Khóa luận Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính Lan hồ điệp (phalaenopsis sp.)

Quốc Luận Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Hƣơng Đà lạt, 5/2009 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả và số liệu trong khóa luận này chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Đây là một phần nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu qui trình tạo phôi vô tính và nhân nhanh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.)” do TS. Dương Tấn Nhựt chủ trì, Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng cấp kinh phí. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Đà lạt, 24/05/2009 Tác giả Trịnh Thị Hương 3 Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô, các anh chị, các bạn và gia đình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt và các phòng ban đã tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành chương trình học của mình ở trường. Quý Thầy Cô khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt đã truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Thầy Dương Tấn Nhựt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thầy, người đã trực tiếp gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chu đáo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, hết lòng sửa chữa những sai sót giúp em hoàn thành trọn vẹn đề tài này và cũng là người dìu dắt em trong bước đi đầu tiên để tiếp cận đến với chân trời của khoa học rộng lớn. Không chỉ là truyền đạt kiến thức, Thầy còn dạy cho em lối sống, cách làm người. Thầy cũng là một tấm gương về lòng nhiệt huyết, cống hiến hết mình cho sự nghiệp của khoa học, để chúng em học hỏi, noi theo. Em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Quốc Luận, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cũng như luôn tạo mọi điều kiện cho em trong những ngày đầu tiên thực tập taị viêṇ và trong suốt quá trình tiến hành các thí nghiệm của đề tài. Cô Hoàng Thị Sâm đã định hướng cũng như luôn chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm và chỉ bảo cho em rất nhiều điều trong cuộc sống. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại viện. Các anh chị trong phòng Sinh học phân tử & Chọn tạo giống cây trồng (viện Sinh học Tây Nguyên): anh Bình, anh Nam, chị Hiền, chị Thu Ba, chị Phượng, chị Hằng. Em cảm ơn các anh chị đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập cũng như tiến hành các thí nghiệm của đề tài. Ngoài ra bên cạnh em còn có các anh chị, các bạn của trường ĐH Bách Khoa TP.HCM, ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, ĐH Nha Trang, ĐH Đà Lạt, ĐH Yersin. Cảm ơn anh Nam, bạn Thu, bạn Thương, Thành, Cương đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn sự nhiệt tình của các anh chị và các bạn. Cảm ơn anh Thắng, Na, Dung, các thành viên của gia đình 1/29b và tất cả những người bạn thân đã luôn bên tôi, cùng tôi chia sẻ những niềm vui và cả những khó khăn. Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong mọi sự lựa chọn của mình. Đặc biệt là mẹ, người đã luôn tin tưởng, cho con nghị lực và sức mạnh những khi con gặp khó khăn nhất để vươn lên trong cuộc sống. Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người! 4 Lời mở đầu Thiên nhiên tươi đẹp đã ban tặng cho cuộc sống rất nhiều món quà. Và sự xuất hiện của các loài hoa chính là món quà tuyệt vời nhất của tạo hóa. Cùng với sự phát triển của xã hội, con người ngày càng hướng tới cái đẹp thì hoa tươi đã trở thành món ăn tinh thần không thể thiếu được. Trong đó, hoa lan được mệnh danh là loài hoa “vương giả” đã dần dần len lỏi xuất hiện ở mọi nơi, như một điều kỳ diệu mà thiên nhiên đã ban tặng cho con người. Có lẽ hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp quanh mình nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê hoặc con người một cách vô điều kiện như loài hoa này. Trong không gian lung linh màu sắc và hương thơm quyến rũ đó, chúng ta phải kể tới sự hiện diện của Phalaenopsis. Từ rất lâu, loài hoa này đã xuất hiện trong các khu vườn làm cảnh cũng như trong trang hoàng nhà cửa, văn phòng. Phalaenopsis không chỉ mang một vẻ đẹp đài các, sang trọng, ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, luôn mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót nặng lòng với loài hoa vương giả này. Ngày nay, nhu cầu hoa tươi nói chung, hoa lan nói riêng trong nước và trên thế giới ngày càng tăng, xu hướng chơi lan cũng ngày càng lan rộng. Hoa lan không chỉ mang giá trị cao về mặt tinh thần, thẩm mỹ mà còn có giá trị cao về mặt kinh tế. Việt Nam là nước có điều kiện khí hậu thuận lợi để phát triển ngành trồng lan. Tuy nhiên, chúng ta vẫn phải phụ thuộc nguồn giống từ Thái Lan, Đài Loan Đây là một điều bất cập trong tiềm năng nhân giống, lai tạo ra các giống lan độc đáo quý hiếm, mang nét đặc trưng của Việt Nam phục vụ thị trường nội địa cũng như cho xuất khẩu. Năm 2005, Tp.HCM khẳng định hoa lan (lan cắt cành như Dendrobium, Mokara, Oncicidium) sẽ trở thành cây giống chủ lực của thành phố trong vòng 5 năm tới. Chương trình phát triển hoa 2004 – 2010 đã được sở Nông nghiệp - Phát triển nông thôn Tp.HCM thông qua với mục tiêu Tp.HCM phấn đấu đạt kim ngạch xuất khẩu hoa kiểng là 10 triệu USD vào năm 2005 và 15 triệu USD vào 2010. Để có thể phát triển được ngành trồng hoa lan, trước mắt chúng ta cần phải chủ động được nguồn giống, dần dần không phải nhập giống, lai tạo ra một số giống có chất lượng cao để cung cấp cho thị trường trong nước và sau đó xuất khẩu. Ngoài ra, kỹ thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô đang là công cụ đắc lực để giúp chúng ta có thể có đủ giống trong một thời gian ngắn. Như vậy, trong nước chúng ta cần phải có thêm nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô có quy mô lớn, chất lượng cao để có thể đáp ứng được nhu cầu nhân giống. 5 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về Phalaenopsis 1.1. Nguồn gốc và phân bố Lan Hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định dưới tên là Angraecum. Đến năm 1753, Linne đổi lại là Epidendrum. Chi Phalaenopsis do C.L Blume phát hiện vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn gọi là lan Hồ điệp. Tên Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy Lạp: “Phalama” (con bướm đêm) và “opsis” (trông giống như) nghĩa là loài hoa có hình dạng như bươm bướm. Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng, sống ở bán đảo Mã Lai, Indonesia, Philippin, các tỉnh ở phía đông Ấn Độ và Châu Úc. Chúng sống trên cây hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m (Dương Công Kiên, 2006). Ở Việt Nam có khoảng 5 - 6 loài Hồ điệp thuần chủng bao gồm: Phalaenopsis. gibbosa Sweet, Phalaenopsis. mannii Rchob.f, Phalaenopsis. braceana (Hook.f), Christenson, Phalaenopsis. Lobbii (Rchob.f), Phalaenopsis. fuscata Rchob.f. Hầu hết đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc sặc sỡ và hương thơm độc đáo. Bên cạnh những loài lan Hồ điệp thuần chủng, những người yêu thích loài hoa này không ngừng sưu tầm, nhập và thuần dưỡng các giống ngoại khiến chủng loại, màu sắc của lan Hồ điệp ở nước ta ngày càng đa dạng. 1.2. Vị trí phân loại Giới Plantae Thực vật Ngành Magnoliophyta Ngọc lan Lớp Liliopsida Hành Phân lớp Lilidae Hành Bộ Orchidales Lan Họ Orchidaceae Lan Chi Phalaenopsis Lan Hồ điệp Loài Phalaenopsis amabilis Lan Hồ điệp trắng 6 Hình 1: Sự đa dạng về màu sắc và hình dáng của Phalaenopsis sp. 7 1.3. Đặc điểm thực vật 1.3.1. Cơ quan sinh dƣỡng 1.3.1.1. Thân Cây đơn thân, không có giả hành. Các đốt thân rất ngắn và thường được bao bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân. 1.3.1.2. Lá Lá đơn nguyên dày, mọng nước, không cuống và có bẹ ôm lấy thân. Lá có hình elip thuôn hay hình lưỡi mác. Lá mang đặc tính của thực vật CAM. 1.3.1.3. Rễ Rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá. Rễ phát triển mạnh, màu lục, xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc (velamen). Lớp mô xốp này dễ dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây đồng thời đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc giữ nước. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp. 1.3.2. Cơ quan sinh sản 1.3.2.1. Hoa Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa). Hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị và nhụy dính liền thành một cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có chuôi và gót nằm ở phía dưới. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới. Bộ nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn (Hoàng Thị Sản, 2003). 1.3.2.2. Quả Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên đường của gió noãn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, số lượng tùy vào từng loài. Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào. 8 1.3.2.3. Keiki Keiki theo tiếng Indonesia có nghĩa là “bé con” là một cây con mọc ra từ một mắt trên thân hay cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả đầu tiên vào năm 1894. Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ. Người ta có thể tách cây con này để nhân giống và cho tỷ lệ sống sót rất cao. 2. Một số yếu tố cần thiết trong nuôi cấy mô lan 2.1. Các chất hấp phụ phenol Vấn đề thường gặp nhất khi nuôi cấy để nhân giống Phalaenopsis là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol khuếch tán vào môi trường làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là làm mẫu cấy hóa nâu hoặc đen và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1997; Fast, 1979). Hiện nay có rất nhiều phương pháp để loại trừ hoặc làm giảm nồng độ của các chất tiết này, chẳng hạn như dùng các chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol, polyvinylprolidone, than hoạt tính và nhiều loại chất khác. Hầu hết các phương pháp này thường đi kèm với việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới sau một thời gian nuôi cấy. Ngày nay than hoạt tính (AC – Activated Charcoal) được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung AC ở nồng độ thích hợp vào môi trường nuôi cấy mô Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ bị loại bỏ giúp mô sinh trưởng tốt (Arditi và Ernst, 1993, 2000). AC được thêm vào môi trường dinh dưỡng ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau. Chồi của nhiều loài cây hình thành rễ dễ dàng hơn khi trong môi trường có bổ sung thêm AC. Không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng AC đặc biệt có thể làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thụ nhiều cơ chất khác nhau, mà các cơ chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường ở nhiệt độ cao, một số chất có thể tiết ra từ các vết thương khi tách mẫu cấy cũng như các chất điều hòa sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, các hợp chất có gốc phenol (Fridborg và 9 cộng sự, 1978; Ammirato, 1983; Ebert và cộng sự, 2000; Geogre, 1993; Pan và Staden, 1999; Wann và cộng sự, 1997). Ngoài ra, AC khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ hấp thu những chất làm kìm hãm, đặc biệt là do các hợp chất có bản chất phenol tiết ra làm môi trường hóa nâu, gây độc cho mẫu cấy. Biện pháp bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đặc biệt có hiệu quả trên các loài Phalaenopsis, Cattleya, Aerides. AC cũng ảnh hưởng đến pH của môi trường nuôi cấy. Nhiều báo cáo thí nghiệm cho thấy AC còn tỏ ra thích hợp cho sự hình thành rễ chồi nuôi cấy trong môi trường in vitro (Duma và cộng sự, 1995; Geogre và Sherriington, 1984; Nguyễn Văn Kết và cộng sự, 2004). 2.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng (Phytohormone) Đây là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy. Chất điều hòa sinh trưởng là hormone thực vật bao gồm các hợp chất hữu cơ có bản chất khác nhau dùng để điều hòa các hoạt động sinh lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong cây. Bằng con đường tổng hợp nhân tạo người ta có thể tạo ra các hợp chất có công thức hóa học tương tự với các chất trong tự nhiên, dùng để kích thích các hoạt động sinh lý của cây. Chất điều hòa sinh trưởng được chia làm hai nhóm chính là chất kích thích sinh trưởng và chất ức chế sinh trưởng. Hai nhóm chất này tuy có tác dụng đối kháng về mặt sinh lý nhưng chúng luôn tồn tại cùng nhau trong cơ thể thực vật. Các chất kích thích sinh trưởng chỉ tác động lên mô cấy ở liều lượng thấp, khi ở liều cao chúng có thể gây độc cho mô cấy, vì vậy mà một vài chất kích thích được dùng làm thuốc diệt cỏ. Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuôi cấy in-vitro đó là: auxin và cytokinin. 2.2.1. Auxin Bao gồm một số hợp chất chứa nhân indol trong phân tử như: IBA; NAA; IAA; 2,4-D. Trong đó IAA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số loài cây; 2,4- D sử dụng có hiệu quả cho việc tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật. 10 Trong nuôi cấy mô in vitro, các auxin gây ra hàng loạt các biến đổi như: sinh trưởng của mẫu qua hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình trao đổi chất, tham gia sự điều chỉnh phân hóa của rễ, chồi Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích hoạt sự phân hóa rễ, ngược lại ở nồng độ cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo (Dương Công Kiên, 2003). Phôi lan có đáp ứng đáng kể đối với auxin. Theo Curtis và Nichol (1984), IAA có khả năng ức chế sự tăng trưởng của phôi trong các giai đoạn đầu sau khi nảy mầm. Nhiều tác giả sau này nhận thấy auxin có tác động lên sự tăng trưởng và nảy mầm của phôi lan ở nhiều giống lan lai khác nhau (Withner, 1953, 1955; Mariat, 1952). Ở một số giống lan biểu sinh, auxin (α-naphthalene acetamide) không ảnh hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng có tác động lên sự tăng trưởng của chồi và rễ (Yates và Curtis, 1949). Một số báo cáo khác cho rằng auxin có hoạt tính khi được sử dụng cùng với các dịch chiết có hoạt tính kích thích tăng trưởng như: nước dừa (Hegarty, 1955), nước cà chua (Meyri, 1954) và rất khó có thể quan sát độ ảnh hưởng riêng rẽ của auxin (Dương Công Kiên, 2000). 2.2.2. Cytokinin Là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được khám phá do những cố gắng tìm hiểu yếu tố kích thích sự phân chia tế bào thực vật. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau đã được cô lập. Ngày nay cytokinin là tên gọi dùng để chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính gần giống nước dừa hay kinetin. Trong nuôi cấy mô thường sử dụng là kinetin, 2iP và BAP. Đối với nuôi cấy mô lan người ta thường sử dụng BA cho vào môi trường để kích thích tạo sơ khởi chồi, tạo cụm chồi hay tạo tiền củ lan vì BA có giá thành rẻ và hoạt tính cao. Cơ quan tổng hợp cytokinin trong cây là hệ thống rễ. Từ rễ, cytokinin được vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều với auxin nhưng không có tính phân cực rõ ràng như auxin. Ngoài rễ, một số cơ quan non đang sinh trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ cytokinin. 11 Đặc tính của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định, ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi, kìm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên vẹn, do đó nó được coi là hormone trẻ hóa, kích thích sự nảy mầm của hạt và của chồi ngủ, giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin có vai trò: cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ); kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành; kích thích sự hình thành củ và sự phình to của củ. Trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây. Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Theo Skoog:  Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ thu được chức năng tạo rễ.  Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp mô sẽ phát sinh chức năng tạo thân.  Nếu tỷ lệ này gần 1 đơn vị ta sẽ thu được mô sẹo (Dương Công Kiên, 2006). Ngoài auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta còn sử dụng các phytohormone khác như: GA (Gibberellic acid); ABA (Abscissic acid); Etylen 2.3. Nƣớc dừa và các dung dịch hữu cơ khác Nước dừa được sử dụng rộng rãi như là chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy phôi. Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi của “Datura” và năm 1949 nuôi mô của “Daucus”. Kết quả phân tích thành phần nước dừa từ non đến già của Tulecke và cộng sự (1961) cho thấy trong nước dừa có: ● Amino acid dạng liên kết có trong protein và lipid. ● Acid hữu cơ. ● Một số loại đường như: glucose, sucrose, fructose ● Các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside. 12 Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của các chất có trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh là có chứa zeatin (Letham, 1974). Khi nuôi cấy phôi lan nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như: nước chiết cà chua (Meyerm, 1954; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957), dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1974, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1974; Mariat, 1952; Withner, 1953). 2.4. Carbohydrate Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là do nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Trong một vài trường hợp fructose cũng được sử dụng. Glucose có hiệu quả tương tự như sucrose còn fructose ít có hiệu quả hơn. Các nguồn carbohydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbohydrate này kém hiệu quả hơn sucrose và glucose. Nồng độ sucrose trong nuôi cấy thường từ 2 – 3%. Sucrose trong môi trường sẽ dễ dàng bị phân cắt ra thành glucose và fructose. Glucose được mô sử dụng trước, sau đó mới đến fructose. Sucrose cũng bị thủy giải một phần trong quá trình hấp tiệt trùng môi trường. Một vài loài thực vật tăng trưởng tốt trong môi trường có sucrose hấp tiệt trùng so với môi trường có sucrose lọc vô trùng và người ta cho rằng khi tế bào được nuôi trong môi trường có sucrose hấp tiệt trùng thì nó vừa được cung cấp glucose vừa sucrose (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006). 2.5. Ảnh hƣởng của pH 13 Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy, việc xác định chính xác và điều chỉnh pH trong môi trường là rất cần thiết. Murashige và Skoog (1962) nhận thấy rằng độ pH từ 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH = 5. Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH (đôi khi cũng sử dụng KOH) hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trường. Có thể chỉnh pH bằng pH kế để bàn, pH kế cầm tay hoặc giấy đo pH. Thường thì pH môi trường được điều chỉnh trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường. Mann và cộng sự (1982) nhận thấy rằng nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7 thì sau khi hấp tiệt trùng pH sẽ giảm xuống còn 5. Nếu muốn pH từ 5,7 – 5,9 trước khi cấy thì trước khi hấp tiệt trùng phải điều chỉnh pH = 7. pH của môi trường cũng sẽ thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy, do đó có nhiều nhà nghiên cứu đã cho vào một chất có màu sắc thay đổi theo pH để theo dõi sự thay đổi pH trong môi trường. Chất chỉ thị thường được sử dụng là chlorophenol đỏ 1 – 5 mg/l (Reinert và White, 1956; Risser và White, 1964; Henson, 1979; Binns và Meins, 1980) và bromocressol đỏ tía. Tuy nhiên, một vài chất chỉ thị có thể gây độc cho mẫu cấy như BDH 4460 cản trở sự tăng trưởng của tế bào trần Petunia (Roscoe và Bell, 1981). 3. Tổng quan về phôi 3.1. Phôi hữu tính ở thực vật họ lan Phôi của các loài thực vật họ lan có kích thước rất nhỏ và chưa phân hóa. Quá trình phát triển ở phôi lan có thể phân biệt với phôi của các loài thực vật có hoa khác như sau: + Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm. + Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu → dạng khiên → dạng diệp tiêu. + Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm. 14 Giai đoạn đầu của phôi ở các loài thực vật họ lan tương tự với những loài thực vật có hoa khác (Veyret, 1965, 1974). Sự khác biệt giữa phôi của các loài họ lan với các họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi hình cầu. Ở các thực vật có hoa khác tất cả tế bào của phôi cầu đều thuộc mô phân sinh. Riêng phôi lan chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia để kéo dài, còn các tế bào khác sẽ không phân chia hay tăng kích thước. Vì vậy, phôi lan có hai vùng phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn. Dựa vào đặc tính phát sinh tử diệp, phôi lan được phân chia làm hai nhóm: + Nhóm phôi không mang tử diệp: các phôi này thường có hình bầu dục, chẳng hạn ở loài Dactylorhiza baltica. + Nhóm phôi mang tử diệp: các phôi này thường có hình thuôn dài, chẳng hạn ở Polystachya microbambusa, Dendrochilum glumaceum. Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên ở protocorm ở cả hai nhóm có thể xem là tử diệp (Burgeff, 1936; Teryokhin, 1977) hoặc lá (Batygina và Vasilyeva, 1983), một số nghiên cứu khác còn cho rằng tất cả cấu trúc dạng lá hình thành đầu tiên ở protocorm đều là tử diệp (Teryokhin, Nikiticheva, 1968). Ở phần cực của protocorm và phôi là một cực chồi, tại cực này các lá (hoặc tử diệp) phát triển bao quanh cực chồi (ở Listera ovata) hoặc hình thành dạng lưỡi liềm (ở Dactylorhiza baltica). Phôi lan bao gồm vỏ phân sinh ngọn, nhu mô và một cực chồi. Mô mạch không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy phôi lan không chứa vùng mô phân sinh rễ. Trong khi đó, phôi các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực chồi, rễ. Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan với các loài thực vật có hoa khác. 3.2. Phát sinh phôi vô tính 3.2.1. Khái niệm về phôi vô tính Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng chỉ một khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2006). 15 Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng mang tính toàn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gen cần thiết. Sau khi đã hoàn toàn thoát khỏi chức năng trước đó của tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang tính toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng tương tự như tế bào trứng đã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995). Williams và Maheswran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hoặc từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con. Cây có thể phát triển từ một hoặc từ một cụm tế bào phôi. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Về nguyên tắc tất cả các cây con tái sinh bằng con đường này thì đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gen thì các cây tái sinh là các cây chuyển gen (Nguyễn Văn Uyển, 1992). Nhân giống thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số nhân rất cao (Dương Tấn Nhựt, 2006). 3.2.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phôi vô tính Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn thiện với đầy đủ các chức năng cần thiết. Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gen ở thực vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gen trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó bằng sự biểu hiện của gen sinh phôi. Giả thuyết này được đưa ra lần đầu tiên do Evans và cộng sự (1981), Sharp và cộng sự (1982). Đây cũng là người đầu tiên đưa ra một số các thuật ngữ như IEDC – inducec embryogenic determined cell nhằm mô 16 tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh phôi. Những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen sinh phôi thì được gọi là thuật ngữ PEDC – pre-embryogenic determined cell. Cả IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả hai có thể được gọi chung bằng thuật ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay gọi đơn giản là EC – embryogenic cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phôi vô tính không phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy các tế bào sinh phôi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp (Carman, 1990). Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô mẫu có chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mô cấy chứa các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính trực tiếp bởi vì phôi xuất phát trực tiếp từ mô cấy. Ngược lại, nếu các mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang Việt, 2002). Các tế bào được sinh ra do nhiều lần nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua giai đoạn tạo mô sẹo (Merkle và cộng sự, 1995). Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo sang trạng thái sinh phôi đi kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau (Wochok, 1973). Trong thực tế, một mô cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có đặc tính sinh phôi và không sinh phôi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mô cấy đó. Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính. Từ đó có thể giải thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phôi của các loại mô cấy khác nhau (Merkle và cộng sự, 1995). 3.2.3. Sự phát sinh phôi từ tế bào soma Sự phát sinh phôi từ tế bào soma được định nghĩa là một quá trình mà trong đó một hoặc vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm có thể tham gia vào sự 17 phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hoặc gần giống như phôi hợp tử. Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phôi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Thorpe, 1988). Các tế bào có khả năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các tế bào không có khả năng sinh phôi dựa trên những đặc tính trên. Sự sinh phôi từ tế bào soma trải qua hai giai đoạn: (1) Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào trong môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất tính hữu cực. (2) Mô sẹo từ giai đoạn (1) sẽ được chuyển vào môi trường có ít hoặc không có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối. 3.2.4. Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lƣợng phôi Cho dù nguồn gốc của các tế bào sinh phôi là IEDC hay PEDC thì chức năng của các tế bào này là như nhau. Tế bào từ cả hai nguồn gốc này đều có thể phát triển thành phôi vô tính hoặc tham gia vào một chu kỳ mới nhằm sản sinh ra ngày càng nhiều các tế bào sinh phôi (MeCoy, 1987). Sự gia tăng các tế bào phôi có nhiều kiểu khác nhau và chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, một vài nhân tố có thể điều khiển được trong quá trình nuôi cấy và một số khác thì không. Những nhân tố được nghiên cứu trong việc tăng sinh các tế bào sinh phôi thì tương tự như những nhân tố tác động trong cảm ứng tạo phôi. Chẳng hạn như các chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng nitơ, loài thực vật và kiểu gen của mẫu cấy. Trong trường hợp tăng sinh các tế bào sinh phôi, các nhân tố này không chỉ quyết định khả năng duy trì và tiếp tục trạng thái sinh phôi mà còn ảnh 18 hưởng đến đặc điểm của chu trình sinh phôi lặp lại. Do đó, các nhân tố này chịu trách nhiệm kiểm soát những biến đổi trong giai đoạn phát triển của phôi vô ... tương ứng ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần. (a1): phôi sau 8 tuần nuôi cấy; (a2): phôi sau 6 tuần nuôi cấy; (a3): phôi sau 4 tuần nuôi cấy. (b1), (b2), (b3): phôi ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần được cấy chuyền sau 12 tuần. (c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c7): phôi thu được ở các nghiệm thức P0, P1, P2, P3, P4, P5, NG2 sau 21 tuần nuôi cấy. (d1), (d2), (d3), (d4): ảnh hưởng của proline tới lên khả năng tăng sinh của phôi sau 4 tuần tương ứng ở các nồng độ 0 mg/l; 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75 mg/l. Trong đó (d1) là môi trường đối chứng có bổ sung 20% nước dừa lấy từ các trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm. 38 Nguồn mẫu cấy ban đầu là 6 tuần đem nuôi cấy sẽ thu được trọng lượng tươi, số lượng phôi, số lượng PLB trung bình cao nhất (trọng lượng tươi trung bình thu được gấp 44,13 lần so với mẫu cấy ban đầu). Đạt thấp nhất là các mẫu cấy 8 tuần (trọng lượng tươi trung bình thu được chỉ gấp 14,5 lần so với mẫu cấy ban đầu), ở dạng này cũng xuất hiện nhiều phôi hóa nâu nhất (Hình 3.b1). Như vậy thời gian cấy chuyền phôi tốt nhất là khoảng 6 tuần. Tiếp tục theo dõi sự phát triển của các nghiệm thức này, chúng tôi nhận thấy ở nghiệm thức 3 các phôi bị hóa nâu và chết đi rất nhiều, còn lại thì chuyển sang dạng PLB và thể chồi sau đó phát triển trực tiếp thành cây con. Ở nghiệm thức 2 cho hệ số nhân cao nhất sau 21 tuần nuôi cấy mỗi mẫu cấy có trọng lượng tươi trung bình là 5,30g gấp 66,25 lần so với mẫu cấy ban đầu. Ở nghiệm thức thứ 2 này hầu hết các phôi cũng chuyển sang dạng chuyển tiếp màu xanh và dạng PLB, ngoài một số phôi đã phát triển trực tiếp thành cây con (Hình 7.a2 và Hình 7.a3). Nghiệm thức 1 cho hệ số nhân thấp hơn nghiệm thức 2 nhưng mẫu cấy duy trì được ở trạng thái phôi cao nhất, một số vẫn ở dạng màu vàng xốp, một số chuyển sang dạng chuyển tiếp màu xanh, một số ít cũng chuyển thành dạng PLB, tuy nhiên các PLB thu được ở nghiệm thức 1 này có đường kính nhỏ hơn so với PLB thu được ở nghiệm thức 2 và thường có hình cầu. Điều này được giải thích là do tuổi của mẫu phôi ban đầu khi cấy chuyền có sự khác nhau, những phôi càng được giữ lâu trước khi đem đi cấy chuyền thì độ tuổi càng già, do đó khả năng chuyển thành dạng PLB cao hơn. Từ tất cả các nghiệm thức trên chúng tôi kết luận rằng đối với các phôi có màu vàng, xốp thì thời gian cấy chuyền tốt nhất là sau 6 tuần nuôi cấy. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nguồn nƣớc dừa già tới khả năng tăng sinh của phôi Các thí nghiệm 1 và 2 đều sử dụng nước dừa lấy từ các trái dừa non có cơm dày khoảng 0,3 – 0,4cm. Nước dừa từ lâu đã được biết đến như là một chất không thể thiếu trong nuôi cấy mô lan. Trong nước dừa có chứa các 39 acid amin, một số loại đường và đặc biệt có chứa cytokinin tự nhiên. Hàm lượng cytokinin, acid amin, đường trong nước dừa non thường cao hơn so với nước dừa già (lấy từ những trái đã già) do trong những trái dừa già các chất này đã được dùng để nuôi cơm của trái dừa. Chính vì vậy trong nuôi cấy mô lan người ta thường sử dụng các loại nước dừa non để nuôi cấy. Tuy nhiên, mục tiêu của nhân giống lan Hồ điệp ngoài tạo ra cây con có chất lượng cao, đồng nhất, hệ số nhân cao thì giá thành cây giống cũng là điều đáng quan tâm. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nguồn nước dừa già được lấy từ những trái có cơm dày khoảng 0,5 - 1cm. Vì trong nước dừa già hàm lượng cytokinin, acid amin, đường giảm đi do đó chúng tôi tăng nồng độ nước dừa lên 30%. Kết quả thu được ở bảng 3.3 và hình 4. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nước dừa già tới khả năng tăng sinh của phôi Phôi PLB Chồi TLT (g) SL TLT (g) SL TLT (g) SL Ban đầu 0,08 ± 0,01 125 ± 5 0 0 0 0 8 tuần 0,60 ± 0,05 225 ± 5 1,40 ± 0,12 220 ± 8 0,20 ± 0,03 7 ± 3 12 tuần 1,09 ± 0,03 1,68 ± 12 2,40 ± 0,05 50 ± 5 2,45 ± 0,03 47 ± 5 Ở giai đoạn đầu mẫu cấy thu được cho hệ số nhân thấp, các mẫu tăng sinh chậm. Tuy nhiên, sau 6 tuần nuôi cấy đã có sự khác biệt rõ rệt cả về hệ số nhân và hình thái. Hầu hết các phôi không bị hóa nâu sau 8 tuần nuôi cấy như trong thí nghiệm 2 mà tốc độ tăng sinh tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Các mẫu cấy chỉ bị chết đi khi môi trường dinh dưỡng sử dụng hết. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, các phôi hầu như đều chuyển thành dạng PLB, rất ít còn ở trạng thái phôi như ban đầu. 40 Hình 4: Ảnh hưởng của nước dừa già tới sự phát triển của phôi, PLB và cây con. (a), (b), (c): sự phát triển của phôi sau các khoảng thời gian 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,8. (c1), (c2): sự phát triển của phôi, PLB trên môi trường Hw (môi trường Vacin -Went + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,3) sau 12 tuần nuôi cấy. (c3): sự phát triển của cây con trên môi trường RC3 (môi trường Vacin-Went + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,3) 41 Sau 8 tuần nuôi cấy trọng lượng tươi của phôi thu được gấp 7,5 lần so với mẫu cấy ban đầu, đồng thời phát sinh các PLB (trọng lượng tươi 1,4 g/mẫu) và các cụm chồi non (7 chồi/mẫu) (Hình 4.b). Sau 12 tuần nuôi cấy sinh khối thu được đã tăng lên rất rõ rệt. Các mẫu cấy phát triển gần như kín bề mặt môi trường. Trong giai đoạn này, hầu hết các phôi đã phát triển hoàn toàn thành dạng PLB có đường kính lớn và xuất hiện nhiều dạng chồi nhỏ (Hình 4.c). Sau 12 tuần, một số bình mẫu được tách và cấy chuyền trên môi trường Hw (môi trường Vacin-Went có bổ sung 30 g/l đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH = 5,3) đối với phôi và PLB; cấy trên môi trường RC 3 (môi trường Vacin- Went có bổ sung 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 0,5 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH = 5,3) đối với các cụm chồi. Sau đó theo dõi thì thấy rằng: các phôi khi được cấy chuyền qua môi trường Hw sẽ nhân lên với hệ số rất cao (gấp 80 lần sau 16 tuần nuôi cấy) đồng thời vẫn giữ được ở trạng thái phôi màu vàng sau 16 tuần, phôi có đường kính lớn và xốp (Hình 4.c1), một số ít phát triển thành dạng PLB tròn (Hình 1.d2). Các PLB phát triển rất đồng đều nhau với đường kính PLB lớn hơn hẳn so với các dạng PLB thu được ở thí nghiệm 1 và 2. Các PLB phát triển thành cụm chồi với hệ số nhân cao (Hình 4.c 2). Các cụm chồi sau khi được cấy trên môi trường RC3 cho sự hình thành rễ cũng phát triển rất đồng đều nhau. Sau 16 tuần nuôi cấy trung bình mỗi cây con đã phát triển với số lượng lá là 3 và số lượng rễ là 4. Chiều dài rễ và lá cân đối nhau. Tuy nhiên, các lá có dạng thon, dài hơn so với các cây con nuôi cấy trên môi trường ra rễ ở thí nghiệm 1 và 2 (Hình 4.c 3). Từ đó chúng tôi kết luận rằng nếu sử dụng môi trường có bổ sung 30% nước dừa già thì các phôi sẽ trực tiếp phát triển thành dạng PLB sau đó phát triển thành chồi non và các cây con. Ở môi trường này cho hệ số nhân PLB cao đồng thời các PLB phát triển đồng đều có đường kính lớn. Mặt khác, nước dừa non thường có giá thành cao gấp 7 – 8 lần so với giá thành của nước dừa già, vì vậy mặc dù tăng nồng độ nước dừa già lên 30% nhưng 42 giá thành khi sử dụng nước dừa già vẫn thấp hơn nhiều so với khi sử dụng nguồn nước dừa non. Do đó nếu sử dụng nguồn nước dừa già cho nhân giống cây con thì có thể rút ngắn thời gian nhân giống do thời gian chuyển từ phôi sang dạng PLB ngắn, đồng thời cho hệ số nhân cao, chất lượng tốt và đồng nhất, giảm giá thành cây con giống. Từ thí nghiệm 2 và 3 chúng tôi rút ra kết luận rằng: Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà chúng ta nên sử dụng nguồn nước dừa phù hợp. Nếu sử dụng cho mục đích nhân nhanh và giữ phôi thì nên sử dụng nguồn nước dừa non. Còn nếu sử dụng cho mục đích nhân nhanh tạo cây con giống thì nên sử dụng nguồn nước dừa già. 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc gạo kết hợp với nƣớc dừa ở các nồng độ khác nhau Trong thí nghiệm này, nguồn nước dừa già được lấy từ những trái dừa có cơm dày 0,5 – 1cm; nguồn nước dừa non được lấy từ những trái có cơm mới hình thành độ dày khoảng 0,1 – 0,2cm. Hai loại nước dừa này được kết hợp bổ sung với nước gạo ở các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần nuôi cấy tiến hành cân trọng lượng tươi của mẫu. Kết quả thu được ở bảng 3.4.1 và hình 5. Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng của nước gạo và nước dừa ở các nồng độ kết hợp khác nhau. NT 4 tuần 8 tuần 12 tuần DG2 1,64 ± 0,14 2,00 ± 0,15 2,21 ± 0,40 DG3 1,81 ± 0,25 2,16 ± 0,12 2,46 ± 0,38 G12 2,14 ± 0,21 2,45 ± 0,20 2,88 ± 0,10 G15 2,00 ± 0,53 2,81 ± 0,14 3,64 ± 0,12 NG2 1,09 ± 0,01 1,24 ± 0,02 1,88 ± 0,09 NG3 2,15 ± 0,08 2,53 ± 0,10 2,47 ± 0,06 NG35 2,58 ± 0,14 3,01 ± 0,12 3,16 ± 0,12 43 N11 0,87 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,48 ± 0,04 N12 0,82 ± 0,04 0,84 ± 0,02 1,41 ± 0,05 G11 0,93 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,53 ± 0,11 G21 0,85 ± 0,01 1,05 ± 0,01 1,05 ± 0,01 L0 1,65 ± 0,02 1,92 ± 0,04 1,55 ± 0,02 Sự kết hợp của nườc dừa non với nước gạo cho thấy không có sự gia tăng đáng kể. Hệ số nhân thu được thấp hơn môi trường đối chứng L 0 (không bổ sung nước dừa). Thậm chí một số mẫu hóa nâu và chết đi sau 3 tuần nuôi cấy. Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy trên môi trường nhân phôi có bổ sung 20% nước dừa non, kết quả là gây cảm ứng làm hóa nâu mẫu và chết đi. Như vậy, nếu sử dụng nguồn nước dừa non từ những trái có cơm dày khoảng 0,3 - 0,4cm (ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2) sẽ gây cảm ứng tăng sinh phôi, nhưng nếu sử dụng nguồn nước dừa non lấy từ những trái có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm lại gây cảm ứng ngược lại. Có thể nguồn nước dừa lấy từ những trái mới hình thành cơm sẽ có hàm lượng cytokinin cao, thêm vào đó các mẫu cấy sử dụng cho thí nghiệm này lấy từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (tức đã qua 1 - 2 lần cấy chuyền nên có hàm lượng cytokinin nội sinh cao) dẫn tới gây chết mẫu. Nước dừa già khi kết hợp bổ sung với nước gạo gây cảm ứng tăng sinh rõ rệt. Ở giai đoạn đầu, nghiệm thức NG 35 cho hệ số nhân cao nhất, sau đó tới nghiệm thức NG3. Tuy nhiên, ở 2 nghiệm thức này các phôi hoàn toàn phát triển thành dạng PLB. Hình thái PLB được quan sát rõ sau 12 tuần nuôi cấy. PLB đã xuất hiện nhiều lông hút, có đường kính lớn, màu xanh đậm và đồng đều nhau (Hình 5). 44 Hình 5: Ảnh hưởng của nước gạo kết hợp với nước dừa. (a ), (a ), (a ): phôi thu được sau 4 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG , DG , G G ), (NG , 1 2 3 2 3 12, 15 2 NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (b1), (b2), (b3): phôi thu được sau 8 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (c1), (c2), (c3): phôi thu được sau 12 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG 2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (d): phôi thu được sau 6 tuần trên các môi trường H0, H1, H2, H3, H15 (Theo thứ tự từ trái sang phải). Ở nghiệm thức G12 và G15 gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số nhân cao nhất. Các phôi phát triển đồng đều, xốp, màu vàng xanh. Ở giai đoạn đầu không có sự khác biệt nhiều cả về hình thái và trọng lượng tươi thu được ở 2 nghiệm thức này (Hình 5a1). Sau 4 tuần trọng lượng tươi của mẫu thu được ở nghiệm thức G12 (2,14g) cao hơn so với nghiệm thức G15 (2,00g). Nhưng qua tới tuần thứ 8 thì hệ số nhân ở nghiệm thức G15 (2,81g) lại cao hơn nghiệm thức G12 (2,45g). Qua tuần thứ 12 thì tốc độ tăng sinh của mẫu ở nghiệm thức G15 đã cao hơn rõ rệt so với nghiệm thức G12. Tuy nhiên, qua tới tuần thứ 12, ở nghiệm thức G 15 hầu hết các phôi đã chuyển 45 qua dạng chuyển tiếp có màu xanh, còn ở nghiệm thức G 12 vẫn giữ được trạng thái phôi ở dạng màu vàng xanh. Dó đó nghiệm thức G 15 thích hợp cho công tác nhân giống với hệ số nhân cao. Còn nghiệm thức G 12 thích hợp cho nhân phôi và giữ phôi. Ở nghiệm thức DG3 mặc dù hệ số nhân không cao bằng bốn nghiệm thức trên, nhưng cũng xuất hiện nhiều dạng PLB. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả thu được ở thí nghiệm 3. Ở nghiệm thức DG2 các phôi có hệ số nhân không cao nhưng giữ được phôi ở dạng màu vàng. Như vậy khi sử dụng nước dừa già (30%) và sử dụng nước gạo ở nồng độ cao (30 - 35%) sẽ gây cảm ứng tạo PLB. Nhưng khi nước dừa già được kết hợp bổ sung với nước gạo lại gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số nhân cao. Trong nước dừa già có hàm lượng cytokinin thấp do chúng đã được dùng để nuôi cơm dừa, vì thế khi sử dụng để nuôi cấy phôi lan thì các phôi chuyển sang PLB. Điều này là hoàn toàn phù hợp vì nồng độ cytokinin thấp không gây cảm ứng tạo và tăng sinh phôi. Thành phần chính trong nước gạo là tinh bột và vitamin đặc biệt là vitamin B 1. Từ đó, chúng tôi đưa ra giả thiết rằng hàm lượng tinh bột và vitamin có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. Nghiệm thức NG2 cũng giữ được phôi ở trạng thái màu vàng và cho hệ số nhân không cao trong giai đoạn đầu. Trong một thí nghiệm riêng biệt khác khi so sánh môi trường này (NG2) với các môi trường P0, P1, P2, P3, P4, P5 (môi trường nhân nhanh phôi có bổ sung 20% nước dừa non lấy từ những trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm, nồng độ đường tương ứng là 0, 10, 20, 30, 40, 50 (g/l) các thành phần khác không thay đổi). Thí nghiệm này được đặt trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết quả chúng tôi thu được: ở giai đoạn đầu không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức; hệ số nhân thu được cũng không cao ở tất cả các nghiệm thức. Điều này hoàn toàn phù hợp với các thí nghiệm ở trên, khi sử dụng nguồn nước dừa từ những trái mới hình thành cơm. Đồng thời có thể nguồn ánh áng nhân tạo cũng có ảnh hưởng tới sự tăng sinh của phôi. Về sau các nghiệm thức P 0 , P1, P2, P3, P4, 46 P5 đều gây cảm ứng hóa nâu mẫu do thời gian lâu. Trong các nghiệm thức này ở nồng độ đường 30 g/l phù hợp nhất cho sự phát triển của phôi. Ở nồng độ đường 0 g/l có sự hình thành PLB hình cầu. Điều này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đó (Nhựt và My, 2008; Nhựt và Thanh, 2007). Sau 21 tuần, kết quả chúng tôi thu được các phôi đã hóa nâu và chết ở hầu hết các nghiệm thức. Chỉ có nghiệm thức P0 vẫn còn tồn tại một số PLB hình cầu ở dạng màu xanh. Riêng ở nghiệm thức NG 2 thì tốc độ nhân vẫn tiếp tục tăng lên theo thời gian, tuy nhiên hệ số nhân không cao bằng các nghiệm thức G12 và G15 như ở thí nghiệm trên. Chứng tỏ nếu bổ sung nước gạo (20%) tuy hệ số nhân nhanh không cao nhưng lại cho khả năng giữ phôi cao. Sau 24 tuần nuôi cấy mặc dù các phôi đã chuyển qua dạng chuyển tiếp màu xanh, tuy nhiên không thấy có hiện tượng hóa nâu của mẫu và hệ số nhân vẫn tiếp tục tăng lên. Điều này chứng tỏ nước gạo có khả năng hấp thụ các hợp chất phenol rất tốt. Đồng thời có thể giúp phôi duy trì mức độ tăng sinh tốt ngay cả khi trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 5.d. Bảng 3.4.2 So sánh môi trường có bổ sung 20% nước gạo với các môi trường có bổ sung 20% nước dừa non kết hợp với sự thay đổi của nồng độ đường trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo sau 21 tuần nuôi cấy STT NT 12 tuần 20 tuần 1 P0 1,67 ± 0,09 1,21 ± 0,14 2 P1 0,69 ± 0,01 0,48 ± 0,04 3 P2 0,73 ± 0,05 0,40 ± 0,05 4 P3 1,67 ± 0,07 0,80 ± 0,08 5 P4 0,86 ± 0,02 0,52 ± 0,03 6 P5 0,88 ± 0,04 0,56 ± 0,02 7 NG2 1,4 ± 0,15 3,65 ± 0,14 47 Để xác định rõ hơn nữa về ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ phôi, chúng tôi tiến hành khảo sát tiếp tục trên 3 loại môi trường np2, np15 và np12. Kết quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 6a. Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ phôi np2 np15 np12 4 tuần 0,72 ± 0,07 0,80 ± 0,03 0,75 ± 0,05 8 tuần 1,02 ± 0,03 2,02 ± 0,09 1,75 ± 0,03 12 tuần 1,66 ± 0,06 3,81 ± 0,08 3,28 ± 0,22 20 tuần 3,25 ± 0,15 3,56 ± 0,11 3,28 ± 0,20 4.5 4 3.5 3 np2 2.5 np15 2 1.5 np12 1 Trọnglƣợng tƣơi 0.5 0 4 tuần 8 tuần 12 tuần 20 tuần Thời gian nuôi cấy Biểu đồ 3.2 Tốc độ tăng sinh của phôi trên ba môi trường np 2, np12, np15 qua các khoảng thời gian khác nhau Sau 4 tuần nuôi cấy không thấy có sự khác biệt về sinh khối thu được cũng như hình thái của phôi trên cả ba loại môi trường, các phôi đều có màu vàng (Hình 6.a1). Sự khác biệt được quan sát rõ từ sau tuần thứ 8 trở đi. 48 Hình 6: Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng tăng sinh của phôi. (a1), (a2), (a3), (a4): sự phát triển của phôi trên các môi trường np2, np15, np12 (theo thứ tự từ trái qua phải) sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần, 20 tuần nuôi cấy. (b1), (b2), (b3), (b4): hình thái phôi thu được tương ứng trên các môi trường np12, np3, NG2, np. 49 Ở tuần thứ 8, môi trường np2 cho hệ số nhân thấp hơn hẳn so với hai môi trường còn lại. Hệ số nhân của môi trường np 15 cao hơn so với môi trường np12, tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều giữa hai môi trường này (Hình 6.a2). Tới tuần thứ 12 thì đã có sự khác biệt rõ ràng giữa ba loại môi trường cả về hình thái và trọng lượng tươi thu được. Trọng lượng tươi đạt cao nhất là ở môi trường np15, tuy nhiên các phôi có hình thái màu xanh và dạng chuyển tiếp. Trên môi trường np12 mặc dù hệ số nhân thấp hơn môi trường np15 nhưng vẫn giữ được phôi ở dạng vàng xanh. Môi trường np 2 vẫn cho hệ số nhân thấp nhất và các phôi đã chuyển sang màu xanh. Qua tới tuần thứ 20, trọng lượng tươi của hai môi trường np 12 và np15 giảm dần do có hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả hai môi trường. Tại thời điểm này, mặc dù trọng lượng tươi thu được ở môi trường np 15 vẫn cao hơn ở môi trường np12, nhưng mức độ giảm trọng lượng tươi ở môi trường np 15 cao hơn nhiều so với môi trường np 12 do ở môi trường np15 hiện tượng hóa nâu mẫu nhiều hơn. Trong khi đó, trên môi trường np 2 chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng tươi thu được, sinh khối vẫn tiếp tục tăng theo thời gian nuôi cấy, đồng thời không có hiện tượng hóa nâu của mẫu, tuy nhiên các phôi đã chuyển sang màu xanh. Điều này chứng tỏ nước gạo có khả năng hấp thu tốt các hợp chất có bản chất phenol, giúp mẫu được duy trì lâu hơn. Như vậy môi trường np15 cho hệ số nhân phôi cao nhất nhưng thời gian giữ được phôi lại thấp hơn so với môi trường np 12 và môi trường np2. Do đó qua tuần thứ 12 nên tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Môi trường này thích hợp cho việc nhân giống. Môi trường np 12 vừa có khả năng giữ phôi ở trạng thái màu vàng xanh, vừa cho hệ số nhân cao không kém nhiều so với môi trường np15, do đó thích hợp việc giữ phôi và nhân nhanh phôi làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm và các mục đích khác như: tạo hạt nhân tạo, nuôi cấy tế bào đơn, dung hợp tế bào trần, chuyển gen Còn môi trường np2 tuy giai đoạn đầu cho hệ số nhân nhanh 50 thấp, tuy nhiên về sau hệ số nhân tăng lên rõ rệt theo thời gian nuôi cấy, đồng thời không gây hiện tượng hóa nâu mẫu do đó giữ mẫu được lâu, không phải cấy chuyền nhiều lần. Vì vậy môi trường này phù hợp cho việc giữ mẫu làm nguồn nguyên liệu khi cần thiết. 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của proline tới khả năng tăng sinh của phôi Proline đã được chứng minh là gây cảm ứng phát sinh phôi ở nhiều loài. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo nào về cảm ứng của proline tới khả năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Vì vậy thí nghiệm này nhằm xác định ảnh hưởng của proline tới cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Kết quả thu được ở bảng 3.5 và hình 3.d. Bảng 3.5 Ảnh hưởng của proline tới khả năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp Ban đầu 4 tuần 6 tuần ĐC 0,48 ± 0,12 0,82 ± 0,04 TLT (g) H0,25 0,26 ± 0,08 0,16 ± 0,03 0,08 ± 0,01 H0,5 0,16 ± 0,07 0,15 ± 0,01 H0,75 0,04 ± 0,02 0,01 ± 0,01 ĐC 370 ± 7 720 ± 10 H,25 250 ± 5 160 ± 5 SL 125 ± 5 H0,5 170 ± 5 130 ± 4 H0,75 70 ± 5 5 ± 3 Trọng lượng tươi thu được sau 4 tuần trên môi trường có bổ sung proline ở các nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 g/l và 0,75 g/l đều thấp hơn so với đối chứng. Không có sự tăng sinh đáng kể về sinh khối thu được, đồng thời có hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả ba môi trường. Trong đó, ở nồng độ proline càng cao thì càng gây cảm ứng hóa nâu mẫu. Qua tuần thứ 6 trên 51 môi trường có bổ sung proline, các mẫu bị chết rất nhiều. Chứng tỏ proline không phù hợp cho cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Trong thí nghiệm này, ở môi trường đối chứng thu được cũng không cho hệ số nhân cao như ở thí nghiệm 2. Nguyên nhân là do nguồn nước dừa sử dụng cho thí nghiệm này lấy từ những trái còn quá non có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm. Đồng thời mẫu cấy lấy từ các thí nghiệm trên (tức đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền). Điều này lại một lần nữa khẳng định nguồn nước dừa lấy từ những trái còn quá non để nuôi cấy các mẫu cấy đã qua một số lần cấy chuyền là không phù hợp do hàm lượng cytokinin nội sinh và hàm lượng cytokinin trong môi trường cao. 3.6. Thí nghiệm 6: So sánh ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng ½MS tới khả năng tăng sinh của phôi Nguồn mẫu phôi qua 2 - 3 lần cấy chuyền liên tiếp trên môi trường nhân phôi có bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA sẽ có hàm lượng cytokinin nội sinh cao. Do dó nếu tiếp tục cấy chuyền phôi trên môi trường cũ, đồng thời nguồn nước dừa sử dụng trong trường hợp này lấy từ những trái còn rất non mới hình thành cơm chứa hàm lượng cytokinin cao sẽ dẫn tới khả năng tăng sinh của mẫu giảm đồng thời có hiện tượng hóa nâu. Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy các phôi đã trải qua 2 - 3 lần cấy chuyền trên môi trường có hàm lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng giảm đi một nửa, đồng thời kết hợp với việc thay thế nước dừa non bằng nước dừa già và nước gạo. Kết quả chúng tôi thu được ở bảng 3.6 và hình 5.d. 52 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường MS và ½MS tới khả năng tăng sinh của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền H0 H1 H2 H3 H15 4 tuần 0,29 ± 0,05 0,41 ± 0,05 0,70 ± 0,03 0,59 ± 0,15 0,51 ± 0,04 6 tuần 0,60 ± 0,03 0,75 ± 0,04 0,84 ± 0,01 1,20 ± 0,05 0,95 ± 0,12 8 tuần 0,70 ± 0,05 0,95 ± 0,02 1,20 ± 0,03 1,82 ± 0,06 1,60 ± 0,83 2 1.5 4 tuần 1 6 tuần 8 tuần 0.5 Trọnglƣợng tƣơi 0 H0 H1 H2 H3 H15 Nghiệm thức Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường ½MS tới khả năng tăng sinh khối của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền Trọng lượng tươi thu được ở nghiệm thức H 1 (môi trường MS có bổ sung 20% nước dừa non) không khác biệt nhiều so với nghiệm thức H 0 (môi trường MS không bổ sung nước dừa), đồng thời hệ số nhân thu được ở nghiệm thức H1 thấp hơn so với môi trường tương tự được sử dụng trong thí nghiệm 1 và 2. Trong khi đó ở các môi trường còn lại có sự giảm đi một nửa về hàm lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng (môi trường ½MS), đồng thời sử dụng kết hợp nước dừa già và nước gạo thay cho nước dừa non lại thu được trọng lượng tươi cao hơn nhiều. Trong đó, trọng lượng tươi thu được cao nhất là nghiệm thức H3. 