được thu thập từ những cây sạch bệnh trồng trong nhà lưới. Lá cà chua sạch bệnh thu thập từ cây sạch bệnh trồng trong nhà lưới. 3.2.4 Các dụng cụ, vật tư hoá chất sử dụng trong nghiên cứu trong phòng và nhà lưới Các thí nghiệm trong phòng, các bước nhân nuôi, phân lập nấm được bảo quản trong phòng định ôn 180C. Các thí nghiệm trong nhà lưới, nhân nuôi lá, củ sạch bệnh phục vụ nhân nuôi và phân lập nấm P.infestans được thực hiện trong nhà lưới Jica khoa Nông Học. Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu : kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp, bình định mức, đĩa peptri, que cấy, panh, bếp điện, ống đong, cốc thuỷ tinh, tủ cấy vô trùng, kéo, dầm, túi nilon, giấy lọc Filter, túi lấy mẫu, Membran filter pore size 0,2, cồn, nước cất, nước javen, ..... 3.2.5 Các mẫu bệnh. Các mẫu bệnh thu thập được trên cà chua, tại các vùng điều tra tại Lào Cai, Lạng Sơn và Hà Nội : Bảng 3.1. Các isolate nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. STT Tên Isolate Kí chủ Địa điểm thu thập Mẫu nấm 1 Pot 01-09 Khoai tây, Atlantic Lạng Sơn Mix 1 2 Pot 02-09 Nt Lạng Sơn 3 Pot 03-09 Khoai tây, Trung Quốc Lạng Sơn Mix 2 4 Pot 04-09 Nt Lạng Sơn 5 Pot 01- 08 Khoai tây, Atlantic Lào Cai Mix 3 6 Pot 02-08 nt Lào Cai 7 Pot 03-08 nt Lào Cai 8 Tom 01-09 Cà chua Hà Nội Tom 09 Ghi chú : Pot : khoai tây Tom : cà chua Mix hỗn hợp Trong một số thí nghiệm như chủng nấm các isolate sẽ được thử nghiệm riêng rẽ nhưng với một số thí nghiệm khác các isolate sẽ được trộn lẫn với nhau như trong bảng. 3.3 Nội dung nghiên cứu - Thu thập các mẫu nấm P. infestans thuần từ các vùng điều tra trong vụ đông và đông xuân 2008-2009. - Nghiên cứu khả năng tồn tại dưới ánh nắng trực xạ của bào tử phân sinh nấm mốc sương. - Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc metalaxyl, metalaxyl M, mancozeb của các mẫu nấm P. infestans thu thập đuợc - Nghiên cứu về sự tồn khả năng tồn tại của của nấm P. infestans trong các mẫu đất của các vùng trồng khoai tây cà chua thu thập được. - Xác định các loại bệnh hại xuất hiện trên củ khoai tây thương phẩm và củ khoai tây giống. - Tìm hiểu khả năng kháng và nhiễm nấm P. infestans của một số giống khoai tây, cà chua có tiềm năng. 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng Điều tra theo phương pháp của viện bảo vệ thực vật 1997. Trên ruộng đại trà tiến hành điều tra 5 điểm chéo góc, định kì 7 ngày 1 lần. Mỗi điểm điều tra 1m2, số cây tuỳ thuộc vào mật độ gieo trồng của từng điểm điều tra. 3.4.2 Phương pháp thu thập mẫu Mẫu bệnh được thu thập tại các điểm điều tra, lấy mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên. Mẫu lá bệnh được thu thập ở các lá bánh tẻ, không dính thuốc bảo vệ thực vật. Các mẫu lá sau khi thu thập ghi địa điểm điều tra, cây kí chủ, nếu có thể tìm hiểu thêm về giống, chế độ chăm sóc. Mẫu bệnh được bảo quản trong thùng xốp có lót đá khô để bảo đảm nhiệt độ thấp, không để lá bệnh sát với túi đá khô, không để mẫu bệnh bị nóng vì khi nóng lá rất nhanh mủn nát và xuất hiện nhiều vi khuẩn hoại sinh. Lá bệnh sau khi thu thập về phòng thí nghiệm được đặt trong môi trường ẩm bão hoà (thường là trong hộp petri có lót giấy lọc ẩm) trong vòng 12-24 tiếng ở điều kiện tối thích 16-180C. 3.4.3 Các thí nghiệm trong phòng. 3.4.3.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh (Caten và Jinks, 1968). Chuẩn bị mẫu bệnh : các mẫu bệnh thu ngoài đồng ruộng chọn những mẫu điển hình, mới, còn tươi, không dính thuốc bảo vệ thực vật phân lập ngay hoặc có thể đặt trong môi trường ẩm bão hoà với điều kiện nhiệt độ 16-180C trong vòng từ 12-24 tiếng để mô bệnh hồi phục và cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh phát triển thành 1 lớp trắng xốp. Lúc này có thể kiểm tra xem có đúng là cành bào tử và bào tử phân sinh của P. infestans hay không. Chuẩn bị các vật liệu dùng trong phân lập : - Nếu phân lập bằng khoai tây. Củ khoai tây sạch thuộc các giống nhiễm bệnh như Diamant được thu từ cây trồng trong nhà lưới hoặc các củ khoai tây thương phẩm sạch bệnh và không sử dụng các loại thuốc nội hấp chống bệnh mốc sương. Củ được rửa sạch đất trên bề mặt bằng nước máy, để ráo. Khử trùng bề mặt củ bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút hoặc nhúng vào cồn 700 sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, chú ý khi đốt đảo đều tránh củ bị quá nóng gây chết mô. Các củ sau đó được cắt thành các lát có kích thước 5-7mm. - Nếu phân lập bằng quả cà chua. Quả cà chua xanh, sạch bệnh thuộc các giống mẫn cảm như HT7, HT9 được thu từ những cây sạch bệnh trồng trong nhà lưới, hoặc cây sạch bệnh trên ruộng sản xuất không phun các loại thuốc nội hấp cũng như tiếp xúc để trừ bệnh mốc sương. Rửa sạch quả bằng nước máy, để ráo, khử trùng quả bằng Sodium