Giáo trình Vi sinh - Chương 3 đến Chương 5

giải phóng và tích luỹ năng l−ợng và tạo ra các chất trung gian quan trọng và từ đấy qua đồng hoá tổng hợp ra các chất cần thiết cho sinh tr−ởng phát triển của tế bào. • Phần lớn các loài vi sinh vật thuộc loại dinh d−ỡng hoá năng, chuyển hoá các hợp chất hoá học làm nguồn năng l−ợng. • Đối với vi sinh vật kỵ khí oxy hoá sinh năng l−ợng không kèm theo kết hợp với oxy không khí mà các hình thái khác: 1. Một số khái niệm chung • mất bớt hydrô, tách hydrô khỏi n−ớc, và mất bớt electron (e-). Năng l−ợng giải phóng ra sẽ tích luỹ trong các chất giầu năng l−ợng: ATP, UTP, các acid phosphoric, các dẫn xuất acid cacbonic (Acetyl-CoA,). • ATP chứa 2 liên kết năng l−ợng cao (11000 cal/liên kết), trong khi liên kết th−ờng chỉ chứa 300 cal. Quá trình hình thành liên kết cao năng giữa P và O còn đ−ợc gọi là quá trình phosphoryl hoá, là ph−ơng thức chủ yếu tích lũy năng l−ợng cho tế bào. 2. Các con đ−ờng phân giải hydrat cacbon 2.1. Phân giải glucose • Glucose là nguồn năng l−ợng dùng cho mọi tế bào VSV. Có 3 con đ−ờng phân giải glucose đ−a đến các hợp chất 3 carbon, trong đó acid pyruvic là một trong những hợp chất trung gian quan trọng nhất. Tr−ớc hết glucose đ−ợc phosphoryl hoá ở vị trí C6 chuyển thành glucose-6-phosphat 2.1.1. Con đ−ờng đ−ờng phân EMP • Dù có hay vắng oxy glucose đều đ−ợc chuyển thành pyruvat qua 10 phản ứng, trong đó chỉ có 3 phản ứng (1,3, và 10) là một chiều, còn lại là thuận nghịch. H.3.1. Con đ−ờng đ−ờng phân EMP O CH2OH H O H OH H H OH H OH H H O CH2OH H O H OH H H OH H OH EucaryotaProcaryota ATP ADP Hexokinase PEP Pyruvat H O CH2O H O H OH H H OH H OH P Glucose-6-phosphat HH OH H OH H CH2OH OH OOH2CP Isomerase Phosphofructokinase H OH H OH H CH2O OH OOH2C H P P Aldolase C OHH C CH2O O H P C O CH2OH CH2O P Dihydroxyaceton- COH CH2OH CH2O P HHCOH CH2OH CH2OH Glycerin Glycerin-3- H3PO4 (Pi) NAD + NADH2Isomerase C OHH C CH2O O O P P Dehydrogenase Fructo-6-phosphat Fructo-1,6-diphosphat Glyceraldehyd- 3-PO4 2(1,3-Diphosphoglycerat ) , 2ADP 2ATPPhosphoglycerat kinase C OHH COOH CH2O 2(3-phosphoglycerat ), P 2(2-phosphoglycerat ) C OH COOH CH2OH Mutase P Enolase C O COOH CH2 P 2(Phospho- enolpyruvat), Kinase C O COOH CH3 2Pyruvat P P ADP ATP GĐPGC 2.1.1. Con đ−ờng đ−ờng phân EMP Cân bằng chung: • Glucose -> 2 pyruvat + 2 ATP + 2 NADH2 ATP đ−ợctạo thành trong 2 phản ứng 7 và 10: • 6. 3-P-Glyceraldehyd + NAD + Pi -> 1,3-bis-P- glycerat • 7. 1,3-bis-P-glycerat -> 3-phosphoglycerat + ATP • 9. 2-P-glycerat -> P-enolpyruvat (PEP) + H2O, sau đó • 10. PEP + ADP -> pyruvat + ATP • Con đ−ờng đ−ờng phân EMP cũng cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: Glucozo-6-P, Fructozo-6-P, 3-P-glyceraldehyd, 3-P- glycerat, PEP, và pyruvat. 2.1.2. Con đ−ờng pentose-phosphat (PP)- HMP • Con đ−ờng này giúp cho nhiều vi khuẩn chuyển hoá glucose thành pyruvat không qua con đ−ờng EMP đồng thời cung cấp cho tế bào hai tiền chất khác là ribose-5-P (để tổng hợp acid nucleic) và erytrozo-4- P (cùng với PEP để tổng hợp các acid amino thơm). • Ngoài ra HMP còn cung cấp NADP.H cần cho phản ứng tổng hợp khử. 2.1.2. Con đ−ờng pentose-phosphat (PP)- HMP • Qua hai phản ứng đ−ợc xúc tác bởi Glucose-6-P dehydrogenase và 6-P-gluconat-dehydrogenase, glucose đ−ợc tách thành ribulose-5-P và CO2. Quá trình oxy hoá đ−ợc kết thúc tại đây, các phản ứng tiếp theo là các phản ứng chuyển hoá. Nếu glyceraldehyd-3-P đi vào TGP và chuyển thành pyruvat ta sẽ có: • Glucose -> Pyruvat + 3CO2+6NADPH2+NADH2+ATP 2.1.2. Con đ−ờng pentose-phosphat (PP)- HMP Glucose-6-phosphat O CH2O H O H OH H H OH H