Nghiên cứu Kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội tử nuôi cấy In Vitro bao phấn

à trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Tơi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn ðặng Thị Mai Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành đợc bản luận văn này tơi đã nhận đợc rất nhiều sự chia sẻ và giúp đỡ. Qua đây tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: - TS. Nguyễn Thị Kim Thanh, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hồn chỉnh luận văn. - Tập thể các thầy cơ giáo trong bộ mơn Sinh lý thực vật - Khoa Nơng học - Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong quá trình thực tập. - Tập thể cán bộ bộ mơn Cơng nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Rau Quả đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và người thân đã động viên, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập. Tác giả luận văn ðặng Thị Mai Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn đề 1 1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài 3 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây dưa chuột 4 2.2 Kỹ thuật nuơi cấy bao phấn 9 2.3 Cây đơn bội và vị trí của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng. 15 2.4 Những nghiên cứu về kỹ thuật nuơi cấy bao phấn tạo cây đơn bội In vitro trên thế giới và trong nước 18 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 26 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo callus từ nuơi cấy invitro bao phấn dưa chuột 35 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền mơi trường dinh dưỡng cơ bản đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 35 4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ở 4oC đến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 39 4.1.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 43 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………iv 4.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ auxin đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 46 4.1.5 Ảnh hưởng của của tổ hợp auxin và cytokinin đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 57 4.2 Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 65 4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ Thidiazuron (TDZ) đến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 65 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự tái sinh từ callus của bao phấn dưa chuột 68 4.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ+ BAP đến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 70 4.2.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng trong mơi trường tạo callus đến khả năng tái sinh cây 72 4.2.6 Kết quả phân tích độ bội của cây dưa chuột thu được bằng phương pháp xác định gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy Flow cytometry 76 4.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cây dưa chuột đơn bội invitro. 76 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội 77 4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột đơn bội 79 4.3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột đơn bội (sau 6 tuần) 81 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 84 5.1. Kết luận 84 5.2. ðề nghị 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC 92 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT α-NAA α -Naphthaleneacetic acid BAP 6 - Benzylamino purine 2,4D 2,4 - dichlorophenoxi aceticacid IAA Indole -3- aceticacid KI Kinetin TDZ Thidiazuron CNM Cao nấm men MS Murashige & Skoog, 1962 CW Nước dừa B5 Gamborg (1968) N6 Chu và Cs (1975) CT Cơng thức CTTD Chỉ tiêu theo dõi CTTN Cơng thức thí nghiệm ð/C ðối chứng NXB Nhà xuất bản ppm Nồng độ mg/l TB Trung bình Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 7 2.2. Tình hình xuất nhập khẩu dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 8 4.1. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng cơ bản đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 36 4.2. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng cơ bản đến động thái tăng trưởng callus 36 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 40 4.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 42 4.5. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 44 4.6. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 45 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ αNAA đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 48 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ αNAA đến đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 49 4.9. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 51 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 52 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………vii 4.11. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 54 4.12. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến động thái tăng trưởng callus 55 4.13. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + KI đến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 58 4.14. Ảnh hưởng của 2,4D + KI đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 60 4.15. Ảnh hưởng của 2,4D + BAP đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 62 4.16. Ảnh hưởng của 2,4D + BAP đến động thái tăng trưởng callus qua các thời điểm theo dõi 63 4.17. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến sự tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 66 4.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 69 4.19. Ảnh hưởng của TDZ + BAP đến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 70 4.20. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng trong mơi trường tạo callus đến khả năng tái sinh cây 73 4.21. Kết quả phân tích độ bội của các chồi dưa chuột 76 4.22. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội (sau 6 tuần) 77 4.23. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột đơn bội (sau 6 tuần) 80 4.24. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột đơn bội (sau 6 tuần) 82 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1. Ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng cơ bản đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 37 4.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 40 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến động thái tăng trưởng của callus qua các thời điểm theo dõi 42 4.4. Ảnh hưởng của chiều dài nụ hoa đến động thái tăng trưởng của callus qua các thời điểm theo dõi 45 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ αNAA đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 48 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 51 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 54 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến động thái tăng trưởng của callus qua các thời điểm theo dõi 56 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D+KI đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 58 4.10. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D+ BAP đến tỷ lệ bao phấn tạo callus 62 4.11. Sự tái sinh callus từ bao phấn dưa chuột 64 4.12. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến tỷ lệ mẫu tái sinh 66 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến tỷ lệ mẫu tái sinh 69 4.14 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng trong mơi trường tạo callus đến tỷ lệ mẫu tái sinh của callus bao phấn dưa chuột 73 4.15. Các dạng tái sinh của callus bao phấn dưa chuột 74 4.16. Kết quả phân tích độ bội của cây dưa chuột thu được bằng máy Flow cytometry 75 4.17 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột 78 4.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi sau 6 tuần 80 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn đề Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) là loại cây rất quen thuộc ở nước ta. Quả cĩ thể dùng ăn tươi hoặc chế biến được nhiều mĩn ăn ngon. Ngồi ra, dưa chuột cịn cĩ giá trị như một vị thuốc quý, trong quả dưa chuột cĩ chứa hàm lượng vitamin C khá cao và một số men cĩ lợi cho kích thích tiêu hố rất tốt cho sức khỏe. ðặc biệt, quả dưa chuột đã được chế biến thành nhiều mặt hàng đa dạng như: đĩng lọ, thái lát, muối mặn... xuất khẩu sang một số nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, ðài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo... [10] Trong những năm gần đây mặc dù đã cĩ nhiều cĩ gắng trong cơng tác chọn, tạo giống nhưng bộ giống dưa chuột ở nước ta vẫn cịn nhiều hạn chế. Các giống dưa chuột dùng cho ăn tươi, tiêu thụ nội địa thì năng suất, hiệu qủa kinh tế thấp. Các giống dùng cho chế biến cơng nghiệp, xuất khẩu cịn quá ít khơng đủ đáp ứng cho nhu cầu sản xuất. Trước yêu cầu của thực tế sản xuất, việc chọn tạo những giống dưa chuột cĩ năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho nhu cầu ăn tươi và chế biến là rất cần thiết. Ở hầu hết các nước việc chọn tạo các giống dưa mới đều theo hướng tạo ra các giống dưa F1 cĩ ưu thế lai cao từ các dịng bố mẹ thuần chủng. Nhưng dưa chuột cĩ đặc điểm là cây đơn tính cùng gốc, giao phấn chủ yếu nhờ cơn trùng nên việc tạo ra các dịng thuần bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và cơng sức. Dịng thuần được tạo ra bằng cách tự thụ phấn và chọn lọc qua nhiều thế hệ (7 - 8 thế hệ). Mặc dù vậy phương pháp này nhiều khi vẫn khơng đạt được dịng bố mẹ đồng hợp tử ở tất cả các cặp alen. Chính vì vậy, việc rút ngắn thời gian chọn tạo dịng thuần là một yêu cầu rất quan trọng trong cơng tác chọn tạo giống mới nĩi chung và chon tạo giống dưa chuột nĩi riêng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………2 Bằng phương pháp nuơi cấy bao phấn dưa chuột sẽ khắc phục nhược điểm của phương pháp trên. Cây đơn bội kép tạo ra từ nuơi cấy bao phấn cĩ độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly trong các thế hệ sau và cĩ thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rất nhiều cơng sức, tiền của và đặc biệt rút ngắn thời gian cho cơng tác chọn tạo giống. Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro thơng qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuơi cấy bao phấn cho phép nhanh chĩng tạo ra cơ thể đơn bội và thơng qua sự đa bội hố tạo ra cơ thể đồng hợp tử[16]. ðây là nguồn vật liệu quan trọng cho việc tạo ra giống dưa chuột cĩ ưu thế lai cao. Do đĩ, để nâng cao hiệu quả trong việc tạo ra dịng thuần bằng phương pháp nuơi cấy bao phấn thì việc tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình nuơi cấy là rất cần thiết. Hiện nay, trên thế giới kỹ thuật nuơi cấy bao phấn tạo cây đơn bội invitro đã được nhiều nước nghiên cứu và đã thu được thành cơng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: Lúa, ngơ, ớt, thuốc lá, dưa hấu, bầu bí....Những nước đi đầu trong lĩnh vực này là Pháp, Mỹ, Trung Quốc và Nhật Bản.... Ở Việt Nam, Việc nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật nuơi cấy bao phấn tạo cây đơn bội invitro đã thu được một số thành cơng nhất định. Tuy nhiên, cơng tác này mới chỉ tập trung chủ yếu trên lúa và ngơ. Những nghiên cứu về nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột cịn rất hạn chế, cho đến nay chưa cĩ quy trình hồn thiện về nuơi cấy bao phấn tạo cây dưa chuột đơn bội invitro. Trước yêu cầu của thực tế của sản xuất cùng với việc kế thừa các kết quả nghiên cứu trong và ngồi nước, chúng tơi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội từ nuơi cấy in vitro bao phấn’’. Trên đây cũng chính là một phần của đề tài nghiên cứu cấp bộ: “Nghiên cứu tạo dịng đơn bội kép (dưa chuột, ớt) phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai”. Thuộc chương trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp giai đoạn 2006 – 2010. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………3 1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích của đề tài Xây dựng quy trình kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội bằng nuơi cấy bao phấn nhằm cung cấp nguồn vật liệu khởi đầu cho cơng tác tạo giống dưa chuột ưu thế lai bằng cơng nghệ đơn bội kép. 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo callus từ nuơi cấy invitro bao phấn dưa chuột (thời gian xử lý lạnh, kích thước nụ hoa, mơi trường dinh dưỡng cơ bản, chất điều tiết sinh trưởng...) . - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung một số chất điều tiết sinh trưởng vào mơi trường nuơi cấy đến khả năng tái sinh chồi từ callus. - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung một số chất điều tiết sinh trưởng và dịch chiết hữu cơ vào mơi trường nuơi cấy đến khả năng nhân nhanh in vitro cây dưa chuột đơn bội. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ðề tài gĩp phần cung cấp dẫn liệu khoa học về: Tác động của các yếu tố như thời gian xử lý lạnh, kích thước nụ hoa, nền mơi trường dinh dưỡng cơ bản, chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn, khả năng tái sinh chồi từ callus, khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội in vitro. Từ đĩ đề xuất quy trình nuơi cấy in vitro bao phấn tạo cây đơn bội . Sản phẩm của đề tài sẽ được dùng làm nguồn vật liệu khởi đầu cho cơng tác chọn tạo giống dưa chuột ưu thế lai. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây dưa chuột 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố Cây dưa chuột thuộc họ bầu bí, cĩ nguồn gốc ở vùng rừng nhiệt đới ẩm thuộc Nam Châu Á (ven ðơng Ấn ðộ, Malaca, Nam Trung Quốc), thuộc nhĩm cây ưa nhiệt. Trong họ bầu bí, dưa chuột là cây được trồng nhiều hơn. Dưa chuột cĩ mặt ở Trung Quốc rất sớm, hơn 100 năm trước cơng nguyên, tuy nhiên hầu hết các loại dưa chuột cĩ ở Châu Phi. Nhiều tài liệu cho rằng dưa chuột cĩ nguồn gốc từ dãy núi Hymalaya nơi cĩ những lồi dưa chuột hoang dại cĩ quan hệ chặt chẽ với lồi cucumis Hardi wichil Royle và được đưa đến một số vùng Tây Châu Á, Bắc Phi, Nam Châu Âu. Dưa chuột được gieo trồng ở Ấn ðộ cách đây 3000 năm. Từ đĩ được lan truyền khắp các nước trên thế giới, đặc biệt các vùng nhiệt đới. Vì vậy, dưa chuột là loại rau ưa nhiệt độ ấm áp và những vùng nhiệt đới mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp để trồng dưa chuột là 18 – 30oC[3]. Ở nước ta, cây dưa chuột cĩ thể trồng được ở tất cả các vùng trong cả nước nhưng thích hợp nhất chủ yếu ở đồng bằng và trung du, miền núi phía bắc. Một số tỉnh trồng nhiều dưa chuột như Hải Dương, Hải Phịng, Hưng Yên, Nam ðịnh, Hà Nội, Phú Thọ...[10] 2.1.2 Giá trị dinh dưỡng và kinh tế * Giá trị dinh dưỡng Dưa chuột là loại rau truyền thống, được trồng lâu đời trên thế giới và đã trở thành một trong các thực phẩm thơng dụng của nhiều dân tộc. Dưa chuột cĩ thể ăn tươi, dùng để giải khát rất tốt, hoặc cũng cĩ thể dùng để trộn xalát, muối chua, muối mặn hoặc đĩng hộp. Quả dưa chuột cĩ hàm lượng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………5 nước thấp hơn các loại quả khác trong họ bầu bí nhưng lại cĩ hàm lượng protêin cao. Dưa chuột cĩ nhiều loại đường, và một số loại axit amin, bêta - caroten, Vitamin B1, C, Canxi, phốt pho, sắt và kali. Do đặc điểm giàu các nguyên tố khống như kali và ít Natri, dưa chuột kích thích sự lưu thơng nước trong cơ thể, cĩ tác dụng lợi tiểu và tái tạo khống. Ngồi ra, dưa chuột cĩ cơng dụng thanh nhiệt, chống khát, giải độc, tốt cho người tiểu tiện khĩ, rơm sảy. Dưa chuột cĩ tác dụng ức chế sự hình thành mỡ trong cơ thể, đồng thời làm giảm cholesterol và chống khối u. Bên cạnh đĩ dưa chuột cịn cĩ tác dụng làm đẹp, đắp mặt nạ bằng dưa chuột cĩ tác dụng bảo vệ da và chống lại các nếp nhăn. Theo “Bảng thành phần hố học thức ăn Việt Nam - 1972”: Trong 100g dưa leo ăn được cĩ chứa 95% nước, Protein 0,8 mg; Gluco 3,0 mg; Canxi 23 mg; Photpho 27 mg; tiền Vitamin A 0,3 mg; vitamin B1 0,04 mg; vitamin PP 0,1 mg và Vitamin C 5mg [1],[4]. Ngồi những giá trị về dinh dưỡng như trên thì dưa chuột cịn cĩ giá trị như một vị thuốc quý. Ở Trung Quốc người ta dùng làm thuốc thanh nhiệt, lợi niệu, giải độc, dùng trị tiểu tiện bất lợi, hầu họng sưng đau, đau mắt do nĩng và vết thương bỏng lửa[9]. * Giá trị kinh tế Dưa chuột là loại rau ăn quả cĩ thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao. Trong vụ thu - đơng cĩ thời gian chiếm đất 70 - 85 ngày, mỗi ha cĩ thể thu được 15 - 20 tấn quả xanh, trong vụ xuân - hè khả năng cho năng suất cịn cao hơn nữa. Vì vậy, trong những năm gần đây, dưa chuột là loại cây trồng đã được một số địa phương mạnh dạn đưa vào sản xuất và thu được hiệu quả kinh tế cao[10]. Một thí dụ điển hình là hợp tác xã Minh Tân, huyện Vụ Bản, Nam ðịnh. Các xã viên thu hoạch dưa chuột vụ xuân được hơn 1,8 tấn/sào, giá bán 700 đồng/kg, thu về khoảng 1,3 triệu đồng. Như vậy, chỉ tính riêng trồng dưa Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………6 chuột xanh xuất khẩu vụ đơng và vụ xuân đã cho thu nhập gần 70 triệu đồng; thêm một vụ lúa mùa nữa thì thu nhập cả năm khơng dừng lại ở con số 80 triệu đồng/năm. Theo số liệu điều tra của viện Kinh tế Nơng nghiệp Năm 2005 tại 4 tỉnh phía bắc gồm Hà Nội, Hà Tây, Nam ðịnh, Thái Bình cho thấy hiệu quả thu được từ việc trồng dưa chuột gấp 1,6 - 7,0 lần so với các loại cây trồng khác như lúa, ngơ, bắp cải, cà chua....[10] Ngồi ra, dưa chuột cịn là nguyên liệu cho ngành cơng nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu cĩ giá trị thu ngoại tệ lớn. Hiện nay các loại rau xuất khẩu chính của nước ta là: Dưa chuột, cà chua, cà rốt, hành, ngơ rau…Trong đĩ dưa chuột, cà chua cĩ nhiều triển vọng và chúng cĩ thị trường xuất khẩu tương đối ổn định đĩ là: Trung Quốc, ðài Loan, Nhật Bản, Tiệp Khắc, ðức, Mỹ, Nga và Sigapore…[15]. Theo số liệu của tổng cục thống kê về xuất khẩu rau quả Việt Nam, dưa chuột được chế biến chẻ thanh đã xuất khẩu sang thị trường Châu Âu từ năm năm trở lại đây trung bình 2.309 tấn mỗi năm[37]. Trong những năm tới, thị trường nhập khẩu mặt hàng này khơng những ổn định mà cịn tăng về chủng loại và khối lượng. Việc tổ chức sản xuất tốt cùng việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật mới về giống, thâm canh và cơng nghệ chế biến sẽ cịn mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn [15]. 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dưa chuột Dưa chuột là loại rau ăn quả cĩ thể được sử dụng để ăn tươi, dầm dấm hay muối mặn…Quả dưa chuột cĩ thể chế biến thành nhiều mặt hàng khác nhau. Do đĩ loại cây này đang là nguồn thu của nhiều quốc gia. Trong những năm gần đây đã cĩ nhiều nước trên thế giới xuất, nhập khẩu loại quả này dưới dạng ăn tươi hay chế biến. Dưới đây là bảng số liệu thống kê tình hình sản xuất dưa chuột của một số nước trên thế giới năm 2005. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………7 Bảng 2.1: Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 STT Quốc gia Diện tích (ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (1000 tấn) Tồn thế giới 2.483.200 168,4 41.807,8 1 Trung Quốc 1.553.100 171,0 26.559,6 2 Cameroon 100.000 120,0 1.200,0 3 Liên Bang Nga 87.000 149,4 1.300,0 4 Iran 80.000 175,0 1.400,0 5 Hoa Kỳ 68.660 141,2 969,4 6 Thổ Nhĩ Kỳ 60.000 287,5 1.725,0 7 Ukraine 55.000 135,6 7.126,0 8 Indonesia 50.064 84,6 423,3 9 Pháp 541 234,9 127,1 10 Newtherlands 600 725,0 435,0 11 Anh 130 472,3 65,5 12 Bỉ 83 277,1 230,0 13 ðức 40 400,0 14,0 14 Iseland 3 333,3 10,0 (Nguồn: FAO 2006) Trong những năm gần đây đã cĩ nhiều nước trên thế giới xuất, nhập khẩu loại quả này dưới dạng ăn tươi hay chế biến. Các nước nhập khẩu dưa chuột lớn nhất thế giới là Hoa Kỳ (423.431 tấn), ðức (410.084 tấn), Anh (104.054 tấn), Newtherlands (66.091 tấn) và Pháp (59.019 tấn). Trong khi đĩ các nước xuất khẩu dưa chụơt lớn nhất là Tây Ban Nha (399.256 tấn), Mexico (398.971 tấn), Newtherlands (360.054 tấn), Jordan (64.308tấn) và Canada (54.967 tấn). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………8 Bảng 2.2: Tình hình xuất nhập khẩu dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 Nhập khẩu Xuất khẩu Quốc gia Khối lượng (tấn) Quốc gia Khối lượng (tấn) Hoa Kỳ 423.431 Tây Ban Nha 399.256 ðức 410.084 Mexico 398.971 Anh 104.054 Newtherlands 360.054 Newtherlands 66.091 Jordan 64.308 Pháp 59.019 Canada 54.967 Liên Bang Nga 44.112 Hoa Kỳ 48.460 CH.Czech 43.256 Honduras 38.253 Canada 42.470 Iran 36.948 Thế giới 1.545.819 Thế giới 1.331.695 (Nguồn: FAO 2006) Như vậy, nhiều quốc gia vừa xuất khẩu vừa nhập khẩu dưa chuột. ðiều đĩ cho thấy rằng cơng nghệ chế biến đồ hộp chỉ đang tập trung vào một số nước phát triển như Hoa kỳ, Canada… Những nước này, ngồi lượng dưa chuột sản xuất trong nước đã nhập khẩu một lượng lớn dưa chuột ở dạng quả tươi, sau quá trình chế biến, xuất khẩu dưa chuột dưới dạng đồ hộp[10]. Nước ta, dưa chuột được xuất khẩu chủ yếu ở một số tỉnh phía Bắc, một số cơng ty rau qủa Hà Nội, cơng ty rau quả Thanh Hố, Hải Dương… thu lợi nhuận cao. Các mặt hàng dưa chuột xuất khẩu chủ yếu dưới dạng quả tươi, dưa bao tử, dưa chuột muối dưa, dầm giấm… sang một số nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Trung Quốc, ðài Loan, Nhật Bản …[15] Hải Dương và Hưng Yên là 2 tỉnh đứng đầu về diện tích và sản lượng dưa chuột. Theo số liệu thống kê cho thấy năm 2003 Hưng Yên cĩ 559 ha trồng dưa chuột, sản lượng 94,58 ngàn tấn, năng suất 16,91 tấn/ha, năm 2004 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………9 diện tích đạt 725 ha, sản lượng 423,9 ngàn tấn, năng suất 19,64 tấn/ha. Năm 2000, tỉnh Hải Dương xuất khẩu được 8.000 tấn, năm 2004 đạt 15.000 tấn, tỉnh Thái Bình xuất khẩu đạt 62,5 tấn, năm 2001 đạt 72 tấn, dự kiến đến năm 2010 xuất khẩu đạt 20.000 tấn. Như vậy, dưa chuột là cây trồng quan trọng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nơng nghiệp nước ta và gĩp phần thực hiện thắng lợi chương trình 1 tỷ đơ la Mỹ xuất khẩu rau quả đến năm 2010.[15]. 2.2 Kỹ thuật nuơi cấy bao phấn 2.2.1 Giới thiệu chung Nuơi cấy bao phấn là kỹ thuật nuơi cấy invitro bao phấn trong cĩ chứa các tiểu bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong mơi trường dinh dưỡng tạo ra cây đơn bội, là một lối thốt kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào cơng tác chọn giống cây trồng. Thơng qua phương pháp này ta cĩ thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khĩ khăn trong lai xa. Các dịng thuần cĩ thể nhanh chĩng được tạo ra từ nuơi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất. Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuơi cấy bao phấn như sau [13],[36]: Phơi hố Cây đơn bội Tạo callus Cây đơn bội Nuơi cấy bao phấn trên mơi trường dinh dưỡng đặc hiệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………10 Một số ưu điểm của phương pháp này như sau: Kỹ thuật khá đơn giản, ở một số lồi sự phân chia tế bào dễ dàng ngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín. Tỷ lệ hạt phấn cĩ phản ứng tốt với mơi trường nuơi cấy cao (tần suất cảm ứng mơi trường cao) và cĩ thể sản xuất thể đơn bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn Một số nhược điểm chính của tạo thể đơn bội bằng nuơi cấy bao phấn là: ðối với một số lồi nhiều cây tạo ra khơng phải là đơn bội. Ở cây ngũ cốc, thu được cây xanh rất ít; nhiều cây bạch tạng hoặc bị thể khảm[36] . Nuơi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dịng đồng hợp tử, trong một quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền thống[25], [45], [51]. Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của nuơi cấy bao phấn, chúng cĩ đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và được coi là nguồn vật liệu đa dạng phong phú cho chọn tạo giống [41], [44], [22]. Thơng qua phương pháp này ta cĩ thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khĩ khăn trong lai xa. Các dịng thuần cĩ thể nhanh chĩng được tạo ra từ nuơi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất. Như vậy, phương pháp nuơi cấy bao phấn đã gĩp phần rút ngắn rất nhiều thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề trong lai xa. Chính vì vậy mà phương pháp này đang được áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam. 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuơi cấy bao phấn Nhiều cơng trình nghiên cứu về nuơi cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quả của nuơi cấy bao phấn nĩi chung và bao phấn dưa chuột nĩi riêng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: ðiều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biện pháp xử lý nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………11 phấn và thành phần của mơi trường dinh dưỡng [20], [26] [31], [35]. *. Ảnh hưởng của cây cho bao phấn. Kiểu gen của cây cho bao phấn nuơi cấy cĩ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuơi cấy khơng những trong phạm vi một chi mà cịn khác nhau giữa các giống trong một lồi. Bao phấn phản ứng trong mơi trường nuơi cấy là một đặc điểm cĩ khả năng di truyền [43], [47], [55]. Tác giả N.A.Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuơi cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuơi cấy, callus chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống. Sự tái sinh cây chỉ cĩ được từ callus của 15 giống. Số liệu thu được ch thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuơi cấy bao phấn [46]. Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến sự hình thành callus và tái sinh cây khi nuơi cấy bao phấn. Niizeki (1983) và Haberlebos (1985) đã chỉ ra tác động cĩ ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, mơi trường đến sự hình thành callus và tái sinh cây. Ngồi ra theo một số nhà khoa học thì ngồi kiểu gen ra cịn cĩ các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng đến nuơi cấy bao phấn (Heberlebor, 1985) [35]. Tuy nhiên trong thời gian gần đây, Quimio & Zapata cho rằng: “sự hình thành callus và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà khơng liên can gì đến các nhân tố tế bào chất”[47]. ðiều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn cũng như mối tương tác giữa yếu tố di truyền và mơi trường bên ngồi đều ảnh hưởng đến phản ứng của bao phấn trong nuơi cấy invitro (Chaleff, 1982) cho rằng: “Nhiệt độ tới hạn của cây cho bao phấn là 18oC”. Hơn nữa, nếu cây sống trong điều kiện nhà lưới cĩ nhiệt độ cao thì sự hình thành callus và tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng[24]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………12 *. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của bao phấn Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuơi cấy cũng cĩ ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuơi cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng. Tuy nhiên khơng phải bất cứ lồi cây trồng nào cũng cĩ hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hồ thảo cĩ nhiều điểm khác nhau. Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho nuơi cấy bao phấn lúa, cịn theo Claphm (1971) lại cho rằng đại mạch cĩ hiệu suất tạo cây cao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm. Một số yếu tố khác hỗ trợ cĩ thể gây nên sự thay đổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong mơi trường nuơi cấy tăng từ 6 đến 9% (Chaleff R.S,1982) [24]. ðể đạt được hiệu quả trong nuơi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai đoạn phát triển của phát triển của hạt phấn cĩ ý nghĩa quan trọng. Chẳng hạn đối với lúa các nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn nhân muộn là tốt nhất (Guzman et al, 2000), cĩ nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm (Zapata, 1983)[59]. Trên cây thuốc lá Sandra M. Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa cĩ chiều dài tương đương nhau[48]. *. Ảnh hưởng của việc xử lý vật liệu trước khi nuơi cấy Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao phấn trước khi nuơi cấy đều cĩ tác động đối với sự hình thành callus và tái sinh cây, nhiệt độ tối thích phụ thuộc vào từng giống. ðiều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh cây cao, callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………13 bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn khơng xử lý. Các giống khác nhau địi hỏi điều kiện xử lý cĩ khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng cĩ ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý. Tác giả khẳng định khả năng hình thành callus tăng lên gấp đơi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình thành cây xanh giảm [16]. Năm 1983 Ying đã nghiên._. cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả nuơi cấy bao phấn đã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mơ sẹo được chứng minh ở nhiều lồi như thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước. Tapia và cs cũng cho là xử lý lạnh làm chậm sự lão hố của hạt phấn, làm tăng sự phân chia của hạt phấn và giúp giải phĩng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính đực (Tapia, 2000). Sugimoto lại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự do và làm thay đổi tương quan giữa các axit amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây đơn bội [49],[58]. Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ từng các giống cây trồng khác nhau. Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả năng tạo mơ sẹo giảm dần, cĩ thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh. ðối với lúa, Gooal và cs (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ ơn hồ 10oC lên bao phấn trong 11 ngày đã nâng tỷ lệ tạo mơ sẹo từ 12,5% lên 32,8%. Ngồi ra Tang và cs cũng cho thấy, tỷ lệ tạo mơ sẹo, tỷ lệ tái sinh cây và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen của cây cho phấn (Tang et al,1998)[53]. Như vậy việc xử lý lạnh đĩng vai trị rất cĩ ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn. Một số phương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma, xử lý trong đều kiện yếm khí tạo ra bởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hồ và với khí cacbonic ở 8oC trong 6 ngày đều cĩ lợi cho sự hình thành callus [28]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………14 *. Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuơi cấy Nhiệt độ trong phịng nuơi cĩ ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và tái sinh cây. Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 250C với biên độ là 25 - 280C và cho tái sinh cây là 20 - 250C. Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích chính là nguyên nhân làm tăng cây bạch tạng. Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phịng nuơi cao hơn 300C thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng. Wang và cộng sự (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ khơng phải ở pha phân hố callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm[56]. *. Ảnh hưởng của thành phần mơi trường nuơi cấy Mơi trường nuơi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nuơi cấy bao phấn, nhiều mơi trường đã được xây dựng và sử dụng như mơi trường White (1953), mơi trường Miashige và Skoog (1962), mơi trường Nitsch (1969), mơi trường Gamborg (1968)... Tuỳ theo từng đối tượng nuơi cấy khác nhau những mơi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều mơi trường khác cho phù hợp. Tuy nhiên cũng cĩ một số quy luật chung: Các cây hồ thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên. Hàm lượng đường cĩ thay đổi tuỳ đối tượng: Lúa mì 60- 120g saccaroza/l, cây họ cà chỉ cần 20- 40g/l. Dịch chiết khoai tây, nấm men, nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra cĩ tác dụng tốt trong nhiều mơi trường nuơi cấy bao phấn [2], [48]. Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hịa sinh trưởng thực vật như auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc mơn và sự cân bằng giữa auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấn với mơi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền. Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………15 lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con. Trong một vài trường hợp lại khơng cần thiết đến sự cĩ mặt của auxin (Evan, 1981) [33]. Những auxin được sử dụng rộng rãi trong mơi trường nuơi cấy bao phấn là: αNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4- dichlorophenoxy acetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid) αNAA ở nồng độ 1 – 2 mg/l được coi là cĩ hiệu quả hơn so với các auxin đơn lẻ hay kết hợp khác[24], [29]. Theo Phan Hữu Tơn (2004) [16] để tạo mơ sẹo đối với cây lúa trong các auxin 2,4D ở nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất. Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại cho rằng phối hợp cả 2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ và các loại hoĩc mơn cịn phụ thuộc vào từng kiểu gen[17]. Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các mơi trường đã được nghiên cứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải được thiết lập cho từng kiểu gen bởi vì khơng cĩ mơi trường đơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim et al, 1987) [40]. Các chất chuyển hố và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose cũng được nghiên cứu, ABA và DDT được coi là ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuơi cấy bao phấn lúa. Trong khi đĩ, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa nước. ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo kiểu gen (Torrizo và Zapata, 1986)[54]. 2.3 Cây đơn bội và vị trí của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng. 2.3.1 Cây đơn bội và đặc điểm di truyền của cây đơn bội Cây đơn bội là cây cĩ số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào dinh dưỡng chỉ cĩ một nửa (n) so với cây bình thường 2n. Như vậy trong cây đơn bội, mỗi chiếc nhiễm sắc thể tương đồng chỉ tồn tại 1 chiếc, hay mỗi một locus Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………16 gen đơn chỉ tồn tại một alen. Trường hợp cây bình thường 2n khơng phải là 2x ( x là bộ nhiễm sắc thể cơ bản) mà là 4x, 6x... thì mỗi nhiễm sắc thể tương đồng cịn cĩ thể cĩ một vài chiếc gần tương đồng khác cùng tồn tại. Khi phân bào giảm nhiễm cĩ thể xuất hiện ghép cặp, trao đổi chéo và cĩ thể sinh ra được giao tử dẫn đến mức độ bất dục giảm đi. Chính do cơ sở tế bào này mà cây đơn bội cĩ những đặc điểm sau[16]: - Cây đơn bội thường cĩ nhiều tình trạng giống với cây lưỡng bội nguồn bình thường nhưng bé nhỏ hơn từ kích thước tế bào đến bộ phận cơ quan do số gen và liều lượng sản phẩm gen giảm nhiều. Chúng cĩ sức sống yếu và cĩ những nét đặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội được thể hiện ra kiểu hình. Cây đơn bội cĩ nguồn gốc từ cây giao phấn chéo thường cĩ sức sống yếu hơn từ cây tự thụ. Các cây đơn bội bất dục mạnh do phân chia giảm nhiễm xảy ra khơng bình thường cá biệt tạo ra các giao tử khơng phân chia mang n nhiễm sắc thể. - Cây đơn bội nếu được lưỡng bội hố sẽ tạo thành cây cĩ kiểu gen đồng hợp tử ở tất cả các gen dẫn đến các tính trạng thuần chủng, điều này cĩ ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn quá trình tạo dịng thuần. - Nếu tác động đột biến vào cây đơn bội sẽ phát hiện được ngay đột biến, sau đĩ nếu lưỡng bội hố sẽ được dạng đồng hợp tử về gen đột biến và dễ dàng duy trì thơng qua sinh sản hữu tính. Chọn lọc cây đơn bội: Khơng phải tất cả các cây tái sinh trong quá trình nuơi cấy bao phấn đều là cây đơn bội. Khi nuơi cấy bao phấn cĩ một số trường hợp xảy ra như: Mơ giao tử cĩ thể tự lưỡng bội hố khi đĩ mơ hoặc cây tạo ra từ mơ này sẽ là cây lưỡng bội. Callus hoặc phơi lưỡng bội cũng cĩ thể được tạo ra từ tế bào vỏ bao phấn lưỡng bội nên sau này cây tái sinh từ mơ này sẽ cho ra cây lưỡng bội nhưng giống hệt với cây mẹ. Cĩ thể xác định cây đơn bội bằng phương pháp như: đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, đo gián Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………17 tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng sinh trưởng, phát triển [16]. 2.3.2 Vị trí của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng Ở thực vật, cây đơn bội được hình thành bằng nhiều hướng khác nhau như: Xử lý đột biến, cứu phơi sau lai xa, thụ tinh giả, nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh, nuơi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời.... Tuy nhiên hướng tạo cây đơn bội từ nuơi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời hiện nay được coi là phương pháp được áp dụng rộng rãi và cho nhiều thành cơng nhất. Nhờ những đặc điểm riêng biệt của cây đơn bội nên chúng được xem là những nguyên liệu lý tưởng cho cơng tác chọn tạo giống cây trồng. Từ lâu các nhà chọn tạo giống đã biết sử dụng dạng đơn bội và thơng qua sự đa bội hố để thu được các dạng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cơng tác chọn tạo[18]. Năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã chứng minh rằng cĩ thể thu được các dịng nhị bội thuần đồng hợp tử bằng cách lưỡng bội hố các thể đơn bội. Năm 1964, hai nhà khoa học người Ấn ðộ Guha và Maheswavi là những người đầu tiên thành cơng trong việc tạo cây đơn bội từ nuơi cấy invitro bao phấn cây cà độc dược Datura innoxia. Từ đĩ kỹ thuật nuơi cấy bao phấn đã phát triển và ngày càng được ứng dụng trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Các tác giả cho rằng bình quân nhà tạo giống cĩ thể tiết kiệm được đến 5 năm khi sử dụng kỹ thuật đơn bội vào việc tạo giống mới. Việc đưa cây đơn bội vào chương trình tạo giống đã trở thành phổ biến trên thế giới[18]. Tại Trung Quốc, cơng nghệ đơn bội đã được triển khai cĩ hệ thống trên quy mơ lớn và cĩ định hướng chiến lược rõ ràng trong tạo giống mới. Hơn một nghìn cơ sở nuơi cấy bao phấn đã hoạt động trên tồn quốc từ những năm 1970. Kết quả đã tạo được trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn, những giống lúa tạo ra từ kỹ thuật đơn bội đã mở rộng sản xuất trên diện tích vài triệu ha. Kỹ thuật nuơi cấy bao phấn ngơ để thu nhận các dịng đơn bội Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………18 kép cũng được ứng dụng thành cơng, hơn 100 dịng thuần đã thu được từ 30 tổ hợp khác nhau (Wu và cs..1983), một số giống được áp dụng trong tạo giống lai và đã được sử dụng trong sản xuất như AC 4115, Elite DK 524 ...(Genovesi,1987). Trên cây ớt hơn 500 cây ớt đơn bội kép đạt được hàng năm sống và chuyển ra cánh đồng. Giống mới cĩ thể phát triển trực tiếp từ con lai và từ các giống lồi. Cho tới nay 6 giống từ nuơi cấy bao phấn và 6 con lai cùng với dịng bố mẹ của chúng từ nuơi cấy bao phấn đã được trồng phổ biến ở Trung Quốc với diện tích trên 38400 ha[18]. Ở Việt Nam kỹ thuật nuơi cấy bao phấn lúa kết hợp với chọn dịng tế bào đã tạo ra 50 dịng bất dục cảm ứng nhiệt độ (TGMS) mới. ðối với cây ngơ việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuơi cấy bao phấn cùng đem lại nhiều thành cơng. Viện Di truyền nơng nghiệp đã hồn thiện quy trình nuơi cấy bao phấn của 2 giống ngơ CM2, CM8 với tần số tái sinh cao (30 - 80 %). Với quy trình này, thời gian tạo dịng thuần rút ngắn từ 5 - 8 thế hệ ngồi đồng ruộng xuống cịn 8 tháng trong phịng thí nghiệm (ðỗ Năng Vịnh, 2005)[18]. ðặc biệt Việt Nam đã sản xuất được các dịng lúa thuần mang gen quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân, gen kết hợp rộng, gen kháng sâu bệnh... để phục vụ chon tạo giống ưu thế lai [11]. 