hypochloride 1% trong 3 phút, để ráo. Cắt ngang quả thành những lát từ 5-7mm. Phân lập : các mô bệnh được cắt thành các miếng nhỏ kích thước khoảng 1cm2 chứa ½ mô bệnh ½ mô khoẻ, nếu mô bệnh bị hoại sinh quá nhiều có thể lấy miếng to hơn nhưng khả năng tạp nhiễm nấm hoại sinh khác sẽ cao hơn. Các mảnh mô được khử trùng nhanh qua Sodium hypochloride 1% trong 3 phút hoặc bằng cồn 700 trong 1 phút, mảnh mô sau đó được nhúng qua nước cất vô trùng, để khô hoặc thấm nước bằng giấy thấm sạch. Các mảnh mô bệnh sau đó được đặt úp xuống sau đó đặt một lát cà chua hoặc khoai tây đã được chuẩn bị như bước trên đậy nắp hộp petri. Chú ý không để lát khoai tây hoặc cà chua bị quá khô bề mặt vì có thể sẽ tạo ra lớp màng tế bào chết làm cho nấm không xâm nhập được. Các đĩa phân lập được đặt trong điều kiện 180C trong điều kiện tối hoàn toàn. Thường xuyên kiểm tra sự hình thành sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh ở mặt trên lát cắt khoai tây hay cà chua. Kiểm tra dưới kính lúp soi nổi, nếu đúng là sợi hoặc cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh của nấm mốc sương thì dùng que cấy khêu nhẹ sợi nấm hoặc cành bào tử phân sinh đặt lên môi trường Pea-agar. Tuỳ thuộc vào giống khoai tây và cà chua mà thời gian xuất hiện sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh nhanh hay chậm, nếu thấy dấu hiện vùng đặt mô bệnh thâm đen thì có thể kết luận nấm đã xâm nhập vào mô thực vật. Sau khi chuyển nấm trên môi trường 3-4 ngày kiểm tra sợi nấm có phát triển hay không, và nấm đã thuần hay chưa. Nếu mẫu đã thuần có thể cấy chuyển sau 7-9 ngày trên môi trường Pea (môi trường phát triển hệ sợi và bào tử vô tính) hoặc môi trường Rye để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.3.2 Phương pháp điều chế môi trường. 3.4.3.2.1. Môi trường Pea-agar (Corbiere R. Andrivon D., 2000) Công thức nấu cho 1 lit môi trường. Thành phần bao gồm: + Đậu Hà Lan : 125g + Agar: 15g + Nước cất: 1200ml Cách điều chế môi trường: Cho 125g đậu + 1,2l nước cất vào nồi sạch. Đun sôi, sau đó nhỏ lửa trong vòng 45phút, lọc bằng vải lọc 4 lớp. Sau đó cho vào bình định mức 1l. Hoà tan 15g agar vào bình và hấp khử trùng ở 121°C, 1.5 atm trong 30 phút. Sau đó để nguội môi trường đến 60 - 70°C rồi đem đổ ra các đĩa peptri đã được khử trùng và sử dụng để cấy nấm. 3.4.3.2.2. Môi trường Rye A (Caten và Jinks) Cách nấu cho 1l môi trường: 1.Ngâm 60g hạt lúa mạch đen trong nước cất trong vòng 36 giờ. 2. Đổ nước ngâm rye trong bước 1 vào cốc đong và thêm vào 20g đường sucrose. 3. Đặt hạt rye đã được ngâm vào trong máy trộn và nhào trong vòng 10 giây 4. Đặt hạt vụn đã trộn ngâm trong nước 490 trong vòng 3 giờ. 5. Sau 3 giờ lọc lấy phần nước ngâm vắt kĩ phần hạt bằng vải lọc. Phần nước được thêm vào phần nước đã có ở bước 2. 6. Điều chỉnh pH bằng NaOH cho đến khi pH là 7 7. Thêm vào lượng nước cất cho vừa đủ 1l. 8. Thêm 15 g agar 9. Hấp tiệt trùng trong vòng 15 phút ở 1200C. 10. Để nguội tới 45-500C. 3.4.2.3.Môi trường Mix (Công thức nấu cho 1 lit môt trường) 50% môi trường Pea Agar + 50% môi trường Rye Agar, cả 2 loại như mô tả bên trên. 3.4.3.3 Phương pháp nhân nuôi nấm, thu bào tử phân sinh và đếm bào tử. Phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh: Nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh nhằm mục đích tạo ra một số lượng lớn bào tử để dùng trong các thí nghiệm về độc tính, kháng thuốc, khả năng tồn tại của bào tử trong ánh nắng trực xạ…. Có thể nhân nuôi nấm tạo bào tử phân sinh bằng những cách sau: Nhân trên môi trường nhân tạo: Nấm được cấy trên môi trường Pea-agar, khi tản nấm mọc hết đĩa môi trường kiểm tra sự tồn tại của bào tử nấm. Nhân trên lá cà chua, khoai tây: lá cà chua khoai tây thuộc các giống mẫn cảm sạch bệnh trồng trong nhà lưới cách ly. Các lá đơn sạch không bám đất, không quá già, úa được đặt úp mặt trên xuống trong các khay có lót giấy thấm đã thấm nước có thể phun trực tiếp dung dịch nước có chứa bào tử lên mặt dưới lá hoặc nhỏ các giọt bào tử lên mặt dưới lá. Bọc các khay lại để đảm bảo ẩm độ thích hợp để trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối. Nhân trên củ khoai tây: củ khoai tây sạch bệnh, thuộc các giống nhiễm mốc sương, trồng trong nhà lưới hoặc củ thương phẩm (với điều kiện cây sạch bệnh và không phun các loại thuốc nội hấp trừ bệnh mốc sương) rửa sạch khử trùng bằng cách nhúng cồn sau đó đốt trên ngọn lửa. Củ khoai sạch được cắt thành từng khoanh xếp trong khay lót giấy thấm đã thấm nước, phun hoặc nhỏ trực tiếp dịch nước chứa bào tử lên trên, bọc kín khay để trong tối hoàn toàn. Tất cả các phương pháp nhân nuôi nấm tạo bào tử đều được thực hiện trong tủ định ôn 180C. Phương pháp thu bào tử: Các bào tử sau khi nhân nuôi có thể thu để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm khác. Thu bào tử nhân trên môi trường nhân tạo: Cho vào đĩa petri từ 1-3ml nước cất vô trùng dùng bàn trang thuỷ tinh di nhẹ trên bề mặt của môi trường nhân tạo cho bào tử rời ra khỏi sợi nấm sau đó chắt nước bào tử ra cốc hoặc bình định mức. Thu bào tử nhân trên lá khoai tây, cà chua: lá đã nhiễm bệnh được bỏ vào túi nilon cùng với 10-20ml nước cất vô trùng tùy thuộc theo kích thước lá lắc đều, nếu lá còn nguyên nhặt lá bỏ ra ngoài chắt nước vào bình hay cốc đong, nếu lá bị nát có thể lọc qua vải màn để tránh các mô tế bào làm tắc bình phun hoặc làm sai lệch thể tích. Thu bào tử trên khoanh củ: tương tự với trên lá nhưng khoanh củ chọn những khoanh khô không bị thối ướt, sau khi lắc đều nhặt bỏ các khoanh củ lọc dịch bào tử qua vải màn để loại bỏ các mảnh mô lớn. Phương pháp nhân bào tử và thu bào tử trên môi trường nhân tạo cho kết quả tốt nhất về độ thuần cũng như độ sạch tuy vậy số lượng bào tử nhân lên không được nhiều. Phương pháp đếm bào tử: Sử dụng phương pháp đếm trên lam kính Bucker có sẵn các ô đếm, đếm ngẫu nhiên theo một số ô. Mỗi ống eppendot được lắc mạnh cho bào tử phân bố đều trong ống, dùng pipet hút 10µl bào tử rồi nhỏ lên trên lam kính. mỗi mẫu được đếm lại 2 lần. 3.4.3.4 Xác định chủng nấm của các isolate thu thập được. Tất cả các isolate thu thập được đều được sử dụng trong thí nghiệm này. Sử dụng bào tử động của các isolate nấm, nhỏ 30μl nước chứa bào tử nấm chưa xác định chủng nấm lên mép lá cà chua hay khoai tây mép lá còn lại nhỏ 30μl nước chứa bào tử của A1 hoặc A2 nuôi cấy ở nhiệt độ 180C với điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối. Quan sát sự hình thành bào tử trứng sau khi 2 vết bệnh đã đan xen vào nhau lắc đều lá cho tan trong cồn và kiểm tra dưới kính hiểm vi. 3.4.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng trực xạ tới khả năng tồn tại nảy mầm của bào tử mốc sương. Thử khả năng nảy mầm của bào tử nấm P. infestans sau khi tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng trực xạ hay được che bóng. Bào tử mốc sương thu được từ các lá khoai tây hay cà chua được nhiễm bệnh nhân tạo trước đó 7 ngày. Thí nghiệm bao gồm 3 công thức lớn : + Đặt dưới ánh nắng trực xạ + Đặt dưới mái che + Đặt trong điều kiện tối thích (đối chứng) * Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử sau các khoảng thời gian 0,60,120 phút với 3 công thức trên.Thí nghiệm này được tiến hành vào các mốc thời gian : 9-11am,10-12 am, 11-13am, 12-14pm trong cùng ngày. Thí nghiệm được tiến hành trong 2 kiểu thời tiết ngày nắng(600W/m2) và ngày mù Chỉ tiêu theo dõi là ti lệ số bào tử nảy mầm trên môi trường nhân tạo (đếm đại diện 300 bào tử) ghi nhận số bào tử nảy mầm và không nảy mầm ở mỗi thí nghiệm. * Thí nghiệm xác định khả năng nảy mầm của bào tử nấm mốc sương sau khoảng thời gian 0,10,20, 30,40,50,60 phút với mốc thời gian 12-13 giờ trong điều kiện ngày nắng và ngày có mây. Chỉ tiêu theo dõi là tỉ lệ nảy mầm của bào tử nấm trên môi trường nhân tạo. 3.4.3.6 Phương pháp nghiên cứu thời gian tiềm dục của bệnh trên một số giống cà chua, khoai tây Lá chét cà chua hoặc khoai tây lá đơn được đặt úp để lên đĩa peptri sạch, trong đĩa có 1 lớp giấy lọc ẩm với 5ml nước cất, nhắc lại 10 lần với 5 lá cà chua và 5 lá khoai tây/1 isolate/1giống. Thí nghiệm tiến hành trên 10 giống cà chua (Money maker, Santa clara, UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6, Rachal, VL 2500, CNL) và 6 giống khoai tây (Diamant, Solara, PO3, Taurus, Atlantic, TFL 1867) giống khoai tây đối với các mẫu bệnh mix 1, mix2, mix 3, tom 09. Pha dung dịch bào tử đã nhân nuôi ở nồng độ 104 bào tử/ml lây nhiễm bào tử bằng cách nhỏ 10µl (100 bào tử/ lá) vào chính giữa. Sau đó đặt trong tủ định ôn ở điều kiện 12h sáng/tối và 180C. Quan sát sự hình thành bào tử, cành bào tử và sợi nấm. Mỗi ngày quan sát 2 lần cách nhau 12 giờ. Chỉ tiêu theo dõi : thời gian xuất hiện bào tử của các isolate khác nhau trên các giống khoai tây, cà chua khác nhau. 3.4.3.7 Phương pháp nghiên cứu tốc độ phát triển của vết bệnh Sau mỗi 24h quan sát sự lan rộng của cành bào tử phân sinh và bào tử trên các lá chét trong thí nghiệm đã nêu ở mục 3.4.3.6. Đo đường kính bào tử nấm phát triển bằng thước đo mm. Sử dụng các ký hiệu khác nhau cho từng ngày đo để biết được sự phát triển của tản nấm. Chỉ tiêu theo dõi : kích thước của vết bệnh trong mỗi ngày cho tới ngày thứ 7 sau lây nhiễm, từ đó tính tốc độ phát triển vết bệnh theo chỉ tiêu RAUDPC. 3.4.3.8 Khả năng hình thành bào tử và số lượng bào tử hình thành trên mỗi vết bệnh Sau 7 ngày từ khi lây nhiễm như trong thí nghiệm mục 3.4.3.6, xác định được số lượng bào tử trên mỗi lá đã lây bệnh bằng phương pháp thu đếm bào từ như đã mô tả trong phương pháp đếm bào tử. Nếu không cần bào tử để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo có thể thay nước bằng cồn 900. 