Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng gà kháng đặc hiệu F4 PILI của Escherichia coli để phòng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa

n đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu và kết quả thể hiện trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai sử dụng để bảo vệ bất cứ học vị nào. Tơi cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Thắm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..ii LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành luận văn tốt nghiệp này ngồi sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tơi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Nhân dịp này cho phép tơi được bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam, TS. Nguyễn Viết Khơng đã cung cấp những kiến thức chuyên mơn bổ ích và dẫn dắt tơi trong suốt thời gian nghiên cứu và viết luận văn. Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ, nhân viên - Bộ mơn Hố Sinh, Miễn dịch, Bệnh lý, Viện Thú y đã tạo điều kiện, chỉ bảo và giúp đỡ tơi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại bộ mơn. Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ trong bộ mơn Bệnh lý, Khoa Thú Y- Trường ðại học Nơng Nghiệp Hà Nội - đã dạy dỗ, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt thời gian qua. Tơi xin cảm ơn tới cán bộ, cơng nhân viên trong trại lợn Cầu Diễn đã hết sức nhiệt tình giúp đỡ tơi trong thời gian thực hiện thí nghiệm tại trại. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi hồn thành luận văn này. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Thắm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ tắt và ký hiệu v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii 1. MỞ ðẦU 1 2. TỔNG QUAN 3 2.1. Vi khuẩn E.coli 3 2.1.1. ðặc điểm hình thái 3 2.1.2. ðặc tính nuơi cấy, sinh hĩa 4 2.1.3. Kháng nguyên và type huyết thanh 5 2.2. Yếu tố độc lực 8 2.2.1. Yếu tố gây bệnh của ETEC 8 2.2.2. Yếu tố bám dính (Adhesion) 9 2.2.3. ðộc tố đường ruột 10 2.2.4. Yếu tố độc lực khác 12 2.3. Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ 14 2.4. Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa 15 2.4.1. Các chủng gây bệnh 15 2.4.2. Yếu tố độc lực 15 2.4.3. Sinh bệnh học 16 2.4.4. Triệu chứng 16 2.4.5. Bệnh tích 17 2.4.6. Chẩn đốn 17 2.5. Bệnh phù đầu ở lợn con 18 2.6. Nhữngnghiên cứu về chế phẩm phịng và điều trị E.coli 19 2.6.1. Văc xin phịng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli 19 2.6.2. Chế phẩm lịng đỏ trứng trong phịngtrị lợn con tiêu chảy 19 2.7. Nghiên cứu trong nước về phịng trị bệnh do E.coli ở lợn 20 2.7.1. Văc xin 20 2.7.2. Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế 21 2.7.3. Kháng thể lịng đỏ trứng 22 3. PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. ðối tượng và nội dung nghiên cứu. 23 3.2. ðịa điểm và thời gian nghiên cứu 23 3.3. Nguyên vật liệu 24 3.3.1. ðộng vật thí nghiệm và sinh phẩm. 24 3.3.2. Mơi trường, hĩa chất 24 3.3.3. Máy mĩc, trang thiết bị 25 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..iv 3.4. Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E.coli 26 3.4.2. Phương pháp PCR xác định chủng F4 E.coli 27 3.4.3. Phương pháp gây miễn dịch cho gà 29 3.4.4. Chế tạo bột kháng thể lịng đỏ bằng cơng nghệ phun sấy khơ 31 3.4.5. Phương pháp phối trộn chế phẩm kháng thể lịng đỏ trứng 32 3.4.6. Phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA) 32 3.4.7. Bố trí thí nghiệm phân tích kháng thể F4 pili ở lợn con 37 3.4.8. Bố trí thí nghiệm phân tích kháng thể F4 pili ở gà miễn dịch 38 3.4.9. Phương pháp xác định liều điều trị 41 3.4.10. Phương pháp điều trị và theo dõi lợn điều trị 42 4. PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể lịng đỏ trứng kháng F4-Pili 44 4.1.1. Kết quả gây miễn dịch cho gà, thu thập mẫu huyết thanh và trứng 44 4.1.2. ðáp ứng miễn dịch ở gà gây miễn dịch bằng 3 quy trình khác nhau 46 4.1.3. Tương quan hiệu giá kháng thể kháng pili ở huyết thanh và trứng 47 4.1.4. Biến động kháng thể ở huyết thanh và lịng đỏ trứng gà lơ 2 và 3 48 4.2. Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lịng đỏ trứng 50 4.2.1. Chế tạo bột trứng phun sấy khơ 50 4.2.2. Phối chế chế phẩm bột lịng đỏ trứng KT04 50 4.3. Kết quả xác định liều điều trị 53 4.3.1. Xác định lợn con tiêu chảy do E.coli F4 53 4.3.2. Kết quả xác định biến động hiệu giá kháng thể ở lợn con 54 4.3.3. Kết quả xác định liều điều trị lành bệnh 50% 56 4.3.4. Kết quả xác định liều điều trị 57 4.3.5. Kết quả kiểm chứng liều điều trị 58 4.3.6. ðánh giá ảnh hưởng của chế phẩm đến tăng trọng 59 4.4. Kết quả ứng dụng chế phẩm trong phịng trị lợn con tiêu chảy 60 4.4.1. Kết quả điều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa 60 4.4.2. ðiều trị dự phịng 61 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 63 5.1. Kết luận 63 5.2. Kiến nghị 63 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 6.1. Tiếng Việt 64 6.2. Tiếng Anh 67 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..v DANH MỤC CÁC CHỮ TẮT VÀ KÝ HIỆU Ab Antibody BHI Brain Heart Infusion bp Base Pair CFU Colony Forrming Unit E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunsorbent Assay EPEC Enteropathogenic Escherichia Coli ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli kDal Kilo Dalton kg Kilogram µm Micro mét nm Nano mét OC ðộ C OD Optical Density (Mật độ quang học) OPD Ortho-phenylenediamin PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction TBE Trisbase- Boric acid- EDTA VTEC Verotoxigenic Escherichia Coli Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Bảng 03-01. Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene 28 Bảng 03-02. Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 03-03. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 29 Bảng 03-04. Thành phần các ống nhũ kháng nguyên 30 Bảng 03-05. Liều kháng nguyên tiêm (mg F4 pili) theo quy trình 30 Bảng 03-06. Thành phần và các bước thực hiện Ab-ELISA 35 Bảng 03-07. Sơ đồ ELISA phát hiện kháng thể F4 ở huyết thanh lợn con 38 Bảng 03-09. Sơ đồ ELISA xác định độ chuẩn kháng thể F4 ở huyết thanh và lịng đỏ trứng (so sánh các quy trình) 39 Bảng 03-10. Sơ đồ ELISA xác định độ chuẩn kháng thể F4 ở huyết thanh và lịng đỏ trứng 40 Bảng 03-11. Thí nghiệm xác định liều điều trị 50% lợn con tiêu chảy 44 Bảng 04-01. Thu thập mẫu huyết thanh gà miễn dịch và trứng gà 44 Bảng 04-02. Dương tính Ab-ELISA với F4-pili ở lợn con 55 Bảng 04-03. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 điều trị lợn con tiêu chảy 56 Bảng 04-04. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 liều cao điều trị lợn con tiêu chảy 57 Bảng 04-05. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 theo liều ở 3 lơ thử nghiệm 58 Bảng 04-06. Kết quả theo dõi trọng lượng lợn điều trị bằng KT04 59 Bảng 04-07. Kết quả theo dõi điều trị lợn con tiêu chảy bằng KT04 60 Bảng 04-08. Kết quả theo dõi điều trị dự phịng lợn con tiêu chảy 62 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang Hình 03-01. Sơ đồ phân lập và giám định vi khuẩn E.coli 27 Hình 04-01. Kết quả ELISA của gà được gây miễn dịch bằng 3 quy trình 46 Hình 04-02. Kết quả chuẩn độ huyết thanh và trứng các lơ gà thí nghiệm 47 Hình 04-03. Biến động hiệu giá kháng thể ở huyết thanh và lịng đỏ trứng gà được gây miễn dịch bằng quy trình 02. 49 Hình 04-04. Kết quả chuẩn độ lịng đỏ trứng sau sấy khơ và chế phẩm 51 Hình 04-05. Kết quả chuẩn độ kháng thể ở chế phẩm KT04 52 Hình 04-06. Kết quả PCR xác định các yếu tố độc lực của F4 E.coli. 54 Hình 04-07. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học pili F4 ở lợn con 55 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..1 1. MỞ ðẦU Theo thống kê của Tổ chức Nơng lương Thế giới (FAO), Việt Nam là quốc gia cĩ số đầu lợn nhiều nhất ở khu vực ðơng Nam châu Á với tổng đàn lợn là 26,9 triệu năm 2006. Trong những năm gần đây, ngành chăn nuơi lợn Việt Nam phát triển mạnh mẽ, dự kiến tổng đàn đạt 35 triệu con vào năm 2020 (Cục Chăn nuơi), đĩng gĩp 42% tỷ trọng chăn nuơi trong nơng nghiệp. Tiêu chảy lợn con là hội chứng đa nguyên nhân như thức ăn kém chất lượng, ngoại cảnh thay đổi, và các vi sinh vật gây bệnh. Các loại vi khuẩn chủ yếu gây tiêu chảy ở lợn con bao gồm: Escherichia Coli (E.coli), Salmonella và Clostridium perfringens, trong đĩ E.coli là phổ biến nhất. Bệnh tiêu chảy do E.coli đã cĩ từ lâu và hiện vẫn là bệnh phổ biến gây chết lợn con và làm giảm tăng trọng, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuơi lợn. Vi khuẩn E.coli gây bệnh chủ yếu ở lợn con ngay sau cai sữa, thời điểm kháng thể thụ động cịn lại ở mức rất thấp và chưa cĩ kháng thể chủ động tuy lợn con đã tiếp xúc với mầm bệnh. E.coli gây bệnh cĩ 2 yếu tố độc lực quan trọng là yếu tố bám dính ở đầu pili và độc tố; yếu tố bám dính giúp căn bệnh bám vào thụ thể ở niêm mạc đường ruột, vi khuẩn tăng sinh và sản sinh độc tố gây bệnh. Cĩ 2 thể bệnh E.coli chính ở lợn, (1) bệnh phù đầu do các E.coli cĩ pili F18, sản sinh độc tố vero (VT) gây bệnh phù đầu, và (2) Bệnh tiêu chảy do các E.coli cĩ kháng nguyên bám dính pili F4, sản sinh các độc tố đường ruột chịu nhiệt (ST) và khơng chịu nhiệt (LT) gây tiêu chảy ở lợn con ngay sau cai sữa. Các chủng E.coli F5, F6 và F18cd đơi khi cũng gây bệnh đường ruột ở lợn con. Mỗi tế bào E.coli được phủ bởi lớp lơng khoảng 3.000 đơn vị pili, chúng thường xuyên thải pili ở nguyên dạng, cĩ đủ kháng nguyên tính gây miễn dịch Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..2 ở lợn. Vắc xin vơ hoạt khơng cĩ tác dụng do vi khuẩn chết khơng thải pili. Trong phịng thí nghiệm, cĩ thể chiết tách pili bằng cách làm lỏng kết cấu màng của vi khuẩn như làm giảm áp lực thẩm thấu, shock nhiệt. Gây miễn dịch cho gà, chế tạo kháng thể lịng đỏ trứng đã trở thành một phương pháp phổ biến chế tạo sinh phẩm điều trị (kháng thể dị lồi). Các sinh phẩm kháng thể lịng đỏ trứng dùng trong điều trị lợn con tiêu chảy ở Việt Nam hiện nay (nội địa và ngoại nhập) cĩ tỷ lệ kháng thể đặc hiệu kháng pili thấp do nguồn kháng nguyên gây miễn dịch là tồn khuẩn. Gây miễn dịch gà bằng pili tinh chế từ chủng E.coli gây bệnh ở Việt Nam sẽ cĩ 2 ưu thế: (1) nâng cao tỷ lệ kháng thể đặc hiệu kháng pili và (2) sự phù hợp chủng gây bệnh hiện đang lưu hành (vốn khơng biết ở sản phẩm nhập ngoại). Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn của sản xuất, cập nhật các cơng nghệ tiên tiến, nhằm sản xuất chế phẩm sinh học phù hợp nhất trong phịng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn con do E.coli, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chế tạo kháng thể lịng đỏ trứng gà kháng đặc hiệu F4 pili của Escherichia coli để phịng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa” Mục tiêu của đề tài là: Sản xuất được kháng thể khác lồi sử dụng kháng nguyên F4 pili của E.coli, ứng dụng trong điều trị và điều trị dự phịng bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn con sau cai sữa. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..3 2. TỔNG QUAN 2.1. Vi khuẩn E.coli Vi khuẩn Escherichia coli lần đầu tiên được Theodor Escherich - bác sĩ nhi khoa người ðức (1857-1911) phân lập và mơ tả vào năm 1885 từ phân trẻ em với tên gọi Bacterium coli commune, một loại vi khuẩn vơ hại sống trong ruột già người và động vật [28], 4 năm sau vi khuẩn này được đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người phát hiện. Lịch sử bệnh đã trải qua nhiều tên gọi khác nhau, nhưng từ 1991, Hội đồng Danh pháp Quốc tế đã thống nhất gọi tên vi khuẩn này là Escherichia coli (E.coli). Trong điều kiện bình thường E.coli chỉ khu trú ở trực tràng, ít khi cĩ trong dạ dày hay ruột non, khi điều kiện ngoại cảnh bất lợi, sức đề kháng của con vật giảm, E.coli bội nhiễm và gây bệnh [29]. Từ phát hiện đầu tiên năm 1955 của Schoield và Davis về E.coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con, càng ngày người ta càng thấy vai trị quan trọng của E.coli trong ngành chăn nuơi lợn [33]. 2.1.1. ðặc điểm hình thái E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu trịn, kích thước 2-3 x 0,4-0,6 µm. Vi khuẩn bắt màu Gram âm, thường thẫm ở hai đầu, ở giữa bắt màu nhạt, khơng hình thành bào tử. Trong cơ thể cĩ hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đơi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E.coli di động do cĩ lơng xung quanh thân, một số chủng khơng di động. E.coli cĩ sức đề kháng kém với nhiệt độ, vi khuẩn bị diệt ở 55OC trong vịng 1 giờ, 60OC trong vịng 15-30 phút, đun sơi 100OC chết ngay. Ở mơi trường bên ngồi, các chủng E.coli cĩ thể tồn tại được đến 4 tháng. Các hố chất sát trùng thơng thường: Acid Phenic, Formol, Hydroperoxit 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..4 2.1.2. ðặc tính nuơi cấy, sinh hĩa E.coli là trực khuẩn hiếu-yếm khí tuỳ tiện, dễ dàng trên mơi trường nuơi cấy thơng thường. Vi khuẩn cĩ thể phát triển ở nhiệt độ 5-40OC, thích hợp nhất là 37OC, và ở pH từ 5,5-8,0, pH thích hợp nhất là 7,2-7,4. Sau 24 giờ nuơi cấy ở 37 OC, E.coli phát triển ở các mơi trường thơng thường với các đặc điểm như sau: - Mơi trường nước thịt: Phát triển tốt, đục, cĩ cặn màu tro nhạt, đơi khi cĩ màu xám nhạt trên mặt mơi trường, mơi trường cĩ mùi thối. - Mơi trường thạch thường: Khuẩn lạc đường kính 2-3 mm, trịn, hơi lồi, ướt, bĩng láng khơng trong suốt, màu tro nhạt. Khuẩn lạc E.coli to hơn nhưng khơng trắng bằng khuẩn lạc của Salmonella. - Mơi trường thạch máu: khuẩn lạc màu sáng, cĩ thể gây dung huyết. - Mơi trường MacConkey: Khuẩn lạc màu đỏ cánh sen. - Mơi trường Endo: Khuẩn lạc màu ánh kim. - Mơi trường thạch Brilliant Green: Khuẩn lạc màu vàng chanh. - Mơi trường Eosin Methyl Blue: Khuẩn lạc màu tím đen. ðặc tính sinh hĩa: E.coli trong phân thường được phân lập trên mơi trường MacConkey hoặc thạch Eosin Methyl Blue ở 370C trong điều kiện hiếu khí, mơi trường chọn lọc những chủng thuộc họ Enterobacteriaceae. E.coli được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh hố trên mơi trường 3 ống nghiệm sau 24 giờ nuơi cấy ở 37OC: Mơi trường KIA (Kligler Iron Agar) cho phép đọc 4 tính chất: - Khả năng lên men đường Glucose (+), làm phần thạch đứng chuyển từ màu hồng sang màu vàng, - Khả năng lên men đường Lactose (+), làm phần thạch nghiêng chuyển từ màu hồng sang màu vàng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..5 - Khả năng sinh hơi (+), làm phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong hoặc cĩ thể đẩy tồn bộ khối thạch lên cao và ở dưới là hơi, - Khả năng sinh H2S (-): Vi khuẩn E.coli khơng cĩ khả năng sinh hơi H2S nên phần thạch đứng khơng cĩ màu đen. Mơi trường Mannitol-Mobility cho phép đọc 2 tính chất: - Khả năng lên men đường Mannite (+), làm mơi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng. - Khả năng di động (+), làm đục đều mơi trường (chủng khơng cĩ khả năng di động chỉ cĩ một đường cấy vi khuẩn, tồn bộ mơi trường vẫn trong). Mơi trường Urea-Indol cho phép đọc 2 tính chất: - Khả năng sinh ureaza (-): Vi khuẩn E.coli khơng cĩ khả năng sinh ureaza nên khơng làm biến đổi màu mơi trường. - Khả năng sinh Indol (+), tạo thành một vịng màu đỏ thẫm khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào canh khuẩn. 2.1.3. Kháng nguyên và type huyết thanh Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli rất phức tạp. Kaufman (1994) đã dựa vào kháng thể đặc hiệu (hay type huyết thanh) phân ra các loại kháng nguyên như kháng nguyên O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên K (capsular) mà nay đổi tên là kháng nguyên F (Fimbriae) hay kháng nguyên pili. Cho đến nay, bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm được 250 quyết định kháng nguyên O, 56 quyết định kháng nguyên H và 89 quyết định kháng nguyên F. Kháng nguyên O (Somatic, kháng nguyên thân) [34, 41] được cấu thành bởi các Lipopolysaccharide nằm ở lớp ngồi cùng màng tế bào vi khuẩn. Lớp Polysaccharide ngồi cùng cĩ tính đặc trưng về serotype; lớp Polysaccharide bên trong, khơng mang kháng nguyên đặc trưng nhưng khi thay đổi làm cho Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..6 độc lực vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc thay đổi (dạng S sang dạng R). Kháng nguyên O chịu nhiệt, bền với cồn và axit. Kháng nguyên O thường được dùng để xác định serotype của vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngưng kết. Hiện cĩ trên 250 serotype O. Kháng nguyên H (flagella) [54]: Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần của roi vi khuẩn, cĩ bản chất protein, tạo nên khả năng di động của E.coli. Kháng nguyên H kém chịu nhiệt cồn và axit yếu. Các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng nguyên H tương ứng sẽ trở thành khơng di động. Hiện cĩ 56 type kháng nguyên H, được đánh số từ H1 đến H56. Vi khuẩn cĩ kháng nguyên H (cĩ roi) là cĩ khả năng di động, tránh bị tiêu diệt bởi tế bào thực bào và làm tăng tiếp xúc với bề mặt tế bào vật chủ. Kháng nguyên K hay Kapsul được gọi lúc đầu do chúng được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết tồn khuẩn, và giả sử kháng nguyên K là polisaccharide [30]. Sau này khi biết bản chất của kháng nguyên K là protein, do thành phần ở pili bao quanh bề mặt tế bào vi khuẩn quyết định, người ta đổi tên thành kháng nguyên F (Fimbriae hay kháng nguyên Pili). Thơng thường các kháng nguyên K ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn với kháng huyết thanh O. Khi gia nhiệt, kháng nguyên K bị biến tính và mất tác dụng ngăn cản này. Kháng nguyên K được chia thành 3 loại chính tùy vào khả năng chịu nhiệt: L (biến tính ở 100oC sau 1 giờ), B (100OC trong 1 giờ nhưng vẫn giữ được khả năng ngưng kết), và A (121OC sau 2,5 giờ, khơng bị mất tính kháng nguyên, vẫn giữ nguyên khả năng ngưng kết) [51]. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, yếu tố bám dính của các E.coli là các sợi bám dính pili (fimbriae) bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ. Sợi bám dính cĩ tính kháng nguyên, gọi là kháng nguyên bám dính hay kháng nguyên F. Các kháng nguyên F cĩ bản chất là protein, dài khoảng 0,5-3 µm, đường kính 2,1- 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Kháng nguyên pili giúp vi khuẩn bám dính Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..7 vào thụ thể đặc hiệu (receptor) trên tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn. Kháng nguyên pili cĩ thể được phân loại dựa theo sự khác biệt về hình thể, hố học, chức năng và đặc tính kháng nguyên (serotype F). Các chủng Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sinh độc tố đường ruột phân lập từ lợn mắc tiêu chảy cĩ mang các kháng nguyên F4 (K88), F5 (K99), F41, F6 (987P) và F18 [64]. Kháng nguyên bám dính F4 (K88) [51]: K88 là loại kháng nguyên khơng chịu nhiệt và bị phá huỷ ở nhiệt độ cao. Nhưng ngược lại, ở nhiệt độ thấp (≤18oC) K88 cũng khơng được sản sinh [7]. F4 là một protein dạng sợi, bao gồm một tiểu đơn vị chính (FaeG), và nhiều tiểu đơn vị phụ (FaeF, FaeH, FaeC, và cĩ thể FaeI). Cấu tạo của F4 gồm 2 phần, phần khơng thay đổi và phần thay đổi (khác nhau giữa các chủng). Phần khơng thay đổi của các chủng F4 là giống nhau (kháng nguyên tính F4a); phần thay đổi chia thành 3 nhĩm chính tuỳ thuộc vào tính ngưng kết đặc hiệu: “b,c” (do Orskov và cs phân biệt năm 1964) và loại thứ 3 “d” do Guinee và Jansen phân loại năm 1979. Như vậy, hiện cĩ 3 phân type F4 chính F4ab, F4ac, F4ad (3 serotype). Kháng nguyên F5 (K99): F5 Protein được cấu tạo từ các tiểu đơn vị 18.500 kDa cĩ điểm đẳng điện 9,5 [31], gene F5 nằm trên Plasmid [26]. Kháng nguyên F5 là một yếu tố gây bệnh phổ biến, hay gặp ở các chủng ETEC gây tiêu chảy cho bê, nghé, dê, cừu non, đơi khi ở lợn [48]. Kháng nguyên F6 (987P): Yếu tố bám dính của các F6 ETEC [59] gắn vào thụ thể glycoprotein [43] ở tế bào thành ruột. F6 cĩ cấu trúc chuỗi xoắn được tạo thành từ 3 tiểu protein, một tiểu đơn vị FasA ở đỉnh nối với các tiểu đơn vị của FasF và FasG làm thành sợi pili. Kháng nguyên F41: Giống như kháng nguyên bám dính F5 nhưng cĩ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..8 trọng lượng phân tử lớn hơn. Gene mã hĩa cho F41 nằm ở Genome. Kháng nguyên bám dính F18: Trước kia gọi là F107 bao gồm 2 biến thể F18ab và F18ac. Những chủng mang yếu tố bám dính F18ab thường sản xuất độc tố VT2e và gây bệnh phù đầu, F18ac thường sản xuất độc tố đường ruột và gây bệnh tiêu chảy. Giữa F18ab và F18ac cĩ miễn dịch bảo hộ chéo. Những dịng E.coli cĩ mang yếu tố F18 bám lên tế bào biểu mơ ruột ở lợn con sau cai sữa, nhưng lại khơng thể bám lên tế bào biểu mơ ruột ở lợn con sơ sinh do lợn sơ sinh chưa cĩ các receptor của F18ab và F18ac; cĩ thể đây là lý do vì sao chỉ thấy các chủng Verotoxigenic Escherichia Coli (VTEC) và ETEC ở lợn cai sữa. 2.2. Yếu tố độc lực 2.2.1. Yếu tố gây bệnh của ETEC Các chủng vi khuẩn thuộc nhĩm Enterotoxigenic E.coli (ETEC) tham gia vào quá trình gây bệnh nhờ hai đặc tính chủ yếu: (1) Khả năng bám dính vào các tế bào biểu mơ ruột nhờ các yếu tố bám dính ở bề mặt vi khuẩn (Fimbriae) như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41, F17 và F18ac; và (2) Khả năng sản sinh một hoặc nhiều loại độc tố đường ruột, bao gồm độc tố khơng chịu nhiệt (LTI và LTII) và độc tố chịu nhiệt (STI và STII) [36]. Vì vậy, để xác định một chủng vi khuẩn E.coli cĩ độc lực và cĩ trong quá trình gây bệnh tiêu chảy của lợn, vấn đề cần thiết là phải xác định được chúng cĩ mang cả hai yếu tố gây bệnh trên. Bám dính là quá trình kết hợp giữa cấu trúc tương đồng của các kháng nguyên bề mặt vi khuẩn với các điểm nhận trên tế bào. Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hố học, vừa mang tính chất sinh học và được thực hiện theo 3 bước: + Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, quá trình này địi hỏi vi khuẩn phải cĩ khả năng di động. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..9 + Bước 2: Quá trình hấp phụ: phụ thuộc đặc tính của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính, tương tác bám dính là phản ứng thuận nghịch. + Bước 3: Là quá trình tác động: ảnh hưởng tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn tại các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào vật chủ. Hai quá trình trước thực hiện nhờ các tác động vật lí và hố học, quá trình thứ 3 được liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính (pili) với receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mơ. 2.2.2. Yếu tố bám dính (Adhesion) ðây là yếu tố cĩ vai trị đặc biệt quan trọng giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh [59], là tiêu chuẩn để phân biệt vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn thường trực đường tiêu hố khơng gây bệnh [21]. Nhờ cĩ yếu tố bám dính, E.coli cố định được vào các tế bào biểu mơ của niêm mạc ruột, khơng bị rửa trơi theo phân. Các chủng ETEC sản sinh K88 là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa và lợn con theo mẹ [7]. Tỷ lệ ngưng kết kháng nguyên K88 của các chủng E.coli phân lập từ lợn con tiêu chảy cĩ thể đến 93,33%, cao hơn chủng từ lợn con khơng tiêu chảy (33,33%) [17]. Các thụ thể bcd tương ứng cho các F4 pili là tập hợp các glycoprotein cĩ khối lượng phân tử từ 45- 70 kDa, thụ thể bc là sự kết hợp của 2 glycoprotein với khối lượng phân tử tương ứng là 210 và 240 kDa, thụ thể b là một glycoprotein cĩ khối lượng phân tử là 74 kDa, và thụ thể d là glycophingolipid, vẫn chưa biết khối lượng phân tử [63]. Kháng nguyên K88 đảm nhiệm chức năng bám dính của vi khuẩn vào phần trên của ruột non. Trong phịng thí nghiệm cĩ thể lựa chọn khả năng bám dính cao dựa vào test kháng nguyên bám tế bào nhung mao ruột lợn và tế bào phơi gà [22]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..10 2.2.3. ðộc tố đường ruột ðộc tố đường ruột: Cĩ hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin được tìm thấy ở các vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy, khác nhau ở khả năng chịu nhiệt: ðộc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin – ST) khơng bị biến tính ở nhiệt độ 100OC trong 15 phút, độc tố khơng chịu nhiệt (Heat Labile Toxin – LT) bị vơ hoạt ở 60OC trong 15 phút. Gene mã hĩa cho LT và ST nằm trên Plasmid ETEC cĩ thể đồng thời sản sinh 2 loại độc tố hoặc chỉ 1 loại, ở người thường là ST [61]. Nhĩm độc tố đường ruột tác động vào chu trình Adenylat làm thay đổi quy trình trao đổi muối-nước ở ruột gây tiêu chảy. Cả hai loại độc tố này đều khơng gây ra những biến đổi bệnh tích hoặc sự thay đổi về mặt hình thái của lớp niêm mạc ruột non, chỉ cĩ tác động gây ra những biến đổi mạnh, làm gia tăng quá trình thẩm xuất H2O, Na + và Cl-, gây giảm sự hấp thu nước và các chất dinh dưỡng. Kết quả là cơ thể bị mất nước, mất muối NaHCO3, con vật rơi vào tình trạng bị nhiễm độc và suy kiệt. - ðộc tố khơng chịu nhiệt LT: ðộc tố LT của E.coli cĩ bản chất protein [37], cĩ khối lượng phân tử lớn, bị vơ hoạt ở 60OC trong 15 phút [50]. ðộc tố LT chỉ tìm thấy ở các chủng ETEC gây bệnh cho người và lợn nhưng lại khơng phân lập được từ ETEC gây bệnh cho bị [26]. ðộc tố LT, gồm 2 phân lớp LT-I và LT-II, khơng cĩ phản ứng chéo. LT tác động bằng cách kích hoạt enzyme adenylate cyclase gây tăng cường chu trình adenosine monophosphate (cAMP). Sự hoạt động quá ngưỡng của cAMP trong tế bào dẫn đến sự gia tăng thẩm xuất Cl-, Na+, HCO- và nước vào trong lịng ruột. Cơ thể mất nước trầm trọng, các quá trình trao đổi chất bị ngừng trệ, con vật bị trúng độc do acid nội sinh. + LT-I cĩ hai phân lớp LTp (LTp-I) tìm thấy ở E.coli lợn và LTh (LTh-I, người) cĩ quan hệ gần gần gũi và cĩ thể phản ứng chéo [50]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..11 + LT-II: ðược tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên động vật và hiếm khi ở người, LT-II cĩ một số đặc tính sinh học tương tự độc tố CT và LT-I, nhưng khơng bị trung hồ bằng giải độc tố của Vibrio cholerae hoặc LT-I [40]. - ðộc tố chịu nhiệt: ST cĩ trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfit. ST được chia thành 2 nhĩm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hố cho cả 2 nhĩm chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hố ST được tìm thấy trên transposon. STa (hay ST-I) được sản sinh bởi ETEC. Protein STa cĩ khoảng 50% giống với EAST1 của EAEC. Một số chủng ETEC cũng sản sinh độc tố EAST1 ngồi độc tố Sta [56]. Cịn STb chỉ được tìm thấy trong ETEC. STa: là một peptide gồm 18-19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa. STa được chia thành 2 lớp gọi là STp (độc tố ST ở lợn hay STIa) và STh (độc tố ST ở người hay STIb). Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) thuộc họ những enzyme receptor cyclase [62]. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, gia tăng lượng cGMP nội bào [58] kích thích tiết Cl- và/hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột. STb: STb chủ yếu thấy ở các chủng ETEC từ lợn, hiếm thấy ở các chủng ETEC gây bệnh trên người. Tiền STb protein cĩ 71 amino acid, chuyển hố thành protein hồn chỉnh gồm 48 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 5,1 kDa [27]. Trình tự STb khơng tương đồng với trình tự STa, mặc dù nĩ cũng cĩ 4 Cysteine nối với nhau bằng cầu nối disulfit [27]. ðộc tố này bị phá huỷ ở 100OC trong vịng 15 phút. Mặt khác, STb khá mẫn cảm và bị vơ hoạt bởi proteaza hay Trypsin, bị bất hoạt sau 60 phút ở 37OC. Như vậy, cĩ thể sử dụng những enzyme này phá hủy STb để bảo vệ đường tiêu hố [65]. Khơng giống như STa, STb gây ra những tổn thương lớp biểu mơ ruột. STb cĩ thể kết hợp khơng đặc hiệu với màng tế bào chất và đi vào trong tế Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..12 bào. STb khơng kích thích tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3 -) [58]. STb khơng làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nĩ kích thích tăng lượng Calci nội bào từ ngoại bào [32]. STb cũng kích thích giải phĩng PGE2 và serotonin [39]. - Nhĩm độc tố thứ 3, bán chịu nhiệt EST1 (Enteroaggregative partially – heat stable enterotoxin 1) do các E.coli thuộc nhĩm Enteroaggregative (EaggEC) cũng thường gặp trong các trường hợp lợn con tiêu chảy. 2.2.4. Yếu tố độc lực khác Yếu tố kháng khuẩn của E.coli (Colicin V): Các chủng E.coli ở người hoặc động vật thường mang plasmid cĩ gen mã hố Colicin V [60]. Colicin V là một yếu tố cĩ bản chất protein trọng lượng phân tử thấp. ColV plasmid mã hố cho Colicin V, thấy ở nhiều chủng E.coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Colicin V ức chế sự hình thành thể màng. Ngồi ra, ColV plasmid thường kết hợp với quá trình xâm nhập và gây bệnh của E.coli [60]. ðặc biệt, những plasmid này cũng mang các gen cĩ khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào trong vật chủ [66]. Khoảng 78% chủng E.coli gây bệnh bị, gà và cừu sản sinh Colicin V. Nếu như, loại bỏ plasmid colicin V, vi khuẩn giảm độc lực và ngược lại. Một số ColV plasmid làm tăng sức đề kháng của vi khuẩn đối với vật chủ. Cĩ hai yếu tố độc lực đã được xác định cĩ mặt trên ColV plasmid [60]. Một loại làm tăng khả năng kháng cơ chế phịng vệ bằng cách mã hố cho các protein tăng cường khả năng kháng lại cơ chế giải độc của vật chủ, quá trình này được tiến hành gián tiếp thơng qua chất bổ trợ trong huyết thanh. Loại thứ hai là ColV plasmid mã hố cho một hệ thống vận chuyển sắt [66] vì tất cả các sinh vật, để duy trì cuộc sống đều cần phải cĩ sắt. Hầu hết các vi khuẩn phải cĩ khả năng đồng hố được dinh dưỡng, khống từ mơi Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..13 trường mà ở đĩ kim loại thường tồn tại ở dạng keo hydroxit khơng hồ tan hoặc ở dạng phức chất. Do đĩ, để tồn tại được trong mơi trường vật chủ, vi khuẩn mang những plasmid cĩ chứa các gen mã hố cho một hệ thống khử sắt Hydroxamate ái lực cao cĩ khả năng chuyển Fe2+ ở dạng phức transferrin hoặc lactoferrin ở trong vật chủ để thành dạng sắt mà sinh vật dễ dàng hấp thụ để sinh trưởng [66]. Hệ thống vận chuyển sắt ái lực cao và ColV plasmid trong E.coli cĩ mối leein h._.ệ chặt chẽ, đảm bảo sử dụng được nguồn Fe2+ sẵn cĩ trong cơ thể của vật chủ bị nhiễm cho sự tồn tại và phát triển. Các Colicin V tác động đến tế bào mẫn cảm theo cơ chế gây độc: phong tỏa tế bào khơng cho tiếp xúc hoặc thu nhận chất dinh dưỡng, do đĩ vi khuẩn mẫn cảm bị rơi vào trạng thái mất cân bằng trao đổi chất, thối hố và phân rã; Colicin V tự ngấm vào tế bào vi khuẩn “địch thủ” và tác động như những enzyme cắt các acid nucleic nội bào, dẫn tới phá huỷ hồn tồn hệ gen của vi khuẩn; vài loại Colicin V khác tạo ra các kênh vận chuyển ion qua màng tế bào vi khuẩn gây ra sự quá tải về nồng độ, chủng loại ion, làm mất cân bằng hiệu điện thế qua màng, rối loạn trao đổi chất và bị tiêu diệt. Yếu tố kháng kháng sinh: ðể điều trị bệnh đường ruột, người chăn nuơi đã sử dụng nhiều loại kháng sinh, ngồi ra họ cịn trộn kháng sinh vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phịng bệnh do vi khuẩn và kích thích tăng trọng. Vì vậy sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nĩi chung và E.coli nĩi riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm thấp, thậm chí nhiều loại kháng sinh cịn bị kháng hồn tồn. Sử dụng kháng sinh lan tràn là tác nhân gây ra sự chọn lọc và phát triển rộng rãi các chủng kháng kháng sinh vốn cĩ sẵn trong mỗi thế hệ vi khuẩn. Trong mơi trường, các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh khác nhau di chuyển từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác làm tồn tại trên cùng một vi khuẩn nhiều R plasmid tạo thành các chủng kháng nhiều loại kháng sinh [57]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..14 2.3. Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ Lợn con sơ sinh bị tiêu chảy do nhiều nguyên nhân, trong đĩ cĩ E.coli. Bệnh thường xảy ra ổ lợn của nái đẻ lứa đầu. Bệnh thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, khí hậu rét, mưa nhiều, độ ẩm cao. Phần lớn các chủng E.coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con mới sinh thuộc thuộc nhĩm ETEC với các serogroup O8, O9, O20, O101, O141, O147, O149 và O157, trong đĩ serogroup O149 là phổ biến nhất [49]. Các ETEC mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính như F4, F5, F6, F18, F41 và cĩ khả năng sản sinh độc tố đường ruột ST và LT. Triệu chứng: Bệnh xảy ra rất nhanh thường 12 giờ sau khi sinh, thậm chí chỉ sau 2 giờ sau khi sinh. Lợn sơ sinh chết ngay sau khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy, tỷ lệ chết trong đàn cĩ thể lên tới 70%, chủ yếu dưới 4 ngày tuổi. Nền chuồng cĩ phân màu trắng, lợn con tụm vào một gĩc chuồng. Lợn con xù lơng, gầy cịm, suy nhược, yếu ớt, các đầu xương nhơ ra, mắt trũng sâu. Chuyển biến từ cịn bú sang bỏ bú; phân từ màu sáng sang màu trắng hoặc xám, lúc đầu thành bãi, về sau phân tự do chảy, lợn bê bết phân. Một số trường hợp lợn cĩ triệu chứng nơn mửa. Trọng lượng cơ thể lợn giảm sút nhanh 30- 40%, cơ vùng bụng run rẩy, nhão, khơng cịn trương lực. Bệnh tích: Xác chết gầy, phần thân sau bê bết phân; tồn bộ đường tiêu hố xuất huyết, các xuất huyết điểm ở ruột non và thành dạ dày. Dạ dày giãn rộng, chứa đầy sữa đơng vĩn khơng tiêu. Ruột non căng phồng chứa đầy hơi, thành ruột cĩ những đám xuất huyết, chất chứa lẫn máu, niêm mạc ruột non bong trĩc, thành ruột mỏng. Hệ thống lâm ba ruột tụ huyết. Các cơ quan nội tạng khác như tim, gan, thận, phổi ít biến đổi. Chẩn đốn: Chẩn đốn phân biệt dựa vào triệu chứng của bệnh tiêu chảy do E.coli gặp nhiều khĩ khăn do biểu hiện lâm sàng của bệnh rất giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do virus. Tuy nhiên cĩ thể dựa vào đặc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..15 điểm phát bệnh để phân biệt: Bệnh colibacillosis thường xảy ra sớm hơn (2- 12 giờ), bệnh do virus TGE (Transmission GastroEnteroritis) thường xuất hiện muộn hơn (72 giờ). Tỷ lệ chết do colibacillosis khoảng 5-70%, trong khi đĩ tỷ lệ chết do TGE xấp xỉ 100%. Chẩn đốn phịng thí nghiệm: Thường phải phân lập căn bệnh trên các mơi trường đặc hiệu, xác định các yếu tố độc lực bằng PCR và type kháng nguyên O và F bằng ngưng kết và ELISA. 