Luận văn Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) ở Việt Nam

NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Quang Huy, người thầy mẫu mực đã tận tụy hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ chúng tôi trong cuộc sống. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng tôi trong suốt khóa học này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh, chị, em trong Phòng Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme; Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh vật học đã nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đặc biệt là chồng tôi đã luôn ở bên động viên, chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011 Học viên cao học Trần Thúy Hằng Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN ii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................2 1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)................................................................2 1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật..................5 1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên..............5 1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật .................................................................7 1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật............................................8 1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật .......................................11 1.3.1 Mạng lưới ngoại bào.....................................................................................11 1.3.2 Các thành phần khác .....................................................................................13 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật ........15 1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật ..........................................................15 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật ................................20 1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật ................................................22 1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật................................................................24 1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải ......................................24 1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại ................25 1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác ................................................................26 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................29 2.1 Nguyên liệu .....................................................................................................29 2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu........................................................................29 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định....................................................................................29 2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ..........................................................30 2.2.1 Môi trường nuôi cấy .....................................................................................30 2.2.2 Máy móc, thiết bị..........................................................................................31 2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................31 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn ....................................................................31 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN iii 2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.......................................................32 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật..............................................................................................................32 2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật...................................................33 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt...........................35 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn...............................................35 2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram ...........................................................................36 2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét ..............................................................................................................................37 2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA...............................37 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................39 3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật ......39 3.1.1 Phân lập vi sinh vật.......................................................................................39 3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập.................40 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập..........42 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................................42 3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường .....................................................................43 3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon .......................................................................44 3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................................46 3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể ..................................................................................47 3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập ..............50 3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt.............................................................50 3.3.3 Đặc điểm hình thái........................................................................................53 3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA .................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................60 PHỤ LỤC..............................................................................................................69 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập....................................................................................................44 Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập....................................................................................................45 Bảng 3: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập....................................................................................................47 Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu ......................52 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN v DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ..............................................3 Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên.................4 Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 ..........................................................................................................................5 Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật ....................................................................8 Hình 5. Mô hình phát triển của màng sinh vật .......................................................16 Hình 6. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch ..........39 Hình 7. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch ...............................................................................40 Hình 8. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia..............................................................................41 Hình 9. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đô............................................................................42 Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng phân lập.................................................................................................................43 Hình 11. Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy ............................48 Hình 12. Màng sinh vật trên bề mặt nhựa ..............................................................48 Hình 13. Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập ......................................49 Hình 14. Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật ......................51 Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học .54 Hình 16. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật ........................55 Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA .............................................................................56 Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA .............................................................................57 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN vi BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Acyl - HSL Acyl - homoserine lactone COD Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học) dd NTP Dideoxynucleotide đvC đơn vị Cacbon E24 Emulsion index (chỉ số nhũ tương hóa) OD Optical Density (Mật độ quang học) SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning electron microscopy TCA Tricarboxylic acid TOC Total Organic Carbon w/v Khối lượng (g)/thể tích (ml) Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 1 MỞ ĐẦU Nghiên cứu vi sinh vật học là mô hình nghiên cứu ưu việt để tìm hiểu bản chất của các quá trình sống, đồng thời nó cũng đóng vai trò quan trọng trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp, công nghiệp và môi trường. Tuy nhiên, trong tự nhiên vi sinh vật ít khi tồn tại dưới dạng các tế bào đơn lẻ mà chúng thường được tìm thấy dưới dạng tập hợp các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau và với các bề mặt thông qua mạng lưới chất ngoại bào gọi là màng sinh vật (biofilm). Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát hơn về sự tăng trưởng, phát triển và thích nghi của vi sinh vật trong mối quan hệ với nhau cũng như với các điều kiện môi trường. Đồng thời, việc tìm hiểu về màng sinh vật cũng giúp chúng ta có những hiểu biết sâu hơn về mối liên hệ bên trong của các tế bào trong một màng sinh vật cũng như các cơ chế điều hòa quá trình tạo màng sinh vật. Nghiên cứu về màng sinh vật góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng cao trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, xử lý các sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như các nghiên cứu trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm v.v mà hiện nay tại Việt Nam các nghiên cứu về vi sinh vật tạo màng sinh vật và ứng dụng của chúng còn rất mới mẻ. Chính từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật phân lập ở Việt Nam”. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm) Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khác nhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau [1]. Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều loại vi sinh vật - Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Với việc tự chế tạo ra trên 400 chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình, trong đó có cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động vật vô cùng nhỏ bé”. Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một dạng của màng sinh vật sau này [1]. Cùng với sự ra đời của kính hiển vi quang học hoàn chỉnh vào đầu thế kỷ 19, đặc biệt là việc chế tạo thành công chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên (1934) đã góp phần tạo nên những cống hiến lớn lao của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật học [1]. Năm 1936, Zobell và cộng sự [87] đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi khuẩn bám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so với các vị trí xung quanh. Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như một nơi cư trú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường hoạt động của các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa. Trong những nghiên cứu về hiệu quả của bề mặt rắn đối với hoạt tính của vi khuẩn, Zobell [86] đã chỉ ra rằng bên cạnh việc cung cấp nơi khu trú và tập trung chất dinh dưỡng, bề mặt chất rắn còn làm chậm sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các chất dinh dưỡng thông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ. Một loạt những nghiên cứu tiếp theo đó cũng đề cập đến khả năng hoạt động và tăng trưởng đáng kể của vi sinh vật bằng cách bám dính vào một bề mặt xác Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 3 định. Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chất dinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi trường. Jones và cộng sự [43] đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chỉ ra sự xuất hiện của màng sinh vật trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước thải và cho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau (dựa trên đặc điểm hình thái tế bào). Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu polysaccarit đặc biệt là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4), các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết dính các tế bào trong cấu trúc màng sinh vật chính là polysaccarit. Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ( 57700) [43]. Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, năm 1978, Costerton và cộng sự [14] đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tự nhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất định nhờ hệ thống sợi glycocalyx”. Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám dính của vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được nhờ phương thức sinh thái thích hợp này. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 4 Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh vật được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn. Hiện nay, khái niệm màng sinh vật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra [26], [56]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh hay hữu sinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên [26] Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp được điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào [57]. Vi khuẩn bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy. Quá trình tạo thành màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 5 Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 [57] do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa học và sinh học gây hại [56]. 1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật 1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành tập hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa. Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng. Tại đây, các mảnh vụn hữu cơ và chất khoáng tập trung lại tạo điều kiện cho phép các vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thành các vi khuẩn lạc và dần hình thành nên màng sinh vật trưởng thành [13]. Phân tích thành phần vi sinh vật của màng cho thấy sự hiện diện của vi tảo và vi khuẩn Gallionella spp. Đặc biệt khả năng oxi hóa sắt của chủng Gallionella spp gây kết tủa sắt trong đường ống tạo ra những thay đổi không mong muốn về độ đục, màu sắc và mùi của nước [58]. Các chủng vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas putrefaciens, Escherichia coli, Bacillus sp, Serratia sp cũng được phân lập. Trong 10 m 1 m Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 6 đó, nghiên cứu cho thấy chủng P. putrefaciens có khả năng tạo chất ngoại bào giúp gắn kết các nhóm vi sinh vật với nhau để hình thành màng sinh vật [66]. Trong công nghiệp thực phẩm, khả năng bám dính của các vi sinh vật trên bề mặt các thiết bị chế biến có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị cảm quan của sản phẩm thực phẩm. Nghiên cứu của Sule và cộng sự [78] cho thấy chủng E. coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh có thể phân lập từ các mẫu thịt tươi. Bằng kỹ thuật Real-time PCR, 13 trong số 15 gen ở chủng E. coli này được nghiên cứu cho thấy có liên quan đến các chức năng sống như trao đổi chất, phân chia tế bào, hình thành màng sinh học và khả năng gây bệnh. Nghiên cứu của Kubota và cộng sự [47] về khả năng hình thành màng sinh vật trên 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis và Lactobacillus fructivorans đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic gây hư hỏng thực phẩm. Đặc điểm của sự hình thành màng sinh vật ở các chủng vi khuẩn này cung cấp cho chúng ta một hướng nghiên cứu trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm thực phẩm. Một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng của màng sinh vật là kiểm soát sinh học các tác nhân gây bệnh hại ở cây trồng. Các chủng vi khuẩn được phân lập từ rễ cây hoặc đất trồng ở các khu vực canh tác nông nghiệp cũng cho thấy khả năng hình thành màng sinh vật tương đối cao như: Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa, Rhizobium leguminosarum Nghiên cứu của Fall và cộng sự [30] cho thấy Bacillus subtilis bám dính ở rễ cây có khả năng hình thành màng sinh vật tốt ở nồng độ K+ cao trong môi trường nuôi cấy. Bacillus subtilis cũng có khả năng ức chế sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 ở rễ cây Arabidopsis nhờ khả năng tạo thành màng sinh vật và sản xuất surfactin [5]. Khả năng cộng sinh với mô thực vật cũng như sự tạo thành màng sinh vật trên bề mặt chóp rễ của các chủng Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa [69] cho thấy sự tương tác cùng có lợi giữa thực vật và vi khuẩn trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và hạn chế các tác nhân gây bệnh. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 7 Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn được thu thập từ khu vực nước thải của các nhà máy, làng nghề cũng được phân lập nhằm tìm ra những chủng có khả năng hình thành màng sinh vật tốt, ứng dụng trong việc xử lý nước thải và vệ sinh môi trường. 