3.4.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng lây nhiễm của bào tử nấm Các lá được chọn ngẫu nhiên từ nhà lưới đục thành khoanh tròn có đường kính 14mm, đặt 10 khoanh/1 đĩa có giấy thấm nước cất (3,5ml). Bào tử được pha loãng 5 lần, qua 4 bước với nồng độ bào tử ban đầu là 104. Nhỏ vào mỗi khoanh lá 10µl vào chính giữa. Các bước pha loãng lần lượt giảm dần theo các mức: 100 - 25 - 6,2 -1,6 - 0,4 bào tử/ khoanh lá. Đặt trong phòng lạnh ở t0 18°C (12h sáng, 12h tối). Sử dụng 10 giống cà chua (Money maker, Santa clara, UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6, Rachal, VL 2500, CNL) và 6 giống khoai tây (Diamant, Solara, PO3, Taurus, Atlantic, TFL 1867) giống khoai tây đối với các mẫu bệnh mix 1, mix2, mix 3, tom 09. Chỉ tiêu theo dõi: số khoanh lá xuất hiện bào tử ở mỗi nồng độ bào tử, trên mỗi giống của từng isolate sử dụng. 3.4.3.10 Phương pháp nghiên cứu khả năng tồn tại của bào tử mốc sương trong đất canh tác (Lancey, 1965) Đất được được sử dụng trong thí nghiệm là đất trồng lúa và đất trồng màu. Đất được khử trùng hoặc để tự nhiên. Đất khử trùng bằng nồi hấp ở điều kiện 1210C trong 15 phút. Đất tự nhiên và đã khử trùng được đập mịn rây bỏ các hạt sạn, sỏi… Nguồn nấm thử nghiệm gồm tổng hợp các nguồn nấm thu được trên khoai tây và nguồn nấm thu được trên cà chua. Nấm sau khi được nhân nguồn phun vào đất thí nghiệm với nồng độ 10000 bào tử/ml. Sau 0, 7, 14, 21,...ngày với khoảng cách giữa các lần là 7 ngày lấy 1ml đất từ các công thức thí nghiệm trải đều trên khoanh khoai tây giống nhiễm đã khử trùng bề mặt củ có thể cho thêm nước cất nếu thấy bề mặt khô. Sau 1 ngày cắt lát khoai tây thành 8 miếng tương đối bằng nhau, đặt trong khay nhựa các miếng cắt không chạm vào nhau. Sau 7 ngày quan sát dưới kính soi nổi sự hình thành của cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh. Chỉ tiêu theo dõi: số mảnh củ bị bệnh sau các mốc thời gian. 3.4.3.11 Phương pháp nghiên cứu thành phần nấm hại trên củ khoai tây giống và thương phẩm. Củ khoai tây thuộc các giống : Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel, Atlantic được sử dụng trong thí nghiệm. Dùng kính soi nổi quan sát bề mặt của củ khoai tây giống và thương phẩm, xác định và phân lập các nấm xuất hiện trên củ. Củ khoai tây được rửa qua, để ráo nước tiến hành đục lấy mắt củ với đường kính 14mm, mỗi củ lấy 3 mắt, đặt 12 khoanh/1 đĩa, mỗi giống được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi: thành phần nấm, bệnh hại củ khoai thương phẩm hoặc khoai giống, trên toàn củ và mắt củ. 3.4.3.12 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới thành phần nấm hại trên mắt củ khoai tây giống. Thí nghiệm được tiến hành ở các điều ._.Thử nghiệm tính kháng nhiễm mốc sương trên 10 giống khoai tây: Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel, Atlantic đối với các mẫu nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 bằng đánh giá tính kháng nhiễm trên toàn củ và tính kháng nhiễm trên lát củ khoai tây. 4.13.1 Tính kháng nhiễm toàn củ Thử nghiệm tính kháng trên củ khoai tây giống của một số giống khoai tây với các isolate nấm thu thập được trong vụ đông 2008-2009 chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.17 và hình 4.18 Bảng 4.17. Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với nâm P. infestans Tên giống Tỉ lệ củ giống nhiễm bệnh sau 7 ngày (%) Mix 1 Mix 2 Mix 3 Tom -09 Diamant 100 100 100 30 Belarosa 50 40 50 10 Solara 80 80 70 80 Marlan 60 50 40 10 Provento 50 40 30 20 Esprit 40 30 30 10 Jerry 30 40 30 10 Sinora 40 30 40 10 Atlantic 100 90 100 80 Marabel 40 40 30 20 Hình 4.18. Tính kháng nhiễm toàn củ của một số giống khoai tây đối với nâm P. infestans Các giống khoai tây thí nghiệm đều nhiễm nấm P.infestans nhưng ở các mức độ khác nhau. Giống Diamant có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất tỉ lệ bệnh có thể lên tới 100%; các giống atlantic, solara nhiễm ở mức cao; các giống còn lại nhiễm ở mức trung bình. Các isolate thu thập trên khoai tây có tỉ lệ nhiễm trên các giống có tỉ lệ nhiễm cao hơn hẳn so với mẫu bệnh thu thập trên cà chua. Vậy độc tính của các mẫu bệnh trên khoai tây cao hơn độc tính của mẫu bệnh thu được trên cà chua. 4.13.2 Tính kháng nhiễm trên khoanh củ Thử nghiệm tính kháng trên khoanh củ khoai tây của 10 giống khoai tây đối với 4 mẫu nấm thu thập được trong vụ đông xuân 2008-2009 chúng tôi thu được các kết quả thể hiện ở bảng 4.18 và hình 4.19: Bảng 4.18. Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối với nấm P. infestans Giống Tỉ lệ khoanh củ nhiễm bệnh (%) với các mẫu nấm Mix 1 Mix 2 Mix 3 Tom -09 Diamant 100 100 100 80 Belarosa 80 90 80 70 Solara 90 80 90 60 Marlan 80 90 80 60 Provento 70 80 80 50 Esprit 80 70 70 40 Jerry 90 80 90 70 Sinora 60 70 60 50 Atlantic 100 100 100 70 Marabel 80 90 80 60 Hình 4.19. Tính kháng nhiễm trên khoanh củ của một số giống khoai tây đối với nấm P. infestans Thí nghiệm trên khoanh củ cũng cho kết quả tương tự với thí nghiệm trên toàn củ: tất cả các giống khoai tây thí nghiệm đều nhiễm nấm mốc sương. Tỉ lệ nhiễm trên khoanh củ cao đối với các mẫu nấm thu thập từ khoai tây (>80%). Tỉ lệ nhiễm bệnh của mẫu nấm thu thập trên cà chua thấp hơn thông thường 40-60%. Kết luận: Tất cả các giống khoai tây đều nhiễm bệnh mốc sương trên củ. Giống Diamant là giống nhiễm rất nặng, giống Atlantic nhiễm nặng các giống còn lại nhiễm ở mức độ cao. 4.14 Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới Khảo nghiệm tính kháng nhiễm của một số giống khoai tây, cà chua trong thí nghiệm chậu vại với mẫu nấm hỗn hợp của các isolate thu thập trên khoai tây vào vụ xuân 2008-2009 chúng tôi thu được kết quả sau: Bảng 4.19. Khả năng kháng nhiễm của một số giống khoai tây, cà chua trong thí nghiệm chậu vại Giống Thời kì tiềm dục Tỉ lệ bệnh Money maker 4 100 Santa clara 4 90 Uc 4 90 TL 10 4 100 T620 3 100 Tl 19 3 100 T6 3 100 CNL 5 10 Rachal 4 100 VL 2500 4 100 Diamant 4 100 Atlantic 4 90 Taurus 3 80 Solara 4 90 PO3 - - TFL 1867 4 70 Thời kì tiềm dục của các giống cà chua khoai tây trong thí nghiệm chậu vại đều từ 3-4 ngày giống CNL là 5 ngày. Tỉ lệ nhiễm bệnh cao thông thường là 80-100% giống TFL 1867 tỉ lệ nhiễm bệnh thấp hơn khoảng 70%, Giống CNL thể hiện tính kháng bệnh khá tỉ lệ nhiễm bệnh chỉ 10%. Các cây bị nhiễm bệnh nhanh chóng chết lụi. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Đặc điểm của các mẫu nấm mốc sương thu thập trong vụ đông xuân 2008-2009: các mẫu nấm thu thập được đều thuộc chủng nấm A1, khả năng tồn tại dưới ánh sáng mặt trời của nấm là không cao trong điều kiện trực xạ ở thời điểm 12-13 giờ trong ngày bào tử nấm có thể mất khả năng nảy mầm tới 60%. 2. Trong 10 giống cà chua khảo sát: Money maker, Santa clara, UC 82b, TL 10, T620, TL 19, T6 , Rachal, VL 2500, CNL và 6 giống khoai tây: PO3, Taurus,Atlantic, Diamant, Solara...hầu hết các giống đều thể hiện tính nhiễm đối với nấm mốc sương. Giống CNL thể hiện tính chịu bệnh tương đối tốt, giống khoai tây PO3 có khả năng kháng tốt đối với các mẫu nấm thu thập được. 3. Các mẫu nấm thu thập trên khoai tây có khả năng lây nhiễm tốt hơn mẫu nấm thu thập trên cà chua. 4.Thành phần bệnh hại trên củ giống các giống khoai tây khảo sát bao gồm 7 bệnh trong đó có 5 bệnh nấm 2 bệnh vi khuẩn. Đối với 3 bệnh hại trên mắt củ khoai tây là Rhizoctonia solani, Helminthosporium solani, Fusarium oxysporum nhiệt độ bảo quản 40C là tốt nhất để khống chế các bệnh này. 5. Các giống khoai tây:Diamant, Belarosa, Solara, Marlan, Provento, Esprit, Jerry, Sinora, Marabel,Atlantic đều nhiễm bệnh trên củ giống với mức độ nhiễm từ trung bình tới cao 40-90% với lát củ và 10-50% với củ nguyên Cao nhất là giống Diamant với tỉ lệ nhiễm có thể đạt tới 100%. 6.Các mẫu nấm thể hiện khả năng kháng đối với metalaxyl, bước đầu có tính kháng với Metalaxyl M. Nấm chưa thể hiện tính kháng với Mancozeb. 7. Bào tử phân sinh nấm mốc sương có khả năng tồn tại trong đất canh tác (đất lúa và đất trồng màu) từ 14-21 ngày. 5.2 Đề nghị Diện tích trồng khoai tây,cà chua ở các tỉnh miền Bắc đang tiếp tục mở rộng. Việc tiếp tục nghiên cứu các đặc tính liên quan tới dự tính dự báo như: khả năng tồn tại trong ánh sáng trực xa, khả năng phát tán của bào tử trong không khí, độc tính của nấm trên các giống cà chua khoai tây…để có thể xây dựng một mô hình dự tính dự báo mốc sương trên đồng ruộng từ đó giảm bớt nồng độ và cường độ sử dụng thuốc giúp cho người nông dân là rất quan trọng. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc(2005). Cây có củ và kỹ thuật thâm canh(Cây khoai tây). Nhà xuất bản lao động xã hội, tr. 53. Tạ Thu Cúc. (2001). Giáo trình Cây Rau. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, tr. 117-120. Vũ Hoan. (1967). Bệnh sương mai hại cà chua. Tạp chí KHKTNN số 29, tr. 339-340. Vũ Hoan. (1973). Nghiên cứu hình thái nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây bệnh mốc sương cà chua. Tạp chí KHKTNN số 129, tr. 178-183. Vũ Tuyên Hoàng, Mai Thị Phương Anh, Trần Khắc Thi. (1982). Nghiên cứu tập đoàn giống cà chua. Tạp chí KHKTNN số 235, tr. 21-30. Đào Mạnh Hùng, Phạm Văn Nhuyễn, Vũ Thanh Xuân, Nguyễn Hoài Nam (1995), Kết quả so sánh một số giống cà chua mới. Tạp chí KH công nghệ và quản lý KT số 1. Tr. 22-23. Trần Thị Mai(2001). Bảo quản khoai tây thương phẩm. Nhà xuất bản nông nghiệp, tr. 4 - 15 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề. (1998). Bệnh cây Nông nghiệp. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 295. Hoàng Thị Mỹ (1956), Luận khảo về các bệnh thường hại cây cối tại miền Nam Việt Nam Nguyễn Duy Nghi. (1975). Bệnh mốc sương khoai tây, cà chua ở vùng bang bằng Bắc bộ, Thông tin BVTV số 22, tr. 16-26. Trương Quang Tám. (1975). Quy trình phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại cà chua khoai tây. Tạp chí BVTV số 21, tr. 25-29. Nguyễn Ánh Tuyết. (1969). Kinh nghiệm trồng cà chua xuân hè. Tạp chí KHKTNN, số 85, tr 409-411. Đặng Vũ Thị Thanh (2008), Các loài nấm bệnh hại cây trồng ở Việt Nam Lê Trường, Nguyễn Trần Oánh và Đào Trọng Ánh (2004), Từ điển sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam, Hội khoa học kỹ thuật bảo vệ thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, trang 192-194. Nguyễn Kim Vân. (1997). Một số nghiên cứu về bệnh mốc sương và bệnh đốm vòng hại cà chua cụ đông xuân và vụ hè 1995-1996 tại Hà Nội. Kết quả nghiên cứu khoa học trồng trọt 1995-1996. NXB Nông nghiệp 1997, tr. 113-116. Nguyễn Văn Viên. (1998). Bệnh mốc sương cà chua ở vùng Hà Nội và hiệu lực phòng chống của một số thuốc trừ bệnh. Tạp chí BVTV, số 160, tr. 11-14. Ngô Thị Xuyên và Hoàng Văn Thọ. (2003). ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy nấm và thuốc Metalaxyl đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary trên một số giống cà chua, khoai tây. Tạp chí KHKTNN. Tập 1, số 3, tr 197-202. Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, Burger và Hermansen (2005), Nghiên cứu đặc điểm của nấm Phytophthora infestans ở Việt Nam Viện bảo vệ thực vật (1975), Kết quả điều tra bệnh cây 1967-1968 Viện bảo vệ thực vật (1999), Kết quả điều tra côn trùng và bệnh cây ở các tỉnh miền Nam 1977-1978 II. Tài liệu tiếng Anh Abad, G.Z. & J.A.Abad (1997), “Another look at the origin of late Blight of potato, tomato and pear Melon in the Andes of South American”, Plant disease/Vol 81 No.6, P.682-687 Andrivon, D (1995), Biology, Ecology and epidemilogy of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil, Phytopathology, Vol 85, P. 1053-1056 Aylor D. E. , William E. Fry, Hilary Mayton, and Jorge L. Andrade-Piedra (2001), Quantifying the Rate of Release and Escape of Phytophthora infestans Sporangia from a Potato Canopy, Phytopathology, Vol 91, P.1187-1196 Didier Andrivon, Fabian Pilet, Josselin Montarry, Majida Hafidi, Roselyne Corbière, El Hassan Achbani, Roland Pellé, and Daniel Ellissèche (2007), Adaptation of Phytophthora infestans to Partial Resistance in Potato: Evidence from French and Moroccan Populations, Phytopathology, Vol 97, P. 338-343 Jorge L. Andrade-Piera, Robert J. Hijmans, Gregory A. Forbes, William E. Fry, and Rebecca J. Nelson (2005), Simulation of Potato Late Blight in the Andes. I: Modification and Parameterization of the LATEBLIGHT Model, Phytopathology, Vol 95, P. 1191-1199 Bodker L.and Nieken BJ (2002) Influence of Irrigation on the wash off fungicides in field grow Potato. Proceedings of The six Workshop of European Ndetwork for Development of Integrated Control Strategy of potato blight. P. 163-168. Bruck R.I., W.E.Fry (1998). Effect of metalaxyl an acyllamin fungicide on developmental stages of Phytophthora infestans, Phytopathology, P.597-601. Canten C,E and Jinks (1968), Spontaneous variability of single isolate of Phytophthora infestans, Culture variation Canadian Journal of Botany, 46, P. 329-348. Shane Clayson, Jeff Miller, Lyndon Porter, and Nora Olsen (2005), EFFICACY OF PHOSPHITE-BASED FUNGICIDES FOR CONTROLLING PINK ROT AND LATE BLIGHT, Presented at the Idaho Potato Conference January 19-20, 2005. Crosier W. (1934). Studies in the biology of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary., Cornell University Agricultural Experiment station, Ithaca, NY Yigal Cohen and Moshe Reuveni (1983), Occurrence of Metalaxyl resistant of isolate Phytophthora infestans in potato fields in Israel, Phytopathology, vol 73 p. 925-927. Deahl K, L. Inglis, D.A. Demuth S, P (1993), Testing for resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans isolate from North Western Washington, Washington state University. Dillion M. (2005), Public Breeding for Organic Agriculture –Screening for Horizontal Resistance to Late Blight in Tomato, Project report. K. L. Deahl 1, S. E DeMuth ~, S. L. Sinden 1, and A. Rivera-Pefia (1995), Identification of chủng nấms and metalaxyl resistance in north American population of Phytophthora infestans, P.35-38. Dhesi N. S. & K.S . Nandpury. (1968). Vegetable Growing in Pundjab, Pundjab Agric, Uni. Farm. Bull., No.2, p. 128. Drenth A., E.M. Janssen, F. Govers (1995), Formation and survival oospores of Phytophthora infestans under natural conditions, Plant Pathology, vol 44, p. 86-94 Drenth