OH H P G-6-PDH 6-Phosphoglucono-1,5-lacton O CH2O H O H OH H H OH O H P 6-phosphogluconat H CH2O H O H OH H H OH HO OH O P 6-PGDH NADP NADPH2 CO2 NADPH2NADP LactonaseMg ++ C O CH2OH COH COH CH2O H H P Ribulose-5PO4 Xylulose-5-phosphat H HO C O CH2OH CH COH CH2O P Ribose-5- phosphat H H C O CH2OH COH COH CH2O P C OHH CHO CH2OPO3 -- D-glyceraldehyd-3-phosphat C O CH2OH C C C C CH2OPO3 -- H H OH H OH H OH HO D-Sedoheptulose-7- phosphat CHO C C CH2OPO3 -- H OH H OH HO C O CH2OH C C C CH2OPO3 -- H H OH H OH D-Erythrose-4-phosphat D-fructose-6-phosphat GĐPGC C O COOH CH3 Pyruvat 2.1.3.C.đ 2-keto-3-deoxy-6-P-gluconat (KDPG) • Tr−ớc tiên glu-6-P đ−ợc chuyển thành 6-P- gluconat nh− con đ−ờng PP. Sau đó chất này bị loại n−ớc nhờ P-gluconat-dehydrase thành KDPG. KDPG này bị phân giải thành pyruvat và 3-P- glyceraldehyd nhờ aldolase đặc hiệu. Cuối cùng 3- P-glyceraldehyd lại đi vào TGP của EMP để cho pyruvat. Cân bằng của con đ−ờng này là: • Glucose -> 2pyruvat + ATP+ NADH2+NADPH2 • Con đ−ờng này chỉ gặp ở một số vi khuẩn. C.đ 2-keto-3-deoxy-6-P-gluconat (KDPG) NADP NADPH2 H O CH2O H O H OH H H OH O 6-Phosphoglucono-1,5-lacton G-6-PDHH O CH2O H O H OH H H OH H OH Glucose-6-phosphatGlucose O CH2OH H O H OH H H OH H OH H ATP ADP Mg ++ P P H2O, Mg ++ Lactonase CH2O H O H OH H H OH HO OH O H 6-Phosphogluconat Dehydratase H2O Fe ++ , GSH PCH2 H O H H H O HO OH O O H 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat P C O COOH C C C CH2OPO3 -- H H H OH H OH hoặc C O COOH CH3 C CH CH2 O O OH P Pyruvat Glyceraldehyd-3-phosphat Aldolase Pyruvat TGP-GĐPGC Các con đ−ờng phân giải gucoza • Các vi sinh vật khác nhau sử dụng 3 con đ−ờng với mức độ khác nhau (X. bảng). Con đ−ờng EMP và PP phổ biến ở nhiều vi sinh vật. Con đ−ờng KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng đ−ợc gluconat. Vd. E. coli và Clostridia Sản phẩm cuối cùng của các con đ−ờng đ−ờng phân: • EMP: 1 glucose –> 2pyruvat • HMP: pentozo-4-P, erythro-4-P và glyceraldehyd 3-P, 1-pyruvat • ED: 1 pyruvat, glyceraldehyd-3-P Bảng 3.1. Phân giải glucose bằng 3 con đđp Vi sinh vật EMP (%) HMP(%) ED(%) S. cerevisiae Candida utilis Streptomyces griseus P. chrysogenum Escherichia coli P. aeruginosa P. saccharophyla Bacillus subtilis Gluconobacter oxydans Alcaligens eutrophus Zymomonas mobilis Sarcina lutea 88 66-81 97 77 72 - - 74 - - - 70 12 19-34 3 23 28 29 - 26 100 - - 30 - - - - - 71 100 - - 100 100 - 2.2. Phân giải các loại đ−ờng khác • Ngoài glucose vi sinh vật còn có thể sử dụng các loại đ−ờng khác nhau. Các loại đ−ờng đơn tr−ớc tiên đều phải đ−ợc phosphoryl hoá, rồi biến đổi thành các dẫn chất t−ơng ứng mà đi vào con đ−ờng đ−ờng phân. • Fructose sau khi phosporyl hóa đi vào EMP. • Mannose sau khi phosporyl hóa đ−ợc biến thành Fr- 6-P và đi vào EMP. 2.2. Phân giải các loại đ−ờng khác • Galactose sau khi biến thành Glu-6-P cũng đi vào EMP. • Pentose đi vào HMP Các olygosaccharid đ−ợc thuỷ phân rồi • Một số VSV (Lactobacillus, Neisseria meningitidis) có men maltophosphorylase có thể xúc tác phản ứng: • Maltose+PO4 - -> glucozo-1-P+glucose 3. Q. tr. oxy hoá pyruvat và chu trình Krebs Pyruvat có vai trò trung tâmCó 3 phản ứng quan trọng: • 1. Pyruvat+CoA+NAD+ -> Acetyl- CoA+ NADH2+CO2 , • 2. Pyruvat+CoA+ 2Fd -> Acetyl- CoA+ 2FdH+CO2 , • 3. Pyruvat+CoA Acetyl- CoA+ format • Fd=ferredoxin • Phản ứng 1 do phức hệ pyruvat-dehydrogenase (PDH) xúc tác. PDH có ở VSV hiếu khí không có ở VSV kỵ khí. Acetyl- CoA tạo ra đi vào chu kỳ ATC. PDH gồm có 3 phức hệ. Điều kiện cho phản ứng còn cần TPP (thiamin-pyro-phosphat) và acid lipoic. Hình 3.4. Ôxy hóa pyr. nhờ pyruvat