1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật Trong tự nhiên, có thể bắt gặp và quan sát thấy màng sinh vật trong rất nhiều môi trường khác nhau: từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt của các viên đá nằm dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhân tạo như vòi hoa sen, ống dẫn nước. 1.2.2.1 Trong môi trường tự nhiên Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất cho việc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh vật. Màng sinh vật có thể được tạo thành ngay trên bề mặt nước (khoảng tiếp xúc với không khí) để hình thành nên dạng cấu trúc màng nổi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạng những cặn hay váng của vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước. Một dạng khác của màng sinh vật trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi sinh vật bám dính trên bề mặt vật liệu rắn như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành dạng màng sinh vật bề mặt (hình 4a). 1.2.2.2 Trong các hệ thống thiết bị nhân tạo Màng sinh vật cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ yếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép ) như trên vỏ của tàu thuyền, trong lòng các ống dẫn nước, ống dẫn dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực phẩm. Trong các thiết bị, đồ dùng gia đình cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật khi các vi sinh vật bám dính trong hệ thống vòi hoa sen, bồn rửa mặt. 1.2.2.3 Trong cơ thể sinh vật sống Ngay trong cơ thể sống con người cũng xuất hiện màng sinh vật chủ yếu là của những loài vi sinh vật gây bệnh. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 8 lớp tế bào biểu mô như biểu mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên răng tạo thành cấu trúc màng sinh vật gọi là mảng bám răng (hình 4c). Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể như van tim, niệu quản nhân tạo cũng có thể là vị trí tồn tại của màng sinh vật. (a) (b) (c) Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật (a): Màng sinh vật trên tảng đá; (b): Màng sinh vật trên bề mặt bàn chải đánh răng; (c): Màng sinh vật của vi khuẩn sâu răng hình thành nên mảng bám răng 1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật Sự tạo thành màng sinh vật là một hiện tượng phổ biến trong đời sống của các vi sinh vật và trở thành phương thức giúp chúng tồn tại và phát triển trong tự nhiên. 1.2.3.1 Bảo vệ tế bào trước những bất lợi của môi trường Mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật cung cấp nơi khu trú và một hằng số nội môi thích hợp cho các vi khuẩn tồn tại. Nó đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của các màng sinh vật. Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính trao đổi anion. Điều này cũng có nghĩa là nó sẽ làm hạn chế sự khuếch tán của một số hợp chất từ môi trường xung quanh vào trong màng sinh vật [45]. Màng sinh vật của các chủng vi sinh vật tạo màng giúp chúng kháng lại các tác nhân là các vi khuẩn, các chất kháng sinh hay chất sát trùng. Cơ chế bảo vệ của màng sinh vật có thể là: ngăn chặn sự xâm nhập của các chất này vào trong màng Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 9 sinh vật; thay đổi tốc độ tăng trưởng của các vi sinh vật trong màng hay các biến đổi chức năng sinh lý khác thông qua các phương thức tăng trưởng. Đặc tính này phần lớn phụ thuộc vào tính chất của cả mạng lưới biofim và tác nhân kháng khuẩn và thường thể hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhóm ưa nước và tích điện dương như các aminoglycoside [36]. Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn [45]. Thành phần chính của màng sinh vật chiếm tới 97% là nước. Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông qua các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn trong môi trường tự nhiên. Quá trình hấp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết đến do tác dụng của nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như nhóm phosphate, lưu huỳnh, hay nhóm chức axit [56]. 1.2.3.2 Thu nhận nguồn chất dinh dưỡng từ môi trường Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phương tiện trao đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất có nguy cơ độc hại [23]. Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh vật thường bao gồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau. Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa các loài sinh vật đồng trao đổi chất. Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các loài. Màng sinh vật cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan hệ hợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật. Hợp dưỡng là một trường hợp đặc biệt của mối quan hệ cộng sinh, trong đó hai loài (hoặc hai chủng) vi sinh vật khác nhau phụ thuộc lẫn nhau về mặt trao đổi chất để sử dụng một số cơ chất nhất định, đặc biệt là cho các yêu cầu về năng lượng [31]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 10 1.2.3.3 Thu nhận những đặc tính di truyền mới Quá trình trao đổi gen (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa và đa dạng di truyền của cộng đồng các vi sinh vật trong tự nhiên. Trao đổi gen được biết đến là sự di chuyển vật liệu di truyền giữa các loài vi sinh vật khác nhau. Hiện tượng này xảy ra trong vi khuẩn là cách kết hợp trực tiếp DNA tự do của các tế bào vi khuẩn. Nhờ việc thu nhận những đặc tính di truyền mới giúp cộng đồng vi sinh vật trong màng tiếp nhận được những gen cần thiết tham gia tích cực trong hoạt động sống của màng sinh vật [45]. Tầm quan trọng của quá trình trao đổi gen đã được ứng dụng trong những nghiên cứu về khả năng kháng thuốc của vi sinh vật, kỹ thuật di truyền tạo nên chủng vi sinh vật mới trong các ngành công nghiệp. Trong đó cơ chế trao đổi gen phổ biến ở vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên khi các vi khuẩn trong tự nhiên tồn tại dưới dạng màng sinh vật, liên kết với nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ đó vi khuẩn trong màng sinh vật có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [26]. 1.2.3.4 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài Màng sinh vật được hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật có cấu trúc không gian phức tạp. Do đó, các loài sinh vật cùng tồn tại trong màng sinh vật thích nghi với những điều kiện dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong màng. Ngoài ra, khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các vi sinh vật tận dụng được tối đa nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất [4]. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong màng sinh vật cũng có tác động lớn đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Sự phối hợp của nhiều nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ và việc cùng cư trú trong màng sinh vật của các nhóm vi sinh vật sẽ góp phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [45]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 11 1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật Quá trình tạo màng sinh vật cần có sự tham gia của nhiều yếu tố để hình thành nên cấu trúc đặc trưng của màng. Tỷ lệ và mức độ bám dính của tế bào vi khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của bề mặt tế bào, sự hiện diện của lông roi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài ra còn có protein màng tế bào và sự sản suất mạng lưới chất ngoại bào [26]. Thêm vào đó, các bằng chứng thực nghiệm cho thấy rằng sự phát triển chủ yếu của một màng sinh vật có thể được điều hòa bởi mật độ tế bào - phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen được điều khiển bởi các phân tử tín hiệu ngoại bào. 1.3.1 Mạng lưới ngoại bào Mạng lưới chất ngoại bào chứa hàm lượng cacbon chiếm 50 - 90% tổng lượng cacbon hữu cơ trong màng sinh vật và được xem như là vật liệu chất nền chính của màn...o thấy rằng các vi sinh vật có thể hoạt động như một tác nhân đối kháng với nhiều mầm bệnh khác nhau ở thực vật bao gồm các loại sâu bọ và các mầm bệnh vi sinh vật như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Các vi sinh vật có thể tồn tại tự do trong đất hoặc bám dính với bề mặt mô thực vật thành từng cụm tế bào. Mối quan hệ này phần lớn mang lại lợi ích cho cả hai bên: thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và nơi khu trú lâu dài cho các Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 26 quần thể vi sinh vật. Mặt khác, các vi sinh vật trong mối tương tác này có thể làm thay đổi môi trường sống xung quanh theo hướng có lợi cho sự phát triển của thực vật [69]. Một trong những cơ chế giúp các vi sinh vật ức chế mầm bệnh gây hại ở cây trồng đó là thông qua chất kháng sinh. Ví dụ, chủng Bacillus cereus UW85 có khả năng tổng hợp cả zwittermycin và kanosamine [69]. Khả năng tổng hợp chất kháng sinh giúp làm tăng tính cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật; đồng thời cũng là cơ sở để tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng phòng trừ bệnh gây hại ở thực vật chủ yếu dưới dạng phân bón vi sinh bổ sung vào nguồn đất trồng. Bais và cộng sự [5] đã chứng minh rằng nhờ quá trình hình thành màng sinh vật trên rễ cây Arabidopsis, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 6051 đã tạo ra surfactin ức chế sự xâm nhiễm của chủng P. syringae gây hại cây trồng. Khả năng đối kháng của chủng Bacillus thuringiensis chống lại tác nhân gây bệnh cây trồng Erwinia carotovora đã được chứng minh qua nghiên cứu của Morikiwa [56]. E. carotovora sản xuất các phân tử tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào acyl - HSL và biểu hiện gen gây độc, trong khi đó các chủng B. thuringiensis có enzyme acyl - homoserine lactonase, làm giảm mạnh acyl - HSL. Do vậy, B. thuringiensis làm giảm đáng kể khả năng nhiễm và phát triển của E. carotovora - tác nhân gây bệnh thối củ ở khoai tây. 1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác  Ứng dụng của màng sinh vật làm giảm sự ăn mòn kim loại Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora SP-6. D. orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số hợp kim khác. Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ USD [34]. Vi khuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một chất cho điện tử để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các bề mặt kim loại. Trong khi đó, vi khuẩn L. discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó không gây ra sự ăn mòn đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 27 với D. orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mòn thép nhẹ sẽ tăng lên rất lớn [28]. Nghiên cứu của Morikawa [56] cho thấy sự hình thành màng sinh vật ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6.  Trong công nghiệp lên men Trong các bồn lên men ở quy mô công nghiệp, màng sinh vật là hình thức hiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật [47]. Sau mỗi mẻ lên men, các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng giữ lại trong các bồn lên men. Do đó, mỗi khi tiếp tục một quy trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Quy trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành. Ngược lại, khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng sinh vật sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý cũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.  Ứng dụng trong công nghiệp dầu khí Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được phân lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu [67] mở ra triển vọng ứng dụng trong công nghiệp dầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường, làm chất phân tán và nhũ hóa cặn dầu. Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứng dụng của màng sinh vật trong đời sống. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhận được từ các công trình khoa học nước ngoài. Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Nam còn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật còn chưa nhiều, chưa sâu. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 28 chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật từ môi trường nước thải giàu nguồn cacbon ở các khu vực làng nghề và nhà máy sản xuất và đưa ra một số ứng dụng theo hướng xử lý nước thải môi trường. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải cũng như ức chế các vi sinh vật gây hại, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước thải tại một số khu vực ô nhiễm làng nghề ở Việt Nam. Mẫu được lấy vào thời điểm các buổi sáng trong ngày, chứa trong các ống falcon đã khử trùng rồi đem về phòng thí nghiệm để phân tích. Cụ thể, tại các địa điểm sau: Thứ nhất, nguồn nước thải tại làng miến Lại Trạch - Yên Phú - Yên Mỹ - Hưng Yên: Hệ thống thoát nước và hồ lắng của làng miến chứa lượng nước thải lớn lẫn cặn bột và bã bột dong. Mẫu nước thải được lấy tại các hồ lắng này. Thứ hai, nguồn nước thải tại làng bún Phú Đô - Mễ Trì - Từ Liêm - Hà Nội: Toàn bộ nước thải của quá trình làm bún được thải trực tiếp ra các cống, rãnh của cả làng. Do vậy, khu vực nước thải làng nghề nơi chúng tôi lấy mẫu có một màu trắng đục, chua và hôi. Thứ ba, nguồn nước thải tại nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp thực phẩm - Thanh Xuân - Hà Nội: Nguồn nước thải được sử dụng là nước thải của xưởng bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã được tách cặn thông qua bể lắng sơ bộ. Nguồn nước thải có thành phần COD 2500 - 3000 (mg/l), BOD5 1500 - 2000 (mg/l), pH 4,5 - 5,5. Chỉ số COD cao chủ yếu là do trong thành phần nước thải có chứa nhiều tinh bột và các chất hữu cơ. 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định Các vi sinh vật kiểm định được sử dụng trong đề tài bao gồm: Staphylococcus aureus; Ralstonia solanacaerum; Samonella typhi; E. coli; Vibrio parahaemolyticus do bộ môn Vi sinh thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cung cấp. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 30 2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.2.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường LB (Luria - Bertani broth hay Luria broth): Tryptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 10g Nước cất 1 lít Môi trường LB là môi trường thường được sử dụng trong việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn hiếu khí. Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng nguồn cacbon, nitơ cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Môi trường khoáng cơ bản: (NH4)2SO4 2g MgSO4.7H2O 0,2g NaH2PO4.H2O 0,5g CaCl2.2H2O 0,1g K2HPO4 0,5g Nước cất 1 lít Môi trường khoáng cơ sở: KH2PO4 1,36g CaCl2 0,03g Na2HPO4 2,13g MgSO4.7H2O 0,2g FeSO4.7H2O 0,01g Glucose 10g Nước cất 1 lít Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 31 Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120 phút. Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu, đánh giá khả năng tạo màng sinh vật như các loại đường Fructose (Sigma - Mỹ); Arabinose (Merk - Đức), Mannose (Merk - Đức), NaCl (Công ty cổ phần Hóa chất Đức Giang) đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu. 2.2.2 Máy móc, thiết bị Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản) Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức) Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý) Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức) Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ) Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản) Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh) Tủ ấm (Memmert - Đức) Tủ sấy (Memmert - Đức) Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức) Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng. Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1, 10-2 đến 10-5 trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch. Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện và được quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ. Các khuẩn lạc sau khi phát triển sẽ được tách riêng rẽ và được nuôi cấy trên môi trường phù hợp hoặc LB có bổ sung thạch. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 32 2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật  Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch, các vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng. Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được lấy ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4oC. Hàng tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới.  Phương pháp bảo quản giống lâu dài Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ lạnh sâu -80oC. 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể. Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v). Tím kết tinh (crystal violet hay Gentian violet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có công thức phân tử là C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino) phenyl) methylium chloride. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các tế bào vi sinh vật. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62] Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4. Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 33 bổ sung vào 700l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC. Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn. Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm. 2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật Mỗi chủng vi sinh vật tùy theo đặc tính sinh học của chúng chỉ có thể tạo thành màng sinh vật tốt nhất ở những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, các nguồn carbon, nitơ. 2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ môi trường khác nhau. Các nhiệt độ được lựa chọn nghiên cứu là: 20oC, 30oC, 37oC, 40oC, 50oC và 60oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 34 2.3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trường khác nhau. Các giá trị pH môi trường khác nhau được lựa chọn nghiên cứu là: pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cacon trong môi trường Bổ sung các nguồn cacbon vào môi trường khoáng cơ bản với nồng độ 1%. Các nguồn carbon được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Đường 5 cacbon: Arabinose, Fucose, Rhamnose Đường 6 cacbon: Glucose, Mannose, Fructose, Galactose Đường đôi: Saccharose, Lactose Polysaccarit : Tinh bột Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau, điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường Bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường khoáng cơ sở với nồng độ 0,1%. Chỉnh pH tới 7,0 - 7,2. Các nguồn nitơ được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, (NH4)2C6H5O7, Pepton, Cao nấm men. Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 35 Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau với điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt Khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật được đánh giá bằng mức độ nhũ tương hóa dung dịch dầu ăn của dịch nuôi cấy tế bào thông qua chỉ số E24 (emulsion index) theo phương pháp của Suwansukho và cộng sự [80]. Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau đó, dịch nuôi cấy lắc được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy phần dịch nổi. Bổ sung 2ml dầu ăn vào 2ml dịch vi khuẩn thu được sau khi ly tâm trong các ống nghiệm nhỏ, đường kính 1cm. Vortex với tốc độ cao trong 1 phút Sau 24 giờ, lấy ra đo mức độ nhũ tương hóa. Chỉ số nhũ tương hóa E24 được tính theo công thức sau: E24 = [(chiều cao cột nhũ tương hóa)/(tổng chiều cao cột)] × 100% [80]. 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm đối với các chủng vi khuẩn kiểm định được xác định theo phương pháp của De Angelis và cộng sự [21]. Các chủng vi sinh vật (bao gồm các chủng vi sinh vật đã phân lập được thử nghiệm khả năng kháng khuẩn và các chủng vi sinh vật kiểm định) được nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng trên máy lắc với tốc độ 160 vòng/phút, ở 37oC. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 36 Sau đó, dịch nuôi cấy vi sinh vật thử nghiệm được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn. Dịch lắc của vi khuẩn kiểm định được cấy trải trên các đĩa môi trường LB - thạch với thể tích 100l. Các lỗ được đục với đường kính 6mm trên các đĩa thạch. Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào các lỗ thạch với thể tích 30l. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát và chụp ảnh trên các đĩa thạch. Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm được xác định dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn (D) xuất hiện xung quanh lỗ thạch. D = D - d D: đường kính vòng vô khuẩn (mm) d: đường kính lỗ thạch (mm). 2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu, vi khuẩn được nhuộm bằng tím kết tinh sau đó được xử lý bằng iot để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot được giữ lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kết tinh - iot. Khi nhuộm lại bằng safranin thì vi khuẩn có màu hồng [3]. Tiến hành: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch (sau khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 37 Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu (ethanol 95%), giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Quan sát dưới kính hiển vi: dùng vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần [3]. 2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét Chuẩn bị mẫu màng sinh vật nổi: dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn phân lập có khả năng tạo màng sinh vật tốt được bổ sung vào bình tam giác chứa 20ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy tĩnh trong 24 giờ, ở 37oC. Mẫu màng sinh vật được gắn lên lamelle, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. Rửa nhẹ mẫu gắn màng sinh vật bằng nước cất khử trùng, để khô tự nhiên. Gắn mẫu lên đế Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC - 1200 trong 5 phút ở 30mA Quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) tại phòng chụp hiển vi điện tử quét thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu - Khoa Vật Lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA Phương pháp này dựa trên phương pháp Sanger có cải tiến: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA - polymerase. Với việc sử dụng thêm các ddNTP cùng các dNTP thông thường, kết quả là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen 16S rRNA mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 38 phải biến tính tách rời 2 mạch rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Mỗi dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một hóa chất huỳnh quang có màu khác nhau. Mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra một phổ ánh sáng hẹp với một đỉnh khác biệt. Các số liệu phát ra được lưu ghi lại trong máy tính. Sau khi quá trình chạy điện di kết thúc, chuỗi các tín hiệu huỳnh quang được chuyển ngược thành thông tin trình tự nucleotit [71]. Kết quả được xử lý trên phần mềm PC/Gene, Gendoc, BioEdit và được so sánh với trình tự đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bằng chương trình BLAST (Basic Local Aignment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJ EMBL để tìm xem mức độ tương đồng của các chủng nghiên cứu với loài nào là lớn nhất [2]. Kết quả đọc trình tự 16S rDNA của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật mạnh được thực hiện với sự giúp đỡ của Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 39 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật 3.1.1 Phân lập vi sinh vật Từ mẫu nước thải khu vực làng nghề miến Lại Trạch, chúng tôi phân lập được 23 chủng vi sinh vật, số lượng các chủng lần lượt thu được từ phần nước thải tầng mặt là 6 chủng, phần giữa cách tầng mặt 30cm là 11 chủng và phần mặt đáy là 6 chủng, số chủng phân lập từ phần giữa chiếm 47,83%. Phân lập mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia chúng tôi thu được 6 chủng vi sinh vật ở tầng mặt, 8 chủng từ khu vực phần giữa cách tầng mặt 30cm và phần mặt đáy là 11 chủng, số chủng phân lập được từ phần mặt đáy chiếm 44%. Từ mẫu nước thải làng bún Phú Đô chúng tôi phân lập được 27 chủng vi sinh vật với số lượng chủng hiện diện ở tầng mặt là 5 chủng, khu vực nước phần giữa cách mặt nước 15cm là 12 chủng và phần mặt đáy là 10 chủng, số chủng phân lập được từ phần giữa chiếm 44,44%. Hình 6. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Kết quả thu được cho phép chúng tôi nhận định: phần lớn các chủng vi sinh vật phân lập được từ các mẫu nước thải tập trung ở khu vực nước phần giữa và phần mặt đáy. Các địa điểm lấy mẫu lại chủ yếu là những khu vực nước thải chứa hàm lượng cacbon cao. Điều này phù hợp với giải thích về khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật ở các phần nước này. Đây là phần nước thải ít có sự biến động và Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 40 xáo trộn về dòng chảy, là một điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn gắn kết với nhau và với các bề mặt. Đồng thời phần nước này cũng là nơi cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng giúp các tế bào tăng trưởng và phát triển tốt, hứa hẹn thu nhận được nhiều chủng có khả năng hình thành màng sinh vật tốt, phù hợp với mục đích nghiên cứu. 3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập Nghiên cứu khả năng phát triển và tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập chúng tôi nhận thấy rằng trong môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng, được lắc 160 vòng/phút, ở 37oC thì vi sinh vật sinh trưởng và phát triển rất nhanh, các tế bào đều tồn tại ở dạng sống trôi nổi, tự do. Tuy nhiên, khi nuôi cấy các vi sinh vật trong điều kiện tĩnh thì chúng tôi lại nhận thấy có một sự chuyển đổi từ dạng sống trôi nổi tự do sang dạng gắn kết với bề mặt. Kết quả nghiên cứu đánh giá khả năng phát triển và tạo màng sinh vật thể hiện trên các hình 7, hình 8 và hình 9 cho thấy rõ nhận định trên. 0 1 2 3 A1 .1 A1 .2 A1 .3 A1 .4 A1 .5 A1 .6 M1 .1 M1 .2 M1 .3 M1 .4 M1 .5 M1 .6 M1 .7 M1 .8 M1 .9 M1 .10 M1 .11 U1 .1 U1 .2 U1 .3 U1 .4 U1 .5 U1 .6 Các chủng vi sinh vật M ứ c độ p há t t ri ển OD620 OD570 Hình 7. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch Đánh giá sự phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập từ nguồn nước thải làng nghề miến Lại Trạch (hình 7), chúng tôi nhận thấy: Trong môi trường nuôi cấy ở điều kiện tĩnh, khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 620 nm (OD620) đặc trưng cho mật độ tế bào sống trôi nổi giảm thấp, trong khi khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm (OD570) đặc trưng cho mật độ tế bào Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 41 trong cấu trúc màng sinh vật tăng lên đáng kể. Trong số đó, có 2 chủng vi sinh vật tạo màng tốt nhất mà chúng tôi lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo đó là M1.10 và U1.3. Kết quả đánh giá tương tự được chúng tôi thực hiện với các chủng vi sinh vật phân lập từ nguồn nước thải nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm (hình 8) và làng nghề bún Phú Đô (hình 9). Từ kết quả thu được có thể nhận thấy rằng đối với mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia chúng tôi thu được khá nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật tốt, trong đó 3 chủng có hoạt tính tạo màng tốt nhất được chúng tôi lựa chọn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo đó là A3.3, M3.8 và U3.7 (hình 8). 0 1 2 3 A3 .1 A3 .2 A3 .3 A3 .4 A3 .5 A3 .6 M3 .1 M3 .2 M3 .3 M3 .4 M3 .5 M3 .6 M3 .7 M3 .8 U3 .1 U3 .2 U3 .3 U3 .4 U3 .5 U3 .6 U3 .7 U3 .8 U3 .9 U3 .10 U3 .11 Các chủng vi sinh vật M ứ c đ ộ p h át tr iể n OD620 OD570 Hình 8. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia Kết quả thí nghiệm cho thấy trong 3 khu vực lấy mẫu thì mẫu nước thải từ làng nghề bún Phú Đô chúng tôi phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật nhất và các chủng này cũng có hoạt tính tạo màng cao nhất. Trong số đó, chúng tôi lựa chọn được 3 chủng có khả năng tạo màng sinh vật tốt nhất để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo đó là M4.3, M4.9 và M4.10 (hình 9). Quá trình chuyển từ dạng sống trôi nổi sang dạng cấu trúc màng sinh vật bám dính bề mặt (cụ thể ở đây là bám dính bề mặt nhựa) trong điều kiện nuôi cấy Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 42 0 1 2 3 4 A4 .1 A4 .2 A4 .3 A4 .4 A4 .5 M4 .1 M4 .2 M4 .3 M4 .4 M4 .5 M4 .6 M4 .7 M4 .8 M4 .9 M4 .10 M4 .11 M4 .12 U4 .1 U4 .2 U4 .3 U4 .4 U4 .5 U4 .6 U4 .7 U4 .8 U4 .9 U4 .10 Các chủng vi sinh vật M ứ c đ ộ p h át tr iể n OD620 OD570 Hình 9. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đô tĩnh đã chứng tỏ đây là một kiểu phản ứng thích nghi với sự thay đổi về điều kiện sống của vi sinh vật. Khi sống trong một điều kiện không thuận lợi cho sự tăng trưởng tự do, các tế bào sống có xu hướng gắn kết nhau trên một bề mặt hữu sinh hoặc vô sinh thông qua mạng lưới chất ngoại bào để có thể trao đổi vật chất và thông tin với nhau, kết thành một tổ chức vững chắc nhằm đáp ứng với những hạn chế của môi trường, thông qua đó giúp chúng tồn tại và phát triển. Như vậy, trong số các chủng vi sinh vật phân lập được từ các khu vực nước thải giàu nguồn cacbon chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng có hoạt tính tạo màng sinh vật mạnh nhất cho các nghiên cứu tiếp theo. Đó là các chủng được ký hiệu lần lượt là M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9, M4.10. Các chủng này hầu hết đều được phân lập từ mẫu nước thải khu vực phần giữa và mặt đáy. Điều này phù hợp với nhận định ban đầu về khả năng bám dính của vi sinh vật với hoạt tính tạo màng sinh vật của chúng. 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ Khảo sát sự tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu với các điều kiện nhiệt độ khác nhau để tìm ra khoảng nhiệt độ thích hợp nhất, chúng tôi thu được kết quả như sau: Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 43 0 1 2 20°C 30°C 37°C 40°C 50°C 60°C Nhiệt độ K h ả n ăn g tạ o m àn g s in h v ật M1.10 U1.3 A3.3 M3.8 U3.7 M4.3 M4.9 M4.10 Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng phân lập Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành màng sinh vật cho thấy: Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu hầu hết biểu hiện hoạt tính tạo màng sinh vật mạnh nhất ở nhiệt độ 37oC. Tuy nhiên, ở 50oC một số chủng như M1.10, U1.3, M3.8, M4.9 vẫn có hoạt tính tạo màng sinh vật tương đối tốt. Kết quả này cho thấy một số chủng được phân lập vừa thể hiện hoạt tính màng sinh vật tốt, vừa có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao. Các kết quả thu được này cũng khá phù hợp với các kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [59]. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ 37oC thích hợp cho nhiều chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường ô nhiễm ở Việt Nam phát triển và tạo màng sinh vật. 3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường Các chủng vi sinh vật tăng trưởng phù hợp với một khoảng pH xác định. Để khảo sát pH thích hợp cho sự tạo thành màng sinh vật của các chủng phân lập, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tĩnh các vi khuẩn trong những môi trường có pH khác nhau và thu được kết quả như ở bảng 1. Kết quả ở bảng 1 cho thấy các chủng phân lập đều có khả năng phát triển và tạo màng sinh vật trong khoảng pH từ 4 đến 8,5. Tuy nhiên với chủng M1.10 thì pH thích hợp nhất cho sự tạo thành màng sinh vật là 7 và 7,5 với giá trị OD570 là 1,7; Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 44 Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân lập Giá trị pH/Khả năng tạo màng sinh vật (OD570) Ký hiệu chủng pH4 pH4,5 pH5 pH5,5 pH6 pH6,5 pH7 pH7,5 pH8 pH8,5 M1.10 0,214 0,514 0,979 1,288 1,418 1,480 1,772 1,725 1,527 0,438 U1.3 0,625 0,781 0,910 0,946 0,971 0,983 1,158 1,130 1,088 0,694 A3.3 0,468 0,525 0,612 0,615 0,806 0,817 1,245 1,066 0,835 0,412 M3.8 1,008 1,116 1,188 1,266 1,388 1,406 1,631 1,482 1,453 1,438 U3.7 0,531 0,993 1,001 1,074 1,187 1,195 1,331 1,261 1,188 1,157 M4.3 0,525 0,803 1,142 1,280 1,287 1,348 1,457 1,451 1,436 1,549 M4.9 0,326 0,362 1,128 1,419 1,551 1,60...U1.3 tương đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970 và tương đồng 99,8% với chủng Bacillus subtilis_AB042061. Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7 tương đồng 99,8% với đoạn trình tự 16S của vi khuẩn Bacillus velezensis_AY603658 và tương đồng 99,5% với chủng Bacillus nematotocita_AY820954. Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 100 99 100 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 M3.8 100 M4.9 80 77 Bacillus sonorensis_AF302118 72 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus nematotocita_AY820954 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 59 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061 Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191 26 61 59 79 23 69 100 98 100 100 85 100 54 0.01 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 57 Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng 4 chủng vi khuẩn có khả năng hình thành màng sinh vật mạnh nhất phân lập được từ các khu vực nước thải của các làng nghề đều thuộc chi Bacillus. Chi này bao gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao, hình thành bào tử và đa số là không gây bệnh. Nhờ khả năng tạo được các sản phẩm thương mại có giá trị, như hầu hết các protease và amylase, cũng như thao tác di truyền dễ dàng mà các vi khuẩn chi Bacillus được xem là mô hình nghiên cứu hiệu quả và có tính ứng dụng cao[49]. Sự tạo thành màng sinh vật ở chủng Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, hóa mỹ phẩm Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 99 100 99 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658 U3.7 Bacillus nematotocita_AY820954 82 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 79 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191 78 Bacillus subtilis subsp spizizenii_ AF074970 59 U1.3 Bacillus subtilis_AB042061 67 54 79 70 72 100 99 100 98 77 100 66 0.01 Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 58 [56]. Bằng cách tạo ra hợp chất surfactin trong quá trình tạo màng sinh vật, B. subtilis giúp các cây trồng có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh như Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Khả năng tạo gramicidin của chủng Bacillus brevis 18-3 có tác dụng làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6 [5]. Mặt khác, khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật trong quá trình tạo màng cũng làm tăng mức độ nhũ tương hóa và tạo bọt trong chế biến thực phẩm và tạo nhũ hóa cho các sản phẩm mỹ phẩm [80]. Đồng thời, đặc tính này cũng đã mở ra triển vọng mới trong việc chế tạo chất hoạt động bề mặt sinh học hoạt tính cao từ nguồn vi sinh vật ứng dụng cho công nghiệp dầu khí để xử lý các sự cố tràn dầu [6]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Từ mẫu 75 chủng vi sinh vật phân lập được từ nước thải các làng nghề ở Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 và M4.10 có hoạt tính tạo màng sinh vật cao hơn các chủng còn lại. 2. Tám chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất ở 37oC và pH từ 7 - 7,5. Trong số các chủng này, bốn chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) và trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ ((NH4)2SO4, cao nấm men) khác nhau. 3. Các chủng M3.8, M4.9 và U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và Vibrio parahaemolyticus, với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm và 9 mm; 8 mm và 10 mm; 7 mm và 9 mm; trong khi đó chủng U3.7 có hoạt tính kháng mạnh đối với 3 chủng Staphylococcus aureus, Samonella typhi và Ralstonia solanacaerum với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm, 7 mm và 8 mm. 4. Những phân tích về đặc điểm hình thái và phân tích gen 16S rDNA của 4 chủng cho phép chúng tôi nhận định 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus. Trong đó, chủng M3.8, M4.9 gần với loài Bacillus licheniformis; chủng U1.3 gần với loài Bacillus subtilis còn chủng U3.7 gần với loài Bacillus velezensis. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt và đặc tính kháng khuẩn của bốn chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải và trong phòng chống dịch hại gây bệnh trên cây trồng. Tìm hiểu thành phần protein và vai trò của sự điều hòa biểu hiện gen trong quá trình tạo thành màng sinh vật của bốn chủng vi khuẩn phân lập. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 3. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh: 4. Allison D. G., Gilbert P., Wilson M. (2000), Community ctructure and co-operation in biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, England. 5. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. (2004), “Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production”, Plant Physiology, 134(1), pp. 307-319. 6. Banat I. M. (1995), “Characterization of biosurfactants and their use in pollution removal-state of the art”, Acta biotechnologica, 15, pp. 251-267. 7. Bendinger B., Rijnaarts H. H. M., Altendorf K., Zehnder A. J. B. (1993), “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp. 3973-3977. 8. Beveridge T. J., Makin S. A., Kadurugamuwa J. L., Li Z. (1997), “Interactions between biofilms and the environment”, FEMS Microbiology Reviews, 20, pp. 291-303. 9. Boyd A., Chakrabarty A. M. (1994), “Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2355-2359. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 61 10. Brading M. G., Jass J., Lappin-Scott H. M. (1995), “Dynamics of bacterial biofilm formation”, Microbial biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, pp. 46-63. 11. Brooks W., Demuth D. R., Gil S., Lamont R. J. (1997), “Identification of a Streptococcus gordonii SspB domain that mediates adhesion to Porphyromonas gingivalis”, Infection and Immunity, 65, pp. 3753-3758. 12. Characklis W. G. (1990), “Biofilm processes”, Biofilms, Wiley-Interscience, New York, pp. 195-231. 13. Characklis W. G., Marshall K. C. (1990), “Biofilms: a basis for an interdisciplinary approach”, Biofilms, John Wiley & Sons, New York, pp. 3-15. 14. Costerton J. W., Geesey G. G., Cheng K. J. (1978), “How bacteria stick”, Scientific American, 238(1), pp. 86-95. 15. Costerton J. W., Ingram J. M., Cheng K. J. (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriological Reviews, 38(1), pp. 87-110. 16. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott H. M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49, pp. 711-745. 17. Cowan M. M., Warren T. M., Fletcher M. (1991), “Mixed species colonization of solid surfaces in laboratory biofilms”, Biofouling, 3, pp. 23-34. 18. Czaczyk K., Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal of Environmental Studies, 16(6), pp. 799-806. 19. Davey M. E., O'toole G. A. (2000), “Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(B), pp. 847-867. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 62 20. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski B. H., Costerton J. W., Greenberg E. P. (1998), “The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm”, Science, 280, pp. 295-298. 21. De Angelis M., Siragusa S., Berloco M., Caputo L., Settanni L., Alfonsi G., Amerio M., Grandi A., Gobbetti M. (2006), “Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding”, Research in Microbiology, 157, pp. 792-801. 22. De Weger L. A., Van Der Vlught C. I. M., Wijfjes A. H. M., Bakker P. A. H. M., Schippers B., Lugtenberg B. (1987), “Flagella of a plant growth- stimulating Pseudomonas fluorescens strain are required for colonization of potato roots”, Journal of Bacteriology, 169, pp. 2769-2773. 23. Decho A. W. (1990), “Microbial exopolymer secretion in ocean environment: Their role(s) in food web and marine process”, Oceanography and Marine Biology: Annual Review, 28, pp. 73-153. 24. Deflaun M. F., Marshall B. M., Kulle E. P., Levy S. B. (1994), “Tn5 insertion mutants of Pseudomonas fluorescens defective in adhesion to soil and seeds”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2637-2642. 25. Donlan R. M. (2000), “Role of biofilms in antimicrobial resistance”, American Society for Artificial Internal Organs Journal, 46(6), pp. S47-S52. 26. Donlan R. M. (2002), “Biofilms: Microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases, 8(9), pp. 881-890. 27. Donlan R. M., Pipes W. O., Yohe T. L. (1994), “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research, 28, pp. 1497-1503. 28. Emerson D., Ghiorse W. C. (1992), “Isolation, cultural maintenance, and taxonomy of a sheath-forming strain of Leptothrix discophora and characterization of manganese-oxidizing activity associated with the sheath”, Applied and Environmental Microbiology, 58, pp. 4001-4010. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 63 29. Espinosa-Urgel M., Salido A., Ramos J. L. (2000), “Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds”, Journal of Bacteriology, 182, pp. 2363-2369. 30. Fall R., Kinsinger R. F., Wheeler K. A. (2004), “A simple method to isolate biofilm-forming Bacillus subtilis and related species from plant roots”, Systematic and Applied Microbiology, 27, pp. 372-379. 31. Flemming H. C. (1993), “Biofilm and environmental protection”, Water Science and Technology, 27, pp. 1-10. 32. Fletcher M. (1988), “Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance”, Journal of Bacteriology, 170, pp. 2027-2030. 33. Fujita M., Tanaka K., Takahashi H., Amemura A. (1994), “Transcription of the principal sigma-factor genes, rpoD and rpoS, in Pseudomonas aeruginosa is controlled according to the growth phase”, Molecular Microbiology, 13, pp. 1071-1077. 34. Geesey G. G. (1990), Biofouling and biocorrosion in industrial water systems: Proceedings of the international workshop on industrial biofouling and biocorrosion, stuttg, Springer Verlag, Berlin, Germany. 35. Geesey G. G. (2001), “Bacterial behaviour at surfaces”, Current Opinion in Biotechnology, 4, pp. 296-300. 36. Gilbert P., Das J., Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”, Advances in Dental Research, 11(1), pp. 160-167. 37. Haggag W. (2010), “The role of biofilm exopolysaccharides on biocontrol of plant diseases”, Biopolymers, InTech, pp. 217-184. 38. Haggag W. M. (2007), “Colonization of exopolysaccharide-producing Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against crown rot disease”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp. 1568-1577. 39. Heukelekian H., Heller A. (1940), “Relation between food concentration and surface for bacterial growth”, Journal of Bacteriology, 40(4), pp. 547-558. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 64 40. Heydorn A., Nielsen A. T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B. K., Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT”, Microbiology, 146, pp. 2395-2407. 41. Hussain M., Wilcox M. H., White P. J. (1993), “The slime of coagulase - negative staphylococci: biochemistry and relation to adherence”, FEMS Microbiology Reviews, 104, pp. 191-208. 42. Jackson D. W., Simecka J. W., Romeo T. (2002), “Catabolite repression of Escherichia coli biofilm formation”, Journal of Bacteriology, 184, pp. 3406-3410. 43. Jones H. C., Roth I. L., Sanders W. M. (1969), “Electron microscopic study of a slime layer”, Journal of Bacteriology, 99(1), pp. 316-325. 44. Kaplan J. B., Ragunath C., Ramasubbu N., Fine D. H. (2003), “Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta- hexosaminidase activity”, Journal of Bacteriology, 185, pp. 4693-4698. 45. Kokare C. R., Chakraborty S., Khopade A. N., Mahadik K. R. (2009), “Biofilm: Importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 8, pp. 159-168. 46. Korber D. R., Lawrence J. R., Sutton B., Caldwell D. E. (1989), “Effects of laminar flow velocity on the kinetics of surface colonization by mot+ and mot- Pseudomonas fluorescens”, Microbial Ecology, 18, pp. 1-19. 47. Kubota H., Senda S., Nomura M., Tokuda H., Uchiyama H. (2008), “Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 106(4), pp. 381-386. 48. Lamont R. J., Jenkinson H. F. (1998), “Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, pp. 1244-1263. 49. Lazarova V., Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29(10), pp. 2227-2245. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 65 50. Lazarova V., Manem J. (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for water and wastewater treatment”, Biofilms II: process analysis and applications, Wiley-Liss, New York, United States, pp. 159-206. 51. Lee J. W., Yeomans W. G., Allen A. L., Deng F., Gross R. A., Kaplan D. L. (1999), “Biosynthesis of novel exopolymers by Aureobasidium pullulans”, Applied and Environmental Microbiology, 65(12), pp. 5265-5271. 52. Lengeler J. W., Drews G., Schlegel H. G. (1999), Biology of the Prokaryotes, Wiley-Blackwell, New Jersey, United States. 53. Leriche V., Sibille P., Carpentier B. (2000), “Use of an enzyme-linked lectinsorbent assay to monitor the shift in polysaccharide composition in bacterial biofilms”, Applied and Environmental Microbiology, 66, pp. 1851-1856. 54. Matsukawa M., Greenberg E. P. (2004), “Putative exopolysaccharide synthesis genes influence Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Journal of Bacteriology, 186, pp. 4449-4456. 55. Mceldowney S., Fletcher M. (1986), “Variability of the influence of physicochemical factors affecting bacterial adhesion to polystyrene substrata”, Applied and Environmental Microbiology, 52(3), pp. 460–465. 56. Morikawa M. (2006), “Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 101(1), pp. 1-8. 57. Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., Kanaya S. (2006), “Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γ - polyglutamate”, Microbiology, 152, pp. 2801-2807. 