A., Sendall B (1996), Practice guide to detection and identification Phytophthora, CRC for the Tropical Plant Protection, P. 12-39. S.N. Elansky, Yu.T. Dyakov, D.I. Milyutina, V.P. Apryshko, M.A. Pobedinskaya, A.V. Filippov, B.E. Kozlovsky, M.A. Kuznetsova, A.N. Rogozhin, N.V. Statsyuk (2007), Russian populations of Phytophthora infestans, Project report. Erwin D. C. and O.K. Ribeiro. (1996). Phytophthora Diseases Wordwide The American Pathological Society. APS Press .st.nl. p. 346 -349. EVENHUIS, G.J.T. KESSEL & P.J. VAN BEKKUM (2005), Epidemiology of P. infestans in relation to tuber blight. Survival of P. infestans sporangia in field soils, Ninth Workshop of an European Network for development of an Integrated Control Strategy of potato late blight Tallinn (Estonia), 19-23 October 2005 Wilbert G. Flier, Niklaus J. Grünwald, Laurens P. N. M. Kroon, Anne K. Sturbaum, Trudy B. M. van den Bosch, Edith Garay-Serrano, Hector Lozoya-Saldaña, William E. Fry, and Lod J. Turkensteen (2003), The Population Structure of Phytophthora infestans from the Toluca Valley of Central Mexico Suggests Genetic Differentiation Between Populations from Cultivated Potato and Wild Solanum spp., Phytopathology, vol 93, P. 382-390. William E. Fry, Stephen B. Goodwin (1997), Re-emergence of potato and tomato late blight in the United States, Plant disease, vol 81, P. 1349-1357 Fry W E., S. B. Goodwin, A. T. Dyer, J.M. Matuszak, A. Dreth, P.W. Tooley, L.S. Sujkowski, Y.J, Koh, B.A. Cohen, L.J. Spielman,K.L. Dheal, D.A. Inglis and K.P. Sandlan (1993), Historical and recent migrations of Phytophthora infestans, chronology, pathways, implications, Plant disease, vol 77, P. 653-661. P. D. Gavino, C. D. Smart , R.W. Sandrock, J. S. Miller, P. B. Hamm, T. Yun Lee, R. M. Davis, and W. E. Fry (2000),Implications of Sexual Reproduction for Phytophthora infestans in the United States: Generation of an Aggressive Lineage, Plant disease, P. 731-735 K. Gotoh, S. Akino, A. Maeda, N. Kondo, S. Naito, M. Kato and A. Ogoshi (2005), Charaterization of some Asian isolate of Phytophthora infestans, Plant pathology, vol 54, P. 733-739. Hartman, G.L and Huang, Y.H (1995), Characterization of Phytophthora infestans isolates and development of late blight on tomato in Tawain, Plant disease, vol 79, P. 849-852. Hermansen, A. (2002), Studies information and survival of Oospores of Phytophthora infestans in Norway, Processdings of the sixth workshop of european network for development of intergrate control strategy of potato blight, P. 77-80. Johnson, D. A., Cummings, T. F., Hamm, P. B., Rowe, R. C., Miller, J. S., Thornton, R. E., Pelter, G. Q., and Sorensen, E. J. (1997). Potato late blight in the Columbia Basin: An economic analysis of the 1995 epidemic. Plant Dis. Vol 81 P. 103-106. Kirk, W. W. 2003. Tolerance of mycelium of different genotypes of Phytophthora infestans to freezing temperatures for extended periods. Phytopathology, vol 93, P. 1400-1406. Kadish, D., and Cohen, Y. (1992), Overseasoning of metalaxyl-sensitive and metalaxyl-resistant isolates of Phytophthora infestans in potato tubers.Phytopathology, vol 82, P.887-889. Ko,W. H. (1994), An Alterative possible origin of the A2 chủng nấm of Phytophthora infestans outside Mexico, Phytopathology, vol 84, P. 1224-1227. MAZÁKOVÁ J., TÁBORSKÝ V., ZOUHAR M., RYŠÁNEK P., HAUSVATER E., DOLEŽAL P. (2006): Occurrence and distribution of chủng nấms A1 and A2 of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in the Czech Republic. Plant Protect. Sci., 42: 41–4 Mayton, H., Forbes, G. A., Mizubuti, E. S. G., and Fry, W. E. (2001), The roles of three fungicides in the epidemiology of potato late blight, Plant Disease, vol 85, P. 1006-1012. Miller, J. S., Hamm, P. B., and Johnson, D. A. (1997). Characterization of the Phytophthora infestans population in the Columbia Basin of Oregon and Washington from 1992 to 1995. Phytopathology, vol 87, P. 656-660. Mizubuti, E. S. G., Aylor, D. E., and Fry, W. E. 2000. Survival of Phytophthora infestans sporangia exposed to solar radiation. Phytopathology 90: 78-84. Nishimura, R. & CTV (1999). Distribution of Phytophthora infestans Populations in Seven Asian countries, Annual Phytopathology Soc. Japanese, vol 65, P. 121-125. Porter, L. D., and Johnson, D. A. 2004. Survival of Phytophthora infestans in surface water. Phytopathology,vol 94, P.380-387. Reis, A., Smart, C. D., Fry, W. E., Maffia, L. A., and Mizubuti, E. S. G. 2003. Characterization of isolates of Phytophthora infestans from southern and southeastern Brazil from 1998 to 2000. Plant Dis. 87:896-900. Smart, C. D., Mayton, H., Mizubuti, E. S. G., Willmann, M. R., and Fry, W. E. (2000). Environmental and genetic factors influencing