dh CCH3 COO - O (-) (+) + + +H + H + (-) C carboxylase CCH3 COO - O - H + carboxylase C H + CO2 CCH3 H OH C carboxylase acetaldehyd hoạt động CH CH2 S CH2)4 CH2 S (CO Enzym HOOC (CH2)4 CH CH2 S CH2 C CH3 O SH S-acetyldihydrolipoic acid CoA S C CH3 O CoA-SH dihydrolipoic acid HOOC (CH2)4 CH CH2 SH CH2 SH NAD + NADH2 acid lipoic 3. Q. tr. oxy hoá pyruvat và chu trình Krebs • Phản ứng 2 đ−ợc xúc tác bởi pyruvat-Fd- oxydoreductase, gặp ở nhiều vi khuẩn kỵ khí nh− Clostridium. • Phản ứng 3 do pyruvat- format-liase xúc tác, enzym này có trong các vi khuẩn kỵ khí tiết acid formic (họ Enterobacteriaceae) cũng nh− vi khuẩn quang d−ỡng. • Acetyl- CoA đ−ợc oxy hoá triệt để qua chu trình Krebs tạo ra CO2 , n−ớc và năng l−ợng (Xem hình). Hình 3.5. Chu trình Krebs CH3 C O S CoA Acetyl-CoA C COOHHO C C COOH COOH H2 H2 Citrat H2O H2 C COOH C C COOH COOHH Cis-aconitat H2 C COOHH C C COOH COOH H HO Isocit rat H2O H2 C COOHH C C COOH COOHO Oxalo- succinat NADP + NADPH2 H2 CH2 C C COOH COOHO CO2 Alfa-ketoglutarat CoASH NAD + NADH2 CH2 C C COOH SCoAO H2 Succinyl-CoA ADP + PiATP CoASH C C COOH COOH H2 H2 Succinat CO2 C C COOH HOOC H HFumarat FAD + FADH2 Malat H2O C COOH COOHHO C H Oxaloacetat C COOH O COOHC H2 H2 NAD + NADH2 C O CH3 COOH Pyruvat CoASH NAD + NADH2 CO2 Citratsynthase Aconitase i-Citrat-DH AK-DH Succinat-DH Malat-DH Fumarase Aconitase i-Citrat-DH SCoA-TK 3. Q. tr. oxy hoá pyruvat và chu trình Krebs • Tóm lại sau khi phân giải 1 phân tử glucose (qua EMP và ED tạo ra 2 pt pyruvat, pyruvat chuyển thành Acetyl- CoA và chu trình Krebs sẽ cho 30 ATP. Năng l−ợng sinh ra đ−ợc giữ trong các chất khử NAD+H+, NADP+H+ và succinat. Khả năng gắn năng l−ợng khôngbền nh− ATP cho đến khi giai đoạn cuối cùng cua rphản ứng xẩy ra. • Chu trình Krebs là nửa giai đoạn tr−ớc của quá trình hô hấp. Nếu một phân tử pyruvat oxy hoá hoàn toàn tạo ra 3 phân tử CO2 , và 15 ATP. Nếu oxy hoá từ phân tử glucose sẽ sinh ra năng l−ợng nhiều hơn (38 ATP), khi glu đ−ợc phân giải bằng EMP và Krebs. 4. Chu trình glyoxylat • Chu trình Krebs có một số thay đổi ở một số vi sinh vật và hạt thực vật gọi là chu trình Glyoxylat. Do không có men α-Keto-glutarat dehydrogenase mà thiếu mất một số b−ớc từ chu trình Krebs. • Còn acetyl-CoA đ−ợc sinh ra từ oxy hoá trực tiếp acid béo thông qua con đ−ờng β-oxy hoá mà không phải từ pyruvat. v.dụ. Avinelanohi Hình 3.6. Chu trình Glyoxylat Acid béo Aconitase Malat-DH Citratsynthase NADH2 NAD + H2 H2 C COOH O COOHC Oxaloacetat C COOH COOHHO C H Malat Isocitrat C COOHH C C COOH COOH H HO H2 Citrat H2 H2 C COOHHO C C COOH COOH Acetyl-CoACH3 C O S CoA Beta-ôxy hoá CH C O OHO SuccinatGlyoxylat Acetyl-CoACoA-SH + H + Glucose Alfa-ketoglutarat CO2 Succinyl-CoA CO2 Succinat Fumarat I-citrat-liaseMalatsynthase FADH2 5. Chuỗi hô hấp và q. tr phosphoryl oxy hoá • Vi khuẩn hiếu khí tổng hợp tổng hợp ATP mạnh mẽ (hơn hẳn vk kỵ khí) nhờ chuỗi hô hấp và ATP-synthase (yếu tố F0 –F1). Hai hệ thống này nằm ở màng. H+ và e- sẽ tách ra từ cơ chất đi qua chuỗi hô hấp; các e- đ−ợc chuyển đến O2. • Năng l−ợng giải phóng ra đ−ợc chuyển thành ATP là chính. Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép gồm nhiều enzym vận chuyển e- và H+ , các coenzym và các dehydrogenase và hệ thống vận chuyển. Quan trọng nhất là: Chuỗi hô hấp và q. tr phosphoryl oxy hoá • Flavoprotein là các enzym chứa các coenzym: NAD, FMD hoặc FAD vận chuyển hydrô. • Protein Fe-S vận chuyển e- chứa Fe vừa liên kết với S của cystein vừa liên kết với S của H2S. [2Fe-2S] • Quinon: ở màng trong ty thể và ở vi khuẩn gram – là ubiquinon (CoQ), ở vi khuẩn G+ và G- là naphtoquinon, và ở lục lạp là plastoquinon. Chuỗi hô hấp và q. tr phosphoryl oxy hoá • Cytochrom: vận chuyển e-, không vận chuyển hydro. Nhận e- từ quinon: trong qúa trình vận chuyển một số H+ t−ơng đ−ơng e- bị tách vào môi tr−ờng. Cytochrom chứa nhóm thêm là hem. Có một số loại cytochrom: a,a3, b, c, O. Cytochrom gặp ở hầu hết các vi sinh vật có chuỗi hô hấp. Cytochrom-oxydase (a, a3) chuyển 4e- trực tiếp lên oxy: • O2+4Fe 2+ -> 2O2 - + 4Fe 3+ Chuỗi hô hấp trong oxy hoá NAD NADH2 FADH2 FAD Đ−ờng phân Chu trình Krebs Quá trình ôxy hoá khác Fe CoQH2 CoQ 3+ Pro(2Fe-2S) 2+ Fe Fe 2+ 3+ Fe Cit .B Fe 2+ 3+ Fe Fe 2+ 3+ Fe Fe 2+ 3+ FeCit .C Cit .A Citcrom oxydase O2 1 2 H + O 2- H2O ADP ATP 6.Hô hấp kỵ khí và các quá trình lên men 6.1. Hô hấp kỵ khí • Trong điều kiện thiếu oxy nhiều vi khuẩn có thể tiến hành hô hấp kỵ khí, sử dụng oxy hợp chất làm chất nhận hydro cuối cùng. Có 3 kiểu hô hấp kỵ khí sau: • Hô hấp nitrat (kỵ khí không bắt buộc): Khử NO3 • 4AH2+HNO3 ---> 4A+NH3+ 3H2O+ ATP. (AH2 là chất cho điện tử) 6.1. Hô hấp kỵ khí - Hô hấp sunfat (kỵ khí bắt buộc): Khử SO4 • 4AH2+H2SO4
4A+H2S+ 4H2O+ ATP. - Hô hấp đặc biệt là khử CO2 với cơ chất là H2: • H2+CO2 --> CH4+H2O+ATP - Lên men kỵ khí. - Trong các VSV kỵ khí thiếu vắng một số enzym hô hấp: Cytocrom a, b, c, cytocrom oxydase , peroxydase, catalase ). Hình 3.8. Các kiểu hô hấp ở VSV Chất cho hydrô Môi tr−ờng thoáng khí O2 H2O Hô hấp hiếu khí Môi tr−ờng kỵ khí NO3 - N2 SO4 2- H2S Hô hấp kỵ khí * Hô hấp nitrat (kỵ khí không bắt buộc) * Hô hấp sulfat (kỵ khí bắt buộc) CO2 CH4 * Hô hấp kỵ khí đặc biệt Chất cho hydrô Lên men Chất hữu cơ Sản phẩm lên men Vi sinh vật Hydrô 6.2. Lên men kỵ khí • Ng−ời ta gọi quá trình phân giải hydrat carbon trong điều kiện kỵ khí là quá trình lên men kỵ khí. Đây là quá trình oxy hoá khử cơ chất mà kết quả là một phần cơ chất bị khử và phần khác bị oxy hoá. • Đây cũng là quá trình tách hydro ra khỏi cơ chất. • Năng l−ợng một phần đ−ợc sử dụng vào các phản ứng khử, một phần tích luỹ. NAD+ đ−ợc tái tạo .mà không tác dụng với oxy. • Sản phẩm lm kỵ k gồm có: CO2, và các sản phẩm ch−a oxy hoá hoàn toàn (r−ợu, một số axit hữu cơ, xeto, aldhyd), tuỳ thuộc vào từng loại vi sinh vật và điều kiện lên men: acid acetic, acid gluconic, v.v Hình 3.9. Các quá trình lên men chính Glucose ATP (H) Acid pyruvic Các Lactobacillus Acid lact ic Nấm men Acetaldehyd Etanol CO2 (H)(H) Các Enterobacteriaceae Acetyl-CoA+ HCOOH Các Clostridium Các Propionibacterium CO2 Acid oxaloacet ic (H) Acid succinic Acid propionic CO2 (H) Acid acet icEtanol H2 CO2 CO2 Acid acet ic (H) Butadiol Acetyl-CoA + H2 CO2 Acetoacetyl-CoAAcid acet ic ATP Etanol Acid butyric ATP (H) ATP (H) Butanol Aceton CO2 Isopropanol (H) 7. Lên men hiếu khí • Ta gọi các quá trình phân giải, chuyển hoá hydratcarbon trong điều kiện hiếu khí là quá trình lên men hiếu khí. Nếu quan niệm chặt chẽ, thì chỉ những quá trình lên men sản xuất các sản phẩm sơ cấp đ−ợc đề cập nh− lên men sản xuất acid acetic, acid citric, acid glutamic, v.v • Theo nghĩa rộng, lên men hiếu khí bao gồm tất cả những quá trình lên men chuyển hoá các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp, và thứ cấp, trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh, kể cả lên men sản xuất một số vitamin Lên men hiếu khí Công nghệ kháng sinh và vitamin đã có những thay đổi rất to lớn và có một số đặc điểm sau: • Công nghệ kháng sinh sử dụng các chủng vi nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn đã trải qua cải tạo giống nhiều b−ớc có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất rất cao so với chủng mới phân lập đ−ợc ban đầu. • Các quá trình lên men sản xuất là các quá trình lên men vô trùng tuyệt đối, có thể đ−ợc điều khiển hoàn toàn bằng máy tính điện tử online (computer online control hay digital control- DC). 