53 Tuy nhiên, nếu so sánh với trọng lượng tươi thu được ở thí nghiệm 2 thì ở thí nghiệm này trọng lượng tươi của mẫu thu được ở tất cả nghiệm thức đều thấp hơn. Điều này chứng tỏ số lần cấy chuyền mẫu cũng có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. 3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng phát triển của cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính Các cây con được nuôi cấy trên môi trường VW cho sự phát triển hoàn thiện sau 12 tuần nuôi cấy sẽ được chuyển ra ngoài vườm ươm. Tổng số lượng cây con chúng tôi thu được là 500 cây (Hình 7.d) Trong quá trình nuôi cấy phôi, một số mẫu phôi phát triển trực tiếp thành chồi sau đó hình thành rễ và phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Tuy nhiên, các cây con hình thành trên môi trường này có số lượng rễ, chiều dài rễ thấp hơn so với các cây con thu được khi đã được cấy chuyền qua môi trường VW, đồng thời các cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi có lá dạng thon dài và đường kính bé hơn so với các cây con có nguồn gốc từ phôi nhưng được cấy chuyền sang môi trường VW. Thí nghiệm này nhằm khảo sát về số lượng lá, số lượng rễ, chiều dài lá, chiều dài rễ và trọng lượng tươi của cây con. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 7. 54 Bảng 3.7 Kích thước các cây thu được trước khi chuyển ra vườm ươm Cây con thu được Cây con thu được sau 12 tuần trên trong quá trình môi trường VW nuôi cấy phôi Chiều dài lá (cm) 4,87 ± 1,15 4,06 ± 1,44 Số lượng lá (lá/cây) 3,80 ± 0,50 3,40 ± 0,75 Chiều dài rễ (cm) 4,18 ± 1,25 2,20 ± 0,85 Số lượng rễ (rễ/cây) 5,80 ± 1,00 3,60 ± 0,70 Trọng lượng tươi của 4,39 ± 1,79 2,83 ± 0,18 cây (g/cây) Cây to khỏe có sức Cây mảnh hơn; lá thon sống cao ; lá màu xanh dài, mọng nước, đường đậm , hình e lip hoặc kính lá nhỏ hơn; số Đặc điểm hình thái thon dài ; hình thành lượng rễ hình thành ít, nhiều rễ , rễ dài (Hình rễ ngắn (Hình 7.c3). 7.b3). 55 Hình 7: Khảo sát chất lượng cây con thu được. (a1), (a2), (a3): sinh khối thu được từ phôi trên môi trường np ở lần cấy chuyền thứ 2 sau 21 tuần nuôi cấy. Trong đó (a1): phôi đang trong giai đoạn chuyển sang PLB; (a2): PLB; (a3): cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi. (b1), (b2), (b3): cây con sinh trưởng trên môi trường VW. (c1): cây con được cấy chuyền qua môi trường VW sau 6 tuần. (c2): cây con sinh trưởng trên môi trường RC3. (c3): cây con thu được trong quá trình nuôi cấy phôi. (d): cây con có nguồn gốc56 phôi vô tính trước khi đem ra vườm ươm. Măc̣ dù những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi (Hình 7.c3) có bộ lá phát triển , tuy nhiên lá moṇ g nước và thường có hình thon dài , đường kính lá và số lươṇ g rê ̃ hình thành thấp hơn so với các cây con đa ̃ đươc̣ cấy chuyền qua môi trường VW (Hình 7.b3). Do đó sứ c sống của những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi se ̃ kém hơn so với các cây con có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền qua môi trường VW khi chuyển ra ngoài vườm ươm . 3.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trƣởng của con trong điều kiện in vitro Sau 2 tuần cấy chuyền trên môi trường VW các cây con P.amabilis cảm ứng với môi trường nuôi cấy và bén rễ. Sang tuần thứ tư chúng kéo dài lá và rễ, gia tăng đường kính lá, các cây con ở tất cả các nghiệm thức đều rất khỏe, có bộ lá xanh tốt, bộ rễ khỏe. Tuy nhiên sự gia tăng kích thước ở các nghiệm thức có sự khác nhau. Sau 12 tuần nuôi cấy tiến hành thu kết quả trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con trong điều kiện in vitro Số lá Số rễ Chiều dài Chiều dài TLT NT Đặc điểm (lá/cây) (rễ/cây) lá (cm) rễ (cm) (g/cây) Cây rất mập, lá xanh đậm, phiến lá dày, 4,88 ± 5,29 ± 5,27 ± R1 4,00 ± 0,75 7,80 ± 1,25 nhiều sắc tố 1,53 2,05 0,90 tím ở mặt dưới, cây và rễ khỏe. Cây khỏe, 3,81 ± 4,25 ± 3,13 ± mập, mặt R2 3,50 ± 0,25 6,00 ± 0,50 1,15 1,73 0,98 dƣới lá có nhiều sắc tố 57 tím. Cây chắc, rễ 2,08 ± 4,06 ± 2,12 ± hơi khô, R3 3,14 ± 0,15 4,60 ± 1,00 0,60 1,20 0,70 nhiều sắc tố tím. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy ở cùng thể tích bình nuôi cấy (bình thủy tinh 500ml) và ở cùng thể tích môi trường (80ml) thì mật độ càng thấp khả năng sinh trưởng của cây con càng cao, khả năng sinh trưởng của cây con giảm dần khi mật độ cây tăng lên. Khả năng sinh trưởng của cây tỷ lệ nghịch với mật độ nuôi cấy. Ở nghiệm thức R1 các chỉ tiêu sinh trưởng đều đạt cao nhất khi so sánh với các nghiệm thức còn lại. Ở mật độ này các cây con sinh trưởng rất mạnh, cây to khỏe, mập, phiến lá dày có nhiều sắc tố tím ở mặt dưới của lá, rễ khỏe, lá dài và bóng mượt, phiến lá bóng. Sở dĩ các cây con thu được ở nghiệm thức này sinh trưởng và phát triển đạt cao nhất là do cây con trong nghiệm thức này được cung cấp đủ chất dinh dưỡng, khoảng không gian, cây có điều kiện tiếp nhận nguồn ánh sáng chiếu đến lá nhiều nhất, vì vậy khả năng quang hợp của cây tốt hơn, không xảy ra hiện tượng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng cũng như không có hiện tượng các cây che bóng lẫn nhau dẫn đến thiếu nhu cầu ánh sáng cho quang hợp, không có hiện tượng cạnh tranh về không gian khiến các cây phải mọc chen chúc. Khi tăng mật độ nuôi cấy lên 3 cây trong 1 bình kết quả cho thấy các chỉ tiêu thu được có sự giảm dần. Tuy nhiên, sự chênh lệch không đáng kể. Các cây thu được vẫn to khỏe, mập, lá xanh bóng, dày, rễ khỏe. Sự chênh lệch không nhiều về các chỉ tiêu giữa hai nghiệm thức R 1 và R2 cho thấy mặc dù mật độ nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tuy nhiên trong một giới hạn nhất định nào đó, sự thay đổi mật độ nuôi cấy vẫn chưa ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng của cây con, vì vậy kích thước 58 của các cây con thu được ở 2 nghiệm thức R 1 và R2 chưa có sự khác nhau nhiều. Ở nghiệm thức R3 các chỉ tiêu thu được thấp nhất. Cây vẫn chắc, nhưng rễ hơi héo, có nhiều sắc tố màu tím ở mép lá và mặt dưới lá. Ở nghiệm thức này cây con sinh trưởng kém nhất, do mật độ cây cao nên xảy ra hiện tượng cạnh tranh về dinh dưỡng, ánh sáng, khoảng không gian trong bình nuôi cấy, các cây mọc chen chúc nên có sự ức chế sinh trưởng lẫn nhau, thường thì các cây ở gần thành bình phát triển mạnh hơn do chúng nhận được nhiều ánh sáng chiếu tới hơn, còn các cây phía trong bị che bóng nhiều nên sinh trưởng kém hơn, dẫn đến kích thước cây không đồng đều. Như vậy, ở mật độ cấy chuyền quá cao hoặc quá thấp đều không mang lại hiêu quả kinh tế. Ở nghiệm thức R 1 cho cây con thu được tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu, nhưng lại tốn kém chi phí về nhân công cấy chuyền, chi phí bình, môi trường nuôi cấy và diện tích phòng, dàn nuôi cây. Còn ở nghiệm thức R3 mặc dù tiết kiệm được về mặt chi phí nhân công, môi trường nuôi cấy, diện tích nhưng cây con sinh trưởng kém và không đồng đều nhau. Trong khi đó, ở