Thử nghiệm vacxin cúm A/H5N1 (chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất trên đàn gà nuôi tại tỉnh Nam Định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NƠNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM VĂN ðỨC THỬ NGHIỆM VẮC-XIN CÚM A/H5N1 (CHỦNG NIBRG-14) DO VIỆT NAM SẢN XUẤT TRÊN ðÀN GÀ NUƠI TẠI TỈNH NAM ðỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ NƠNG NGHIỆP Chuyên ngành: THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM CƠNG HOẠT PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2010 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... i LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan rằng: - Các kết quả nghiên cứu trong lu

pdf87 trang | Chia sẻ: huyen82 | Ngày: 09/12/2013 | Lượt xem: 632 | Lượt tải: 4download
Tóm tắt tài liệu Thử nghiệm vacxin cúm A/H5N1 (chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất trên đàn gà nuôi tại tỉnh Nam Định, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ận văn là trung thực, khách quan và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Phạm Văn ðức Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... ii LỜI CÁM ƠN Trong suốt 2 năm học tập và hồn thành luận văn, với nỗ lực của bản thân, tơi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tơi được tỏ lịng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, Viện đào tạo Sau ðại học, Khoa Thú y, Bộ mơn Bệnh lý, các thầy cơ giáo đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học. Tiến sỹ Phạm Cơng Hoạt, người trực tiếp hướng dẫn tơi thực hiện luận văn tốt nghiệp Ban Lãnh đạo và tồn thể cán bộ Chi cục Thú y, đồng nghiệp đang làm việc trong lĩnh vực Chăn nuơi-Thú y của tỉnh Nam ðịnh. Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tơi vượt qua mọi khĩ khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài. Một lần nữa tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập. Hà Nội, tháng 10 năm 2010 Tác giả Phạm Văn ðức Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... i MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cám ơn ii Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình v 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 4 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 4 2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và trong nước 6 2.4 ðặc điểm sinh học của virus cúm typ A 11 2.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 24 2.6 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 27 2.7 Chẩn đốn bệnh 28 2.8 Kiểm sốt bệnh 29 2.9 Vắc-xin cúm gia cầm 30 2.10 Nghiên cứu trong nước về bệnh cúm gia cầm 33 3 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 ðối tượng, địa điểm nghiên cứu 36 3.2 Nội dung nghiên cứu 36 3.3 Nguyên liệu và thiết bị hĩa chất dùng trong nghiên cứu 36 3.4 Phương pháp nghiên cứu 37 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... ii 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 4.1 Diễn biến dịch cúm gia cầm và kết quả phịng chống dịch của tỉnh Nam ðịnh 47 4.1.1 ðặc điểm, tình hình chăn nuơi của tỉnh giai đoạn 2005- 2009 47 4.1.2 Diễn biến dịch cúm gia cầm tại tỉnh Nam ðịnh 48 4.1.3 Thiệt hại do dịch cúm gia cầm gây ra ở Nam ðịnh 51 4.1.4 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàng của gà, mắc bệnh cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nam ðịnh 51 4.1.5 Các biến đổi bệnh tích đại thể của gà mắc bệnh cúm gia cầm 52 4.2 Kiểm tra một số chỉ tiêu vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) do việt nam sản xuất trong phịng thí nghiệm 55 4.2.1 Kết quả đánh giá độ vơ trùng của vắc-xin. 55 4.2.2 Kiểm tra độ an tồn của vắc-xin 56 4.2.3 Kết quả tiêm thí nghiệm vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) 58 4.3 Kết quả tiêm thử nghiệm vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG- 14) tại Nam ðịnh 61 4.3.1 Kết quả khảo sát mức độ an tồn của vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất qua lâm sàng 61 4.3.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ nhất 62 4.3.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ 2 63 4.3.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ 3 65 4.4 So sánh sử dụng một số phản ứng miễn dịch học để đánh giá hiệu giá kháng thể trên gà sau khi tiêm vắc-xin 67 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 5.1 Kết luận 69 5.2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể TN: Thí nghiệm ARN: Acid ribonucleic cADN: Complementary ADN GMT: Geographic Mean Titre HA: Hemagglutination test HI: Hemagglutination inhibitory test HPAI: High Pathogenicity Avian Influenza LPAI: Low Pathogenicity Avian Influenza OIE: Office Internationale des Epizooties PBS: Phosphate - Buffered - Saline Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... iv DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Thống kê số lượng người nhiễm/chết do H5N1 từ năm 2003 đến tháng 10/2010 ở Việt Nam và thế giới 10 4.1 Số lượng gia cầm tiêu hủy tháng 5 năm 2007 50 4.2 Kết quả mổ khám gà, mắc bệnh cúm gia cầm 53 4.3 Kết quả kiểm tra vơ trùng vắc-xin cúm A/H5N1 55 4.4 Bảng kết quả kiểm tra độ an tồn của vắc-xin cúm A/H5N1 trên phơi 56 4.5 Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể phơi gà được tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 57 4.6 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày 59 4.7 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin sau 5 tháng 60 4.8 Kết quả khảo sát mức độ an tồn của vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất qua lâm sàng 61 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ nhất 62 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 2 64 4.11 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 3 65 4.12 Kết quả so sánh hiệu quả đánh giá hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin 68 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... v DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Phơi trứng gà 9 ngày tuổi 38 4.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày 59 4.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin sau 5 tháng 60 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ nhất 63 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 2 64 4.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 3 66 4.6 Hình ảnh điện di kháng nguyên hịa tan của virus cúm A/H5N1 trên gel SDS-PAGE 67 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn đề Bệnh cúm gia cầm chủng độc lực cao (HPAI) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, cĩ tốc độ lây lan rất nhanh với tỉ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh [14]. Bệnh do virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều phân typ khác nhau gây nên. Virus gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các lồi chim và cịn gây bệnh cho cả con người. Với những tính chất nguy hiểm của bệnh, Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) xếp bệnh vào Bảng A- Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất [14]. Hiện nay dịch cúm gia cầm đang là mối quan tâm và đáng lo ngại của tồn cầu, đến nay đã cĩ hơn 50 nước trên thế giới xuất hiện dịch, dịch cĩ chiều hướng diễn biến phức tạp. Ở Việt Nam, theo báo cáo của Cục Thú y, từ cuối năm 2003 dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện ở nước ta. ðến nay đã xảy ra nhiều đợt dịch với số gia cầm bị chết do dịch và phải tiêu hủy khoảng 50 triệu con, ước thiệt hại lên tới hàng nghìn tỉ đồng. Theo thơng báo của Bộ Y tế, từ khi xuất hiện dịch cúm gia cầm đến nay, tính từ ca mắc H5N1 đầu tiên ở Việt Nam vào năm 2003 tới nay, cả nước cĩ 117 người mắc, trong đĩ cĩ 59 ca tử vong. Tỷ lệ tử vong chung là trên 50%, tuy nhiên từ đầu năm tới nay tỷ lệ tử vong do nhiễm H5N1 trong cả nước rất cao tuy rằng số ca nhiễm ít. Nguyên nhân mắc bệnh đều liên quan tới giết mổ và ăn thịt gia cầm, thủy cầm ốm, chết. Tại Nam ðịnh, ổ dịch đầu tiên được phát hiện ngày 12/1/2004, đến đầu tháng 2 dịch đã xảy ra trên diện rộng, với 38 xã phường ở 9/10 đơn vị huyện, thành phố cĩ dịch. Số gia cầm tiêu huỷ trong đợt dịch này là 817.720 con, ước thiệt hại trực tiếp khoảng 24 tỉ đồng. Mặc dù đã tích cực áp dụng các biện pháp Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 2 phịng chống dịch nhưng đến cuối năm 2004, đầu năm 2005 dịch lại tái bùng phát trở lại. Theo thơng báo của Sở Y tế Nam ðịnh, từ khi xuất hiện dịch cúm gia cầm đến cuối năm 2004 cĩ 4 trường hợp người bị tử vong do virus cúm A (H5N1). ðến năm 2007 dịch xuất hiện trở lại tại 25 xã, ở 6 huyện, 86 hộ, với số gia cầm phải tiêu huỷ lên tới 12973 con ước thiệt hại là 4 tỉ đồng. Việt Nam là quốc gia đưa ra chính sách phịng chống cúm A/H5N1 bằng vắc-xin và hố dược, song cho đến thời điểm hiện tại chúng ta hồn tồn phải nhập vắc-xin từ Trung Quốc, Hà Lan... Việc Việt Nam chủ động sản xuất được vắc-xin cúm A/H5N1 nĩ khơng chỉ đơn thuần là giảm chi phí ngoại tệ mà việc lựa chọn chủng vắc-xin sẽ đảm bảo tính tương đồng kháng nguyên với chủng gây bệnh, mặt khác cịn chủ động trong kế hoạch tiêm phịng cho đàn gia cầm. Viện Cơng nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã được Nhà nước đặt hàng sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1 bằng chủng NIBRG-14 cho gia cầm. Kết quả đánh giá bước đầu vắc-xin cĩ hiệu lực tốt, để cĩ cơ sở cho việc sử dụng vắc-xin đại trà, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: Thử nghiệm vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIBRG-14 ) do Việt Nam sản xuất trên đàn gà nuơi tại tỉnh Nam ðịnh. 1.2 Mục tiêu của đề tài - Làm rõ thêm một số đặc điểm của bệnh cúm gia cầm, mức độ thiệt hại dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nam ðịnh. - Thử nghiệm hiệu lực của vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất trên một số đàn gà được tiêm phịng tại địa bàn tỉnh Nam ðịnh. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Các kết quả điều tra, nghiên cứu tại Nam ðịnh nhằm cung cấp, bổ sung, hồn thiện thêm các thơng tin về bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 3 - Các biện pháp tổ chức thực hiện và kết quả tiêm vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất trên một số đàn gà được tiêm phịng theo độ tuổi khác nhau tại địa bàn tỉnh Nam ðịnh, nhằm rút kinh nghiệm để cĩ cơ sở tiến tới chỉ đạo tiêm phịng đại trà ở Nam ðịnh nĩi riêng và cả nước nĩi chung. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm ở gia cầm thường gọi là bệnh cúm gia cầm hoặc bệnh cúm gà (avian influenza), là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtyp khác nhau. Trước đây bệnh cịn được gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), nhưng từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 đã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly pathogenic avian influenza viết tắt là HPAI) để chỉ virus cúm typ A cĩ độc lực mạnh [14]. Bệnh cúm gia cầm HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, cĩ tốc độ lây lan rất nhanh với tỉ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các loại chim. Virus cịn gây bệnh cho cả con người và cĩ thể thành đại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm đang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết [16], [6]. 