8. Sự phân giải protein (quá trình thối rữa) • Theo chất khô protein chứa khoảng 15,0- 17,6% nitơ (10-25 tỷ tấn N/700 tỷ tấn C hữu cơ). • Phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ là một khâu quan trọng của vòng thvc trong tn, và có ý nghĩa rất lớn đối với n.nghiệp. Quá trình p. giải này còn đ−ợc gọi là quá trình amoni hoá. • Tr−ớc tiên protein đ−ợc enzym ngoại bào protease thuỷ phân thành polypeptid và olygopeptid và peptidase thuỷ phân thành acid amino rồi đ−ợc hấp thụ, hay các polypeptid và olygopeptid đ−ợc hấp thụ vào trong tế bào và đ−ợc thuỷ phân ở đó thành acid amino. Sự phân giải protein • Một phần các acid amino này đ−ợc VSV sử dụng luôn, phần khác đ−ợc phân giải để giải phóng NH3, CO2 và các sản phẩm trung gian khác. Nếu VSV không có Protease ngoại bào • Các khả năng sử dụng acid amino nội bào: • Khử amin và phân giải mạch carbon hợp chất • Khử amin • Chuyển amin và phân giải mạch carbon • Trực tiếp sử dụng trong quá trình tổng hợp. Sự phân giải protein • Nhiều loài VSV tham gia vào quá trình amon hoá trong tự nhiên: • Vi khuẩn: Các loài Bacillus, Ps. fluorescens,E. coli, Cl. sporogenes, Cl. welchii, • Xạ khuẩn và nấm: S. griseus, A. oryzae. A. niger, P. camemberti, Rhizopus ssp., Mucor ssp • Các acid amin đ−ợc khử nhóm amin hoặc khử nhóm carboxylic, hoặc cả hai, các enzym là các enzym đặc hiệu L- hoặc D-. Hình 3.10. Các khả năng phân giải protein Protein Protease ngoại bào Polypeptid Olygopeptid Peptidase ngoại bào Acid amino Hấp thụ Phân giải nội bào Acid amino nội bào Hấp thụ Khử amin và phân giải mạch carbon Khử amin Chuyển amin và phân giải mạch carbon Sử dụng trực tiếp Chuyển hoá tryptophan N CH2CH(NH2)COOH H + H2O H N CH3 H N + CH3COCOOH + NH3 IndolT ryptophan H N CH2CH(NH2)COOH H N CH2COOH Tryptophan Acid indolacet ic Skatol Chuyển hoá tryptophan N CH2 CH COOH NH2 H COOH COOH Succinat t Acetat + OH OH Catechin Acid cys, cys-muconic Phân giải các chất khác • Các base purin, pirimidin có thể đ−ợc các enzym phân giải tạo ra CO2, NH3 và một số acid hữu cơ: acid formic, acid lactic, acid acetic. Các acid này lại đ−ợc phân giải tiếp. N N C NN O O O H H + H2O4 (NH2)2CO + 2 HOOC-CHOH-COOH Urê Acid tartric Acid uric Phân giải urê • Urê cũng đ−ợc một số VSV phân huỷ: Micrococcus ureae, Proteus vulgaris do chúng tạo ra đ−ợc urease xúc tác phản ứng sau: • CO(NH2)2 + 2H2O -> (NH4)2CO3 • (NH4)2CO3 ít bền vừng nên bị phân giải tiếp: • (NH4)2CO3 -> 2NH3 + CO2 + H2O 9. Sự phân giải lipid và các acid béo • Lipid và các chất sáp là nguồn dinh d−ỡng C và năng l−ợng cho một số VSV. Các chất này đ−ợc đồng hoá với tốc độ chậm. Đầu tiên các chất này đ−ợc phân giải thành acid béo và glycerin (hoặc r−ợu) nhờ lipase. • Glycerin sau khi đ−ợc phosphoryl hoá sẽ đ−ợc chuyển hoá tiếp trong EMP để giải phóng ATP và pyruvat. Acid béo đ−ợc thuỷ phân qua con đ−ờng β-oxy hoá tạo ra acetyl-CoA, và chất này đ−ợc chuyển hoá tiếp trong chu trình Krebs và glyoxylat. Sự phân giải lipid H3C (CH2)n C O CH2 O H3C (CH2)n C O CH2 O O CH2OC(CH2)nH3C Lipid Lipase H2O 3 CHOH CH2OH CH2OH Glycerin + 3CH3 (CH2)n COOH Acid béo Ch. 4. Sinh tr−ởng và phát triển của vsv • Mục tiêu • Trình bầy đ−ợc các điều kiện cần thiết đối với sinh tr−ởng của VSV, • Trình bầy đ−ợc đặc tr−ng sinh tr−ởng phát triển 4 pha của VSV, • Trình bầy đ−ợc các sản phẩm chính của vsv, • Trình bầy đ−ợc cơ chế tác dụng của các kháng sinh, và tính