2.4. Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa Bệnh thường xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhưng tỷ lệ mắc bệnh, mức độ trầm trọng và tỷ lệ chết cao tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa 1 tháng. ðặc điểm: Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa 3-10 ngày với triệu chứng tiêu chảy, đơi khi cĩ lợn chết đột ngột ở ngày thứ 4 - 5 sau cai sữa. Bệnh lây lan trong đàn rất nhanh, trong vịng 1-3 ngày tỷ lệ ốm cĩ thể lên tới 80-90%. Ở trại chăn nuơi tập trung, trong thời gian ngắn bệnh sẽ lây sang các đàn khác. Bệnh cũng cĩ thể tồn tại trong đàn bị nhiễm hàng tuần hoặc tháng. 2.4.1. Các chủng gây bệnh Các chủng E.coli thuộc nhĩm ETEC là nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Ngồi nhĩm ETEC, các chủng E.coli thuộc nhĩm VTEC, EPEC và gần đây nhĩm EaggEC (Enteroaggrigative E.coli) cũng thường xuyên phân lập được từ lợn con bị bệnh tiêu chảy [69]. 2.4.2. Yếu tố độc lực Những chủng này thường mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính F4, F5, F6 và F41 và cĩ thể sản sinh độc tố đường ruột như Sta, STb, LT1, LT2 và ST1, EAST1 [STb (77.6%), EAST1 (65.8%), LT (61.6%), STa (26.5%) and VT2e (16.4%) [35]]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..16 Ở lợn con sau cai sữa các chủng E.coli thuộc nhĩm ETEC là nguyên nhân chính gây bệnh Colibacillosis [49]. Các chủng F4 E.coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy (44,7%), tuy nhiên cũng thường gặp F18 (39,3), đơi khi Intimin (1,4%), và F6 (0,9%) và F5, F41 [35, 53]. ða số các chủng E.coli thuộc nhĩm ETEC gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa thuộc một số serotype đặc trưng như O149, O138, O139, O141, O147 và O8, trong đĩ các chủng thuộc tổ hợp O 149:K91:K88 (F4) là phổ biến [38]. 2.4.3. Sinh bệnh học Các Receptor của kháng nguyên bám dính của E.coli thuộc nhĩm ETEC gây bệnh tiêu chảy sau cai sữa: Các receptor của F4 xuất hiện nhiều ở niêm mạc ruột của lợn con sơ sinh và cĩ xu hướng giảm nhẹ ở lợn con sau cai sữa. Ngoại cảnh: Cĩ rất nhiều yếu tố liên quan đến quá trình gây bệnh của vi khuẩn E.coli ở lợn sau cai sữa như: lợn con bị stress khi tách mẹ, nhập chung với đàn khác, thay đổi thức ăn, mất nguồn kháng thể bị động truyền qua sữa mẹ, chuồng ẩm. Cơ thể lợn: pH trong đường ruột của lợn sau cai sữa cao hơn so với trước cai sữa, yếu tố này rất quan trọng bởi vì các chủng E.coli dung huyết thuộc serotype O149, K88 từ phần cuối của hệ thống tiêu hố chuyển đến cư trú ở phần trước của ruột non. Số lượng của các chủng E.coli gây dung huyết ở phần trung tâm của ruột chạy cĩ thể nhiều 103 đến 105 lần ở lợn con bị nhiễm bệnh Colibacillosis so với lợn khoẻ mạnh ở cùng lứa tuổi. Miễn dịch ở lợn cai sữa: Lợn con sau cai sữa là mất đi nguồn miễn dịch thụ động qua sữa mẹ. Ở giai đoạn sau cai sữa sự bảo hộ qua sữa mẹ mất đi, lợn con chưa cĩ khả năng tự sản sinh kháng thể để phịng bệnh 2.4.4. Triệu chứng Ngay sau khi cai sữa 3-4 ngày, lợn cĩ hiện tượng giảm cân với tỷ 50- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..17 100%. Trong một số trường hợp khơng cĩ biểu hiện tiêu chảy. Trong đàn cĩ 1 hoặc 2 con lợn chết đột ngột nhưng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Sau đĩ một nhĩm trong đàn cĩ triệu chứng tiêu chảy, lây lan và tỷ lệ ốm chết lên đến 100%. Triệu chứng điển hình là sốt, bỏ ăn, phân lỏng, màu vàng, mùi hơi tanh, đi lại siêu vẹo, co giật, đầu, mặt phù. Xuất hiện những vùng da tím tái ở mũi, chĩp tai và bụng. Một vài lợn cĩ triệu chứng thần kinh, đi vịng trịn theo một chiều nhất định hoặc liệt hai chân sau, vào giai đoạn cuối lợn nằm nghiêng chân bơi chèo, xác gày và bẩn. Trong một đàn, bệnh thường kéo dài 6-7 ngày. Nếu khơng điều trị kịp thời lợn bệnh bị chết sau 5 ngày nhiễm, số cịn lại chậm lớn, cịi cọc. 2.4.5. Bệnh tích Mức độ bệnh tích phụ thuộc nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian kéo dài của bệnh, thường bệnh tích tập trung ở cơ quan tiêu hố và hơ hấp. Nhìn chung xác lợn chết gầy, bẩn; thân bê bết phân; mắt trũng sâu; tím tái ở mũi, tai. Niêm mạc mắt miệng nhợt nhạt; Phổi nhợt nhạt và khơ; cơ tim nhão, mất trương lực; bàng quang xẹp, niêm mạc xuất huyết; gan mất màu, cĩ những nốt hoại tử trên bề mặt. Dạ dày chứa đầy thức ăn. Chất chứa trong các đoạn ruột cĩ trạng thái khác nhau từ nhiều nước đến sền sệt, cĩ mùi đặc trưng. Niêm mạc ruột, dạ dày xuất huyết, nếu tiêu chảy nặng niêm mạc bị bong trĩc. Quan sát bệnh tích vi thể thấy lẫn trong lớp tế bào lơng nhung là vi khuẩn E.coli. Lớp tế bào lơng nhung bị phá huỷ nặng [13]. 2.4.6. Chẩn đốn Chẩn đốn phân biệt: cần phân biệt với bệnh viêm ruột và phĩ thương hàn cũng cĩ triệu chứng tiêu chảy và chết nhưng khơng liên quan đến giai đoạn cai sữa, 2 bệnh này thường gặp ở lợn nhỡ. Lợn con bị bệnh phĩ thương hàn cĩ phân mùi thối khắm, lẫn dịch nhầy, thỉnh thoảng cĩ lẫn máu. Bệnh viêm ruột tiêu chảy thường xảy ra dai dẳng trong đàn, lợn bị bệnh thường sốt cao. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..18 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm: Cách tốt nhất dựa vào yếu tố độc lực và định type kháng nguyên O. Phân lập E.coli từ phân và phủ tạng trên các mơi trường thơng thường. Cĩ thể dùng ELISA, kháng thể huỳnh quang để xác định các kháng nguyên bám dính F4, hoặc PCR xác định gene cho yếu tố bám dính F4 và độc tố đường ruột. 100% chủng E.coli phân lập từ lợn chết cĩ ngưng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết mạnh [13]. 2.5. Bệnh phù đầu ở lợn con Bệnh phù đầu (Oedema disease) ở lợn được Shanks mơ tả lần đầu tiên tại Ireland năm 1938, do các VTEC cĩ kháng nguyên bám dính F18 và độc tố VT2 gây ra. Bệnh thường xảy ra ở lợn sau cai sữa. Bệnh xảy ra lẻ tẻ hoặc ổ dịch nhỏ; bệnh xuất hiện đột ngột, kéo dài trung bình 8 ngày và kết thúc cũng đột ngột. Tỷ lệ bệnh thấp (16%) nhưng tỷ lệ chết cao (64%) [42]. Triệu chứng: Sau 36 giờ ủ bệnh lợn bỏ ăn, sốt, chui rúc một gĩc chuồng, uống nhiều nước, táo bĩn. Sau 48 giờ lợn cĩ biểu hiện khĩ thở, bỏ ăn hồn tồn, uống nhiều nước, mắt hơi phù, vừa tiêu chảy vừa táo bĩn. ðến giờ thứ 52 bắt đầu cĩ lợn co giật và chết. Bệnh tích: Phù dưới da tồn thân; phù mí mắt, trán, đường cong lớn ở dạ dày. Cĩ dịch nhầy ở thanh quản, màng treo ruột, ruột kết giữa, vỏ thận, tràn nước màng tim, màng phổi. Trường hợp mạn tính, khơng thấy phù, nhưng cĩ thể thấy cuống não phồng rộp [5]. Chẩn đốn: Bệnh phù đầu xảy ra ở ổ dịch thường đặc trưng, những trường hợp quá lẻ tẻ hoặc mạn tính thường khĩ chẩn đốn. Quan sát những tổn thương đặc trưng như phù ở mí mắt, mặt trước, sau gốc tai. Xét nghiệm vi khuẩn học: phân lập E.coli gây, xét nghiệm yếu tố bám dính F18ab [tăng cường trên mơi trường đặc hiệu (Iso-Sensitest, Oxoid), 20% CO2]; Xét nghiệm huyết thanh học bằng ngưng kết nhanh với kháng thể đơn dịng, ELISA phát hiện F18ab; thử độc tố trên tế bào Vero. PCR xác định sự cĩ mặt Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..19 của gene mã hĩa F18ab và độc tố Stx2e. Ở Việt Nam: Bệnh phù đầu thường xảy ra ở lợn 45 đến 90 ngày tuổi (sau cai sữa và trước cai sữa muộn), thường gặp ở những con phát triển nhanh nhất trong đàn với triệu chứng sốt, bỏ ăn, phù, co giật điển hình. Bệnh xảy ra quanh năm, cao nhất vào mùa hè. Bệnh lẻ tẻ, rời rạc, khơng lan từ đàn này sang đàn khác. Tỷ lệ lợn bệnh thấp nhưng tỷ lệ chết cao [5]. 2.6. Những nghiên cứu về chế phẩm phịng và điều trị E.coli Tiêu chảy ở lợn con do E.coli khơng phải chỉ là vấn đề của Việt Nam mà là vấn đề nan giải của thế giới. Những nghiên cứu về văc xin và sinh phẩm phịng trị bệnh do E.coli là mối quan tâm của nhiều quốc gia. 2.6.1. Văc xin phịng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli Văc xin phịng bệnh lợn con tiêu chảy nĩi chung ít cĩ hiệu quả. Hiện cĩ một số văc xin dùng cho nái, phịng bệnh cho lợn con. Các văc xin này bao gồm các yếu tố bám dính, phổ biến là F4, F5, F6, F18ab,… và độc tố đường ruột ST hay LT [47, 67]. 2.6.2. Chế phẩm lịng đỏ trứng trong phịng trị lợn con tiêu chảy Hiện nay, trên thế giới đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về sản xuất IgY; Yokoyama và cs (1992) thu hoạch trứng gà tách riêng lịng đỏ sấy khơ thành chế phẩm dạng bột. Trong 10 gam lịng đỏ trứng, sau khi tách riêng protein, lipid và IgY, cĩ thể thu được 15 mg IgY ở độ tinh khiết 93,8% [68]. Kháng thể IgY cĩ bản chất protein, nhưng bền với nhiệt độ và pH. Hoạt tính trung hịa kháng thể kháng E.coli khơng bị ảnh hưởng khi hấp thanh trùng ở 650C, 15 phút. Tại pH 4,0 IgY khơng bị biến tính. Gây miễn dịch cho gà, kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh sau 8 ngày và trong trứng sau 10 ngày, đạt hiệu giá cao nhất ở ngày thứ 15 và 20 ngày sau khi gây miễn dịch lần đầu [52]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..20 Khi bổ sung vào kháng nguyên gây miễn dịch một loại chất bổ trợ, C- phosphate-quanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN), hiệu quả đáp ứng miễn dịch được nâng cao, hiệu quả điều trị của chế phẩm bột lịng đỏ trứng hồn thiện [44]. Cơng nghệ kháng thể dị lồi trong điều trị đã được áp dụng rộng rãi, trên nhiều đối tượng khác nhau. IgY-Hp (kháng thể lịng đỏ trứng kháng Helicobacter pylori) cho uống làm giảm thiểu nhiễm H. pylori. Tương tự, kháng thể lịng đỏ trứng ức chế sự sinh trưởng của Aeromonas hydrophila ở nồng độ 1,0 mg/ml trong thời gian ủ bệnh, giảm 70% tỷ lệ chết [45]. Nhật Bản được coi là một trong những cường quốc kháng thể lịng đỏ trứng, chế phẩm kháng thể lịng đỏ trứng dùng điều trị lợn con tiêu chảy bắt đầu từ năm 1992, với tỷ lệ điều trị khỏi bệnh cao [68]. Akita và cs (1993) đã sử dụng E.coli tồn khuẩn sản xuất kháng thể đặc hiệu lịng đỏ trứng gà dùng trong phịng và trị bệnh tiêu chảy cho lợn con. Marquardt và cs (1999) đã sử dụng kháng thể lịng đỏ trứng gà miễn dịch kháng pili F4 ETEC để điều trị tiêu chảy cho lợn sơ sinh và cai sữa. Kết quả cho thấy lợn uống kháng thể lịng đỏ trứng cĩ khả năng kháng lại sự lây nhiễm ETEC [46]. Chế phẩm lịng đỏ trứng được đánh giá hiệu quả cao trong điều trị (đánh giá thơng qua gây bệnh thực nghiệm). Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và chỉ cĩ 81% lợn bị nhiễm (xác định yếu tố bám dính K88 bằng PCR) [55]. 2.7. Nghiên cứu trong nước về phịng trị bệnh do E.coli ở lợn 2.7.1. Văc xin Nguyễn Thị Nội và cs (1978, 1984, 1986, 1989) đã nghiên cứu sử dụng vắc xin trong phịng bệnh do E.coli, các tác giả đã lựa chọn các serotyp cĩ tần suất cao để chế tạo vắc xin, dựa trên kết quả xác định serotyp O các chủng E.coli gây bệnh phân lập được. Vắc xin tiêm cho nái chửa trước khi đẻ 4-6 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..21 tuần cho kết quả bảo hộ 30-40% so với đối chứng [10-12]. Lê Văn Tạo và cs (1993, 1995) đã chế tạo vắc xin E.coli vơ hoạt từ các chủng gây bệnh tiêu chảy lợn con cĩ mang các yếu tố gây bệnh (Enterotoxin, Hly, ColV, F4, R). Lợn con uống văc xin giảm tỷ lệ bệnh từ 46% xuống cịn 11%, giảm tỷ lệ chết từ 9% cịn 2,2% [20], giảm tỷ lệ lợn con mắc bệnh phân trắng từ 31,0% đến 34,6% và tỷ lệ chết do bệnh này từ 3,6- 6,8% [21]. Văc xin vơ hoạt phịng bệnh phù đầu cũng đã được thử nghiệm, giảm tỷ lệ bệnh 20% ở một số tỉnh ðồng bằng sơng Cửu Long [14], ở Bình ðịnh và Hà Tây [16], ở Bắc Giang [9], bảo hộ 90% lợn khơng mắc bệnh phù đầu. ðể nâng cao hiệu lực của văc xin phịng bệnh do E.coli, văc xin tiểu phần cĩ thể là một trong những hướng ưu tiên. 2.7.2. Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế Trong khi việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuơi vẫn cịn phổ biến, kháng sinh trộn thức ăn là một biện pháp thơng dụng để phịng bệnh, hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng phổ biến [15, 18], việc giảm thiểu sự lạm dụng kháng sinh bắt đầu được cân nhắc [19], các yếu tố liên quan đến cơ chế lan truyền sự kháng thuốc cũng đang được quan tâm [23]. Các thử nghiệm tìm dẫn xuất tự nhiên thay cho kháng sinh và sulfamid là một hướng nghiên cứu ưu tiên, như thử nghiệm sử dụng dịch chiết lá cây xuân hoa (P. palatiferum) điều trị lợn con tiêu chảy [4], sử dụng Becberin (kháng sinh chiết từ cây Hồng Liên) điều trị tiêu chảy ở lợn con tập ăn [6]. Sinh phẩm Bacterin EBC tiêm dưới da liều 3ml/con ở lợn 3 ngày tuổi, khơng cĩ phản ứng phụ [8]. Chế phẩm cao mật lợn, Vitom cho hiệu quả điều trị lành bệnh 75% [25]. Chế phẩm biosubtyl (men tiêu hố sống chứa 105-106 CFU/g Bacillus subtilis) làm giảm 42% tiêu chảy tái phát ở lợn con 1- 60 ngày [3]. Chế phẩm E.coli sữa chế từ các vi khuẩn phân lập từ lợn con tiêu chảy [1], dùng cho lợn mẹ làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 55,5% xuống cịn 28,12% [8]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..22 2.7.3. Kháng thể lịng đỏ trứng Cùng với các biện pháp miễn dịch thụ động, như qua sữa đầu của lợn mẹ, cịn cĩ thể sử dụng 1 lượng thích hợp kháng thể đặc hiệu, khác lồi chống lại các chủng E.coli độc, bổ sung vào thức ăn cho lợn con sẽ cĩ tác dụng khống chế tiêu chảy. Kháng thể dị lồi sản xuất từ gà được gây miễn dịch cung cấp một phương pháp thay thế mới để điều trị các bệnh lây nhiễm. Sinh phẩm lịng đỏ trứng cĩ 3 điểm thuận lợi: (1) do trứng gà là nguồn phong phú, dễ kiếm [24] kháng thể IgY cĩ trong trứng gà cĩ chất lượng cao, số lượng lớn, giá thành rẻ mà khơng phải giết vật thí nghiệm, (2) Ngồi tác dụng đặc hiệu, lịng đỏ trứng cịn cĩ tác dụng bảo vệ niêm mạc đường tiêu hố của gia súc non (3) Kháng thể phi đặc hiệu cịn cĩ tác dụng trung hồ độc tố và láng một lớp vỏ vật lý bảo vệ màng nhầy của ruột non [24], ngăn cản quá trình độc tố đường ruột bám màng nhầy ruột non [52]. Các cơng ty thuốc thú y trong nước cũng bắt đầu sản xuất chế phẩm lịng đỏ trứng áp dụng trong điều trị bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli. Cơng ty Hanvet chế tạo thành cơng kháng thể KTE kháng 11 chủng E.coli độc. Chế phẩm bột kháng thể YP-99, kháng các chủng E.coli cùng nguồn với E.Rnl, E.Rn2 và E.Ma (mang yếu tố bám dính F5 và F6, vơ hoạt bằng formol) cĩ tác dụng điều trị lành bệnh 80,7% lợn con theo mẹ bị tiêu chảy [2]. Các nghiên cứu đều nhằm nâng cao hiệu quả của chế phẩm lịng đỏ trứng, hồn thiện phương pháp chế kháng nguyên (rửa mặt thạch, vơ hoạt), hoặc đa dạng hĩa chế phẩm (bột uống, thuốc tiêm), điều trị lành bệnh lợn con tiêu chảy sau 3 ngày [24]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..23 3. PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðối tượng và nội dung nghiên cứu. ðối tượng: - Gà được gây miễn dịch bằng kháng nguyên F4 pili, - Kháng thể lịng đỏ trứng và chế phẩm kháng thể lịng đỏ trứng, - E.coli gây bệnh lợn con tiêu chảy, - Lợn con bị tiêu chảy do E.coli tại thời điểm cai sữa và ngay sau cai sữa. Nội dung nghiên cứu: 1. Nghiên cứu chế tạo kháng thể lịng đỏ trứng kháng Pili F4 (1) Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch cho gà. (2) Nghiên cứu chế tạo chế phẩm lịng đỏ trứng. 2. Nghiên cứu xác định liều điều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lịng đỏ trứng kháng pili F4 (1) Xác định nguyên nhân E.coli gây tiêu chảy ở lợn con cai sữa. (2) Xác định biến động kháng thể kháng F4 pili ở lợn con. - Thu thập mẫu huyết thanh lợn con, - Ab-ELISA xác định hiệu giá kháng thể kháng F4-pili. (3) Nghiên cứu xác định liều điều trị bệnh lợn con tiêu chảy của chế phẩm lịng đỏ trứng kháng F4-pili. (4) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm trong phịng trị lợn con tiêu chảy - Hiệu quả điều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa. - Hiệu quả điều trị dự phịng. 3.2. ðịa điểm và thời gian nghiên cứu ðịa điểm nghiên cứu: Bộ mơn Hĩa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú Y, - Phun sấy khơ lịng đỏ trứng tại Viện Cơng nghệ Thực phẩm, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..24 - Trại lợn giống Cầu Diễn, Cơng ty Nhà nước một Thành viên Giống gia súc Hà Nội. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5 năm 2009 đến tháng 10 năm 2010. 3.3. Nguyên vật liệu 3.3.1. ðộng vật thí nghiệm và sinh phẩm. - Gà hướng trứng (giống CP Brown) khỏe mạnh, được tiêm phịng các bệnh truyền nhiễm phổ biến Gumboro, Newcastle, cúm, - Lợn con cai sữa ở trại chăn nuơi lợn giống Cầu Diễn, - Kháng nguyên Pili của F4 (K88) E.coli do Bộ mơn Hĩa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú y cung cấp, - Antipig-HRP-Conjugate: Cat. # A7042 do Sigma-Aldrich cung cấp, - Anti-Chicken Chicken IgY Polyclonal (Rabbit), Horseradish Peroxidase Conjugated: Cat. LS-C60281-1500, LifeSpan BioSciences, - Taq DNA Polymerase Master mix 2x: Cat. # M5122, Promega, - Thang DNA 100 bp DNA chuẩn: Cat. #15628-019, Invitrogen. 3.3.2. Mơi trường, hĩa chất - Hố chất dùng trong phản ứng Ab-ELISA: Coating buffer (Carbonate-Bicarbonate buffer PH=9,6): Cat. #C-304, do hãng Sigma-Aldrich cung cấp, PBS (Photphate Buffer Saline): Cat. #P4417, Sigma-Aldrich, Cơ chất màu OPD (Ortho-phenylenediamine): Cat. S2045, DAKO, Tween 20: Cat. #40350-2, Cica-Reagent, H2SO4: Cat. #S:1/2-26-30-45, Lachema, Nước Oxy già 30% (H2O2): Cat. #S:3-28-36/39-45, Lachema, Sữa tách bơ độ béo ≤ 0.08% (Skim Milk): Cat. #92720, Marvel. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..25 - Hố chất để làm phản ứng PCR: Dung dịch TE 5 mM [(TrisBase-EDTA pH 7,0), EDTA Disodium: Cat. # H5031, Promega; Tris Base, Cat. # H5131, Promega)], DNase free-water: Cat. #P119C, Promega. - Các loại hố chất chạy điện di: Agarose: Cat. #A9539 do hãng Sigma-Aldrich cung cấp, TAE Buffer (dung dịch mẹ 50x): Cat. #24710-030, Gibco, Ethidium Bromide: Cat. #E-1385, Sigma-Aldrich. - Mơi trường 3 ống nghiệm KIA: Cat. #1.03913.0500 do hãng Merck cung cấp, Mannitol-Mobility: Cat. #1.05404.0500, Merck, Urea-Indole: Cat. #880239, Bio-Rad. - Hố chất chế mơi trường nuơi cấy vi khuẩn: Pepton: Cat. #M885 do hãng Himedia cung cấp, Agar: Cat. #3644679, Merck, Yeast extract: Cat. #L21, OXOID, BHI (Brain Heart Infusion): Cat. #1.10493.0500, Merck, Blood Agar base (thạch máu nền): Cat. #M089, Himedia. - Hĩa chất bảo quản huyết thanh Natriazit (NaN3): Cat. #5224343, Merck. - Bổ trợ dầu Freund Complete Adjuvant: Cat. #F5881, do Sigma-Aldrich cung cấp. - Hĩa chất thơng thường phịng thí nghiệm. 3.3.3. Máy mĩc, trang thiết bị - Máy mĩc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..26 Tủ ấm lắc chuyên dụng (Stat fax 2200, Awareness), Vortex (Genie), máy đọc ELISA (Elx800, Biotek), hộp đèn tử ngoại, máy PCR (Thermocycler), máy điện di (Biorad), máy sấy trứng Centrifuge spray dryer- LPG-5. - Trang thiết bị dụng cụ thơng thường phịng thí nghiệm Cân phân tích, buồng cấy vơ trùng (Biosafety Cabinet), nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, bể ấm, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C, tủ lạnh -800C, tủ ấm CO2, đèn UV. Micro-pipette các loại 2 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl và đầu tip tương ứng. Dụng cụ thơng thường phịng thí nghiệm: Ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que cấy, pince, kéo, đĩa ELISA 96 giếng, tấm dán ELISA. Bơm tiêm, bơng cồn, ống ly tâm 14 ml; 50 ml; Eppendorf 0,2 ml và 1,5 ml, máng nhựa, giá đựng, cốc xả týp và dung dịch. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E.coli Phương pháp chuẩn bị các mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Các mơi trường nuơi cấy, giám định đặc tính sinh vật hĩa học của E.coli bao gồm nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch KIA, Mannitol-Mobility, Urea-Indole…được chuẩn bị như thường quy phịng thí nghiệm. Phương pháp thu thập mẫu phân Phân được lấy trực tiếp từ trực tràng của lợn con. Cố định lợn, dùng tăm bơng ngốy vào lỗ hậu mơn, cho tăm bơng vào ống Eppendorf cĩ sẵn dung dịch bảo quản. Mẫu được ghi rõ ký hiệu, tính biệt, ngày tuổi và ngày lấy mẫu. Mẫu phân được bảo quản trong hộp lạnh và chuyển về phịng thí nghiệm. Phương pháp nuơi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn E.coli Mẫu phân mới chuyển về phịng thí nghiệm được nuơi cấy, phân lập giám định đặc tính sinh vật hĩa học và giám định PCR như thường quy và được tĩm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..27 tắt ở sơ đồ hình 03-01. Hình 03-01. Sơ đồ phân lập và giám định vi khuẩn E.coli 3.4.2. Phương pháp PCR xác định chủng F4 E.coli Quy trình tách DNA vi khuẩn - Canh khuẩn nuơi cấy sau 16-18h/370C, lắc 220 vịng/ phút, - Lấy 50µl canh khuẩn ly tâm 3000v/phút ở 40C, bỏ dịch lấy cặn, - Hịa tan cặn bằng 250 µl nước cất, dùi thủng lỗ ống đựng mẫu, - ðun cách thủy 5 phút/1000C, - Lập tức chuyển ống vi khuẩn đã đun vào đá lạnh, giữ 3 phút, - Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C, - Giữ trên đá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR. Chuẩn bị mồi (Primer) ðể xác định sự cĩ mặt của gene mã hĩa pili F4, các độc tố đường ruột LT, Sta và STb, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cĩ trình tự Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..28 nucleotide ở bảng 03-01. Bảng 03-01. Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene Gene Trình tự nucleotide Sản phẩm (bp) F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT 499 LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT 272 STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG 158 STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG 133 Chuẩn bị Primer: Dung dịch mẹ primer 100 µM (10 x nồng độ cho PCR) được chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC. Trước khi tiến hành PCR, chuẩn bị dung dịch primer theo tỷ lệ 1/10 trong TE, dung dịch làm việc cĩ nồng độ 10 µM, dùng 1 µl primer mỗi loại cho 25 µl phản ứng. Thành phần PCR Chuẩn bị (trên đá lạnh) trong mỗi phản ứng 25 µl PCR trong ống PCR 0,2 ml thành mỏng bằng cách tuần tự thêm các chất và dung lượng như ở bảng 03-02; chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng 03-03. Bảng 03-02. Thành phần phản ứng PCR TT Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) 1 Dnase-, Rnase- Free water Cat. #P119C, Promega 8,5 2 Sợi mẹ DNA 2 3 Mồi xuơi (các loại) 10 µM 1 4 Mồi ngược (các loại) 10 µM 1 5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat. # M5122, Promega) 12,5 Tổng 25 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..29 Bảng 03-03. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Giai đoạn Bước Tên Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ A 1 Biến tính 94 5 1 1 Biến tính 94 1 2 Gắn mồi 52 1 B 3 Tổng hợp chuỗi 72 1 30 C 1 Tổng hợp chuỗi 72 10 1 D 1 Dừng 4 ðến khi nhỏ gel 1 ðiện di sản phẩm PCR trên gel Agarose - Thêm 0,8 gam Agarose (Cat. #A9539 Sigma-Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat. #24710-030, Gibco), - ðun sơi trong Microwave, 2 phút tạo dung dịch Agarose 2%, - ðể nguội dung dịch tới 600C; đổ gel vào khuơn nằm ngang đã cĩ gel- lược; để yên 20 phút cho tới khi gel đơng cứng; tháo bỏ lược. - ðặt gel Agarose vào khoang chạy, thêm dung dịch chạy điện di TAE 1 X đến khi ngập gel. - Nhỏ mẫu vào trong các giếng tương ứng của gel (khơng cần thêm loading dye vì Gotaq Green MasterMix đã cĩ dye); nhỏ thang DNA 1 giếng (Cat. #15628-019, Invitrogen). - Chạy điện di ở 100 Vol trong 30 phút. - Nhuộm gel trong Ethidium Bromide (Cat. #E-1385, Sigma-Aldrich) 5µg/ml trong 10 phút. - Kiểm tra sản phẩm PCR trên đèn UV, chụp ảnh. 3.4.3. Phương pháp gây miễn dịch cho gà Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên gây miễn dịch cho gà ðể gây miễn dịch cho gà bằng các quy trình khác nhau, kháng nguyên pili được chuẩn bị ở dạng nhũ dầu tuần tự như sau: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..30 - Giải đơng tan kháng nguyên pili F4 do Bộ mơn Hĩa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp. Kháng nguyên gốc cĩ nồng độ protein 4 mg/ml trong PBS. - Chuẩn bị 5 ống kháng nguyên, lần lượt thêm các thành phần theo từng ống như ở bảng 04-04, trộn đều sau đĩ thêm Complete Freund Adjuvant (Cat. #F5881, Sigma-Aldrich) theo tỷ lệ 1: 1. Tạo nhũ bằng máy siêu âm. Bảng 03-04. Thành phần các ống nhũ kháng nguyên Ống Kháng nguyên Pili gốc (ml) PBS (ml) Freund Adjuvant (ml) Nhũ kháng nguyên (ml) Nồng độ pili thành phẩm (mg/ml) 1 10 0 10 20 2 2 15 15 30 60 1 3 2,5 7,5 10 20 0,5 4 1,25 8,75 10 20 0,25 5 0 20 20 40 0 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch cho gà, so sánh 3 quy trình Ba quy trình gây miễn dịch cho gà gồm: - Quy trình 01 (lơ 01): Giữ nguyên liều kháng nguyên, lập lại 4 lần. - Quy trình 02 (lơ 02): Tiêm liều kháng nguyên giảm dần - Quy trình 03 (lơ 03): Tiêm liều kháng nguyên tăng dần - Lơ 04: ðối chứng, khơng tiêm kháng nguyên, chỉ tiêm nhũ dầu PBS. Gà CP Brown hướng trứng 18 tuần tuổi được gây miễn dịch bằng cách tiêm bắp 1ml/con theo lịch tiêm và liều lượng theo lơ ở bảng 03-05. Bảng 03-05. Liều kháng nguyên tiêm (mg F4 pili) theo quy trình Ngày đầu Ngày 7 Ngày 14 Ngày 28 Ghi chú Lơ 1 1 1 1 1 Kháng nguyên ống 2 Lơ 2 2 1 0,5 0,25 Kháng nguyên ống 1 đến 4 Lơ 3 0,25 0,5 1 2 Kháng nguyên ống 4 đến 1 Lơ 4 ðC-PBS ðC-PBS ðC-PBS ðC-PBS Nhũ PBS ống 5 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..31 Thu thập mẫu huyết thanh gà Thu thập mẫu máu gà: Thu thập mẫu máu 4 gà cho mỗi lơ thí nghiệm tại ngày tiêm (D0) và mỗi tuần sau đĩ thu mẫu máu 1 lần đến tuần thứ 33. Dùng bơm và kim tiêm lấy 1 ml máu ở tĩnh mạch cánh, cho máu vào ống Eppendorf, ghi ký hiệu mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh và vận chuyển về phịng thí nghiệm. Các mẫu máu được đánh số tuần tự D0, D7, D14, D21, D28, D35, D42, D49, D56, D63, D70, D77, D84, D91, D98, D105, D112, D119, D126, D133, D140, D145, D154, D161, D168, D175, D182, D189, D196, D203, D210, D217 và D224. Tách huyết thanh và bảo quản: Ly tâm ống Eppendorf ở 4000 vịng/phút trong 10 phút, dùng micropipet và đầu type tương thích chuyển 0,4 ml huyết thanh sang ống Eppendorf vơ trùng, thêm 4 µl Natriazit 10% (NaN3), dán nhãn, bảo quản huyết thanh trong 1 tuần ở 4 OC, bảo quản lâu dài ở -30OC đến khi phân tích. Thu thập mẫu trứng gà miễn dịch Trứng gà được thu thập hàng ngày, đánh số theo lơ và theo ngày, bảo quản ở kho lạnh._.sĩ nơng nghiệp ……………..54 Hình 04-06. Kết quả PCR xác định các yếu tố độc lực của F4 E.coli. (1) Khung trên PCR xác định gene mã hĩa F4 pili (499 bp), (2) Khung dưới : multiplex PCR xác định các độc tố đường ruột, LT (272 bp), STa (158 bp) và STb (133 bp). Nhận xét : (1) Dương tính PCR cho vạch đặc hiệu 499 bp chứng tỏ 11 trong số 16 mẫu cĩ dung huyết đều là E.coli F4. (2) Các chủng F4 E.coli phân lập đều mang ít nhất 1 gene mã hĩa cho độc tố đường ruột LT, STa hoặc STb (4 chủng mang gene mã hĩa STa, 1 chủng mang STa và STb, 5 chủng mang gene LT và STb và 1 chủng mang gene mã hĩa cả 3 độc tố). (3) Kết quả giám định gene học cho phép kết luận cĩ ít nhất 36,67 % (11/30) các trường hợp lợn con tiêu chảy sau cai sữa cĩ sự tham gia của F4 E.coli. 4.3.2. Kết quả xác định biến động hiệu giá kháng thể ở lợn con Ab-ELISA sử dụng kháng nguyên pili F4 được dùng để đánh giá tình trạng miễn dịch kháng nguyên bám dính pili F4 ở lợn con. Kết quả Ab-ELISA phân tích 200 mẫu huyết thanh lợn con các lứa tuổi được trình bày ở bảng 04- 02 và mơ tả ở biểu đồ của hình 04-07. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..55 Bảng 04-02. Dương tính Ab-ELISA với F4-pili ở lợn con TT Nhĩm tuổi Số xét nghiệm Số dương tính Tỷ lệ (%) 1 Sơ sinh (7 ngày tuổi) 40 37 92,50 2 Theo mẹ (14 ngày tuổi) 40 17 42,50 3 Theo mẹ (21 ngày tuổi) 40 6 15,00 4 Cai sữa (28 ngày tuổi) 40 3 7,50 5 Sau cai sữa (35 ngày tuổi) 40 5 12,50 Tổng 200 68 34,00 Hình 04-07. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học pili F4 ở lợn con Nhận xét: Kết quả ở bảng 04-02 và hình 04-07 cho thấy: (1) Trong tổng số 200 mẫu xét nghiệm, số mẫu dương tính huyết thanh học đối với F4 pili là 68 (34%), chứng tỏ khơng cĩ nhiều lợn con các lứa tuổi cĩ kháng thể đặc hiệu kháng F4 pili, hoặc hầu hết lợn con mẫn cảm với F4+ E.coli. (2) Tỷ lệ dương tính huyết thanh học biến động theo lứa tuổi, cao nhất ở lợn con 1 tuần tuổi (92,50%), sau đĩ giảm nhanh đến 42,50 (14 ngày tuổi) và 15,00 % (21 ngày tuổi), chứng tỏ kháng thể thụ động đã mất dần theo thời gian. Tại thời điểm cai sữa 28 ngày tuổi, chỉ cĩ 7,50% lợn cịn kháng thể thụ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..56 động. Tuy nhiên, cĩ thể 1 số lợn đã phơi nhiễm F4 E.coli, tỷ lệ dương tính huyết thanh học với F4 bắt đầu tăng lên, ở lợn 35 ngày tuổi, dương tính 12,5%. (3) Tại thời điểm cai sữa, lợn con khơng cĩ kháng thể qua sữa mẹ, đồng thời lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh là thấp nhất, sức kháng của lợn con cai sữa là thấp nhất với F4 E.coli. Cĩ thể đây là 1 trong những nguyên nhân lợn con mắc tiêu chảy do F4 E.coli. 4.3.3. Kết quả xác định liều điều trị lành bệnh 50% Trong thí nghiệm xác định liều điều trị lành bệnh 50% lợn con tiêu chảy sau cai sữa, dãy liều tăng gấp đơi từ 0,125 đến 1 gam/kgP đã được sử dụng. Thí nghiệm trên 5 lợn cho mỗi lơ, lặp lại 1 lần, tổng hợp kết quả về tỷ lệ lành bệnh được ghi nhận ở bảng 04-03. Bảng 04-03. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 điều trị lợn con tiêu chảy TT Liều (gam/kgP) Số điều trị Số lành bệnh % tích lũy 1 1 10 7 84,21 2 0,5 10 5 52,94 3 0,25 10 3 21,05 4 0,125 10 1 4,00 Nhận xét: (1) ðối tượng điều trị là lợn con sau cai sữa, giống lai kinh tế ðại Bạch- Yorshire- Mĩng Cái, cai sữa ở 28 ngày tuổi, mắc tiêu chảy từ ngày 29 đến 35, ở điều kiện thực địa với sự cĩ mặt của ít nhất 36,67% F4+E.coli mang gene mã hĩa độc tố đường ruột STa, STb và LT, xác nhận bằng PCR (như đã trình bày ở phần trên). (2) Lợn lành bệnh/khơng khỏi bệnh được ghi nhận như sau: lợn con tiêu chảy được điều trị theo liệu trình chỉ định 2 liều /ngày, khơng can thiệp thêm kháng sinh hoặc bất kỳ chất điện giải khác, sau 4 liều nếu triệu chứng bệnh khơng giảm, chuyển phác đồ khác, được tính là khơng lành bệnh, nếu triệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..57 chứng thuyên giảm, điều trị tiếp đến liều thứ 6, nếu khơng lành bệnh, chuyển phác đồ khác, cũng được tính là khơng lành bệnh; ngược lại lợn ngưng tiêu chảy được tính là số lành bệnh. (3) Kết quả trình bày ở bảng 04-03 cho biết, số lợn lành bệnh tăng dần theo liều nhưng khơng đạt 100%, (4) Liều điều trị 50% số lợn con tiêu chảy được tính tốn là 0,47 gam/kgP (làm trịn 0,5 gam cho 1 kg thể trọng). 4.3.4. Kết quả xác định liều điều trị Căn cứ vào liều điều trị lành bệnh 50% lợn con tiêu chảy ở thực địa, để xác định liều điều trị cĩ hiệu quả thực tế, chúng tơi sử dụng các liều tăng gấp 2 và 4 lần nghĩa là 1 gam và 2 gam cho 1 kg thể trọng. Phác đồ điều trị và theo dõi can thiệp, nguyên tắc tính tỷ lệ lành bệnh tương tự như ở thí nghiệm xác định liều 50%. Kết quả điều trị lành bệnh lợn con tiêu chảy bằng KT04 tăng liều được trình bày ở bảng 04-04. Bảng 04-04. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 liều cao điều trị lợn con tiêu chảy Lơ Số điều trị Số lành bệnh Tỷ lệ Ghi chú 1g/1 kg P 32 23 71,88 1 con tái phát sau 3 ngày 2g/1 kg P 30 21 70,00 Nhận xét: (1) Tỷ lệ lành bệnh đối với liều 1g/1 kg P là 71,88% và liều 2g/1 kg P là 70%, được coi là tương đương (sai khác nhỏ khơng cĩ ý nghĩa thống kê). (2) Chế phẩm KT4 khơng điều trị khỏi 100% tiêu chảy sau cai sữa. Việc tăng liều điều trị khơng làm tăng mãi tỷ lệ lành bệnh, tỷ lệ lành bệnh ngưỡng trên của chế phẩm KT04, khi sử dụng khơng cĩ phối hợp với thuốc khác chỉ đạt mức 70-71%. Việc tăng liều, xét về hiệu quả cĩ thể chỉ (nếu cĩ) là ở liều thấp hơn (1 gam/ kg P) cĩ 1 trường hợp tái phát sau 3 ngày lành bệnh. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..58 (3) Từ kết quả thí nghiệm ở bảng 04-03 và 04-04 và những phân tích, cĩ thể kết luận liều điều trị cĩ hiệu quả lợn con tiêu chảy tại thực địa của chế phẩm KT04 theo phác đồ thí nghiệm là 1 gam cho 1 kg thể trọng. (4) Những lợn con tiêu chảy khơng lành bệnh sau điều trị đều được can thiệp bằng kháng sinh liều cao tiêm bắp và chất điện giải hỗ trợ. ða số lợn con tiêu chảy lành bệnh sau 2-3 lần tiêm. Theo con số thống kê của trại chăn nuơi Cầu Diễn, tỷ lệ lợn con tiêu chảy điều trị khơng khỏi và chết là khoảng 1-2%. Kết quả can thiệp kháng sinh và tỷ lệ điều trị khơng khỏi chứng tỏ ngồi nguyên nhân E. coli gây tiêu chảy cịn cĩ những nguyên nhân khác (vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng thuốc, vi rút...). 