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm Năm 412 trước cơng nguyên, Hippocrate đã mơ tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ đại dịch cúm được mơ tả kỹ và từ đĩ đến nay đã xảy ra 31 vụ đại dịch. Trong hơn 100 năm qua cĩ 4 vụ đại dịch cúm xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 [14]. Năm 1878 ở Italy đã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở đàn gia cầm và được gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), bệnh lần đầu tiên được Porroncito mơ tả và ơng nhìn nhận một cách sáng suốt rằng tương lai sẽ là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. Năm 1901, Centanni và Savunozzi đã đề Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 5 cập đến ổ dịch này và xác định được căn nguyên siêu nhỏ qua lọc (Filterable agent) là yếu tố gây bệnh. ðến năm 1955 Achafer đã xác định được căn nguyên gây bệnh thuộc nhĩm virus cúm typ A thơng qua kháng nguyên bề mặt là H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận ðơng [6]. Năm1963, virus cúm typ A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do lồi thủy cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà. Cuối thập kỷ 60, phân typ H1N1 thấy ở lợn và cĩ liên quan đến những ổ dịch ở gà tây. Mối liên hệ giữa lợn và gà tây là những dấu hiệu đầu tiên về virus cúm ở động vật cĩ vú cĩ thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm. Những nghiên cứu đều cho rằng virus cúm typ A phân typ H1N1 đã ở lợn và truyền cho gà tây, ngồi ra phân typ H1N1 ở vịt cịn truyền cho lợn [14]. Năm 1971, Beard đã mơ tả khá kỹ virus gây bệnh và đặc điểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây khá lớn xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H7N1. Từ năm 1960-1979 bệnh được phát hiện ở Canada, Mehico, Achentina, Braxin, Nam Phi, Ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kơng, Nhật Bản, các nước vùng Trung Cận ðơng, các nước thuộc liên hiệp Anh và Liên Xơ [25]. Các cơng trình nghiên cứu cĩ hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt được cơng bố ở Australia năm 1975, ở Anh năm 1979, ở Mỹ năm 1983-1984, ở Ailen năm 1983-1984 về đặc điểm sinh học, bệnh học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn đốn miễn dịch và biện pháp phịng chống bệnh [25]. Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm đã cĩ bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ được cơng nhận khi xác định được tỉ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số lồi thuỷ cầm di trú [14]. Từ sau khi phát hiện ra virus cúm typ A, các nhà khoa học thấy rằng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 6 virus cúm cĩ ở nhiều lồi chim hoang dã và gia cầm nuơi ở những vùng khác nhau trên thế giới. Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất với gia cầm thuộc phân typ H5 và H7 như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983-1984 là H5N2 [14]. Cuối tháng 12/2003 đến nay, một đợt cúm gà lớn do chủng A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra ở nhiều quốc gia ở ðơng Nam Á và ðơng Á: Trung Quốc,Việt Nam, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc, ðài Loan, Pakistan, Lào, Cambodia, Indonesia. Hàng triệu con gia cầm bị tiêu hủy và nhiều người tử vong đặc biệt Indonesia, Việt Nam và Thái Lan (theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO)) Từ năm 2003 đến tháng 10/2010, trên thế giới cĩ 383 người nhiễm cúm A/H5N1, trong đĩ 290 người chết (Bảng 2.1). 2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và trong nước 2.3.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Virus cúm gia cầm phân bố khắp tồn cầu, vì vậy dịch bệnh đã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới. Năm 1983-1984 ở Mỹ, dịch cúm gà xảy ra do chủng virus H5N2 ở 3 bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu huỷ hơn 19 triệu gà [26]. cũng trong thời gian này tại Ireland người ta đã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy khơng cĩ triệu chứng lâm sàng nhưng đã phân lập được virus cúm chủng độc lực cao (HPAI) để loại trừ bệnh một cách hiệu quả, nhanh chĩng. Năm 1977 ở Minesota đã phát hiện dịch trên gà tây do chủng H7N7. Năm 1986 ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2. Năm 1997 ở Hồng Kơng dịch cúm gà xảy ra do virus cúm typ A subtyp H5N1. Tồn bộ đàn gia cầm của lãnh thổ này đã bị tiêu diệt vì đã gây tử vong cho con người [14]. Như vậy đây là lần đầu tiên virus cúm gia cầm đã vượt “rào cản về lồi” để lây cho người ở Hồng Kơng làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong đĩ cĩ 6 người chết [Nguyễn Hồi Tao, Nguyễn Tuấn Anh: “Một Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 7 số thơng tin về dịch cúm gia cầm”, Chăn nuơi số 3-2004, tr 27]. Năm 2003, ở Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mơ lớn do chủng H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu hủy, 83 người lây nhiễm và 1 người chết, gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng [26]. Cuối năm 2003 đầu năm 2004 đã cĩ 11 quốc gia ở châu Á thơng báo cĩ dịch cúm là Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Inđơnêxia, Trung Quốc, Hồng Kơng, ðài Loan, Việt Nam và Pakistan. Từ cuối năm 2003 đến nay dịch cúm gia cầm diễn biến hết sức phức tạp, đã cĩ hơn 50 nước trên thế giới phát hiện thấy virus cúm gia cầm, dịch đã tái xuất hiện trở lại ở một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan... 2.3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm phát ra tại trại gà giống của Cơng ty C.P (Thái Lan) ở xã Thuỷ Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây gây ốm, chết 8.000 gà trong 4 ngày. Ngày 02/01/2004, Cơng ty đã tiến hành tiêu huỷ 100.000 gà. Dịch đã nhanh chĩng lây lan ra hầu hết các tỉnh trong cả nước. ðể thuận lợi cho việc đánh giá về dịch tễ học cĩ thể chia quá trình dịch từ khi xuất hiện vào cuối năm 2003 đến nay thành 4 đợt dịch như sau: * ðợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2003: Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm thể độc lực cao với tác nhân gây bệnh là virus cúm H5N1 xảy ra ở Việt Nam. ðây là lần đầu tiên trong lịch sử nước ta dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Hà Tây, Long An và Tiền Giang, vì thế nĩ cĩ thể được coi là một bệnh mới ở gia cầm. Dịch lây lan một cách nhanh chĩng cùng một lúc ở nhiều địa phương khác nhau, đã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuơi gia cầm. Chỉ trong vịng 2 tháng, đến ngày 27/02/2004 dịch đã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6%) thuộc 381 huyện, quận, thị xã (chiếm 60%) của 57 tỉnh, thành phố trong cả nước. Tổng số gia cầm bị mắc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 8 bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con chiếm 16,8% tổng đàn, trong đĩ gà 30,4 triệu con; thủy cầm 13,5 triệu con. Ngồi ra cịn cĩ 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và bị tiêu huỷ. * ðợt dịch thứ hai từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2004: Dịch cúm gia cầm thể độc lực cao đã tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc ðồng bằng sơng Cửu Long. Bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuơi nhỏ lẻ và hầu như khơng cĩ trại chăn nuơi quy mơ lớn nào bị nhiễm bệnh. Dịch cĩ khuynh hướng xuất hiện ở những vùng cĩ chăn nuơi nhiều thủy cầm. Dịch đã xảy ra ở 46 xã phường của 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao điểm nhất vào tháng 7 sau đĩ giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ cĩ 1 điểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu huỷ trong thời gian này là 84.078 con, trong đĩ cĩ 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút Trong đợt này cĩ 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1 trong đĩ cĩ 9 ca tử vong. * ðợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 đến tháng 5/2005: Trong thời gian này dịch đã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Dịch xuất hiện nhiều nhất vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh thành phố, số gia cầm tiêu hủy là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút. Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ðồng bằng sơng Cửu Long [11]. Những tỉnh bị dịch bệnh nặng là Long An, Tiền Giang, Bạc Liêu, ðồng Tháp, ước tính thiệt hại khoảng 3.000 tỷ đồng, trong đĩ thiệt hại trực tiếp do gia cầm bị chết và tiêu hủy là 1.800 tỷ đồng [15] * ðợt dịch thứ 4 từ 01/10/2005 đến 15/12/2005: Từ đầu tháng 10/2005 đến 15/12/2005 dịch đã tái phát ở 285 xã, phường, thị trấn thuộc 100 quận, huyện của 24 tỉnh, thành phố. Số gia cầm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 9 ốm, chết và tiêu hủy là 3.735.620 con, trong đĩ cĩ 1.245.282 gà; 2.005.557 vịt; 484.781 chim cút, bồ câu, chim cảnh, tuy thiệt hại khơng lớn nhưng gây sự hoang mang trong cộng đồng dân cư là dịch cúm vẫn cịn dai dẳng xảy ra * ðợt dịch thứ 5: từ 12/2006 đến nay: Dịch đã làm chết nhiều gia cầm và thuỷ cầm trên địa bàn cả nước Theo thống kê của Cục Thú Y, từ ngày 26/12/2003 đến ngày 31/03/2010 nước ta đã cĩ 59 người chết/117 trường hợp nhiễm bệnh Từ đầu năm 2006, Việt Nam đã áp dụng chương trình tiêm phịng cho gia cầm, thủy cầm trong cả nước. Dịch cúm A sẽ cịn diễn biến phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luơn biến đổi và thích ứng [11]. *Nhận xét về dịch tễ học: - Về phân bố địa lý: các đợt dịch phát ra tập trung ở khu vực ðồng bằng Sơng Cửu Long và ðồng bằng Sơng Hồng. Những vùng này cĩ nhiều hệ thống sơng ngịi, kênh rạch, mật độ chăn nuơi cao, tổng đàn gia cầm lớn và việc buơn bán, vận chuyển, tiêu thụ gia cầm cao hơn các vùng khác. - Về thời gian xảy ra dịch: dịch phát ra nặng vào vụ ðơng Xuân, cao điểm vào cuối tháng 1 đầu tháng 2. Trong thời gian này thời tiết thay đổi, độ ẩm cao, nhiệt độ thường xuống thấp, tạo điều kiện thuận lợi cho virus cúm tồn tại, phát triển và lây lan. ðồng thời giai đoạn này là lúc mật độ chăn nuơi gia cầm và hoạt động vận chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm diễn ra sơi động nhất trong năm cũng là điều kiện thuận lợi cho sự bùng phát và lây lan dịch. - Về lồi mắc bệnh: ở đợt dịch thứ nhất và thứ hai tỉ lệ gà mắc bệnh cao hơn vịt, ngan. Nhưng đợt dịch thứ 3 đã cĩ sự thay đổi lớn khi các thống kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh, chết và tiêu huỷ ở vịt cao gần gấp 2 lần gà. ðiều này cho thấy mầm bệnh đã lây lan, tồn tại trong đàn thuỷ cầm, cĩ thể tăng độc lực và bột phát thành đợt dịch thứ 3. Tỉ lệ dương tính huyết thanh ở đàn thuỷ cầm tăng từ 15% trong đợt 2 lên 39,6% trong đợt 3. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 10 - Về loại hình, quy mơ và mức độ dịch: dịch phát ra ở tất cả các loại hình chăn nuơi, tỉ lệ mắc bệnh cao nhất ở loại hình chăn nuơi hỗn hợp các lồi gia cầm (đặc biệt chăn nuơi gà lẫn với vịt) và giảm dần ở những trại chăn nuơi gà cĩ số lượng lớn. Quy mơ của dịch đợt 1 là lớn nhất, trong đợt 2, 3 và 4 mặc dù dịch vẫn xảy ra ở nhiều tỉnh, thành phố nhưng quy mơ giảm nhiều [12]. Virus cúm A/H5N1 chính thức được cơng bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 đã nhanh chĩng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn. ðây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra ở Việt Nam và chưa cĩ một cơ sở nào ở nước ta tiến hành nghiên cứu một cách sâu sắc nên đã lúng túng trong việc phịng chống cũng như dập tắt các ổ dịch. Do đĩ chỉ trong một thời gian ngắn dịch cúm gia cầm bùng phát nhanh tại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu con gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế quốc dân và đã cĩ nhiều người mắc bệnh và tử vong vì virus cúm A/H5N1. Bảng 2.1: Thống kê số lượng người nhiễm/chết do H5N1 từ năm 2003 đến tháng 10/2010 ở Việt Nam và thế giới (theo . Quốc gia Số người nhiễm/chết 2003-2005 Số người nhiễm/chết 2006 Số người nhiễm/chết 2007-2010 Tổng số nhiễm/chết Azerbaijan 0/0 8/5 0/0 8/5 Cambodia 4/4 2/2 3/1 9/7 Trung Quốc 9/6 13/8 16/11 24/15 Djibouti 0/0 1/0 0/0 1/0 Ai Cập 0/0 18/10 100/23 118/33 Indonesia 20/13 55/45 88/77 163/135 Iraq 0/0 3/2 0/0 3/2 Lào 0/0 0/0 2/2 2/2 Nigeria 0/0 0/0 1/1 1/1 Thái Lan 22/14 3/3 0/0 25/17 Thổ Nhĩ Kỳ 0/0 12/4 0/0 12/4 Việt Nam 93/42 0/0 24/17 117/59 Tổng số 147/78 104/80 232/132 383/290 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 11 2.4 ðặc điểm sinh học của virus cúm typ A 2.4.1 ðặc điểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Orthomyxoviridae Họ Orthomyxoviridae gồm cĩ 4 nhĩm virus là: + Nhĩm virus cúm A: gây bệnh cho mọi lồi chim, một số động vật cĩ vú và cả con người. + Nhĩm virus cúm B: chỉ gây bệnh cho người. + Nhĩm virus cúm C: gây bệnh cho người, lợn. + Nhĩm Thogotovirus. Virus thuộc họ Orthomyxoviridae cĩ đặc tính cấu trúc chung là hệ gen chứa axit Ribonucleic (ARN) một sợi, cĩ cấu trúc là sợi âm được ký hiệu là ss (-)ARN (Negative Single Stranded RNA). Sợi âm ARN của hệ gen cĩ độ dài từ 10.000-15.000 nucleotit (tùy loại virus), mặc dù nối với nhau thành 1 sợi ARN liên tục, nhưng hệ gen lại chia thành 6-8 phân đoạn (segment), mỗi phân đoạn là một gen chịu trách nhiệm mã hĩa cho mỗi loại protein của virus. Hạt virus (virion) cĩ cấu trúc hình khối, đơi khi cĩ dạng hình khối kéo dài, đường kính khoảng 80-120 nm. Vỏ virus cĩ bản chất protein cĩ nguồn gốc từ nguồn tế bào mà virus đã gây nhiễm, bao gồm một số protein được glycosyl hĩa (glycoprotein) và một số protein dạng trần khơng được glycosyl hĩa (non glycosylated protein). Protein bề mặt cĩ cấu trúc từ các loại glycoprotein, đĩ là những gai, mấu cĩ độ dài 10-14 nm, đường kính 4-6 nm. Nucleocapsid bao bọc lấy nhân virus là tập hợp của nhiều protein phân đoạn, cấu trúc đối xứng xoắn, kích thước 130-150 nm, tạo vịm (loop) ở giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau qua cầu nối các peptit. Phân tử lượng của hạt virus vào khoảng 250 triệu dalton. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 12 2.4.2 ðặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm typ A Phân bố trên bề mặt của virus là loại protein gây ngưng kết hồng cầu cĩ tên gọi là Hemagglutinin (HA) và một loại protein cĩ chức năng là một loại enzim phá hủy thụ thể của virus cĩ tên gọi Neuraminidae (NA), chúng là các glycoptein riêng biệt. Hạt virion cĩ cấu trúc là axit Ribonucleic sợi âm ở dạng đơn, độ dài 13.500 nucleotit chứa 8 phân đoạn kế tiếp nhau mã hĩa cho 10 loại protein khác nhau của virus là HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1, NS2. Tám phân đoạn của sợi RNA cĩ thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp điện di. [www.biolog.p/ptasia-grypa-5.htm]. - Phân đoạn 1-3: mã hĩa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein cĩ chức năng là enzim polymerase tổng hợp axit Ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thơng tin tổng hợp protein của virus. - Phân đoạn 4: mã hĩa cho protein Hemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm gốc vào bên trong, cĩ chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, cĩ khả năng gây ngưng kết hồng cầu, cĩ khả năng hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hịa virus. HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng đoạn oligopeptit ngắn, thuộc loại hình mơ typ riêng đặc trưng cho các subtyp H (H1-H16) trong tái tổ hợp tạo Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 13 nên biến chủng. Mơ typ của chuỗi oligopeptit này chứa một số axit amin cơ bản làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtyp H. Sự thay đổi thành phần của chuỗi nối quyết định độc lực của virus thuộc biến chủng mới. - Phân đoạn 5: mã hĩa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein được phosphoryl hĩa, cĩ biểu hiện tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhĩm (Group-Specific), tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân đoạn ARN nên loại NP cịn được gọi là Ribonucleo protein [18]. - Phân đoạn 6: mã hĩa cho protein enzim Neuraminidae (NA), cĩ chức năng là một enzim phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào nhiễm [37]. - Phân đoạn 7: mã hĩa cho 2 tiểu phần protein đệm (Matrix protein) M1 và M2 là protein màng khơng được glycosyl hĩa, cĩ vai trị làm đệm bao bọc lấy ARN hệ gen. M2 là một tetramer cĩ chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 cĩ chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nẩy mầm của virus [45]. - Phân đoạn 8: cĩ độ dài ổn định (890 nucleotit) mã hĩa cho 2 tiểu phần protein khơng cấu trúc NS1 và NS2 cĩ chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kích thích phiên mã, chống interferon. 2.4.3 ðặc tính kháng nguyên của virus cúm typ A Các loại kháng nguyên được nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (Nucleoprotein, NP), protein đệm (matrix protein, M1), protein gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin, HA) và protein enzim cắt thụ thể (Neuraminidase, NA). NP và M1 là protein thuộc loại hình kháng nguyên đặc hiệu nhĩm (genus-specific antigen), ký hiệu là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên đặc hiệu typ và dưới typ (typ-specific antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên. Một đặc tính quan trọng là virus cúm cĩ khả năng gây ngưng kết hồng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 14 cầu của nhiều lồi động vật. ðĩ là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus cúm với thụ thể cĩ trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo thành mạng ngưng kết thơng qua cầu nối virus, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Hemagglutination test). Kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên HA cĩ khả năng trung hịa các loại virus tương ứng, chúng là kháng thể trung hịa cĩ khả năng triệt tiêu virus gây bệnh. Nĩ cĩ thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu khơng bám vào được để liên kết tạo thành mạng ngưng kết. Người ta gọi phản ứng đặc hiệu KN-KT cĩ hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination inhibition test). Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu (HI) được sử dụng trong chẩn đốn cúm gia cầm. Theo Ito và Kawaoka (1998), sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên của virus cúm là sự biến đổi và trao đổi trong nội bộ gen dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên [46]. Cĩ 2 cách biến đổi kháng nguyên của virus cúm: + ðột biến điểm (đột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trơi trượt, lệch lạc về kháng nguyên-Antigenic drift). ðây là kiểu đột biến xảy ra liên tục thường xuyên trong quá trình tồn tại của virus mà bản chất là do cĩ sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hĩa, đặc biệt đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N. Kết quả là tạo ra các phân typ cúm hồn tồn mới cĩ tính thích ứng lồi vật chủ khác nhau và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến đổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- H16) và 9 kháng nguyên N (N1-N9) [16]. + ðột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca-antigenic Shift). Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm. Hiện Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 15 tượng này chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus. ðiều này tạo nên sự sai khác cơ bản về bộ gen của v._.irus cúm đời con so với virus bố mẹ. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen xuất hiện cĩ thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và động vật với mức độ nguy hiểm khơng thể lường trước được. Vụ dịch năm 1918-1819 làm chết 40-50 triệu người mà tác nhân gây bệnh là virus H1N1 từ lợn lây sang người kết hợp với virus cúm người tạo ra chủng virus mới cĩ độc lực rất mạnh [26]. Do hạt virus cúm A cĩ cấu trúc là 8 đoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus cĩ thể xuất hiện 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau [22]. Khi nghiên cứu về đặc tính kháng nguyên của virus cúm thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtyp về huyết thanh học khơng hoặc rất ít cĩ phản ứng chéo. ðây là điểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vắc-xin cúm để phịng bệnh cho người và động vật [49]. Khi xâm nhiễm vào cơ thể động vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu, trong đĩ quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ cĩ kháng thể này mới cĩ vai trị trung hịa virus cho bảo hộ miễn dịch. Một số kháng thể khác cĩ tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 khơng cho quá trình bao gĩi virus xảy ra. 2.4.4 Thành phần hĩa học ARN của virus chiếm 0,8%-1,1%; protein chiếm 70%-75%; lipit chiếm 20%-24%; hydratcacbon chiếm 5%-8% khối lượng hạt virus. Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipit cĩ gốc phospho, số cịn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocacbon gồm các loại men galactose, ribose, fructose, glucosamin. Thành phần chính protein của virus chủ yếu là glycoprotein [6]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 16 2.4.5 Quá trình nhân lên của virus Theo Kingrbury 1985, Fener và cộng sự mơ tả quá trình nhân lên (sinh sản) của virus được tĩm tắt như sau: Virus xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thơng qua hiện tượng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Thụ thể liên kết tế bào của virus cúm cĩ bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ virus. Trong khoang ẩm bào, khi nồng độ PH được điều hịa để giảm xuống mức thấp sẽ xảy ra quá trình hợp nhất màng tế bào và virus, sự hợp nhất này phụ thuộc vào sự cắt rời protein HA nhờ enzim peptidase và enzim protease của tế bào. Lúc này nucleocapsid của virus đi vào trong nguyên sinh chất rồi vào trong nhân tế bào, chuẩn bị thực hiện quá trình tổng hợp ARN nguyên liệu hệ gen cho các virion mới. Hệ thống enzim sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các ARN thơng tin. Các phân đoạn ARN hệ gen được mã hĩa ở 10-13 nucleotit đầu 5’ với nguyên liệu mã hĩa lấy từ ARN tế bào, nhờ vào hoạt tính enzim PB2 của virus. ARN thơng tin của virus sao chép trong nhân được chuyển vận ra nguyên sinh chất, được riboxom trợ giúp tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu. Protein H, N, M2, ở lại trong nguyên sinh chất, được vận chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mơ (RE) và hệ golgi sau đĩ được cắm lên màng tế bào nhiễm. Protein NS1, NP, M1 được chuyển vận vào nhân để bao bọc đệm lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới được tổng hợp [17]. Song song với quá trình sao chép ARN thơng tin và tổng hợp protein cấu trúc, protein nguyên liệu, virus tiến hành tổng hợp nguyên liệu di truyền là các sợi ARN mới. Từ sợi ARN âm đơn của virus ban đầu, một sợi dương ARN tồn vẹn được tạo ra theo cơ chế bổ sung, sợi dương mới này lại làm khuơn để tổng hợp nên sợi âm ARN mới làm nguyên liệu. Các sợi âm ARN mới, một số vừa làm nguyên liệu để lắp ráp virion mới, số khác lại làm khuơn Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 17 để tổng hợp ARN theo cơ chế như với sợi ARN của virus đầu tiên. Các sợi ARN hệ gen được tạo ra là một sợi hồn chỉnh về độ dài và được các protein đệm (NS1, M1, NP) bao gĩi tạo nên ribonucleocapsid (nucleoriboprotein) ngay trong nhân tế bào nhiễm, sau đĩ được chuyển vận ra nguyên sinh chất rồi được chuyển vận đến vị trí màng tế bào cĩ sự biến đổi đặc hiệu với virus. Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp nucleoriboprotein với các protein cấu trúc (HA, NA, M2) tạo nên các hạt virus hồn chỉnh mới và được giải phĩng ra khỏi tế bào nhiễm theo hình thức nảy chồi. 2.4.6 ðộc lực của virus ðộc lực của virus cúm gia cầm cĩ sự dao động lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA. Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm của virus phụ thuộc vào tác động của men proteaza vật chủ đến sự phá vỡ của liên kết hĩa học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men protease lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại điểm bắt đầu phá vỡ các liên kết. Các enzim giống trypsin cĩ khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ cĩ một phân tử Arginin, trong khi đĩ các enzim protease khác lại cần nhiều amino axit cơ bản. Tại Hội thảo thế giới lần đầu tiên về bệnh cúm gà 1981, Bankowski và cộng sự thơng báo virus cúm gà cĩ kháng nguyên bề mặt H7 thuộc loại cĩ độc lực cao. Nhưng Pensyvania (Mỹ) đã chứng kiến trận dịch cúm gà gây chết 75% số gà, khi phân lập virus cĩ kháng nguyên bề mặt H5 mà khơng phải là H7. ðể đánh giá độc lực của virus cúm một cách khoa học, các nhà khoa học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch nước trứng đã được gây nhiễm virus. Sau đĩ đánh giá mức độ nhiễm bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI). ðiểm tối đa là 3 điểm và đĩ là virus cĩ độc lực Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 18 cao nhất. Theo Quy định của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), virus nào cĩ chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại cĩ độc lực cao [18] Bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng gà đã gây nhiễm virus được pha lỗng ở nồng độ 1/10 cho gà mẫn cảm từ 3-6 tuần tuổi, các nhà khoa học đã thống nhất chia độc lực của virus ra 3 loại: - Virus cĩ độc lực cao: nếu sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày phải làm chết 75%-100% số gà thực nghiệm. Virus gây bệnh cúm gà (cĩ thể là typ phụ) phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực địa và phát triển tốt trên tế bào xơ phơi trong mơi trường nuơi cấy khơng cĩ Trypsin. - Virus cĩ độc lực trung bình: là những chủng virus gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết gà khơng quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc khơng gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. - Virus cĩ độc lực thấp (nhược độc): là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, cĩ thể gây ra dịch nhưng khơng cĩ triệu chứng lâm sàng rõ rệt, khơng tạo ra bệnh tích đại thể và khơng làm chết gà. Trong thực tế người ta chia virus cúm gà ra làm 2 loại: Loại virus cĩ độc lực thấp-LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza). Loại virus cĩ dộc lực cao- HPAI (Highly Pathgennic Avian Influenza). Cho đến nay người ta thừa nhận chỉ cĩ 2 biến chủng virus cĩ cấu trúc kháng nguyên H5, H7 được coi là loại cĩ độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng khơng phải tất cả các chủng mang gen H5, H7 đều gây bệnh [46]. Thực tế chứng minh rằng các chủng cĩ độc lực thấp trong quá trình lưu hành trong thiên nhiên và trong đàn thủy cầm cĩ thể đột biến nội gen hoặc đột biến tái tổ hợp để trở thành các chủng cĩ độc lực cao-HPAI. 2.4.7 Danh pháp ðể ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ các chủng virus Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 19 cúm phân lập được, năm 1980 Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đưa ra một hệ thống phân loại mới, được quy định ký hiệu theo trình tự serotyp/ lồi nhiễm/ nơi phân lập/ số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình subtyp HA (H) và NA (N). Ví dụ virus cúm cĩ ký hiệu A/GS/HK/437/4/99/H5N1, cĩ nguồn thơng tin là cúm nhĩm A; lồi nhiễm là ngỗng (GS = goose); nơi phân lập là Hồng Kơng (HK); số hiệu 437; thời gian phân lập tháng 4/1999; subtyp H5N1 [5]. 2.4.8 Nuơi cấy và lưu giữ virus cúm gà Virus cúm gà phát triển tốt trên phơi gà 9-11 ngày tuổi, trong nước phơi gà tập trung khá nhiều virus và cĩ thể lưu giữ virus được vài tuần ở điều kiện 40C. Khả năng tồn tại và gây bệnh của virus rất cao nếu ta bảo quản nước phơi đĩ ở - 700C hoặc cho đơng khơ [6]. Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong tế bào xơ phơi gà (CEF) và tế bào thận chĩ MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cell) với điều kiện mơi trường nuơi cấy tế bào khơng chứa trypsin [6]. 2.4.9 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm Miễn dịch là trạng thái đặc biệt của cơ thể khơng mắc phải tác động cĩ hại của yếu tố gây bệnh, trong khi đĩ các cơ thể cùng lồi hoặc khác lồi lại bị tác động trong điều kiện sống như nhau [9]. Cũng như các động vật khác, miễn dịch chống virus cúm của gia cầm cĩ 2 loại là miễn dịch đặc hiệu và khơng đặc hiệu. * Miễn dịch khơng đặc hiệu: Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể, gia cầm bảo vệ trước hết bằng miễn dịch khơng đặc hiệu nhằm ngăn cản hoặc giảm số lượng và khả năng gây bệnh của chúng. Miễn dịch khơng đặc hiệu cĩ vai trị quan trọng khi miễn dịch đặc hiệu chưa phát huy tác dụng. Hệ thống miễn dịch khơng đặc hiệu của gia cầm rất phát triển bao gồm: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 20 - Hàng rào vật lý như da, niêm mạc và các dịch tiết cĩ tác dụng bảo vệ cơ thể ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể. - Khi mầm bệnh qua hàng rào da và niêm mạc nĩ gặp phải hàng rào hĩa học là kháng thể dịch thể tự nhiên khơng đặc hiệu. + Bổ thể: bổ thể cĩ tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào (opsonin hĩa), ngồi ra bổ thể cũng cĩ vai trị nhất định trong cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (nhiều trường hợp sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể cần sự cĩ mặt của bổ thể) [27]. + Interferol (IFN): do nhiều loại tế bào tiết ra nhưng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên (NK). Khi Interferol được sản sinh ra, nĩ gắn vào tế bào bên cạnh và cảm ứng tế bào đĩ sản sinh ra protein AVP (antivirus protein), do đĩ khi virus xâm nhập vào tế bào nhưng khơng nhân lên được. - Hàng rào tế bào gồm: + Tiểu thực bào, quan trọng nhất là bạch cầu đa nhân trung tính chiếm 60%-70% tổng số bạch cầu ở máu ngoại vi, nĩ thực bào những phân tử nhỏ và vi khuẩn ngồi tế bào. + ðại thực bào là các tế bào lớn cĩ khả năng thực bào, khi được hoạt hĩa nĩ sẽ nhận biết và loại bỏ các vật lạ, ngồi ra nĩ cịn giữ vai trị quan trọng trong sự trình diện kháng nguyên tới tế bào T và kích thích tế bào T sản sinh ra IL-1. ðại thực bào cịn tiết ra interferol cĩ hoạt tính kháng virus, lysozyme và các yếu tố khác cĩ tác dụng kích thích phản ứng viêm. + Các tế bào diệt tự nhiên (NK) là một quần thể tế bào lâm ba cầu cĩ nhiều hạt với kích thước lớn. Các tế bào này cĩ khả năng tiêu diệt các tế bào đã bị nhiễm virus và các tế bào đích đã biến đổi, nĩ cịn tiết ra interferol làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào. * Miễn dịch đặc hiệu: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ sản sinh ra kháng thể Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 21 đặc hiệu để loại trừ kháng nguyên đĩ. Kháng thể đặc hiệu cĩ thể là dịch thể hoặc cĩ thể là tế bào, đĩ là các limphơ T mẫn cảm. Vì vậy người ta chia miễn dịch đặc hiệu ra miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. - Miễn dịch đăc hiệu dịch thể: do tế bào limphơ B đảm nhiệm, nĩ tiết ra các loại globulin miễn dịch (Ig) gồm cĩ 3 lớp chính là IgM, IgG, IgA. IgG của gia cầm lớn hơn của động vật cĩ vú nên thường được gọi là IgY. Các limphơ bào bắt nguồn từ tế bào nguồn ở tủy xương đi tới túi Fabricius, ở đây chúng được huấn luyện để trở thành các limphơ B, sau đĩ di tản đến các cơ quan limphơ ngoại biên, chúng khu trú ở các tâm điểm mầm và vùng tủy của lách, hạch bạch huyết. Mỗi tế bào B đều cĩ một kháng thể khác nhau trên bề mặt của nĩ. Khi tế bào B đã cĩ thể sản sinh IgM trên bề mặt thì nĩ cũng cĩ thể cĩ khả năng sản sinh một kháng thể khác lớp khác, nhưng dù là lớp nào thì tất cả kháng thể do tế bào đĩ sản sinh ra đều cĩ khả năng nhận biết cùng loại kháng nguyên ấy mà thơi. Tức là vùng Fab của phân tử kháng thể khơng thay đổi mà chỉ cĩ vùng Fc là khác nhau tùy vào lớp kháng thể. Trong hạch lâm ba các limphơ B cĩ thể gặp một kháng nguyên và được nhận biết bởi các kháng thể cĩ trên bề mặt của chúng. Sau khi đã nhận biết kháng nguyên và được kích thích bởi các cytokines do tế bào T tiết ra, chúng được biệt hĩa thành tương bào (plasma) để sản sinh kháng thể. ðáp ứng của kháng thể khi gặp kháng nguyên lần đầu tiên được gọi là đáp ứng tiên phát (sơ cấp). Sau khi xuất hiện vài ngày, hàm lượng kháng thể trong máu mới tăng và các kháng thể đầu tiên chủ yếu là IgM. ðáp ứng tiên phát cũng cĩ thể cĩ IgG nhưng với hàm lượng thấp. Kháng thể dịch thể chỉ cĩ tác dụng với virus khi nĩ cịn ở ngồi tế bào, lớp IgM và IgG kết hợp với virus với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 22 virus, 2 lớp kháng thể này cịn ngăn virus khơng cho kết hợp với Recepter của tế bào tương ứng, ngăn cản sự hịa màng giữa vỏ virus và màng tế bào. Lớp IgA cĩ trong niêm mạc, nĩ diệt virus ngay trong hàng rào niêm mạc, khơng cho virus xâm nhập vào trong. Khi virus sinh ra kháng thể thì kháng thể cĩ tính đặc hiệu cao giúp ta định typ virus gây bệnh bằng các phản ứng huyết thanh học. Một số limphơ B sau khi nhận biết kháng nguyên sẽ thành thục thành limphơ B nhớ, hiệu quả làm cho đáp ứng miễn dịch lần 2 đối với kháng nguyên nhanh hơn, mạnh hơn lần 1 và lớp kháng thể thường là IgG. - Miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào: quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào do tế bào limphơ T đảm nhiệm. Các limphơ bào bắt nguồn từ tủy xương di chuyển đến tuyến ức, tại đĩ chúng được huấn luyện, biệt hĩa thành tiền limphơ T, rồi thành limphơ T chưa chín, rồi thành limphơ T chín. Từ tuyến ức chúng di tản đến các cơ quan limphơ ngoại vi như các hạch lâm ba, các mảng Payers ở ruột hoặc tới lách. Khi đại thực bào đưa thơng tin đến các limphơ T, chúng tiếp nhận, biệt hĩa trở thành nguyên bào limphơ T rồi thành tế bào mẫn cảm với kháng nguyên cĩ chức năng như một kháng thể đặc hiệu và gọi là kháng thể tế bào. Các tế bào limphơ T thực hiện 2 chức năng quan trọng: - Chức năng hỗ trợ: do các limphơ T cĩ dấu ấn CD4 đảm nhiệm (TH) + Giúp đỡ các tế bào limphơ B phát triển thành tương bào để sản xuất kháng thể. + Giúp các tế bào TCD8 trở thành tế bào TC gây độc. Tế bào TC được hoạt hĩa và tiêu diệt tế bào đích. + Thực hiện phản ứng quá mẫn muộn. + Sản xuất ra các cytokines cĩ tác dụng điều khiển sự phát triển của các Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 23 dịng tế bào bạch cầu và các tế bào mầm của hệ thống tạo máu. + Sản xuất các cytokines cĩ tác dụng hoạt hĩa các tế bào đại thực bào. + Thúc đẩy quá trình sản xuất các phân tử glycoprotein MHC trên các tế bào trình diện kháng nguyên. ða số các tế bào T hỗ trợ thể hiện dấu ấn CD4 nhận biết kháng nguyên được trình diện trên bề mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên với các phân tử MHC lớp II. Chức năng này do 2 tiểu quần thể TH đảm trách. TH1 tham gia phản ứng quá mẫn muộn, sản xuất IL-2 và interferol γ, TH2 hỗ trợ tế bào B và sản xuất chủ yếu IL-4, IL-5. - Chức năng thực hiện: do các limphơ T mang dấu ấn CD8 đảm nhiệm cĩ 2 loại: + Limphơ T gây độc (TC): chúng gây độc đối với tế bào bị nhiễm virus, tế bào ung thư và mảnh ghép dị lồi. Chúng cĩ khả năng nhận biết các mảnh peptit của kháng nguyên của tế bào đích gắn với các phân tử MHC lớp I. + Limphơ T ức chế (TS): chúng triệt thối quá trình sản xuất imunoglobulin của tế bào B và triệt thối hoặc ức chế các phản ứng quá mẫn muộn và miễn dịch tế bào. * Những yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành kháng thể : Sự hình thành kháng thể và quá trình đáp ứng miễn dịch phụ thuộc rất nhiều yếu tố như trạng thái sức khoẻ của cơ thể, điều kiện ngoại cảnh , sự chăm sĩc nuơi dưỡng. Nhưng quan trọng hơn cả là phụ thuộc vào bản chất kháng nguyên. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành kháng thể như sau: + Bản chất kháng nguyên: kháng nguyên cĩ bản chất là protein và cĩ tính kháng nguyên cao sẽ kích thích sinh kháng thể tốt. + ðường xâm nhập của kháng nguyên: thường đường xâm nhập tốt nhất là dưới da và trong bắp thịt. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 24 + Liều lượng kháng nguyên: lượng kháng nguyên đưa vào vừa đủ sẽ kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch ở mức tối đa mà khơng gây ức chế và tê liệt miễn dịch. + Số lần đưa kháng nguyên vào cơ thể: tiêm nhắc lại vắc-xin cĩ tác dụng tốt, kháng thể sinh ra nhiều hơn và được duy trì trong thời gian lâu hơn. + Chất bổ trợ: chất bổ trợ cho vào khi chế vắc-xin với mục đích giữ và duy trì lượng kháng nguyên lâu trong cơ thể nhờ đĩ tạo kích thích liên tục, đều đặn các cơ quan cĩ thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì được lâu hơn. Những chất bổ trợ thường dùng là keo phèn, nhũ tương, dầu khống, dầu thực vật, saponin. 2.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 2.5.1 Phân bố dịch bệnh Virus cúm gia cầm phân bố khắp thế giới trong các lồi gia cầm, dã cầm, động vật cĩ vú. Sự phân bố và lưu hành của virus cúm khĩ xác định chính xác và chịu ảnh hưởng bởi cả lồi vật nuơi, hoang dã, tập quán chăn nuơi gia cầm, đường di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh, phương pháp nghiên cứu [14], [29]. 2.5.2 ðộng vật cảm nhiễm Tất cả các lồi gia cầm (gà, vịt, ngan, chim cút, vẹt, bồ câu), chim hoang dã (đặc biệt thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus. Phần lớn các lồi gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm typ A. Ngồi ra virus cúm typ A cịn gây bệnh cho nhiều lồi động vật cĩ vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, thú hoang dã và cả con người. Lợn mắc bệnh cúm thường do phân typ H1N1 và H3N2. 2.5.3 ðộng vật mang virus Virus cúm đã phân lập được ở hầu hết các lồi chim hoang dã như vịt Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 25 trời, thiên nga, hải âu, mịng biển, vẹt, vẹt đuơi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu. Tần suất và số lượng virus phân lập được ở thủy cầm (đặc biệt vịt trời) đều cao hơn các lồi khác [10]. Kết quả điều tra thủy cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp đàn trước khi di trú. Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân typ virus cúm A diễn ra ở chim hoang dã. Những virus này khơng gây độc đối với vật chủ, được nhân lên ở đường ruột những chim này khiến cho các lồi này mang virus là nguồn gieo rắc virus cho các lồi khác, đặc biệt gia cầm [32]. ðã cĩ nghiên cứu phát hiện nhiều virus cúm từ những lồi vịt đi đầu trong mùa di trú, sau khi xuất hiện đã gây ra dịch ở gà tây. Vịt từ khi bị nhiễm đến khi bắt đầu thải virus trong vịng 30 ngày. Dường như virus được duy trì trong số đơng vịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyền cho các con non theo đường tiêu hĩa do virus bài thải theo phân, gây ơ nhiễm ao, hồ [10], [14]. 2.5.4 Sự truyền lây Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hơ hấp và đường tiêu hĩa. Sự truyền lây của bệnh được thực hiện theo 2 phương thức. - Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh. - Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong khơng khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chăn nuơi, phân, thức ăn, nước uống, quần áo, giầy dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, cơn trùng cĩ mang mầm bệnh. Như vậy virus cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuơi. Bệnh chủ yếu truyền ngang (do tiếp xúc), chưa cĩ bằng chứng cho thấy bệnh cĩ thể truyền dọc (qua phơi thai) vì những phơi bị nhiễm virus thường chết mà khơng phát triển được [6]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 26 ðối với gia cầm nuơi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là: Từ các lồi gia cầm nuơi khác nhau trong cùng một trang trại hoặc các trang trại khác liền kề như vịt lây sang gà. Từ gia cầm nhập khẩu. Từ chim di trú đặc biệt thuỷ cầm được coi là đối tượng chính dẫn nhập virus vào quần thể đàn gia cầm nuơi. Từ người và các động vật cĩ vú khác, phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm gần đây đã cĩ sự lây lan thứ cấp thơng qua con người [10], [14]. 2.5.5 Sức đề kháng của virus cúm Virus khơng bền vững với nhiệt độ, ở 56-600C chỉ vài phút virus mất độc lực. Tuy nhiên virus tồn tại khá lâu trong các vật chất hữu cơ như phân gà ít nhất 3 tháng, 30-35 ngày ở nhiệt độ 40C, 7 ngày ở nhiệt độ 200C. Trong thức ăn, nước uống bị ơ nhiễm virus cĩ khả năng tồn tại hàng tuần. ðây chính là nguồn bệnh nguy hiểm và tiềm tàng để làm lây lan dịch bệnh [6]. Trong nước ao hồ virus vẫn cĩ thể duy trì đặc tính gây bệnh tới 4 ngày ở nhiệt độ 220C và trên 30 ngày ở nhiệt độ 00C [65]. Do cấu trúc vỏ ngồi của virus là lipit nên chúng mẫn cảm với các chất dung mơi và chất tẩy rửa như formalin, axit, ete, β - propiolacton, sau khi tẩy vỏ, các hĩa chất như phenolic, NH4+, axit lỗng, natrihypochlorit và hydroxylanine cĩ thể phá hủy virus cúm gia cầm. Người ta thường dùng các hĩa chất này như các chất sát trùng hữu hiệu để tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuơi. 2.5.6 Mùa vụ phát bệnh Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào vụ đơng xuân từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau. Khi cĩ những biến đổi bất lợi về điều kiện thời tiết như nhiệt độ lạnh, độ ẩm cao, thời tiết cĩ những thay đổi đột ngột, làm giảm sức đề kháng tự nhiên của con vật. Mặt khác thời Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 27 điểm này cĩ mật độ chăn nuơi cao nhất trong năm, các hoạt động vận chuyển, giết mổ gia cầm diễn ra cao nhất trong năm cũng là điều kiện thuận lợi để dịch bệnh phát sinh lây lan [12]. 2.6 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 2.6.1 Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm Các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh diễn biến rất đa dạng và phức tạp, nĩ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độc lực, số lượng virus, lồi nhiễm bệnh, mật độ chăn nuơi, tiểu khí hậu chuồng nuơi. Thời gian ủ bệnh ngắn thường chỉ vài giờ đến 21 ngày, Tổ chức Thú y thế giới đề nghị nâng lên 28 ngày [18]. Các triệu chứng về hơ hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình như khẹc, lắc đầu, vẩy mỏ, khĩ thở, chảy nước mũi, nước mắt. Tiếp theo là mí mắt viêm, sưng mọng, phù mặt, phù đầu. Mào và tích dầy lên do phù thũng, tím tái, xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thâm tím. Xuất huyết dưới da chân là đặc điểm đặc trưng của bệnh cúm gia cầm. Ngồi các triệu chứng trên cịn thấy các triệu chứng về thần kinh như đi lại khơng bình thường, siêu vẹo, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụm đống với nhau. Gia cầm tiêu chảy mạnh, phân lỗng trắng, trắng xanh. Với gia cầm đang đẻ thì tỉ lệ đẻ giảm rất nhanh. Bệnh lây lan nhanh, gia cầm chết đột ngột. Với chủng virus độc lực cao (HPAI) tỉ lệ chết từ 15-100%, với chủng virus độc lực thấp (LPHI) tỉ lệ chết thấp hơn và mức độ biểu hiện triệu chứng cũng nhẹ hơn. Tuy nhiên khi cĩ sự bội nhiễm hoặc điều kiện chăn nuơi bất lợi tỉ lệ tử vong cao hơn cĩ thể tới 60%-70% với các biểu hiện triệu chứng nặng hơn [6]. 2.6.2 Bệnh tích đại thể của bệnh cúm gia cầm Mức độ biến đổi bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm cũng đa dạng và rất khác nhau trong cùng một đàn, phụ thuộc rất nhiều vào độc lực virus, quá trình diễn biến của bệnh [6]. Những biến đổi mang tính tổng quan như sau: Mào và tích thâm tím, phù nề, xuất huyết dưới da và rìa tích. Xuất Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 28 huyết dưới da ống chân thành vệt, nốt. Khí quản viêm xuất huyết, chứa nhiều đờm. Túi khí phù nề, thành túi khí dầy và cĩ nhiều fibrin bám dính. Phổi viêm cata, xuất huyết đến viêm fibrin làm phổi dính vào lồng ngực. Viêm xuất huyết đường ruột, đặc biệt vùng hậu mơn, van hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng. Bao tim tích nước vàng, xuất huyết màng bao tim, mỡ vành tim, cơ tim. Lách biến màu lốm đốm vàng, rắn chắc hơn bình thường. Tụy khơ rịn, xuất huyết. Viêm xuất huyết buồng trứng, ống dẫn trứng, nhiều trường hợp trứng non dập vỡ, xoang bụng tích nước vàng lợn cợn. Xuất huyết màng treo ruột, màng bao dạ dày tuyến, dạ dày cơ, màng xương lồng ngực cĩ thể coi là đặc điểm riêng của bệnh cúm gia cầm [6]. 2.6.3 Bệnh tích vi thể Các biến đổi đặc trưng về tổ chức học bao gồm: phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập limphơ đơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào, tích, gan, thận, mắt và thần kinh [6]. 2.7 Chẩn đốn bệnh Việc chẩn đốn bệnh do nhiễm virus cúm gia cầm typ A, vấn đề chủ yếu và quan trọng là phải phân lập, định danh được virus thơng qua các xét nghiệm phi lâm sàng kết hợp chẩn đốn lâm sàng (triệu chứng, bệnh tích, dịch tễ). * Phân lập virus Bệnh phẩm cĩ thể là dịch ngốy hầu họng, dịch ổ nhớp hoặc các tổ chức phổi, khí quản, não, gan, lách, tim. Mẫu sau khi lấy được bảo quản trong dung dịch PBS ở 40C và phải tiến hành phân lập trong vịng 48 giờ, nếu muốn bảo quản dài hơn phải giữ ở - 700C. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 29 * ðịnh danh virus ðể định danh virus phân lập được cĩ thể dùng phản ứng HI hoặc dùng phản ứng RT-PCR với các cặp mồi chuẩn để xác định kháng nguyên H và N. ðể xác định kháng thể cúm trong huyết thanh cĩ thể dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI, ELISA, phản ứng khuyếch tán trong thạch (AGP) 2.8 Kiểm sốt bệnh Bệnh cúm gia cầm cũng như các bệnh truyền nhiễm nĩi chung, quá trình sinh dịch cĩ 3 khâu quan trọng là nguồn bệnh, yếu tố truyền lây, động vật cảm nhiễm và cĩ sự liên hệ giữa 3 khâu. Nếu thiếu 1 trong 3 khâu, đặc biệt là khâu thứ nhất thì bệnh khơng thể xảy ra. Nếu cĩ đủ 3 khâu nhưng khơng cĩ sự liên hệ giữa 2 trong 3 khâu thì bệnh cũng khơng thể xảy ra. ðể kiểm sốt, khống chế bệnh cúm gia cầm cĩ hiệu quả cần tác động vào cả 3 khâu của quá trình sinh dịch. - ðối với nguồn bệnh: tiêu hủy triệt để gia cầm nhiễm bệnh, thực hiện tốt cơng tác vệ sinh khử trùng để tiêu diệt mầm bệnh. Tăng cường cơng tác giám sát phát hiện bệnh. Khi phát hiện thấy gia cầm mang virus phải tiêu hủy ngay. - ðối với yếu tố truyền lây: thực hiện tốt kiểm dịch vật chuyển, kiểm dịch gia cầm nhập khẩu, khơng vận chuyển gia cầm từ các nước hoặc các khu vực cĩ dịch vào địa phương. Thực hiện nuơi nhốt, nuơi cách ly, hạn chế người và phương tiện ra vào khu vực chăn nuơi. Khơng nuơi chung các loại gia cầm (gà, vịt, ngan) trong cùng một hộ. Ngăn chặn sự xâm nhập của giã cầm tiếp xúc với gia cầm. Quản lý chặt chẽ việc buơn bán, giết mổ gia cầm, quy hoạch khu vực buơn bán giết mổ gia cầm riêng. Thực hiện tốt cơng tác vệ sinh, khử trùng, tiêu độc. Tuyên truyền hướng dẫn các biện pháp chăn an tồn sinh học, các biện pháp phịng chống dịch cúm gia cầm để người chăn nuơi và nhân dân tự giác, chủ động thực hiện. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 30 - ðối với động vật cảm thụ: tích cực tuyên truyền để thay đổi dần tập quán chăn nuơi nhỏ lẻ sang chăn nuơi trang trại, chăn nuơi cơng nghiệp. Quy hoạch khu vực chăn nuơi gia cầm ra xa khu dân cư. Xây dựng chuồng trại đúng tiêu chuẩn kỹ thuật, khơng gây ơ nhiễm mơi trường. Thực hiện tốt quy trình vệ sinh thú y. Chăm sĩc nuơi dưỡng tốt để nâng cao sức đề kháng tự nhiên cho gia cầm. Trong điều kiện chăn nuơi gia cầm của Việt Nam hiện nay, để kiểm sốt dịch cúm gia cầm, một biện pháp rất quan trọng là tạo miễn dịch chủ động bằng cách tiêm vắc-xin cho đàn gia cầm. Như vậy để kiểm sốt dịch cúm gia cầm cĩ hiệu quả cần thực hiện đồng bộ các biện pháp để tác động vào cả 3 khâu của quá trình sinh dịch trong đĩ cĩ biện pháp tiêm vắc-xin cho đàn gia cầm. 2.9 Vắc-xin cúm gia cầm ðể khống chế dịch cúm gia cầm chúng ta đã áp dụng hàng loạt các biện pháp như giết hủy đàn gia cầm nhiễm bệnh, thực hiện kiểm dịch vận chuyển, kiểm sốt giết mổ và vệ sinh khử trùng tiêu độc. Tuy nhiên dịch cúm gia cầm vẫn liên tiếp xảy ra, trước tình hình đĩ Bộ Nơng nghiệp & PTNT đã ban hành Quy định về sử dụng vắc-xin cúm gia cầm. Phịng hộ bệnh cúm gia cầm là kết quả của đáp ứng miễn dịch chống lại protein Haemaglutinin (HA) mà hiện nay đã xác định được 16 subtyp khác nhau từ H1-H16 và ở mức độ nào đĩ chống lại protein Neuraminidae (NA) mà đã xác định được 9 subtyp từ N1-N9. Các đáp ứng miễn dịch kháng lại protein bên trong như Nucleoprotein (NP) và protein Matrix (M) của virus đã được chứng minh là khơng đủ để tạo phịng hộ trên thực địa. Vì vậy khơng cĩ 1 vắc-xin nào chung cho tất cả các virus cúm gia cầm. Trong thực tế sự phịng hộ được tạo ra nhờ các subtyp Haemaglutinin cĩ trong vắc-xin [30]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 31 * Vắc-xin được sử dụng đúng sẽ đạt được một số mục đích: - Bảo hộ cho con vật khơng xuất hiện các triệu chứng lâm sàng và chết. - Giảm bài thải virus cường độc nếu gia cầm bị nhiễm virus đĩ > 1000 lần so với gia cầm khơng được tiêm, ngừng hẳn sự bài thải virus vào ngày 13- 18 sau tiêm [3], [18], [21]. - Phịng được sự lây lan virus cường độc do tiếp xúc. - Phịng hộ chống lại cơng cường độc bằng virus thực địa dù liều gây nhiễm cao hay thấp. - Phịng hộ chống lại virus luơn thay đổi. - Tăng sức đề kháng của gà chống lại nhiễm virus cúm gia cầm[32]. * Các loại vắc-xin phịng bệnh hiện nay: - Vắc-xin vơ hoạt đồng chủng: ban đầu được sản xuất như các vắc-xin tự phát (autogenous), nghĩa là vắc-xin chứa cùng những virus cúm giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Loại vắc-xin này được sử dụng rộng rãi ở Mehico và Pakistan [6]. Nhược điểm của vắc-xin này là khơng phân biệt gia cầm ._.0 100 1 (n=10) 9 9 9 9 9 9 90 2 (n=10) 10 10 10 10 10 10 100 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 3 (n=10) 10 10 10 10 10 10 100 ðối chứng âm (n=10) 10 10 10 10 10 10 100 ðối chứng dương: Phơi được tiêm vắc-xin Trung Quốc ðối chứng âm: Phơi được tiêm nước sinh lý Sau 24h soi trứng kiểm tra phơi 1 lần liên tục đến 108 giờ. Kết quả kiểm tra cho thấy cả hai loại vắc-xin đều an tồn cho phơi, cụ thể: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 57 - ðối với lơ thí nghiệm phơi gà được tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 do Việt Nam sản xuất: Từ 48h đến 108h các lơ thí nghiệm đều cĩ tỷ lệ phơi sống đạt 100%. Cĩ 10% số phơi chết 24h, tiến hành mổ khám những phơi này chúng tơi thấy dịch trứng đục, mùi thối. Các phơi sống đến 108 giờ thấy các phơi phát triển bình thường. Mổ khám những phơi sống sau 108 h chúng tơi khơng phát hiện được bệnh tích của phơi như: Mảng phơi keo nhầy, xuất huyết đầu, thân phơi… - ðối với lơ đối chứng dương cho kết quả lơ thứ nhất cĩ một phơi chết, mổ khám chúng tơi thấy cĩ hiện tượng dịch trứng đục, mùi thối, các phơi cịn lại tiếp tục theo dõi đến 108 giờ thấy các phơi đều sống khỏe. Như vậy, cĩ thể phơi trứng đĩ chết do nhiễm khuẩn hoặc do kỹ thuật tiêm. ðể kiểm tra lại, chúng tơi lấy mẫu vắc-xin và tiêm lại trên 10 phơi gà sống, kết quả cho thấy 100% các phơi sống sau 108h sử dụng vắc-xin. Kết quả mổ khám khơng phát hiện được bệnh tích ở những phơi sống sau 108h. Kết quả mổ khám bệnh tích được trình bày ở bảng 4.5. Bảng: 4.5: Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể phơi gà được tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 Kết quả mổ khám phơi gà sống sau 108h Số TT Số phơi mổ khám Màng phơi keo nhày Xuất huyết đầu, mình Gan Thận Lách Vắc-xin Việt Nam H5N1 30 - - - - - Vắc-xin Trung Quốc H5N1 30 - - - - - ðối chứng âm 10 - - - - - Ghi chú: +: Cĩ bệnh tích - : Khơng cĩ bệnh tích Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 58 Qua kết quả bảng: 4.4 và 4.5 chúng tơi rút ra kết luận sau: - Những phơi chết 24h, cĩ thể phơi trứng do nhiễm khuẩn hoặc do kỹ thuật tiêm. - Virus sử dụng làm vắc-xin đã được vơ hoạt hồn tồn khơng cĩ khả năng gây bệnh tích cho phơi gà 9 ngày tuổi - Chất bổ trợ cĩ trong vắc-xin khơng gây mẫn cảm cho phơi, đạt độ an tồn. 4.2.3 Kết quả tiêm thí nghiệm vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) - Hiệu lực của vắc-xin được đánh giá trên ba giống gà nuơi phổ biến tại Việt Nam: Rhosde, Leghorn, Tam Hồng một ngày tuổi khỏe mạnh được lấy từ các cơ sở sản xuất giống cĩ chất lượng cao như trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Cơng ty cổ phần gà giống Châu Thành. Hiệu lực của vắc- xin H5N1(chủng NIBRG-14) được theo dõi, đánh giá trong 5 tháng và so sánh với gà được tiêm vắc-xin H5N1Trung Quốc. Mỗi lơ tiêm vắc-xin chúng tơi sử dụng 30con/1 giống và 10 con giống dùng cho lơ đối chứng tiêm nước muối sinh lý để làm thí nghiệm. Gà được tiêm vắc-xin 2 lần: lần một lúc gà 7 ngày tuổi và lần hai lúc gà 14 ngày tuổi, liều lượng tiêm là 0,5ml/con. Sau khi gây miễn dịch lần 2 được 1 tuần chúng tơi bắt đầu lấy máu tách huyết thanh, huyết thanh được chúng tơi lấy định kỳ theo tuần, mỗi lơ lấy ngẫu nhiên 10 mẫu. Hiệu giá kháng thể cĩ trong huyết thanh được chúng tơi đánh giá bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI). Phản ứng này được thực hiện với virus trong dịch niệu trứng tiếp truyền giống virus cúm A/H5N1 do Viện Cơng Nghệ Sinh Học cung cấp. Kết quả hiệu giá kháng thể sẽ được so sánh với cơng bố của Viện NIRBG (Anh) cung cấp: hiệu giá kháng thể đạt mức Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 59 6log2 - 8 log2 (tương đương độ pha lỗng kháng thể từ 1/64 đến 1/256) thì gà sẽ cĩ khả năng phịng chống bệnh cúm gia cầm Dưới đây là kết quả chúng tơi thu được qua theo dõi và kiểm tra - Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày Lơ VX Vắc-xin Việt Nam H5N1 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 ðối chứng Giống gà Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng HI (Log2) 7 6,8 7,4 6,6 7,2 7,4 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H I (L og 2) R ho de L eg ho rn T am H ồ n g R ho de L eg ho rn T am H ồ n g R ho de L eg ho rn T am H ồ n g Vắc-xin Việt Nam Vắc-xin Trung Quốc ðối chứng Lơ Vắc xin Hình 4.1. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau 21 ngày Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 60 - Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin sau 5 tháng Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin sau 5 tháng HI(log2) Lơ vắc-xin Giống gà Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Rhode 7,2 6,7 6,2 5,7 Leghorn 7,2 6,7 6,4 5,8 Vắc-xin Việt Nam H5N1 Tam Hồng 7,6 6,9 6,7 6,3 Rhode 7,2 6,6 6.2 5,6 Leghorn 7,2 6,5 6.2 5,6 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 Tam Hồng 7,4 6,9 6,5 6,1 ðối chứng 0 0 0 0 7.2 6.7 6.2 5.7 7.2 6.7 6.4 5.8 7.6 6.9 6.76.3 7.2 6.6 6.2 5.6 7.2 6.5 6.2 5.6 7.4 6.9 6.56.1 0 0 0 00 1 2 3 4 5 6 7 8 H I (l og 2) Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng Việt Nam Trung Quốc ðối chứng Lơ Vắc-xin Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Hình 4.2. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin sau 5 tháng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 61 4.3. Kết quả tiêm thử nghiệm vắc-xin cúm A/H5N1(chủng NIBRG-14) tại Nam ðịnh ðược sự đồng ý của Chi cục Thú y tỉnh Nam ðịnh chúng tơi tiến hành tiêm thử nghiệm trên 05 trang trại vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất với số lượng gia cầm là 1000 con thuộc các giống Rhode, Leghorn, Tam Hồng (Rhode 300con, Leghorn 300 con, Tam Hồng 400 con). Trong các giống trên cĩ tách riêng nuơi 30 con mỗi giống tiêm vắc- xin H5N1 của Trung Quốc để đối chứng. Sau khi gây miễn dịch 1 tuần chúng tơi bắt đầu lấy máu tách huyết thanh, huyết thanh được định kỳ theo tuần lấy ngẫu nhiên mỗi giống 40 mẫu (20 mẫu tiêm vắc-xin H5N1 của Việt Nam, 20 mẫu tiêm vắc-xin H5N1 của Trung Quốc) và theo dõi qua lâm sàng kết quả như sau: 4.3.1.Kết quả khảo sát mức độ an tồn của vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất qua lâm sàng Quan sát biểu hiện lâm sàng các đàn gà sau (1-3 ngày) tiêm vắc-xin H5N1 (chủngNIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất, tiến hành theo dõi diễn biến sức khỏe đàn gia cầm: như bỏ ăn, sưng ở vùng tiêm, xã cánh, số gia cầm chết, thống kê số lượng gia cầm cĩ biểu hiện phản ứng sau tiêm. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả khảo sát mức độ an tồn của vắc-xin cúm A/H5N1 (chủng NIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất qua lâm sàng TT Giống gà Số tiêm (con) Số phản ứng (con) Tỉ lệ (%) 1 Rhoder 300 1 0,33 2 Leghor 300 0 0,00 3 Tam Hồng 400 1 0,25 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 62 Kiểm tra số gia cầm cĩ phản ứng sau tiêm, gia cầm bị chết ngay sau khi tiêm trong vịng 48h (1 con Rhoder và 1 con Tam Hồng) mổ khám gia cầm chết thấy; nguyên nhân là do sơ xuất về kỹ thuật tiêm đã bơm thuốc vào xoang ngực, nội tạng gia cầm. Như vậy qua theo dõi lâm sàng vắc-xin H5N1 (chủngNIRBG-14)) do Việt Nam sản xuất an tồn khi sử dụng trên thực địa. Hiệu lực của vắc-xin được theo dõi và đánh giá trong 03 tháng so sánh với vắc-xin của Trung Quốc. 4.3.2.Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ nhất Hiệu giá kháng thể hai tuần đầu của mẫu huyết thanh lơ gà tiêm vắc-xin cúm A/H5N1(chủngNIRBG-14) do Việt Nam sản xuất đạt giá trị trung bình từ 3,8 đến 5.4 log2 và với vắc-xin cúm A/H5N1 của Trung Quốc đạt từ 3.6 đến 4.8 log2 (bảng 4.9). Bảng 4.9: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ nhất HI(log2) Lơ vắc-xin Giống gà Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Rhode 4.2 5.2 7 7.4 Leghorn 3.8 5.2 6.8 7.4 Vắc-xin Việt Nam H5N1 Tam Hồng 4.8 5.4 7.4 7.8 Rhode 4.4 4.8 6.6 7.2 Leghorn 3.6 4.6 7.2 7.4 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 Tam Hồng 4.6 4.8 7.4 7.6 Tuần thứ 3 và tuần thứ 4 sau khi gây miễn dịch bằng vắc-xin cúm, lơ gà tiêm vắc-xin cúm A/H5N1(chủngNIRBG-14) do Việt Nam sản xuất và vắc-xin cúm A/H5N1 của Trung Quốc đạt hiệu giá kháng thể trung bình từ 6.8 đến 7.8 log2 (Tỷ lệ hiệu giá HI ≥ 6log2 là 97%). Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Trần Bình, hiệu giá HI đạt trên 6log2 thì gà của khả năng miễn dịch Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 63 hồn tồn với virus cúm. Như vậy sau 21 ngày gây miễn dịch bằng vắc-xin cúm A/H5N1(chủngNIRBG-14) do Việt Nam sản xuất đàn gà được bảo hộ miễn dịch hồn tồn tới 97%. Giống gà Tam Hồng cho đáp ứng miễn dịch cao hơn hai giống gà cịn lại. Hiệu giá trung bình HI trong hai tuần đầu và khoảng 5.3 log2 với vắc-xin cúm A/H5N1 của Việt nam và 4.7 log2 với vắc-xin cúm của Trung Quốc, tỷ lệ mẫu huyết thanh cĩ hiệu giá HI từ 4log2 đến 6log2 vào khoảng 90%. Trong khi đĩ giống gà Rhosde và Leghorn chỉ đạt hiệu giá HI trung bình giao động khoảng từ 4.2 log2 đến 4.5 log2 (Tỷ lệ mẫu đạt hiệu giá từ 4log2 đến 6log2 vào khoảng 70 đến 80 %). 4.2 5.2 7 7.4 3.8 5.2 6.8 7.4 4.8 5.4 7.4 7.8 4.4 4.8 6.6 7.2 3.6 4.6 7.2 7.4 4.6 4.8 7.4 7.6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H I (l og 2) Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng Việt Nam Trung Quốc Lơ Vắc-xin Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Hình 4.3. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ nhất 4.3.3. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ 2 Với kết quả đã được thống kê (bảng 4.10) thì đáp ứng miễn dịch của ba giống gà với vắc-xin cúm A/H5N1 của Việt Nam trong giai đoạn này ổn định, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 64 dao động về hiệu giá kháng thể giữa các tuần là khơng đáng kể. Hiệu giá HI trung bình của tháng là vào khoảng 7.4 log2 dao động từ 7.2 log2 đến 7.8 log2 với các giống gà tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 của Việt Nam, và 7.2 log2 đến 7.6 log2 với các giống gà tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 của Trung Quốc Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 2 HI trung bình (log2) Lơ vắc-xin Giống gà Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Rhode 7.4 7.6 7.4 7.2 Leghorn 7.8 7.4 7.4 7.2 Vắc-xin Việt Nam H5N1 Tam Hồng 7.8 7.6 7.4 7.6 Rhode 7.2 7.6 7.2 7.2 Leghorn 7.4 7.6 7.2 7.2 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 Tam Hồng 7.6 7.6 7.4 7.4 7.4 7.6 7.4 7.2 7.8 7.4 7.4 7.2 7.8 7.6 7.4 7.6 7.2 7.6 7.2 7.2 7.4 7.6 7.27.2 7.6 7.6 7.4 7.4 6.9 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 H I (l og 2) Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng Việt Nam Trung Quốc Lơ Vắc-xin Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Hình 4.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 2 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 65 Hiệu giá kháng thể trên giống gà Rhode đạt từ từ 7.2 log2 đến 7.6 log2, cao nhất vào tuần thứ 2 của tháng với hiệu giá trung bình là 7.6 log2 với lơ tiêm vắc-xin cúm A/H5N1 Việt Nam, và hiệu giá của lơ tiêm vắc-xin Trung Quốc đạt ở mức 7.2 log2 đến 7.6 log2, cao nhất vào tháng thứ 2 với hiệu giá kháng thể trung bình là 7.6 log2. Giống gà Tam Hồng cho đáp ứng miễn dịch cao nhất với cả hai loại vắc-xin so với các giống gà cịn lại. Với vắc-xin cúm của Việt Nam cho đáp ứng miễn dịch trên gà Tam Hồng trong tháng thứ 2 đạt từ 7.4log2 đến 7.8log2, cao hơn so với vắc-xin của Trung Quốc đạt hiệu giá ở mức 7.2log2 đến 7.6log2, 100% mẫu huyết thanh của cả hai lơ vắc-xin cúm cĩ hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 7 log2. Kết quả kiểm tra hiệu giá cũng cho chúng tơi thấy đến tháng thứ 2 sau khi gây miễn dịch thì hiệu giá kháng thể trong các mẫu huyết thanh ở các giống gà khơng cĩ sự chênh lệch lớn nữa. 4.3.4. Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc-xin tháng thứ 3 Tháng thứ 3 hiệu giá kháng thể trong các mẫu huyết thanh bắt đầu giảm nhưng khơng đáng kể (bảng 4.11). Bảng 4.11: Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 3 HI trung bình (log2) Lơ vắc-xin Giống gà Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Rhoder 7.3 7.1 7 6.7 Leghor 7.2 7 7 6.7 Vắc-xin Việt Nam H5N1 Tam Hồng 7.4 7 7 6.9 Rhoder 7.2 6.8 6.6 6.6 Leghor 7.2 6.8 6.8 6.5 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 Tam Hồng 7.3 7.1 6.9 6.9 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 66 7.3 7.1 7 6.7 7.2 7 7 6.7 7.4 7 7 6.9 7.2 6.8 6.6 6.6 7.2 6.8 6.8 6.5 7.3 7.1 6.96.9 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 H I (l og 2) Rhode Leghorn Tam Hồng Rhode Leghorn Tam Hồng Việt Nam Trung Quốc Lơ Vắc-xin Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Hình 4.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin trong tháng thứ 3 Hiệu giá trung bình của các giống gà gây đáp ứng miễn dịch bằng vắc- xin Việt Nam vẫn đạt trên 6,5log2 với HI. Tỷ lệ gà được bảo hộ miễn dịch vào khoảng 98% (98% mẫu huyết thanh làm phản ứng đạt hiệu giá HI ≥ 6,5log2). Một số mẫu huyết thanh của giống gà Rhode và Leghorn tiêm vắc- xin Việt Nam giảm xuống dưới 6log2 (chiếm khoảng 2% số mẫu). Mẫu huyết thanh của giống gà Tam Hồng đều đạt hiệu giá trên 6,9log2. ðáp ứng miễn dịch của lơ gà tiên vắc-xin cúm A/H5N1 của Trung Quốc đạt hiệu giá HI trung bình ≥ 6.5log2. Khả năng bảo hộ miễn dịch của đàn gà đạt khoảng 97% (Tỷ lệ hiệu giá HI ≥ 6,5log2 là 97%). 2% số mẫu huyết thanh ở hai giống gà Rhode và Leghorn giảm xuống dưới 6log2 Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh ở các lơ gà bắt đầu cĩ dấu hiệu giảm ở hai tuần cuối của tháng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 67 4.4 So sánh sử dụng một số phản ứng miễn dịch học để đánh giá hiệu giá kháng thể trên gà sau khi tiêm vắc-xin Ở đây, chúng tơi sử dụng hai phương pháp huyết thanh miễn dịch để đánh giá hiệu giá kháng thể trên gà sau khi tiêm vắc-xin là phản ứng ELISA gián tiếp và HI để so sánh hiệu quả xác định hiệu lực của vắc-xin và hiệu quả chẩn đốn. Kháng nguyên virus sử dụng cho phản ứng HI là virus được tăng sinh trong túi nhung niệu phơi gà 9 ngày tuổi. Kháng nguyên sử dụng cho phản ứng ELISA gián tiếp là kháng nguyên hịa tan. Hàm lượng kháng nguyên hịa tan của virus cúm A/H5N1 thu được là 5,8 mg/ml, kháng nguyên cĩ độ tinh khiết cao, đảm bảo để phản ứng ELISA hoạt động tốt (hình 4.6). Hình 4.6. Hình ảnh điện di kháng nguyên hịa tan của virus cúm A/H5N1 trên gel SDS-PAGE Huyết thanh sử dụng để so sánh hiệu quả đánh giá hiệu giá kháng thể là huyết thanh của gà thu vào các tuần thứ nhất, thứ ba, thứ sáu và hai mươi Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 68 sau khi tiêm vắc-xin. Sở dĩ chúng tơi lựa chọn mẫu huyết thanh thu tại thời điểm này là vì hiệu giá kháng thể các lơ gà ổn định trong tất cả các tuần trong tháng và đều đạt trên 7,1log2. Với phản ứng ELISA, chúng tơi xác định được giá trị OD cut-off là 0,2 tại độ pha lỗng kháng nguyên là 1/3.200. Kết quả thể hiện trong ( Bảng 4.12.) Bảng 4.12: Kết quả so sánh hiệu quả đánh giá hiệu giá kháng thể của gà được tiêm vắc-xin (HI log2, ELISA độ pha lỗng kháng thể) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Lơ vắc-xin Giống gà HI ELISA HI ELISA HI ELISA HI ELISA Rhode 3 600 7 1400 8 1600 5 800 Leghorn 3 600 8 1600 7 1400 6 1200 Vắc-xin Việt Nam H5N1 Tam Hồng 5 800 9 1800 8 1600 6 1200 Rhode 4 700 7 1400 7 1400 6 1000 Leghorn 3 600 7 1400 8 1600 5 800 Vắc-xin Trung Quốc H5N1 Tam Hồng 5 800 9 1800 8 1600 6 1000 ðối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 * Sau khi tiêm vắc-xin, tiến hành theo dõi diễn biến sức khỏe đàn gà, thống kê số lượng gà cĩ biểu hiện phản ứng sau tiêm. Kết quả được trình bày ở (Bảng 4.8.) Với số mẫu cịn ít nhưng nhận thấy tỷ lệ phản ứng sau tiêm vắc-xin của Việt Nam(chủng NIBRG-14) và vắc-xin Trung Quốc H5N1 là như nhau. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 69 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tơi rút ra một số kết luận sau: - Vắc-xin cúm gia cầm do Việt Nam sản xuất bằng chủng NIBRG-14 đạt tiêu chuẩn Việt Nam: vơ trùng, an tồn, hiệu lực, các mức chất lượng tương đương với vắc-xin cúm gia cầm nhập của Trung Quốc. - ðộ dài miễn dịch của vắc-xin khoảng 5 tháng, hiệu giá HI trung bình cao nhất tại tháng thứ 2 và kéo dài đến tháng thứ 3 sau khi tiêm (7,2log2≤HI≤7,8log2). Hiệu giá này ổn định nhất trong tháng thứ 2. - ðáp ứng miễn dịch ở các giống gà cĩ khác nhau nhưng độ chênh lệch khơng lớn. Hiệu giá kháng thể giống gà Rhosde đạt đỉnh điểm từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 10 sau gây miễn dịch vào khoảng 7.6 log2 với vắc-xin cúm của Việt Nam và 7.4 log2 với vắc-xin của Trung Quốc. Giống gà nội địa Tam Hồng cho đáp ứng miễn dịch cao nhất với vắc-xin cúm - Hiệu quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu gà được tiêm vắc-xin bằng phản ứng ELISA và HI là tương đương nhau. Tùy thuộc vào tình hình của cơ sở chẩn đốn và xét nghiệm để lựa chọn phương pháp xác định cho phù hợp. - Qua theo dõi lâm sàng, cả 2 loại vắc-xin H5N1 của Việt Nam và của Trung Quốc đều an tồn khi sử dụng trên thực địa. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 70 5.2. Kiến nghị - Kết quả nghiên cứu của chúng tơi trên thực địa với số lượng mẫu cịn ít, do thời gian thực tập hạn chế nên tơi chỉ đánh giá được độ dài miễn dịch trên an tồn với gà nuơi lấy thịt. Với gà lấy trứng hoặc nuơi hộ gia đình thời gian nuơi cĩ thể lâu hơn vậy tơi cĩ đề nghị cần đánh khả khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà ở thời gian dài hơn và khả năng đáp ứng miễn dịch trên gà thế hệ thứ 2 để cĩ kết quả chính xác hơn, trên cơ sở đĩ cĩ chiến lược dùng vắc-xin đúng. - Mở rộng tiến hành phản ứng ELISA trên số lượng mẫu lớn để đánh giá dải hiệu giá bảo hộ miễn dịch bằng phản ứng ELISA. - Khuyến khích hộ chăn nuơi sử dụng vắc-xin cúm gia cầm của Việt Nam giảm chi phí. Hơn nữa vắc-xin cúm gia cầm của Việt Nam được tạo ra từ chủng NIRBG-14 là chủng virus tái tổ hợp từ nguồn gen cúm H5N1 phân lập được tại Việt Nam do vậy cĩ khả năng chống lại các biến chủng tốt hơn. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2002). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục (tái bản lần thứ hai). 2. Lê Thanh Hồ (2002). Bài giảng : “Sinh học phân tử: nguyên lý và ứng dụng”. Viện Cơng nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, 104 trang. 