kháng kháng sinh của vi sinh vật, • Trình bầy đ−ợc các tác nhân xát khuẩn hoá học và vật lý. Sinh tr−ởng và phát triển của vsv • Sinh tr−ởng và phát triển là • Sinh tr−ởng là sự gia tăng kích th−ớc và khối l−ợng tế bào còn phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng tr−ởng số l−ợng tế bào. • Rất khó rạch ròi, nên nói sinh tr−ởng là bao gồm cả phát triển và ng−ợc lại. 1. Điều kiện cho sinh tr−ởng vi sinh vật • Ngoài chất dinh d−ỡng còn có các điều kiện ngoại cảnh • 1.1. Độ ẩm • −a khô ít vsv, vd. M. tuberculosis. • 1.2. Nhiệt độ môi tr−ờng • Tối thiểu, cực đại, tối thích • Ưa lạnh: 5 -20oC • Ưa ấm: 10- 45oC • Ưa nhiệt: 25-80oC, d−ới đáy TBD vsv sống đ−ợc ở 200-300oC 1.3. áp suất, thẩm áp, áp suất thuỷ tĩnh • Dung dịch muối 10-15%, đ−ờng 50-80% làm co sinh chất của VSV. Đa số VSV vật phát triển tốt trong môi tr−ờng có nồng độ muối ít hơn 2%, −a muối chịu đ−ợc đến 30% muối. • Ưa đ−ờng, −a thẩm áp • 1.4. Khí quyển • Hiếu khí bắt buộc • Hiếu khí không bắt buộc: S. cerevisiae, E. coli, • Vi hiếu khí: Vibrio cholera, Bacteriodes spp • Kỵ khí chịu d−ỡng: Streptococcus lactis, Lactobacillus lactis, 1.4. Khí quyển • Kỵ khí: sự có mặt của ôxy phân tử là có hại. SOD, cytochromoxydase, phần lớn không có hydrogenperoxydase. Clostridium, Fusobacterium, Butyrivibrio, Desulfovibrio, Veillonela • 1.5. pH môi tr−ờng • Đa số vi khuẩn sinh tr−ởng tốt nhất ở pH 6 - 8. Một số loài sinh tr−ởng ở pH 9 - 11 (Vibrio cholerae, Bacillus sp. ), vi khuẩn lactic trong d−a muối chịu đ−ợc pH 3 - 4. Nấm mốc, nấm men có khoảng pH sinh tr−ởng rộng hơn vi khuẩn, nh−ng pH tối thích là 5 - 6. 2. Sinh sản của vi khuẩn • Đa số vi khuẩn sinh sản bằng con đ−ờng vô tính • Một số vi khuẩn ví dụ nh− Rhodopseudomonas acidophia, Mycobacterium tuberculosis sinh sản bằng nảy chồi giống nh− nấm men. 3. Sinh tr−ởng và phát triển của quần thể vi khuẩn • Sinh tr−ởng và phát triển của l−ợng lớn tế bào của cùng một loài • 3.1. Thế hệ sinh tr−ởng của vi sinh vật • Thời gian thế hệ ( tg ), hay thời gian bội đôi ( td ), 3.1. Thế hệ sinh tr−ởng của vi sinh vật • tg = t* lg2 / ( lg xn - lg x0 ) (3.5) • 3.2. Các pha sinh tr−ởng phát triển của vi khuẩn • Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (còn gọi là pha luỹ thừa), pha dừng và pha suy tàn . • 3.2.1. Pha lag (pha thích ứng) • Vi sinh vật thích nghi với môi tr−ờng mới • Dài ngắn khác nhau 3.2.2. Pha log ( pha luỹ thừa ) • Gọi à là tốc độ tăng tr−ởng s. Kh. riêng của VSV • ln x = àt + ln x0 (3.8) • à = àm*S/(KS + S ) • Hiện t−ợng sinh tr−ởng kép: • 3.2.3. Pha dừng hay pha ổn định • 3.2.4. Pha suy tàn • Đ−ờng cong sinh tr−ởng • Kết thúc lên men ở pha nào? texx à*0= 4. Các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật • Có thể là có hại đối với con ng−ời, nh−ng cũng có thể là các sản phẩm hữu ích • 4.1. Độc tố • Ngoại độc tố : chỉ cần 0,02 mg ngoại độc tố bạch hầu, hoặc 0,0006 mg ngoại độc tố uốn ván là có thể gây chết ng−ời. • Nội độc tố: là độc chất của trực khuẩn G -, của các vi khuẩn đ−ờng ruột. 400 mg mới gây chết ng−ời. Phức hợp glucid-lipid-protein. • 4.2. Chất gây sốt • Pyrogen Chất gây sốt không bị nhiệt độ phá huỷ 4. Các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật • Lọc qua phễu lọc thuỷ tinh G5 hay màng lọc amiăng. N−ớc dùng để pha thuốc tiêm nhất thiết không đ−ợc phép chứa chất gây sốt. • 4.3. Các vitamin • Ergocalciferol (Vitamin D) có nhiều trong nấm men (Sac. carlsbergensis) • Thiamin (Vitamin B1) có trong Ps. fluorescens, • Pyridoxin (Vitamin B6) có trong Aerobacter aerogenes, • Vitamin B2 (riboflavin), VB12 do 4.4. Các kháng sinh • 4.4.1. Định nghĩa kháng sinh • Kháng sinh là sp trao đổi chất thứ cấp chỉ đ−ợc sth mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau • 4.4.2. Một số kháng sinh đ−ợc quan tâm • Cefepime, cepha th 4 • Imipenem: kháng sinh β-lactam họ tienamicin • 4.4.