2.4 Những nghiên cứu về kỹ thuật nuơi cấy bao phấn tạo cây đơn bội In vitro trên thế giới và trong nước 2.4.1 Trên thế giới Trong nuơi cấy bao phấn tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu đựơc tỷ lệ cây đơn bội và nhị bội khác nhau, trong một vài trường hợp cĩ thể thu được cây cĩ mức độ bội thể cao hơn (Chu & Cs, 1982) [27]. Các bao phấn dùng để nuơi cấy thường được lấy từ các cây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thể những cây đơn bội được tạo thành. Nhiễm sắc thể của cây đơn bội thơng qua nuơi cấy hạt phấn F1, sau khi lưỡng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………19 bội hố sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dịng thuần, qua đánh giá chọn lọc và cho ra giống mới (Singsit và CS, 1990)[50]. Tác giả Brasiluro và cộng sự (1999) đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu giai đoạn phát triển của bao phấn và ảnh hưởng của xử lý tia gamma trên bao phấn cà chua đến sự hình thành callus. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt phấn trong tế bào phân chia tiền kỳ I sinh ra nhiều calus nhất. Bao phấn và chiều dài nụ hoa đều cĩ ý nghĩa quan trọng liên quan đến giai đoạn phát triển bao phấn. Trong thí nghiệm xử lý tia gamma, các tác giả đã xử lý hạt và nụ hoa cà chua của con lai IPA 5x Rotam4 (F2), IPA6x Rotam4 (F2) và đem cấy trên mơi trường Gresshoff và Doy (1972) cĩ bổ sung các chất điều hồ sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên, các tác giả khơng tìm thấy sự sai khác cĩ ý nghĩa đến sự hình thành callus [23] . ðối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuơi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội cũng được nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu và đã thu được những thành cơng nhất định. Tuy nhiên, dịng đơn bội kép được tạo ra thơng qua nuơi cấy bao phấn cịn nhiều hạn chế [34], [19], [30]. Những yếu tố như đặc tính di truyền, điều kiện trồng của cây mẹ, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuơi cấy, mơi trường và điều kiện nuơi cấy cĩ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình nuơi cấy bao phấn [21]. Với cây dưa hấu tác giả Xue và cộng sự (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi bao phấn ở giai đoạn một nhân, cĩ kích thước 5 mm và nụ hoa cĩ tràng hoa nhìn rõ sẽ cho hiệu quả nuơi cấy tốt nhất. Callus phát sinh trên mơi trường MS muối cĩ bổ sung 2ppm BA + 2ppm Ki + 3 succarose + 6-7% agar ở pH 5,8. Sự phát sinh cơ quan thu được bằng nuơi cấy callus trên mơi trường MS muối cĩ bổ sung agar + 5-10 ppm GA3 + 4ppm BA + 30-40 ppm adenine + 500ppm lactalbumin hydrolysate. Sự phát sinh cơ quan chuyên hố Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………20 và sự phát triển chồi thu được trên mơi trường nuơi cấy MS + 2ppm Triaconital. Rễ phát sinh trên mơi trường agar + ½ MS + 0,2ppm IBA + 1ppm IAA + 1,5% succarose + pH 5,7. Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu được cây đơn bội và đơn bơi kép qua quá trình nuơi cấy [57]. Các nghiên cứu khác trên cây bí ngơ E.I. Metwall cho thấy rằng khi nuơi cấy bao phấn cây ở giai đoạn giữa và cuối của giai đoạn hạt phấn một nhân được thu vào buổi sáng và xử lý ở nhiệt độ 40C trong 4 ngày, khử trùng nụ hoa bằng ethanol 70% trong 2 phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên mơi trường MS + 150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất. Rễ của 20 cây tạo ra được soi ở dưới kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây là đơn bội [32]. Các tác giả Gemes Juhasz, G. Venczel, P. Balogh đã tạo cây đơn bội thơng qua quá trình nuơi cấy nỗn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh. Hoa cái được thu từ cây mẹ trồng trong nhà lưới cĩ chiều dài 2–3 cm đối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm đối với cây dưa chuột. Cắt thành từng lát cấy vào mơi trường cĩ bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, mơi trường phát sinh phơi cĩ chứa NAA và BA đều cĩ kết quả đối với cả dưa chuột và bí xanh [34]. Năm 1974 Eun J. S. và cộng sự khi nuơi cấy bao phấn dưa chuột đã phát hiện calus phát triển từ bao phấn sau khi nuơi cấy 7 ngày trên mơi trường cĩ bổ sung 2,4 D. Sau 30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện[39]. Theo Lazarte, J. E và Sasser, C.C (1982) bao phấn dưa chuột được trên nuơi cấy mơi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đĩ tạo callus trên mơi trường cơ bản MS. Phơi phát triển thành cây con trên mơi trường Nitsch and Nitsch đặc cĩ chứa 20 g/lit raffinos [42]. Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuơi cấy bao phấn dưa chuột. Tác giả T.Suprunova và N.Shmykova đã nuơi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana, Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………21 Kết quả chỉ cĩ giống Gordion cĩ thể tạo cây đơn bội từ nuơi cấy bao phấn. Trong số những chất điều tiết sinh trưởng được nghiên cứu, thidiazuron (TDZ) là tốt nhất cho sự cảm ứng của bao phấn với nồng độ tối ưu nhất là 0,02 mg/l. Dựa vào kết quả nghiên cứu các tác giả khẳng định giai đoạn phát triển tốt nhất của bao phấn để tạo cây đơn bội là tiểu bào tử đơn nhân muộn và sớm [52]. Năm 2002 H. G. Ashok Kumar và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm trên hai giống dưa chuột Calypso và Green Long cho thấy bao phấn dưa chuột của cả hai giống đều thích hợp cho sự tái sinh phơi trực tiếp và tái sinh phơi gián tiếp thơng qua quá trình tạo callus trên mơi trường cơ bản B5cĩ bổ sung 0,25M saccarose và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM. Nụ hoa trước khi nuơi cấy đựơc xử lý lạnh 4oC trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu. Callus hình thành sau hai tuần nuơi cấy và cĩ màu vàng. Callus sau khi hình thành được chuyển sang mơi trường B5 muối và vitamin cĩ chứa 0,09M saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM Ki. Sau đĩ lại được chuyển sang mơi trường để phát sinh phơi là mơi trường B5 muối và vitamin cĩ chứa 0,09M saccarose và 5µM ABA. Cuối cùng để phơi nảy mầm thành cây, callus lại được chuyển sang mơi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25 µM NAA + 0,25 µM KN. Qua soi nhiễm sắc thể ở đầu rễ của 24 cây tái sinh ở mỗi giống đã phát hiện được 21 cây giống Calypso và 17 cây giống Green Long là đơn bội [19]. Tại Trung Quốc năm 2007 Song et al. cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của cây dưa chuột chỉ cĩ 16 kiểu gen tạo được callus. Tác giả đã khẳng định xử lý nụ hoa trước khi nuơi cấy là chìa khố của sự thành cơng trong nuơi cấy bao phấn. Xử lý nhiệt phụ thuộc vào kiểu sinh thái, các lồi dưa chuột từ vùng lạnh cĩ phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh, các lồi dưa chuột từ vùng nĩng cĩ phản ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt. Mơi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus là mơi trường MS cĩ bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3% Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………22 sucrose và 0,8% agar. Mơi trường cho sự phát sinh phơi là MS cĩ bổ sung 0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar. Mơi trường cho sự tái sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar[ 38]. 2.4.1 Trong nước Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro thơng qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong nuơi cấy bao phấn cho phép nhanh chĩng tạo ra hàng loạt cây đơn bội đã là một lối thốt kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng [13]. Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật mang một tính chất đặc biệt (tính tồn năng) nghĩa là một tế bào chuyên hố khi đưa vào điều kiện nhất định, cĩ khả năng phân chia và tái sinh thành cây hồn chỉnh. Trong trường hợp tế bào khởi đầu là bào tử hay giao tử thì cây nhận được cĩ thể là cây đơn bội. Phương pháp nuơi cấy nỗn, bao phấn và bào tử nhằm thu được cây đơn bội chính là dựa trên tính chất đặc biệt này của tế bào thực vật. Bình thường sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn đi theo các giai đoạn sau: Từ tế bào mẹ thơng qua quá trình phân bào giảm nhiễm hình thành các tiểu bào tử (tế bào đơn bội). Sau đĩ từ các tiểu bào tử hình thành các giao tử đực (hạt phấn – cũng là tế bào đơn bội). Nhưng khi ta đưa bao phấn vào nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi. Dưới tác động của một loạt các yếu tố trong mơi trường nuơi cấy, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng, trong các tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hố, từ đĩ các tiểu bào tử sẽ phân chia hình thành mơ sẹo. Các mơ sẹo này lúc đầu bao gồm các tế bào đơn bội. Sau đĩ tuỳ điều kiện nuơi cấy chúng cĩ thể là đơn bội hoặc bị lưỡng bội hố. Khi chuyển mơ sẹo vào mơi trường tái sinh, ta sẽ thu được cây đơn bội hoặc cây lưỡng bội. Tỷ lệ cây đơn bội nhận được phụ thuộc vào các yếu tố như giai đoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì ở giai đoạn mơ sẹo (tuổi mơ sẹo). Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………23 giai đoạn mitos đầu (giai đoạn một nhân) sẽ cho tỷ lệ cây đơn bội cao nhất. ðối với tuổi mơ sẹo thì mơ sẹo nào phát sinh càng sớm và đựơc cấy chuyển sang mơi trường tái sinh cây ngay thì thời gian tái sinh càng ngắn và tỷ lệ cây đơn bội thu được càng cao. ðể tạo ra những cây nhị bội từ mơ sẹo hạt phấn hoặc cây đơn bội, cĩ hai phương pháp thường dùng là xử lý callus hạt phấn hoặc cây đơn bội với colchicine (0,5%) trong 24 – 48 giờ sau đĩ tái sinh cây. Phương pháp thứ hai là tạo mơ sẹo từ các cây đơn bội rồi tái sinh cây. Các thể nhị bội thu được đều là đồng hợp tử (hồn tồn thuần về phương diện di truyền) do chúng cĩ nguồn gốc từ một tế bào đơn bội (Phan Phải, Vũ ðức Quang và cộng sự, 1990) [12]. Tại Viện di truyền nơng nghiệp, bằng phương pháp nuơi cấy bao phấn lúa kết hợp với chọn tạo dịng tế bào đã tạo ra 50 dịng bất dục đực cảm ứng với nhiệt độ (TGMS), 12 dịng giống thuần cĩ ưu thế lai gần tương đương con lai F1 là DT26, DT29, J1, AC24. ðối với ngơ, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuơi cấy bao phấn cũng đem lại nhiều thành cơng. Viện di truyền nơng nghiệp đã hồn thiện quy trình nuơi cấy bao phấn của 2 giống ngơ CM2, CM8 với tần số tái sinh cao (30 - 80%). Với quy trình này, thời gian tạo dịng thuần rút ngắn từ 5 - 8 thế hệ ngồi đồng ruộng xuống cịn 8 tháng trong phịng thí nghiệm [18]. ðặc biệt chúng ta đã sản xuất được những dịng lúa thuần mang gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân, gen kết hợp rộng, gen kháng sâu bệnh…để phục vụ cho tạo giống ưu thế lai [11]. Việc nghiên cứu tối ưu hố các điều kiện nuơi cấy là cần thiết đối với chương trình nghiên cứu tạo giống. Các nghiên cứu tiến hành tại Viện di truyền nơng nghiệp cho thấy cĩ thể nâng cao hiệu quả nuơi cấy bao phấn bằng các phương pháp sau: Nâng cao hiệu quả nuơi cấy bao phấn bằng cải tiến quy trình nuơi cấy như: xử lý nhiệt bao phấn trước và sau khi cấy. xử lý mannitol trước khi nuơi cấy ở 14oC làm tăng đáng kể số phơi tạo thành, bổ sung chất điều hồ sinh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………24 trưởng như kinetine 1mg/l cho hiệu quả tái sinh cây từ phơi hình thành trong nuơi cấy bao phấn cao nhất (8,8%) (Lê Huy Hàm và cs, 2000)[6]. Khi nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuơi cấy tạo cây đơn bội, tác giả Nguyễn ðức Thành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho nuơi cấy cĩ thể là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời. Sử dụng bao phấn để nuơi cấy đơn giản hơn về mặt kỹ thuật và mơi trường nuơi cấy nhưng mơ và cây cĩ thể tạo thành từ mơ soma của thành bao phấn và như vậy rất khĩ phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn. Tuy nhiên thành bao phấn lại cĩ vai trị quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn. Hạt phấn được khởi đầu phân chia trong bao phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tục phát triển. Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn và đĩng vai trị như bể chứa chất trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổi các chất từ mơi trường nuơi cấy. ðối với hạt phấn tách rời sẽ rất khĩ khăn để nuơi cấy và mơi trường nuơi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn. Sự ổn định pH là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào vì vậy pH mơi trường cũng cần được quan tâm. Sự bền vững và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào pH mơi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường là 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong mơi trường cĩ khuynh hướng kết tủa[14]. Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc lồi phụ Japonica cĩ tỷ lệ tạo callus cao hơn các giống lúa thuộc lồi phụ Indica, xử lý địng ở nhịêt độ 7oC trong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và mơi trường tái sinh cây thích hợp cho nhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin + 1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [8]. Khi nuơi cấy bao phấn của các dịng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với mơi trường tác giả Nguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận điều kiện ngoại cảnh của cây cho bao phấn ( ánh sáng, nhiệt độ, chế độ dinh dưỡng....) và đặc biệt Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………25 là yếu tố mùa vụ cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dịng EGMS. Nuơi cấy các dịng lúa EGMS khi hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ đem lại hiệu quả cao hơn nhiều so với nuơi cấy ở thời điểm hạt phấn bất dục [7]. Trên cây dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Dung khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuơi cấy bao phấn của các giống dưa hấu (Hắc Mỹ Nhân, Siêu Nhân 0110, SG 221) cho biết xử lý nụ hoa ở nhiệt độ 7oC trong 1 ngày và cấy trên mơi trường B5 cĩ bổ sung 1mg/l Ki + 1mg/l 2,4D + 3% Saccarose cho tỷ lệ tái sinh callus cao nhất [5]. Trong chọn tạo giống dưa chuột bằng phương pháp truyền thống, để tạo được dịng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 7- 8 thế hệ (3- 4 năm), mất rất nhiều thời gian và kinh phí, đồng thời kéo dài thời gian cho cơng tác chọn tạo giống. Bằng phương pháp nuơi cấy hạt phấn dưa chuột sẽ khắc phục nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống. Cây đơn bội kép tạo ra từ nuơi cấy hạt phấn cĩ độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly trong các thế hệ sau và cĩ thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rất nhiều kinh phí và đặc biệt rút ngắn thời gian cho cơng tác chọn tạo giống dưa chuột. Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội phục vụ cơng tác tạo dịng thuần trong chọn tạo giống cây trồng vẫn cịn nhiều hạn chế. Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứng dụng được một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngơ cịn các đối tượng cây trồng khác chưa được nghiên cứu nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu nuơi cây bao phấn đối với nhiều loại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết. ðặc biệt là trong cơng cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng, để phát triển ngành nơng nghiệp cần phát triển ngành cơng nghiệp chế biến, đẩy mạnh xuất khẩu, vấn đề rút ngắn thời gian tạo dịng thuần phục vụ cơng tác chọn tạo giống cần được quan tâm nhiều hơn nữa. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………26 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu - Giống dưa chuột: đề tài được tiến hành trên 2 giống dưa chuột bao tử lai F1: Marinda cĩ nguồn gốc từ Hà Lan và Valaspik cĩ nguồn gốc từ Mỹ. ðây là những giống cho 100% hoa cái (gynoecious), hoa mọc chùm, tạo quả khơng qua thụ phấn (partenocarpic). Vật liệu thí nghiệm là các nụ hoa cĩ kích thước khác nhau tuỳ theo từng thí nghiệm. - Hố chất: đề tài tiến hành với các hố chất trong thành phần mơi trường cơ bản MS (Muashige Skoog, 1962 ), N6(Chu và Cs, 1975), B5 (Gamborg, 1968) và các chất kích thích sinh trưởng như BAP (6 - Benzylamino purine), αNAA (α - Naphthaleneacetic acid), IAA (Indole -3- aceticacid), KI (Kinetin), 2,4D (2,4 - dichlorophenoxi aceticacid), TDZ (Thidiazuron) và dịch chiết cao nấm men. 3.1.2 ðịa điểm và thời gian nghiên cứu - ðịa điểm: ðề tài được tiến hành tại phịng thí nghiệm bộ mơn Cơng nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Rau Quả, phân tích độ bội của cây được tiến hành tại Viện Di truyền nơng nghiệp - Thời gian thực hiện đề tài: Từ 6/2008 đến 8/2009. 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 3.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo callus từ nuơi cấy invitro bao phấn dưa chuột Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hồn tồn, mỗi cơng thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc 30 đĩa petri và mỗi đĩa cấy 20 bao phấn. * Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền mơi trường dinh dưỡng cơ bản đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………27 CTTN Mơi trường Ký hiệu CT1 Mơi trường Muashige Skoog (1962) MS CT2 Mơi trường Chu và Cs (1975) N6 CT3 Mơi trường Gamborg (1968) B5 Nụ hoa thu với các kích thước được xử lý lạnh ở 40C trong 48 giờ, cấy trên các mơi trường cơ bản cĩ bổ sung 1ppm BAP; 2ppm 2,4D; 15% CW; 5g agar/l. Sau thí nghiệm 1 tìm ra nền mơi trường cơ bản tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo. * Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh nụ hoa đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột CTTN Thời gian xử lý lạnh (giờ) Ký hiệu CT1 0 L0 CT2 12 L12 CT3 24 L24 CT4 36 L36 CT5 48 L48 CT6 60 L60 Sau thí nghiệm 2 tìm ra được thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo. * Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nụ hoa đến hiệu quả tạo callus từ nuơi cấy in vitro bao phấn dưa chuột CTTN Kích thước nụ hoa CT1 5 - 9 mm CT2 10 - 15 mm CT3 16 - 20 mm Nụ hoa thu với các kích thước khác nhau xử lý lạnh thích hợp nhất TN2, cấy trên các mơi trường cơ bản cĩ bổ sung 1ppm BAP; 2ppm 2,4D; 15% CW; 5g agar/l. Kích thước nụ hoa được đo theo chiều dài nụ hoa (từ đế nụ đến đỉnh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………28 nụ hoa). Sau thí nghiệm 3 xác định được kích thước nụ hoa thích hợp nhất cho sự tái callus để sử dụng cho các thí nghiệm tạo callus tiếp theo. * Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ auxin trong mơi trường nuơi cấy đến hiệu quả callus từ nuơi cấy invitro bao phấn dưa chuột Trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành trên 3 nhĩm chất auxin đĩ là: αNAA, IAA và 2,4D so sánh với đối chứng khơng bổ sung auxin. Thí nghiệm được bố trí như sau: CTTN Nồng độ αNAA; IAA; 2,4D (ppm) Ký hiệu CT1 0 ðC CT2 0,5 0,5 ppm CT3 1,0 1,0 ppm CT4 1,5 1,5 ppm CT5 2,0 2,0 ppm CT6 2,5 2,5ppm CT7 3,0 3,0 ppm Sau thí nghiệm 4 tìm ra được loại auxin và nồng độ auxin tốt nhất để sử dụng cho thí nghiệm 5. * Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh của tổ hợp auxin + cytokinin trong mơi trường nuơi cấy đến hiệu quả callus từ nuơi cấy invitro bao phấn dưa chuột Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng một loại auxin ở nồng độ thích hợp nhất trong thí nghiệm 4 kết hợp với Kinetin (KI) và Benzyl amino purine (BAP). Các cơng thức thí nghiệm đều được bố trí như sau: CTTN Nồng độ KI; BAP (ppm) Ký hiệu CT1 0,0 ðC C._. ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 6 3315.296 552.549 667.252 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 3.973 1.986 2.399 ║ ║ Sai so │ 12 9.937 0.828 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 20 3329.206 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.828 Phan do nhan to = 183.907 Chiem ti le : 0.45% 99.55% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 3 Gia tri 8.653 24.850 37.757 45.095 45.669 42.447 40.397 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.828 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.910 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 12 bac tu do : 2.179 He so bien dong CV : 2.60 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[7] M[6] M[4] M[5] 8.65 24.85 37.76 40.40 42.45 45.10 45.67 a b c d e f──────f ---------------------------------------- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………97 *. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến tỷ lệ bao phấn tạo callus. Giống valaspik THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 9.187 0.459 0.050 8.780 9.685 Muc 2 3 26.823 1.428 0.053 25.349 28.200 Muc 3 3 38.448 1.177 0.031 37.269 39.623 Muc 4 3 46.592 1.059 0.023 45.475 47.582 Muc 5 3 46.849 1.108 0.024 45.670 47.869 Muc 6 3 43.664 1.147 0.026 42.516 44.811 Muc 7 3 41.071 1.073 0.026 39.914 42.032 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 6 3370.189 561.698 408.889 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 0.416 0.208 0.151 ║ ║ Sai so │ 12 16.485 1.374 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 20 3387.090 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 1.374 Phan do nhan to = 186.775 Chiem ti le : 0.73% 99.27% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 3 Gia tri 9.187 26.823 38.448 46.592 46.849 43.664 41.071 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 1.374 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 1.172 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 12 bac tu do : 2.179 He so bien dong CV : 3.25 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[7] M[6] M[4] M[5] 9.19 26.82 38.45 41.07 43.66 46.59 46.85 a b c d e f──────f Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………98 *. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và Kinetin đến tỷ lệ bao phấn tạo callus. Giống marinda THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 45.988 1.004 0.022 45.000 47.007 Muc 2 3 49.218 0.983 0.020 48.348 50.284 Muc 3 3 57.115 1.572 0.028 55.550 58.693 Muc 4 3 55.657 0.977 0.018 54.738 56.683 Muc 5 3 49.896 0.982 0.020 48.833 50.768 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 4 260.831 65.208 63.273 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 4.479 2.239 2.173 ║ ║ Sai so │ 8 8.245 1.031 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 14 273.554 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 1.031 Phan do nhan to = 21.392 Chiem ti le : 4.60% 95.40% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 Gia tri 45.988 49.218 57.115 55.657 49.896 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 1.031 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 1.015 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 8 bac tu do : 2.306 He so bien dong CV : 3.97 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[5] M[4] M[3] 45.99 49.22 49.90 55.66 57.12 a b──────b c──────c ---------------------------------------- *. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và Kinetin đến tỷ lệ bao phấn tạo callus. Giống valaspik THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 45.478 1.355 0.030 44.427 47.007 Muc 2 3 48.287 0.579 0.012 47.680 48.833 Muc 3 3 56.284 1.552 0.028 54.738 57.842 Muc 4 3 53.304 1.399 0.026 51.943 54.738 Muc 5 3 49.124 1.554 0.032 47.680 50.768 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………99 BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 4 219.979 54.995 105.425 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 13.728 6.864 13.159 ** ║ ║ Sai so │ 8 4.173 0.522 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 14 237.881 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.522 Phan do nhan to = 18.158 Chiem ti le : 2.79% 97.21% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 Gia tri 45.478 48.287 56.284 53.304 49.124 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.522 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.722 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 8 bac tu do : 2.306 He so bien dong CV : 3.43 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[5] M[4] M[3] 45.48 48.29 49.12 53.30 56.28 a b──────b c d ---------------------------------------- *. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống marinda THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 0.000 0.000 * 0.000 0.000 Muc 2 3 19.862 0.908 0.046 19.066 20.852 Muc 3 3 28.883 0.450 0.016 28.433 29.334 Muc 4 3 34.570 1.842 0.053 32.791 36.469 Muc 5 3 39.747 1.362 0.034 38.451 41.167 Muc 6 3 31.375 0.892 0.028 30.657 32.374 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 5 3038.655 607.731 485.268 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 1.623 0.811 0.648 ║ ║ Sai so │ 10 12.524 1.252 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 17 3052.801 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………100 MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 1.252 Phan do nhan to = 202.160 Chiem ti le : 0.62% 99.38% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 Gia tri 0.000 19.862 28.883 34.570 39.747 31.375 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 1.252 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 1.119 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 10 bac tu do : 2.228 He so bien dong CV : 4.35 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[6] M[4] M[5] 0.00 19.86 28.88 31.37 34.57 39.75 a b c d e f ---------------------------------------- *. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống valaspik THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 0.000 0.000 * 0.000 0.000 Muc 2 3 22.690 0.816 0.036 21.973 23.578 Muc 3 3 32.371 0.421 0.013 31.948 32.791 Muc 4 3 38.964 1.761 0.045 37.269 40.785 Muc 5 3 42.322 0.383 0.009 41.940 42.706 Muc 6 3 39.490 0.979 0.025 38.451 40.396 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 5 3835.255 767.051 776.358 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 0.223 0.111 0.113 ║ ║ Sai so │ 10 9.880 0.988 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 17 3845.358 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………101 MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.988 Phan do nhan to = 255.354 Chiem ti le : 0.39% 99.61% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 Gia tri 0.000 22.690 32.371 38.964 42.322 39.490 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.988 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.994 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 10 bac tu do : 2.228 He so bien dong CV : 3.39 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[4] M[6] M[5] 0.00 22.69 32.37 38.96 39.49 42.32 a b c d──────d e ---------------------------------------- *. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống Marinda THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 0.000 0.000 * 0.000 0.000 Muc 2 3 15.214 0.428 0.028 14.967 15.708 Muc 3 3 22.514 0.539 0.024 21.973 23.050 Muc 4 3 31.520 0.427 0.014 31.093 31.948 Muc 5 3 29.632 0.258 0.009 29.334 29.781 Muc 6 3 26.082 0.482 0.018 25.600 26.565 Muc 7 3 22.514 0.539 0.024 21.973 23.050 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 6 2070.129 345.022 1899.712 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 0.312 0.156 0.859 ║ ║ Sai so │ 12 2.179 0.182 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 20 2072.620 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.182 Phan do nhan to = 114.947 Chiem ti le : 0.16% 99.84% Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………102 Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 3 Gia tri 0.000 15.214 22.514 31.520 29.632 26.082 22.514 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.182 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.426 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 12 bac tu do : 2.179 He so bien dong CV : 2.02 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[7] M[6] M[5] M[4] 0.00 15.21 22.51 22.51 26.08 29.63 31.52 a b c──────c d e f --------------------------------------- *. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống Valaspik THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 0.000 0.000 * 0.000 0.000 Muc 2 3 16.661 0.401 0.024 16.430 17.124 Muc 3 3 24.092 0.511 0.021 23.578 24.601 Muc 4 3 32.931 0.243 0.007 32.791 33.211 Muc 5 3 29.927 0.252 0.008 29.781 30.218 Muc 6 3 25.761 0.278 0.011 25.600 26.082 Muc 7 3 23.226 0.305 0.013 23.050 23.578 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 6 2143.665 357.277 3019.035 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 0.010 0.005 0.042 ║ ║ Sai so │ 12 1.420 0.118 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 20 2145.095 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.118 Phan do nhan to = 119.053 Chiem ti le : 0.10% 99.90% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 3 3 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………103 Gia tri 0.000 16.661 24.092 32.931 29.927 25.761 23.226 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.118 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.344 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 12 bac tu do : 2.179 He so bien dong CV : 2.58 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[7] M[3] M[6] M[5] M[4] 0.00 16.66 23.23 24.09 25.76 29.93 32.93 a b c d e f g --------------------------- *. Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng trong mơi trường tạo callus đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống Marinda THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 23.203 1.549 0.067 21.414 24.097 Muc 2 3 28.729 0.940 0.033 27.972 29.781 Muc 3 3 36.337 0.229 0.006 36.073 36.469 Muc 4 3 39.098 0.982 0.025 38.057 40.007 Muc 5 3 42.579 0.586 0.014 41.940 43.091 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 4 748.246 187.062 206.712 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 2.048 1.024 1.132 ║ ║ Sai so │ 8 7.240 0.905 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 14 757.534 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.905 Phan do nhan to = 62.052 Chiem ti le : 1.44% 98.56% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 Gia tri 23.203 28.729 36.337 39.098 42.579 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.905 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.951 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 8 bac tu do : 2.306 He so bien dong CV : 2.80 % So sanh theo DUNCAN Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………104 M[1] M[2] M[3] M[4] M[5] 23.20 28.73 36.34 39.10 42.58 a b c d e ---------------------------------------- *. Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng trong mơi trường tạo callus đến tỷ lệ mẫu tái sinh. Giống Valaspik THONG KE CO BAN ───────────────────────────────────────────────────────────────────── MUC SO LAN LAP TRUNG BINH DL(H chinh) HS B DONG MIN MAX Muc 1 3 25.423 1.020 0.040 24.601 26.565 Muc 2 3 31.378 0.494 0.016 31.093 31.948 Muc 3 3 39.102 0.596 0.015 38.451 39.623 Muc 4 3 42.449 0.222 0.005 42.320 42.706 Muc 5 3 45.764 0.765 0.017 45.000 46.530 ───────────────────────────────────────────────────────────────────── BANG PHAN TICH PHUONG SAI --------------------------- ╔══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╗ ║ Nguon bien dong │ Bac tu do Tong BP Trung binh FTN ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Muc │ 4 829.163 207.291 415.555 ** ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Khoi │ 2 0.560 0.280 0.561 ║ ║ Sai so │ 8 3.991 0.499 ║ ║──────────────────────────────────────────────────────────────────────────║ ║ Toan bo │ 14 833.714 ║ ╚══════════════════════════════════════════════════════════════════════════╝ MO HINH NGAU NHIEN -------------------------------- Phan ngau nhien = 0.499 Phan do nhan to = 68.931 Chiem ti le : 0.72% 99.28% Cac Trung binh cua cac muc --------------------------------------- So lan 3 3 3 3 3 Gia tri 25.423 31.378 39.102 42.449 45.764 Sai so binh phuong cua mot quan sat (Se2) : 0.499 Do lech chuan cua mot quan sat (Se) : 0.706 Gia tri Tlt o muc tin cay 5%, 8 bac tu do : 2.306 He so bien dong CV : 1.92 % So sanh theo DUNCAN M[1] M[2] M[3] M[4] M[5] 25.42 31.38 39.10 42.45 45.76 a Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………105 b c d e -------------------------------- *. Ảnh hưởng tổ hợp BAP và TDZ đến tỷ lệ mẫu tái sinh BALANCED ANOVA FOR VARIATE TSM FILE XL 4/ 9/ 9 16:27 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 "thi nghiem to hop tdz bap" VARIATE V003 TSM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 12 3593.48 299.457 ****** 0.000 3 2 N 2 .253001 .126500 1.41 0.264 3 * RESIDUAL 24 2.16051 .900213E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 38 3595.89 94.6288 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TSV FILE XL 4/ 9/ 9 16:27 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 "thi nghiem to hop tdz bap" VARIATE V004 TSV LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 12 4272.14 356.012 510.01 0.000 3 2 N 2 2.04290 1.02145 1.46 0.251 3 * RESIDUAL 24 16.7533 .698053 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 38 4290.94 112.919 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE XL 4/ 9/ 9 16:27 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 "thi nghiem to hop tdz bap" MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TSM TSV 1 3 0.000000 0.000000 2 3 26.0277 21.0393 3 3 29.9577 26.7177 4 3 33.0713 31.5200 5 3 31.1257 28.7323 6 3 34.2423 35.3973 7 3 38.2423 40.0070 8 3 40.3603 43.5967 9 3 36.9113 37.2667 10 3 35.2733 34.9927 11 3 31.5323 29.6320 12 3 30.3917 26.8503 13 3 28.4507 24.0760 SE(N= 3) 0.173226 0.482374 5%LSD 24DF 0.505597 1.40791 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE XL 4/ 9/ 9 16:27 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………106 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 "thi nghiem to hop tdz bap" F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N | (N= 39) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TSM 39 30.430 9.7277 0.30004 2.0 0.0000 0.2642 TSV 39 29.218 10.626 0.83550 2.9 0.0000 0.2506 ---------------------------------------------------------------- *. Ảnh hưởng của cao nấm men đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN M FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 " Thi nghiem CNM" VARIATE V003 HSN M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 .312380E-02 .520634E-03 0.68 0.669 3 2 N 2 .816189E-01 .408094E-01 53.42 0.000 3 * RESIDUAL 12 .916656E-02 .763880E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .939092E-01 .469546E-02 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNV FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 " Thi nghiem CNM" VARIATE V004 HSNV LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 .160000E-02 .266667E-03 0.28 0.933 3 2 N 2 .524798E-01 .262399E-01 27.99 0.000 3 * RESIDUAL 12 .112515E-01 .937625E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 .653313E-01 .326656E-02 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOM FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 " Thi nghiem CNM" VARIATE V005 CAOM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 13.4640 2.24399 84.84 0.000 3 2 N 2 1.74988 .874941 33.08 0.000 3 * RESIDUAL 12 .317391 .264492E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 15.5312 .776562 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOV FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 " Thi nghiem CNM" Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………107 VARIATE V006 CAOV LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 6 14.5849 2.43082 93.31 0.000 3 2 N 2 1.43468 .717341 27.54 0.000 3 * RESIDUAL 12 .312599 .260499E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 20 16.3322 .816610 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 " Thi nghiem CNM" MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN M HSNV CAOM CAOV 0 3 1.16667 1.17667 3.54667 3.70667 50 3 1.17333 1.17000 4.88333 4.61333 100 3 1.19333 1.19667 6.03667 5.67333 150 3 1.19667 1.18667 5.66667 6.39333 200 3 1.20333 1.17333 4.52000 5.16667 250 3 1.19000 1.18333 4.39000 4.87000 300 3 1.19333 1.17333 4.16333 4.21333 SE(N= 3) 0.159570E-01 0.176788E-01 0.938958E-01 0.931842E-01 5%LSD 12DF 0.491690E-01 0.544745E-01 0.289325 0.287132 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CNM 7/ 9/ 9 10:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 " Thi nghiem CNM" F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N | (N= 21) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSN M 21 1.1881 0.68523E-010.27638E-01 2.3 0.6692 0.0000 HSNV 21 1.1800 0.57154E-010.30621E-01 2.6 0.9327 0.0000 CAOM 21 4.7438 0.88123 0.16263 3.4 0.0000 0.0000 CAOV 21 4.9481 0.90366 0.16140 3.3 0.0000 0.0000 ------------------------------------------------------------------------------- *. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN M FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 "thi nghiem IAA va BAP" VARIATE V003 HSN M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 9 14.0892 1.56547 172.25 0.000 3 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………108 2 N 2 1.22519 .612595 67.41 0.000 3 * RESIDUAL 18 .163586 .908813E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 29 15.4780 .533723 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNV FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 "thi nghiem IAA va BAP" VARIATE V004 HSNV LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 9 10.5655 1.17394 121.30 0.000 3 2 N 2 1.06037 .530183 54.78 0.000 3 * RESIDUAL 18 .174207 .967817E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 29 11.8001 .406899 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOM FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 "thi nghiem IAA va BAP" VARIATE V005 CAOM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 9 25.8880 2.87644 84.59 0.000 3 2 N 2 2.41480 1.20740 35.51 0.000 3 * RESIDUAL 18 .612064 .340036E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 29 28.9148 .997064 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOV FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 "thi nghiem IAA va BAP" VARIATE V006 CAOV LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 9 17.2502 1.91669 79.71 0.000 3 2 N 2 1.24914 .624569 25.97 0.000 3 * RESIDUAL 18 .432830 .240461E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 29 18.9322 .652834 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 "thi nghiem IAA va BAP" MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN M HSNV CAOM CAOV 1 3 1.18667 1.17667 6.08667 5.63667 2 3 2.81333 2.50000 5.81000 4.36333 3 3 3.25000 3.11333 5.34000 4.21667 4 3 2.72333 2.73000 4.80667 3.94333 5 3 3.64333 3.28000 3.91333 3.77000 6 3 3.19000 2.85333 3.78000 3.56000 7 3 2.78333 2.59000 3.46333 3.44667 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………………………109 8 3 2.64000 2.33333 3.90000 3.25800 9 3 2.11000 1.98000 3.82667 3.12000 10 3 1.88667 1.92667 3.56667 2.83667 SE(N= 3) 0.550398E-01 0.567984E-01 0.106464 0.895286E-01 5%LSD 18DF 0.163531 0.168756 0.316319 0.266003 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CNM 7/ 9/ 9 11: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 "thi nghiem IAA va BAP" F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |N | (N= 30) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | HSN M 30 2.6227 0.73056 0.95332E-01 3.6 0.0000 0.0000 HSNV 30 2.4483 0.63789 0.98378E-01 4.0 0.0000 0.0000 CAOM 30 4.4493 0.99853 0.18440 4.1 0.0000 0.0000 CAOV 30 3.8151 0.80798 0.15507 4.1 0.0000 0.0000 ._.