4.3.5. Kết quả kiểm chứng liều điều trị Trong điều kiện thực địa, trước khi cĩ thể đánh giá chế phẩm điều trị ở mức rộng hơn, chúng tơi tiến hành lập lại thí nghiệm với 2 liều điều trị đã xác định như trình bày ở phần trên: liều điều trị lành bệnh 50% và liều điều trị sẽ chỉ định cho phác đồ KT04, nghĩa là liều 0,5 gam/kgP và liều 1 gam/kgP. Mỗi liều được áp dụng cho 10 lợn tiêu chảy, lặp lại 3 lần để đánh giá sự ổn định của liệu trình. Kết quả theo dõi lợn lành bệnh theo lơ được trình bày ở bảng 04-05. Bảng 04-05. Tỷ lệ lành bệnh của KT04 theo liều ở 3 lơ thử nghiệm Lơ 1 (n=10) Lơ 2 (n=10) Lơ 3 (n=10) Tổng (N=30) TT Liều (gam/kgP) Lành bệnh % Lành bệnh % Lành bệnh % Lành bệnh Tỷ lệ % 1 0,5 5 50 4 40 6 60 15 50 2 1,0 7 70 7 70 7 70 21 70 Nhận xét: (1) Kết quả ở bảng 04-05 cho biết liều 0,5gam/kgP theo phác đồ chỉ định cho tỷ lệ lành bệnh 50%, biến động giữa 3 lơ là khơng đáng kể. (2) Ở liều điều trị 1gam/kgP, kết quả điều trị ở cả ba lơ đều là 7/10 (70%). (3) ðiều trị thử nghiệm lặp lại 3 lần với liều 0,5 gam/kg P cho kết quả Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..59 lành bệnh 15/30 (50%) và kết quả điều trị ở liều 1 gam/ kg P cho kết quả lành bệnh 21/30 (70%), với sai số giữa các lơ khơng đáng kể, là hồn tồn phù hợp với kết quả thí nghiệm xác định liều trình bày ở các phần trên. Kết quả này tái xác nhận hiệu quả điều trị của chế phẩm KT04 theo liều lượng và phác đồ chỉ định là ổn định và cĩ thể áp dụng thực tiễn. 4.3.6. ðánh giá ảnh hưởng của chế phẩm đến tăng trọng Trong quá trình theo dõi điều trị, để đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm KT04 đến sinh trưởng và phát triển của lợn sau lành bệnh, trọng lượng của lợn tiêu chảy khi cai sữa được hồi cứu và tiến hành cân trọng lượng của lợn khi xuất chuồng (60 ngày tuổi). Căn cứ vào theo dõi tổng đàn, cân 10 lợn khơng cĩ tiền sử tiêu chảy sau cai sữa để so sánh. Trọng lượng của 96 lợn theo dõi điều trị lành bệnh được thống kê theo liều điều trị và so sánh với 10 lợn khỏe mạnh được trình bày ở bảng 04-06. Bảng 04-06. Kết quả theo dõi trọng lượng lợn điều trị bằng KT04 TT ðã điều trị với liều (gam/kg P) Số lợn lành bệnh P cai sữa (kg) P 60 ngày (kg) Ghi chú 1 <0,5 4 8,80 ± 0,14 19,93 ± 0,10 2 0,5 20 8,79 ± 0,19 19,97 ± 0,12 3 1 51 8,84 ± 0,25 19,91 ± 0,31 4 2 21 8,82 ± 0,18 19,95 ± 0,17 Tổng 96 8,82 ± 0,22 19,93 ± 0,25 ðiều trị KT04 5 Khỏe mạnh 10 8,83 ± 0,13 19,93 ± 0,15 Khơng điều trị Nhận xét: Kết quả ở bảng 04-06 cho biết : (1) Trọng lượng gốc của lợn con cai sữa ở tất cả các nhĩm lợn điều trị khá đồng đều, sai khác về trọng lượng giữa các nhĩm lợn điều trị bằng các liều khác nhau và sai lệch so với nhĩm lợn khỏe mạnh là khơng đáng kể (khơng cĩ ý nghĩa thống kê). (2) Lợn con lành bệnh sau điều trị cĩ trọng lượng trung bình tại 60 ngày Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..60 là 19,93 ± 0,25 kg, tương đương với trọng lượng trung bình của nhĩm khơng mắc tiêu chảy 19,93 ± 0,15 kg. Trọng lượng trung bình giữa các nhĩm cũng cĩ sự sai khác khơng đáng kể (khơng cĩ ý nghĩa thống kê), biên độ dao động rộng hơn ở nhĩm điều trị 1 gam/ kgP (19,91 ± 0,31 kg) cĩ thể chỉ đơn thuần là do số lượng mẫu lớn hơn. (3) Kết quả đồng đều về trọng lượng lợn khi cai sữa và lúc xuất chuồng (60 ngày tuổi) của các nhĩm điều trị so với nhĩm khơng bị bệnh cho thấy chế phẩm KT4 khơng ảnh hưởng đến sức tăng trọng của lợn. (4) Theo nhận xét của kỹ thuật và quản lý trại chăn nuơi lợn Cầu Diễn, lợn con tiêu chảy điều trị bằng chế phẩm KT04 cĩ da đẹp hơn và khơng thấy cĩ trường hợp cịi cọc như điều trị bằng kháng sinh. 4.4. Kết quả ứng dụng chế phẩm trong phịng trị lợn con tiêu chảy 4.4.1. Kết quả điều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa ðể đánh giá khả năng áp dụng thực tiễn của chế phẩm KT04, trại đã sử dụng khu chuồng A (32 ơ chuồng) để theo dõi các áp dụng thực nghiệm, điều trị và điều trị dự phịng được đánh giá vào tháng 3, 4 và 5 năm 2010. Tổng số 9 ơ chuồng được theo dõi và dành riêng cho điều trị lợn con tiêu chảy bằng KT04. Liều điều trị 1 gam cho 1 kg thể trọng theo đúng phác đồ đã áp dụng như trình bày ở các phần trên. Kết quả điều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa bằng chế phẩm KT04 của 3 tháng được trình bày ở bảng 04-07. Bảng 04-07. Kết quả theo dõi điều trị lợn con tiêu chảy bằng KT04 TT Thời gian Số điều trị Số lành bệnh Tỷ lệ Số liều điều trị Ghi chú 1 Tháng 03 26 18 69,23 4,54 ± 0,95 2 Tháng 04 21 15 71,43 4,38 ± 1,02 3 Tháng 05 23 17 73,91 3,96 ± 0,77 Giảm TC nhanh Tổng 70 50 71,43 4,30 ± 0,94 Nhận xét: (1) Trong điều kiện thực tế, KT04 cho hiệu quả điều trị Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..61 71,43%, thấp nhất 69,23% (tháng 3) và cao nhất vào tháng 5 (73,91%), khác biệt giữa các tháng khơng cĩ ý nghĩa thống kê. (2) Số liều điều trị lành bệnh trung bình là 4,30 ± 0,94 liều. Tuy trong tháng 5, khi dùng KT04, triệu chứng tiêu chảy giảm rất nhanh (3,96 ± 0,77 liều) nhưng khác biệt so với số liều cao nhất vào tháng 3 (4,54 ± 0,95) khơng đủ ý nghĩa thống kê (với p=0,01). (3) Hiện tượng tỷ lệ lành bệnh cao trong khi số liều điều trị thấp vào tháng 5 (tuy khơng khác xa) nhưng cĩ lẽ do yếu tố thời tiết, nhiệt độ cao hơn và độ ẩm thấp hơn. 4.4.2. ðiều trị dự phịng Theo số thống kê, lợn con sau cai sữa, tuy khơng đồng loạt mắc tiêu chảy nhưng số ca tiêu chảy tăng dần đến đỉnh điểm là ngày thứ 3 và cĩ thể kéo đến 1 tuần tùy thời tiết. Kết quả phân tích về sức đề kháng của lợn con với E.coli F4 là thấp nhất vào thời điểm cai sữa (hình 04-07). Giả sử tất cả tất cả lợn vào thời điểm cai sữa đều cĩ nguy cơ mắc tiêu chảy, điều trị dự phịng theo kinh nghiệm cĩ thể sử dụng 50% liều điều trị. Kinh nghiệm trên thế giới dùng kháng thể dị lồi cũng cho thấy, điều trị dự phịng cĩ hiệu quả cao trong lợn con tiêu chảy. ðiều trị dự phịng được tiến hành lập lại trong 3 tháng, cĩ đối chứng so sánh bao gồm 4 lơ: (1) Lơ 1: khơng dùng chế phẩm điều trị dự phịng, khi cĩ lợn tiêu chảy, điều trị bằng chế phẩm KT04; (2) Lơ 2: Thử nghiệm điều trị dự phịng bằng KT05 (đang được dùng để dự phịng E.coli F5 cho lợn con theo mẹ); (3) Lơ 3: sử dụng KT04 liều 0.5 gam/kg P/ ngày x 3 ngày, trộn thức ăn, căn cứ vào trọng lượng kiểm tra khi cai sữa để xác định lượng KT04; và (4) Lơ 4: ðiều trị dự phịng bằng chế phẩm Boost Start (nhập ngoại, hãng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..62 Bayer cung cấp), liều 4 gam/ 1 kg thức ăn x 5 ngày. Kết quả theo dõi được so sánh với lơ khơng dùng chế phẩm dự phịng được trình bày ở bảng 04-08. Bảng 04-08. Kết quả theo dõi điều trị dự phịng lợn con tiêu chảy Lơ 01 Lơ 02 Lơ 03 Lơ 04 TT Thời gian Số TN Số T. Chảy Tỷ lệ Số TN Số T. Chảy Tỷ lệ Số TN Số T. Chảy Tỷ lệ Số TN Số T. Chảy Tỷ lệ 1 Tháng 03 93 26 27,96 40 11 27,50 80 10 12,50 86 9 10,47 2 Tháng 04 87 21 24,14 118 12 10,17 81 9 11,11 3 Tháng 05 91 23 25,27 125 11 8,80 89 11 12,36 Tổng 271 70 25,83 40 11 27,50 323 33 10,22 256 29 11,33 Nhận xét: (1) Tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại điểm thí nghiệm (trong điều kiện khơng cĩ thuốc dự phịng) là 25,83%, dao động theo thời gian (từ 24,14 đến 27,96%). (2) Kháng thể lịng đỏ trứng KT05 (thường dùng dự phịng ở lợn con theo mẹ tập ăn) khơng cĩ tác dụng làm giảm tỷ lệ nhiễm tiêu chảy. (3) Ở lơ cĩ sử dụng chế phẩm KT04 trộn thức ăn theo liều chỉ định, tỷ lệ lợn con tiêu chảy là 10,22%, thấp hơn so với lơ khơng can thiệp (25,83%), [giảm 60.45% so với đối chứng]. (4) Mức tỷ lệ lợn con tiêu chảy 10,22% ở lơ dùng KT04 và 11,33% ở lơ dùng Boost Start được xem là tương đương (khác biệt khơng đủ ý nghĩa thống kê). Tuy nhiên Boost Start cĩ vẻ tốt hơn ở tháng 2, KT04 tốt hơn ở tháng 5, cho tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn. Sự khác biệt nhỏ giữa 2 loại chế phẩm cĩ thể do tính đặc hiệu kháng thể-kháng nguyên, hiện chưa đủ số liệu để kết luận. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..63 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 1. ðề tài đã chế tạo thành cơng chế phẩm kháng thể lịng đỏ trứng kháng đặc hiệu E.coli pili F4. 2. Xác định được sự khác biệt về hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong lịng đỏ trứng khi áp dụng quy trình gây miễn dịch khác nhau và chọn được 1 trong 3 quy trình đã thử nghiệm, cho hiệu giá kháng thể trong trứng đạt mức 1/12800. 3. ðề tài đã xác định được liều điều trị cĩ định lượng dựa vào hiệu giá kháng thể trong chế phẩm. Chế phẩm kháng thể lịng đỏ trứng KT04 sử dụng điều trị ở liều 1 gam/kg thể trọng và liều điều trị dự phịng là 0,5 gam cho 1 kg trọng lượng. 4. ðã bước đầu đánh giá hiệu quả điều trị trong điều kiện thực địa khỏi bệnh trên 70% sau 4,30 ± 0,94 liều (trung bình), dự phịng làm giảm 60,45% so với đối chứng khơng can thiệp thuốc dự phịng. Sinh phẩm là an tồn, khơng ảnh hưởng đến tăng trọng sau khi lành bệnh. 5.2. Kiến nghị ðề tài đề nghị áp dụng phương pháp ELISA trong xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong các sinh phẩm cùng loại ðề nghị tiếp tục nghiên cứu áp dụng sinh phẩm trong điều trị và điều trị dự phịng nhằm cĩ được phác đồ hiệu quả nhất, gĩp phần từng bước giảm thiểu kháng sinh trong điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con cai sữa. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..64 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. Tiếng Việt 01. ðặng Xuân Bình, Trần Thị Hạnh (2003), “Khảo sát sự biến động hàm lượng Globulin miễn dịch trong sữa đầu của lợn nái khi sử dụng chế phẩm sinh học phịng bệnh tiêu chảy lợn con”. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y. 10 (1), tr. 42- 49. 02. ðặng Xuân Bình , Lê Văn Tạo và Trần Thị Hạnh (2003), “Nghiên cứu chế tạo bột kháng thể lịng đỏ trứng gà (YP-99) và hiệu quả điều trị tiêu chảy do E.coli ở lợn con theo mẹ”. Báo cáo khoa học Chăn nuơi Thú y 2002-2003. Tr. 219- 323 03. ðỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh và Nguyễn Quang Tuyên (2000), “Sử dụng chế phẩm sinh học Biosubtyl để phịng và trị bệnh tiêu chảy ở lợn con trước và sau cai sữa”. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y. 7 (2), tr. 58-62. 04. Huỳnh Thị Kim Diệu (2001), “Tác dụng của cơm mẻ trên năng suất của heo con theo mẹ và heo con cai sữa đến 2 tháng tuổi”. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y. 8 (3), tr. 29-33. 05. Bùi Xuân ðồng (2001), “Bệnh phù đầu do Escherichia coli gây ra ở lợn con của Hải Phịng và biện pháp phịng trị”. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y. 9, tr. 98-99. 06. ðồn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài (1997), “Tác dụng của Becberin và dung dịch điện giải trong điều trị hội chứng tiêu chảy của lợn con theo mẹ”. Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp thực phẩm. 8, tr. 367-368. 07. Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003), “Nghiên cứu và so sánh các yếu tố độc lực của những chủng E.coli phân lập từ lợn con bị bệnh tiêu chảy ở cộng hồ Slovakia”. Báo cáo khoa học Chăn nuơi- thú y 2002-2003. Tr. 45-58 . 08. Trần Thị Hạnh và ðặng Xuân Bình (2002), “Chế tạo thử nghiệm chế phẩm sinh học phịng trị bệnh tiêu chảy phân trắng lợn con do E.coli và Cl.perferingens”. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y. 10, tr. 19-28. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..65 09. Nguyễn Thị Kim Lan (2004), “Thử nghiệm phịng và điều trị bệnh coli dung huyết cho lợn con ở Thái Nguyên và Bắc Giang”. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y. 9 (30), tr. 35-39. 10. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở và Trần Thị Thu Hà (1985), “Kết quả điều tra về tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuơi lợn”. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú Y 1979-1984. Tr. 50-53. 11. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Thị Sở, Cù Hữu Phú và Trương Văn Dung (1986), “Vacxin E.coli phịng bệnh cho lợn con”. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú Y 1979-1984. Tr. 98-103. 12. Nguyễn Thị Nội, Vũ Ngọc Lâm và Phạm Khắc Vượng (1979), “Hiệu lực của vacxin E.coli đối với bệnh lợn con ỉa phân trắng trong sản xuất”. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y 1968-1978. Tr. 219-225. 13. Nguyễn Khả Ngự và Lê Văn Tạo (1996), “Tình hình bệnh trực khuẩn Coli ở lợn con trước và sau cai sữa tại một số tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long”. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y. 4, tr. 50-55. 14. Nguyễn Khả Ngự, Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngọc Nhiên và ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Xác định độc lực và chọn chủng vi khuẩn E.coli phân lập từ lợn con mắc bệnh phù đầu, chế tạo thử nghiệm vacxin phịng bệnh”. Kết quả nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật Thú y. Tr. 207-217. 15. Cù Hữu Phú và cs (2004), “Kết quả điều tra tình hình tiêu chảy của lợn con theo mẹ tại một số trại ở miền Bắc Việt nam. Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh chủ yếu và các yếu tố gây bệnh của các chủng E.coli phân lập đuợc”. Báo Cáo khoa học chăn nuơi thú y 2002-2003, Nhà xuất bản Nơng nghiệp Hà nội. Tr. 106- 119. 16. Cù Hữu Phú và cs (2004), “Bệnh phù đầu lợn con do E.coli dung huyết gây ra ở Bình định, Hà tây, sử dụng Autovaccin phịng bệnh”. Báo Cáo khoa học chăn nuơi thú y, Nhà xuất bản Nơng nghiệp Hà Nội. Tr. 123-137. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..66 17. Trương Quang (2005), “Kết quả nghiên cứu vai trị gây bệnh của E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1-60 ngày tuổi”. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 7, tr. 27-32. 18. ðinh Bích Thuý và Nguyễn Thị Thạo (1995), “Nghiên cứu độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn”. Khoa học kỹ thuật thú y. 2 (3), tr. 18-24. 19. Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân và Phạm Xuân Uy (1999), “Phịng ngừa tiêu chảy ở heo con bằng sử dụng kháng sinh Colistin và Oxytetracyclin trong thức ăn của heo”. Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y. 4, tr. 57-61. 20. Lê Văn Tạo (1993), “Nghiên cứu chế to vacxin cho uống phịng bệnh lợn con phân trắng”. Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú Y. 9. 21. Lê Văn Tạo (1995), “Hiệu quả sử dụng vaccine E.coli cho uống phịng bệnh phân trắng lợn con”. Tạp chí Nơng nghiệp và Cơng nghệ thực phẩm Nhà xuất bản Hà Nội. Tr. 432-453. 22. Lê Văn Tạo, Khương Bích Ngọc, Nguyễn Thị Vui và ðồn Băng Tâm (1991), “Khả năng bám dính và sản sinh kháng nguyên K88 của một số giống E.coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng”. Cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 1990-1991. Tr. 82-88. 23. Lê Văn Tạo, Khương Bích Ngọc, Nguyễn Thị Vui và ðồn Băng Tâm (1991), “Xác định các yếu tố gây bệnh di truyền bằng Plasmid của vi khuẩn E.coli để chọn giống sản xuất vacxin phịng bệnh phân trắng của lợn con”. Cơng trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 1990-199. Tr. 77-81. 24. Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngã, Nguyễn Thiên Thu, Nguyễn Văn Quang và ðào Duy Hưng (2001), “Nghiên cứu sản xuất kháng thể khác lồi từ lịng đỏ trứng gà phịng trị bệnh Colibacilosis cho lợn con”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. 8 (1), tr. 21-26. 25. Tạ Thị Vịnh và ðặng Thị Hoè (2002), “Một số kết quả sử dụng các chế phẩm sinh học để phịng bệnh tiêu chảy của lợn con”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. 9 (4), tr. 54-56. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..67 6.2. Tiếng Anh 26. Acres, S. D. (1985), Enterotoxigenic Escherichia coli infections in newborn calves: a review. J Dairy Sci. 68, 229-256. 27. Arriaga, Y. L., Harville, B. A., & Dreyfus, L. A. (1995), Contribution of individual disulfide bonds to biological action of Escherichia coli heat-stable enterotoxin B. Infect Immun. 63, 4715-4720. 28. Bertschinger, H. U. & Fairbrother J.M. (1992), Escherichia coli Infections. Diseases of Swine, 431-440. 29. Bornside, G. H. & Cohn, I., Jr. (1965), The normal microbial flora: comparative bacterial flora of animals and man. Am.J Dig.Dis. 10, 844-852. 30. BRIGGS, C. (1951), The nutritive value of colostrum for the calf. 6. The 'K' antigens of Bacterium coli. Br.J Nutr. 5, 349-355. 31. De Graaf, F. K., Klemm, P., & Gaastra, W. (1981), Purification, characterization, and partial covalent structure of Escherichia coli adhesive antigen K99. Infect Immun. 33, 877-883. 32. Dreyfus, L. A. et al. (1993), Calcium influx mediated by the Escherichia coli heat-stable enterotoxin B (STB). Proc.Natl.Acad.Sci U S A. 90, 3202-3206. 33. Dubreuil, J. D. (2010), STb and AIDA-I: the missing link? Crit Rev Microbiol. 36, 212-220. 34. Ewing, W. H. and Kauffmann, F. (1950), A new coli O-antigen group. Public Health Rep. 65, 1341-1343. 35. Frydendahl, K. (2002), Prevalence of serogroups and virulence genes in Escherichia coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches. Vet Microbiol. 85, 169-182. 36. Goodford, P. J. and Hermansen, K. (1961), Sodium and potassium movements in the unstriated muscle of the guinea-pig taenia coli. J Physiol. 158, 426-448. 37. Gyles, C. L. & Barnum, D. A. (1969), A heat-labile enterotoxin from strains of Escherichia coli enteropathogenic for pigs. J Infect Dis. 120, 419-426. 38. Hampson, D. J., Woodward, J. M., & Connaughton, I. D. (1993), Genetic analysis of Escherichia coli from porcine postweaning diarrhoea. Epidemiol.Infect. 110, 575-581. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..68 39. Hitotsubashi, S., Fujii, Y., Yamanaka, H., & Okamoto, K. (1992), Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect Immun. 60, 4468-4474. 40. Holmes, R. K., Twiddy, E. M., & Pickett, C. L. (1986), Purification and characterization of type II heat-labile enterotoxin of Escherichia coli. Infect Immun. 53, 464-473. 41. Kauffmann, F. and Perch, B. (1948), On a common antigen in Proteux X 2 and Escherichia coli O group 12. Acta Pathol Microbiol Scand . 25, 608-610. 42. Kernkamp, H. C., Sorensen, D. K., Hanson, L. J., & Nielsen, N. O. (1965), Epidemiology of Edema disease in swine. J Am.Vet Med Assoc. 146, 353-357. 43. Khan, A. S., Johnston, N. C., Goldfine, H., & Schifferli, D. M. (1996), Porcine 987P glycolipid receptors on intestinal brush borders and their cognate bacterial ligands. Infect Immun. 64, 3688-3693. 44. Levesque, S., Martinez, G., & Fairbrother, J. M. (2007), Improvement of adjuvant systems to obtain a cost-effective production of high levels of specific IgY. Poult.Sci. 86, 630-635. 45. Li, X. L., Shuai, J. B., & Fang, W. H. (2006), Protection of Carassius auratus Gibelio against infection by Aeromonas hydrophila using specific immunoglobulins from hen egg yolk. J Zhejiang.Univ Sci B. 7, 922-928. 46. Marquardt, R. R. et al. (1999), Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli K88+ infection in neonatal and early- weaned piglets. FEMS Immunol Med Microbiol. 23, 283-288. 47. Moon, H. W. (1981), Protection against enteric colibacillosis in pigs suckling orally vaccinated dams: evidence for pili as protective antigens. Am.J Vet Res. 42, 173-177. 48. Moon, H. W., Nagy, B., Isaacson, R. E., & Orskov, I. (1977), Occurrence of K99 antigen on Escherichia coli isolated from pigs and colonization of pig ileum by K99+ enterotoxigenic E. coli from calves and pigs. Infect.Immun. 15, 614-620. 49. Nagy, B. & Fekete, P. Z. (1999), Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals. Vet Res. 30, 259-284. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..69 50. Nataro, J. P. & Kaper, J. B. (1998), Diarrheagenic Escherichia coli. Clin.Microbiol Rev. 11, 142-201. 51. Nisbet, D. (2002), Defined competitive exclusion cultures in the prevention of enteropathogen colonisation in poultry and swine. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 481-486. 52. O'Farrelly, C., Branton, D., & Wanke, C. A. (1992), Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain. Infect Immun. 60, 2593-2597. 53. Ojeniyi, B., Ahrens, P., & Meyling, A. (1994), Detection of fimbrial and toxin genes in Escherichia coli and their prevalence in piglets with diarrhoea. The application of colony hybridization assay, polymerase chain reaction and phenotypic assays. Zentralbl.Veterinarmed.B. 41, 49-59. 54. Orskov, F. (1953), Antigenic relationships between H antigens 1-22 of E.coli and Wramby's H antigens 23W-36W;11 new H antigens: 23-33. Acta Pathol Microbiol Scand. 32, 241-244. 55. Owusu-Asiedu, A., Nyachoti, C. M., Baidoo, S. K., Marquardt, R. R., & Yang, X. (2003), Response of early-weaned pigs to an enterotoxigenic Escherichia coli (K88) challenge when fed diets containing spray-dried porcine plasma or pea protein isolate plus egg yolk antibody. J Anim Sci. 81, 1781-1789. 56. Savarino, S. J. et al. (1996), Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin is not restricted to enteroaggregative E. coli. J Infect Dis. 173, 1019-1022. 57. Scott, W. J. (2008). Antimicrobial resistance in companion animals. Anim Health Res Rev. 9 169-176. 58. Sears, C. L. & Kaper, J. B. (1996). Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol Rev. 60, 167-215. 59. Shin, S. L., Chang, Y. F., & et al. (1994), Hybridization of clinical Escherichia coli isolates from calves and piglets in New York Sate with the gene probes for enterotoxins (Sta, STb, LT), Shiga-like toxins (LT-I, SLT-II) and adhsion factors (K88, K99, F41, 987P). Vet.Microbiol. (38) 217-225. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ……………..70 60. Smith, H. W. & Huggins, M. B. (1976), Further observations on the association of the colicine V plasmid of Escherichia coli with pathogenicity and with survival in the alimentary tract. J Gen Microbiol. 92, 335-350. 61. Takeda, Y., Honda, T., Sima, H., Tsuji, T., & Miwatani, T. (1983), Analysis of antigenic determinants in cholera enterotoxin and heat-labile enterotoxins from human and porcine enterotoxigenic Escherichia coli. Infect.Immun. 41, 50-53. 62. Vaandrager, A. B., van der, W. E., Hom, M. L., Luthjens, L. H., & de Jonge, H. R. (1994), Heat-stable enterotoxin receptor/guanylyl cyclase C is an oligomer consisting of functionally distinct subunits, which are non-covalently linked in the intestine. J Biol Chem. 269, 16409-16415. 63. Van den, B. W., Cox, E., Oudega, B., & Goddeeris, B. M. (2000), The F4 fimbrial antigen of Escherichia coli and its receptors. Vet Microbiol. 71, 223- 244. 64. Vazquez, F., Gonzalez, E. A., Garabal, J. I., & Blanco, J. (2006), Characterization of fimbriae extracts from porcine enterotoxigenic Escherichia coli strains carrying F6 (987P) antigen. Int Microbiol. 9, 241-246. 65. Whipp, S. C. (1987), Protease degradation of Escherichia coli heat-stable, mouse-negative, pig-positive enterotoxin. Infect Immun. 55, 2057-2060. 66. Williams, P. H. (1979), Novel iron uptake system specified by ColV plasmids: an important component in the virulence of invasive strains of Escherichia coli. Infect Immun. 26, 925-932. 67. Wilson, M. R. & Hohmann, A. W. (1974), Immunity to Escherichia coli in pigs: adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to isolated intestinal epithelial cells. Infect.Immun. 10, 776-782. 68. YokoYama H, Peralta.R, & et al. (1992), Passive protective effed of chicken egg yolk immunoglobulins agaist Experimental Enterotoxigenic Escherichia coli infection in Neonatal piglets. Infection and immunity. Mar, 998-1007. 69. Zhu, C. et al. (1994), Virulence properties and attaching-effacing activity of Escherichia coli O45 from swine postweaning diarrhea. Infect Immun. 62, 4153-4159. ._.