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh • 6 mức tác dụng Hình 4.2. Các đích tác dụng chính của kh sinh 4.4.4. Cơ chế khg thuốc kh. sinh của vi khuẩn • 4.4.4.1. Tính kháng thuốc • Khảo sát độ nhạy kháng sinh rất khó khăn • ổn đinh, không ổn định • ĐN: Kháng thuốc là • Kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận • Kháng thuốc tự nhiên : đó là tính thấm của tế bào và sự thiếu vắng phân tử đích. • Kháng thuốc mới nhận : Đề kháng sinh học , đề kháng điều trị 4.4.4.2. Cơ chế di truyền học tính kháng thuốc • Kháng thuốc mới nhận có thể do: • Đột biến nhiễm sắc thể, tiếp nhận gen plasmid • a. Kháng thuốc do đột biến nhiễm sắc thể c 10% • kiểu streptomycin, kiểu penicillin • b. Kháng thuốc plasmid chiếm 90%, plasmid • qua các cơ chế di truyền - tải nạp (transduction), biến nạp (transformation), tiếp hợp (conjunction) lan truyền • PTL 1-260 MD, t−ơng ứng khoảng 3-500 gen • Hiện t−ợng kháng chéo 4.4.4.3. Cơ chế sinh hoá kháng thuốc mới nhận • Có 4 kiểu chính : • Thay đổi tính thấm thành tế bào • Vô hiệu hoá các kháng sinh bằng enzym NCOR H N S CH3 COOHO CH3 A1K61 Vô hiệu hoá các kháng sinh bằng enzym N SN H OCR O COOH R' Vô hiệu hoá các kháng sinh bằng enzym NH2 OH OH H2N O O OH NH2NH2 O O OH OH OH NH2 O Vô hiệu hoá các kháng sinh bằng enzym C C CH2OH H H OH NO2 NH2 C O CHCl2 Thay đổi phân tử đích • Phân tử đích, nơi tác dụng của kháng sinh bị thay đổi • Hoạt hoá con đ−ờng trao đổi chất thay thế khác • Nguyên tắc sử dụng kháng sinh: • Phân lập chủng vi sinh vật gây bệnh, lập kháng sinh đồ • - Chọn kháng sinh có hoạt tính mạnh nhất, • - Quyết định liều dùng, cách cung cấp, và điều trị, • - Phối hợp kháng sinh với 5. các tác nhân sát khuẩn • 5.1. Các tác nhân vật lý • Nhiệt ẩm, thô • UV • 5.2. Các tác nhân hoá học • Phenol, etanol • Các chất chứa Halogen hoạt động: cloramin B • Các chất chứa oxy hoạt động: H2O2, KMnO4 • Chứa kim loại nặng: Hg2Cl2, timerosel • Các chất tẩy rửa, formaldehyd Ch−ơng 5. Di truyền vi sinh vật Mục tiêu: • Trình bầy đ−ợc đặc điểm của hai loại đột biến ở tế bào vi khuẩn • Phân biệt đ−ợc hai loại tổ hợp di truyền và 3 loại nhân tố di truyền IS, Tn và Bacteriophage Mu ở vi khuẩn. • Nêu đ−ợc 3 con đ−ờng vận chuyển vật liệu di truyền ở vi khuẩn • Trình bầy đ−ợc những b−ớc cơ bản và lợi ích của kỹ thuật di truyền trong công nghiệp d−ợc. Đại c−ơng • Các vi sinh vật cũng đều giống tổ tiên mình ở hầu hết các đặc điểm, vì mang các gen di truyền. Các đặc điểm của gen đ−ợc di truyền lại cho đời sau qua sao chép. • Mặt khác gen đảm nhận chức năng nhất định trong quá trình truyền thông tin di truyền, chẳng hạn đọc mã cho một chuỗi polypeptid qua mỗi loại ARN (t- ARN, m-ARN, ), có chức năng điều chỉnh hoặc đóng vai trò điều khiển sự biểu hiện hoạt động của genom. Một số virus có vật liệu di truyền là ARN (virut cúm, dại, HIV ) thì gen là một đoạn ARN đọc mã (nh− bộ máy phiên dịch của tế bào chủ) cho một protein xác định. Bên canh nhân còn có cả plasmid Đại c−ơng • Theo quan niệm hiện hành dòng thông tin di truyền từ nhiễm sắc thể đến tế bào chất ở mọi vi sinh vật diễn ra nh− sau: • 1 2a 1 3a • ADN ARN protein • 2b 3b? • Liệu quá trình 3b có tồn tại trong tự nhiên hay không? 