3. Lê Thanh Hịa (chủ biên) (2006). “Y-Sinh học phân tử”. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 240 trang. 4. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hồ, ðinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2007). Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch giữa các chủng virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vắc-xin cúm A/H5N1. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 4(3): 1-7. 5. Lê Thanh Hồ, Nguyễn Thị Bích Nga, ðinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2006). Nghiên cứu biến đổi thành phần gen H5 của virus cúm A/H5N1 của vịt An Giang (Việt Nam) và thế giới. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 4(1): 23-30. 6. Lê Văn Năm (2004). Bệnh cúm gà. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XI, số 1: 81-86. 7. Nguyễn Thị Bích Nga (2006). “Phân lập, lưu giữ và nghiên cứu đặc tính phân tử gen HA (H5) và NA (N1) của một số chủng virus cúm A/H5N1 trên gia cầm ở Việt Nam”. Luận văn thạc sĩ. Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 92 trang. 8. Phạm Văn Ty (2005). Virut học. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, 334 trang. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 72 9. Vũ Triệu An (1998), Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội. 10. Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ (2004), “Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đốn và kiểm sốt dịch bệnh”, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 69- 75. 11. Ban Chỉ đạo Quốc gia phịng chống dịch cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết cơng tác 2 năm (2004-2005) phịng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị Tổng kết 2 năm phịng chống dịch cúm gà, ngày 18 tháng 4 năm 2005, Hà Nội. 12. Bộ Nơng nghiệp & PTNT (2005), Dự án sử dụng vắc-xin nhằm khống chế và thanh tốn bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1, Hà Nơi. 13. J. H. Breytenbach (2004), “Tiêm chủng, một phần của chiến lược khống chế bệnh cúm gà”, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(2), tr. 72-80. 14. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2004), Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phịng chống, Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội. 15. Caroline Yuen (2004), “ðánh giá tiêm chủng vắc-xin cúm gà H5 năm 2003 tại Hồng Kơng”, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(2), tr. 79-80. 16. Cục thú y (2005), Sổ tay hướng dẫn phịng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên người, Hà Nội. 17. Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Khơng (2004), “Một số hoạt động nghiên cứu khoa học của Viện Thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học cơng nghệ trong thời gian tới”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(3), tr. 62-68. 18. Nguyễn Tiến Dũng (2004), Hội thảo một số biện pháp khơi phục đàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội, Tr. 5-9. 19. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 73 Khơng và Ngơ Thành Long (2004), “Nguồn gốc virut cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003 – 2004”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(3), tr. 6-9. 20. Nguyễn Tiến Dũng, ðỗ Quí Phương, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Thuý Duyên (2005), “Giám sát bệnh cúm gia cầm tại Thái Bình”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 12(2), tr. 6-12. 21. Nguyễn Tiến Dũng, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Kenjiro Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Bá Thành, Phạm Thị Kim Dung (2005), “Giám sát tình trạng nhiễm vi rút cúm gia cầm tại đồng bằng Sơng Cửu Long cuối năm 2004”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 12(2), tr. 13-18. 22. Trần Xuân Hạnh (2004), “Một vài vấn đề phịng bệnh cúm gia cầm bằng vắc-xin”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(3), tr. 84-85. 23. Vũ Quốc Hùng (2005), Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh cúm gia cầm, Luận văn thạc sĩ Nơng nghiệp, ðại học Nơng nghiệp I, Hà Nội. 24. ðào Yến Khanh (2005), Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vắc-xin cúm gia cầm ngoại nhập, Luận văn thạc sĩ Nơng nghiệp, ðại học Nơng nghiệp I, Hà Nội. 25. Phạm Sỹ Lăng (2004), “Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở Châu Á và các hoạt động phịng chống bệnh”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(3), tr. 91-94. 26. Phạm Sĩ Lăng (2004), Hội thảo một số biện pháp khơi phục đàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội, Tr. 33-3 8. 27. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y, Nhà xuất bản Nơng nghiệp. 28. Tơ Long Thành (2004), “Bệnh cúm lồi chim”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2), tr. 53-58. 29. Tơ Long Thành (2004), “Thơng tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các nước Châu Á”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(4), tr. 87- 93. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 74 30. Tơ Long Thành (2006), “Thơng tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vắc-xin phịng chống”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 13(1), tr. 66-76. 31. Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương (2004), Tài liệu tập huấn chẩn đốn bệnh cúm và bệnh lở mồm long mĩng, Hà Nội. B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 32.Alexpander DJ (2003). “Report on avian influenza in different bird species”. Vet Microbiol 74: 3-13. 33.Beaton AR., and Krug RM (1986). Transcription antitermination during influenza viral template RNA synthesis requires the nucleocapsid protein and the absence of a 5' capped end. Proc Natl Acad Sci USA 83:6282- 6286. 34.Biswas SK and Nayak DP (1996). “Influenza virus polymerase báic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites”. J Virol 70: 6716-6722. 35.“Biodefense: Principles and Pathogens” edited by Bronze MS and Greenfied RA, chapter 21. “Miscellaneous threats: Hingly pathogenic avian influenza, and novel bio-engineered organism.” By D.R. Perez, S.H. Nazarian, G.McFadden, and M.S. Gilmore. Copyright 2005, Horizon Bioscience, Norfolk, England. 36. Capua I, Terregino C, Cattoli G, Mutinelli F and Rodriguez JF (2002). Development of a DIVA (Diferentiating infected from Vắc-xinated Animals) strategy using a vắc-xin containing a heterologus neuramidase for the control of avian influenza. Avian pathol 32: 47-55. 37.Castrucci MR and Kawaoka Y (1993). Biologic importance of neuraminiase stalk length in influenza A virus. J Virol 67: 759-764. 38.Cauthen AN, Swayne DE, Schultz-Cherry S, Perdue ML and Suarez Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 75 DL (2000). Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. J Virol 74: 6592-6599. 39.De BK, Brownlee GG, Kendal AP and Shaw MW (1998). Complete sequence of a cDNA clone of the hemaglutinin gene of influenza A/Chicken/Scotland/59 (H5N1) virus: comparision with contermporary North American and European strains. Nucleic Acids Res 16 (9): 4181-4182. 40. Fenner et al (1998).Virology. Raven pres NewYork: 1157-1178. 41 .Steinhaure DA and Skehel JJ (2002). Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet 36: 305-332. 42.Gorman OT, Bean WJ, Webster RG (1992). “Evolutionary processes in influenza viruses: divergence, rapid evolution, and stasis”. Curr Top Microbiol 172: 75-97. 43.Guan Y, Shortridge KF, Krauss S and Webster RG (1999). Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the “internal” genes of H5N1 viruses in Hong Kong. Proc Natl Acad Sci USA 96: 9372-9380. 44.Helenius A (1992). Unpacking the incoming influenza virus. Cell 69: 577-578. 45 .Holsinger LJ, Nichani D, pinto LH and Lamb RA (1994). Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-fuction analysis. J virol 68: 1551- 1563. 46.Horimoto T, Kawaoka Y (1994). Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus. J Virol 68: 3120-3128. 47.Horimoto T, Kawaoka Y (1995). Direct reverse transcriptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds. J Clin Mircobiol Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 76 33(3): 748-751. 48.Horimoto T, Kawaoka Y (2001). Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clin Mircobiol Rev 14(1): 129-149. 49.Ito T, Kawaoka Y, (1998), Avian influenza. P. 126-136. In Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ (eds.), Textbook of influenza, Blackwell Sciences Ltd., Oxford, UnitedKingdom. 50.Krug RM., Alonso-Caplen FV, Julkunen I, and Katze MG. (1989). Expression and Replication of the Influenza Virus Genome. In The Influenza Viruses, K. R.M, ed. (New York, Plenum): 89-152. 51.Lamb R (1989). Genes and Proteins of the Influenza Viruses. In The Influenza Viruses, Krug R M., ed. (New York, Plenum Press): 1-67 52.Lương G và Palese P (1992). Genetic analysí of influenza virus. Curr Opinion gen Develop 2: 77-81. 53.Murphy BR and Webster (1996). Orthomyxoviruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM et al (eds.), Fields Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa: 1397-1445. 54.Nicholson KG, Wood JM and Zambon M (2003). Influenza. Lancet. 362(9397): 1733-1745. 55.Noda T (2006). Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles. Nature 439: 490-492 56. Pinto LH., Holsinger LJ, and Lamb RA (1992). Influenza virus M2 protein has ion channel activity. Cell 69: 517-528. 57. Plotch SJ., Bouloy M, Ulmanen I, and Krug R.M (1981). A unique cap(m7GpppXm)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription. Cell 23: 847-858. 58.Portela A, Digard P. The influenza virus nucleoprotein: a Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 77 multifuntionnal RNA-binding protein pivotal to virus replication. J Gen Virol 83: 723-734: 2002 59. Rev. sci. tech. off. Int. Epiz., 2004, 23 (university of Hong Kong, Department of Microbiology, Pokfular Roac, Hong Kong, People’s Republic of China): 453-465. 60.Shortridge KF (1999). Poultry and the influenza H5N1 outbreak in Hong Kong 1997: abridged chronology and virus isolation. Vắc-xin 17 (Suppl.1): S26-S29. 61.Shu LL, Bean WJ and Webster RG (1993). Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990. J Virol 67:2723-2729. 62.Steinhaure DA (1999). Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology 258:1-20. 63.Ulmanen I., Broni B, and Krug RM (1983). Influenza virus temperature-sensitive cap (m7GpppNm)-dependent endonuclease. J Virol 45: 27-35. 64.Wang X, et al. Influenza A virus NS1 protein prevents activation of NF-kappaB and introduction of Alpha/Beta interferon. J Virol. 2000 Dec: 74 (240:11566-73). 65.Webster RG, Peiris M, Chen H and Guan Y (2006). H5N1 Outbreaks and Enzootic Influenza. Emerg Infect Dis 12(1): 3-8. 66.Webster RG (1998). “Influenza: An emerging disease”, Emerg infect Dis 4: 436-441. 67.Wei W, Brown JH, Cusack SC, Paulson JC, Skehel JJ , and Wiley DC (1988) Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. Nature 333: 426-431. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .......... 78 C. TRANG WEB 68. 69. 70. 71.ắc-xin.html 72. _aicanhbaomap.gif ._.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfCH2717.pdf
Tài liệu liên quan