self-fertility in Phytophthora infestans. Phytopathology, vol 90, P. 987-994. PHỤ LỤC SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE ANHSANG 21/ 9/ 9 16:23 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Anh huong cua anh sang ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 0.31519E-01 2 1621.5 177 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIDIEM$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 492.15 3 1622.4 176 0.30 0.825 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - error (a) -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 134.23 11 1699.6 168 0.08 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIGIAN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 10144. 17 707.14 162 14.35 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIDIEM$*THOIGIAN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 2836.1 71 793.05 108 3.58 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - Error (b) -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 1830.4 138 839.38 41 2.18 0.002 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - DIEUKIEN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 13590. 6 1187.7 173 11.44 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIDIEM$*DIEUKIEN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 3100.5 27 1337.5 152 2.32 0.001 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIGIAN$*DIEUKIEN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 3463.4 82 31.112 97 111.32 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - THOIDIEM$*THOIGIAN$*DIEUKIEN$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 1688.3 170 -0.69444E-02 9 -34.97 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - Residual -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TLNAYMAM 0.28701E+06 179 0.00000 0 -34.97 0.000  TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ANHSANG 21/ 9/ 9 16:23 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Anh huong cua anh sang MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TLNAYMAM 1 60 57.9687 2 60 57.9493 3 60 57.9950 SE(N= 60) 5.19863 5%LSD 177DF 14.5071 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT THOIDIEM$ ------------------------------------------------------------------------------- THOIDIEM$ NOS TLNAYMAM 9gio-11gio 12 34.9958 12012gio2gio-14gio 2 74.6000 9gio-11gio 0 0.000000 9gio-11gio 0 0.000000 10gio-12gio 0 0.000000 11gio-13gio 2 20.1250 11gio-13gio 3 100.000 12gio-14gio 1 15.3000 12gio-14gio 56.6222 9gio-11gio 3 100.000 0ng ta 4 20.0000 60 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE TIEMDUC 21/ 9/ 9 19:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 0.20973E-03 2 3.2376 69 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - ISOLATE$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 5.7397 11 2.6709 60 2.15 0.030 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - Error (a) -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 1.8042 35 4.4513 36 0.41 0.996 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 17.176 13 0.17256E-02 58 9954.03 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - ISOLATE$*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 9.7117 23 0.46380E-03 4820939.27 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 5.4465 41 0.28285E-02 30 1925.60 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*ISOLATE$*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TG TIEMD 223.39 71 0.00000 0 1.03 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TIEMDUC 21/ 9/ 9 19:47 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TG TIEMD 1 24 3.92917 2 24 3.92333 3 24 3.92542 SE(N= 24) 0.367285 5%LSD 69DF 1.03612 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT ISOLATE$ ------------------------------------------------------------------------------- ISOLATE$ NOS TG TIEMD Mix 1 2 2.34500 1 Mix 3 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 19:59 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 19:59 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 0.87311E-10 2 7.2181 45 0.00 1.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 12.946 25 0.53028E-01 22 244.13 0.000 ANOVA FOR SINGLE EFFECT - REP*GIONG$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB TIBENH 324.81 47 0.00000 0 0.94 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DIALA 21/ 9/ 9 20:17 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT REP ------------------------------------------------------------------------------- REP NOS TIBENH 1 16 9.06250 2 16 9.06250 3 16 9.06250 SE(N= 16) 0.671661 5%LSD 45DF 1.91301 ------------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TIBENH Money makerNL 0 0.000000 1 TL 10 ._.