1. Đột biến ngẫu nhiên và phát sinh đột biến • Tế bào vi sinh vật cũng chịu đột biến. Ta phân biệt genotyp (kiểu gen) và phenotyp (kiểu hình) của VSV. Genotyp là tổng tính trạng di truyền trong một cá thể, nh−ng ch−a chắc đ−ợc biểu hiện hết, mà trong mối t−ơng quan với môi tr−ờng chỉ một kiểu hình (phenotyp) trong đó đ−ợc biểu hiện mà thôi. Cần phân biệt Genom (tổng gen) của cơ thể sống và genotyp (kiểu gen) của cá thể sống nói riêng. • Đột biến là sự thay đổi kiểu gen của vi sinh vật. Đột biến có thể là ngẫu nhiên, hay nhân tạo (gây tạo). 1.1.Đột biến ngẫu nhiên và đột biến gây tạo • Đột biến ngẫu nhiên • Trong quần thể VSV luôn diễn ra đột biến ngẫu nhiên với tần xuất khoảng 10-10– 10-5. Nguyên nhân có thể là do tác động của môi tr−ờng và do chuyển hoá tautomer (hỗ biến) của các bazơ khi sao chép. Ví dụ: T tồn tại bình th−ờng ở trạng thái keto(=oxo) sẽ ghép đôi với A. Nh−ng khi sao chép T chuyển sang dạng enol (hydroxy) sẽ ghép đôi với G. Hậu quả là trong sợi ADN mới một cặp GC sẽ thay vào vị trí lẽ ra là của cặp AT. Đột biến gây tạo • Khi xử lý tế bào vsv với các t.nhân đột biến (vật lý, hoá học, sinh học hay kết hợp các tác nhân ấy) đại đa số vsv bị giết chết (trên 99%). Trong số các VSV sống sót xuất hiện các cá thể mang đột biến. Đột biến nh− thế đ−ợc gọi là đb gây tạo. Về tổng thể có hai dạng đột biến: đột biến tổng gen (genom) và đột biến gen. • Đột biến tổng gen là làm thay đổi số gen nom của sinh vật (vd. Từ đơn bội thành đa bội), có giá trị trong cải tạo giống thức vật. • Đột biến gen là làm thay đổi cấu trúc của gen. Đột biến này có hai kiểu chính: đột biến điểm và đột biến chuyển (tr−ợt) khung. Đột biến gen • Đột biến điểm xẩy ra khi một cặp bazơ bị thế bằng một cặp bazơ khác: vd. AT bị thay bằng GC, đây là sự chuyển dịch (transition); còn khi AT bị thay bằng CG, đây là sự đảo dịch (transversion). • Đột biến chuyển khung (tr−ợt khung) xẩy ra khi một đoạn ADN gồm một số bazơ, thậm chí nhiều gen bị loại đi, bị chuyển chỗ, hoặc bị cách ra do sự xen vào (chèn vào) hoặc mất đi của đoạn ADN lạ (nội tại). Hình 5.4. Đột biến điểm đổi cặp base A - T (H)A*- T A - T(H)A* - C (H)A*- C G - C Tác nhân đột biến Cặp bazơ A-T d−ới tác dụng của tác nhân đột biến đã biến đổi thành cặp G -C trong allen đột biến. Hình 5.5. Đột biến tr−ợt khung C C G CT TT T C G AT G G C G A A A A G C T A đứt đoạn C C G C T T T TC G A T G G C G A A A G C T A C C G C T T T T C G A T G G C G A A G C T A A Sóng đôi sai Tái tổng hợp ADN- ligase Tái tổng hợp ADN- ligase Phân huỷ A C C G C T T T T C G A T G G C G A A A A G C T A Thêm A Mất A A C C G C T T C G A T G G C G A A G C T A T T Tr−ợt khung thay đổi mã (các acid amin thay đổi trong protein) 1.2.Cơ chế tác dụng của các t. nhân đ.biến Lắp chất t−ơng tự bazơ • Chất t−ơng tự bazơ là chất kháng trao đổi (anti- metabolite), tế bào nhầm lẫn lắp vào ADN, th−ờng dùng để gây đột biến là BU (bromo-uracil) và AP (2- amino-purin). BU t−ơng tự nh− T nên trong ADN BU chiếm chỗ T sóng đôi với A. • Tuy nhiên do khuynh h−ớng dễ tautome hoá thành dạng enol mà ở vòng sao chép tiếp theo Bu sẽ sóng đôi với G. Hậu quả là đột biến điểm dịch chuyển TA thành CG. AP cũng tác dụng t−ơng tự: mặc dù thể hiện nh− A, nh−ng th−ờng tautomer hoá thành dạng imino sóng đôi với C. Thay đổi hoá học của bazơ • Acid nitrơ (HNO2) khử amin của A, G hoặc nh−ng không làm đứt sợi, do đó thay thế nhóm -NH2 bằng -OH mà: • A –> thành hypoxantin ghép đôi với C, do đó đổi AT-GC. • G –> xantin, vẫn sóng đôi với C nên không gây đột biến. • Hydroxylamin phản ứng chủ yếu với C, khiến bazơ này sóng đôi với A, do đó cũng dẫn đến đột biến: CG –> TA. • Ethyl- và methyl-sulfonat, ethylenimin, N-nitroso- guanidin là các tác nhân alkyl hoá gây đột biến mạnh. Thay đổi hoá học của bazơ • Ví du, EMS (ethyl-methansulfo