58. National Association of Corrosion Engineers (1976), “The role of bacteria in the corrosion of oil field equipment”, Technical Practices Committee No 3, National Association of Corrosion Engineers, Houston, Texas, pp. 23. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 66 59. Nguyen Q. H., Nguyen T. P. L., Tran T. H. (2011), “Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam”, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 27(2S), pp. 187-193. 60. Notermans S., Doormans J. A., Mead G. C. (1991), “Contribution of surface attachment to the establishment of microorganisms in food processing plants: A review”, Biofouling, 5, pp. 21-36. 61. O'toole G. A., Gibbs K. A., Hager P. W., Phibbs P. V. J., Kolter R. (2000), “The global carbon metabolism regulator crc is a component of a signal transduction pathway required for biofilm development by Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182(2), pp. 425-431. 62. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular Microbiology, 30, pp. 295-304. 63. O’toole G. A., Kolter R. (1998), “Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: A genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28, pp. 449-461. 64. Oliveira R., Melo L., Oliveira A., Salgueiro R. (1994), “Polysaccharide production and biofilm formation by Pseudomonas fluorescen: effects of pH and surface material”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2(1-3), pp. 41-46. 65. Otto K., Norbeck J., Larsson T., Karlsson K. A., Hermansson M. (2001), “Adhesion of type 1-fimbriated Escherichia coli to abiotic surfaces leads to altered composition of outer membrane proteins”, Journal of Bacteriology, 183, pp. 2445-2453. 66. Page S., Gaylarde C. (1990), “Biocide activity against Legionella and Pseudomonas”, International Biodeterioration, 26(2-4), pp. 139-148. 67. Pornsunthorntawee O., Maksung S., Huayyai O. (2009), “Biosurfactant production by Pseudonmonas aeruginosa SP4 using sequencing batch reactors: Effect of oil loading rate and cycle time”, Bioresource Technology 100, pp. 812-818. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 67 68. Pratt L. A., Kolter R. (1998), “Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili”, Molecular Microbiology, 30(2), pp. 285-289. 69. Ramey B. E., Koutsoudis M., Von Bodman S. B., Fuqua C. (2004), “Biofilm formation in plant-microbe associations”, Current Opinion in Microbiology, 7(6), pp. 602-609. 70. Ron E. Z., Rosenberg E. (2001), “Natural roles for biosurfactants”, Environmental Microbiology, 3, pp. 229-236. 71. Sanger F., Nicklen E. F., Conlson A. R. (1997), “DNA Sequencing with chain terminating inhibitor”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(12), pp. 5403-5460. 72. Sauer K., Camper A. K., Ehrlich G. D., Costerton J. W., Davies D. G. (2002), “Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm”, Journal of Bacteriology, 184, pp. 1140-1154. 73. Schmoll T., Ott M., Oudega B., Hacker J. (1990), “Use of a wild-type gene fusion to determine the influence of environmental conditions on expression of the S fimbrial adhesin in Escherichia coli pathogen”, Journal of Bacteriology, 172(5), pp. 5103-5111. 74. Sleytr U. B. (1997), “Basic and applied S-layer research: an overview”, FEMS Microbiology Reviews, 20(1-2), pp. 5–12. 75. Stanley N. R., Lazazzera B. A. (2004), “Environmental signals and regulatory pathways that influence biofilm formation”, Molecular Microbiology, 52, pp. 917-924. 76. Steyn B. (2005), Proteomic analysis of the biofilm and biofilm – associated phenotypes of Pseudomonas aeruginosa cultured in batch, PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria, Pretoria. 77. Stoodley P., Sauer K., Davies D. G., Costerton J. W., Microbiol. A. R. (2002), “Biofilms as complex differentiated communities”, Annual review of microbiology, 56, pp. 187-209. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 68 78. Sule P., Horne S. M., Logue C. M., Prüß B. M. (2011), “Regulation of cell division, biofilm formation, and virulence by FlhC in Escherichia coli O157:H7 grown on meat”, Applied and Environmental Microbiology, 77(11), pp. 3653–3662. 79. Sutherland I. W. (2001), “Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework”, Microbiology, 147, pp. 3-9. 80. Suwansukho P., Rukachisirikul V., Kawai F., H-Kittikun A. (2008), “Production and applications of biosurfactant from Bacillus subtilis MUV4”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 30, pp. 87-93. 81. Thys S. (2009), Effect of biosurfactants isolated from endophytes on biofilm formation by Candida albicans, Master dissertation, Universiteit gent, Novara, Italy. 82. Tolker-Nielsen T., Brinch U. C., Ragas P. C., Andersen J. B., Jacobsen C. S., Molin S. (2000), “Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms”, Journal of Bacteriology, 182, pp. 6482-6489. 83. Watnick P., Kolter P. (2000), “Biofilm, city of microbes”, Journal of Bacteriology, 182(10), pp. 2675-2679. 84. Watnick P. I., Fulner K. J., Kolter R. (1999), “A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholera El Tor”, Journal of Bacteriology, 181, pp. 3606-3609. 85. Xie H., Cook G. S., Costerton J. W., Bruce G., Rose T. M., Lamont R. J. (2000), “Intergeneric communication in dental plaque biofilms”, Journal of Bacteriology, 182(24), pp. 7067-7069. 86. Zobell C. E. (1943), “The effect of solid surfaces upon bacteria activity”, Journal of Bacteriology, 46(1), pp. 39-56. 87. Zobell C. E., Anderson D. Q. (1936), “Observations on the multiplication of bacteria in different volumes of stored sea water and the influence of oxygen tension and solid surfaces”, The Biological bulletin, 71, pp. 324-342. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 69 PHỤ LỤC Bảng 1: Trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 CTCAGGACGA ACGCTGGCGG CGTGCCTAAT ACATGCAAGT CGAGCGGACC GACGGGAGCT TGCTCCGTTA GGTCAGCGGC GGACGGGTGA GTAACACGTG GGTAACCTGC CTGTAAGACT GGGATAACTC CGGGAAACCG GGGCTAATAC CGGATGCTTG ATTGAACCGC ATGGTTCAAT CATAAAAGGT GGCTTTTAGC TACCACTTAC AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAACT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTACCGTTCG AATAGGGCGG TACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GCGCGCGCAG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGCGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGAGGGTTTC CGCCCTTTAG TGCTGCAGCA AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAACCCTAG AGATAGGGCT TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG TGACAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGGC AGAACAAAGG GCAGCGAAGC CGCGAGGCTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG GATCGCAGTC TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTTG GAGCCAGCCG CC Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 70 Bảng 2: Trình tự gen 16S rDNA của chủng M4.9 CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC GGACCGACGG GAGCTTGCTC CCTTAGGTCA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT AATACCGGAT GCTTGATTGA ACCGCATGGT TCAATCATAA AAGGTGGCTT TTAGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAACGGCTCA CCAAGGCGAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC GGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAACTCTGTT GTTAGGGAAG AACAAGTACC GTTCGAATAG GGCGGTACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGCGCG CGCAGGCGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTC TGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGCGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGAGG GTTTCCGCCC TTTAGTGCTG CAGCAAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAC CCTAGAGATA GGGCTTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGGCAGAAC AAAGGGCAGC GAAGCCGCGA GGCTAAGCCA ATCCCACAAA TCTGTTCTCA GTTCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGG TGAGGTAACC TTTTGGAGCC AGCCGCC Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 71 Bảng 3: Trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3 AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA CACGTGGGTA ACCTGCCTGT AAGACTGGGA TAACTCCGGG AAACCGGGGC TAATACCGGA TGGTTGTTTG AACCGCATGG TTCAAACATA AAAGGTGGCT TCGGCTACCA CTTACAGATG GACCCGCGGC GCATTAGCTA GTTGGTGAGG TAATGGCTCA CCAAGGCAAC GATGCGTAGC CGACCTGAGA GGGTGATCGG CCACACTGGG ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC GCAATGGACG AAAGTCTGAC GGAGCAACGC CGCGTGAGTG ATGAAGGTTT TCGGATCGTA AAGCTCTGTT GTTAGGGAAG AACAAGTACC GTTCGAATAG GGCGGTACCT TGACGGTACC TAACCAGAAA GCCACGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGTA GGTGGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGGGCT CGCAGGCGGT TTCTTAAGTC TGATGTGAAA GCCCCCGGCT CAACCGGGGA GGGTCATTGG AAACTGGGGA ACTTGAGTGC AGAAGAGGAG AGTGGAATTC CACGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATGT GGAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGACTCTC TGGTCTGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG CGTGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACGA TGAGTGCTAA GTGTTAGGGG GTTTCCGCCC CTTAGTGCTG CAGCTAACGC ATTAAGCACT CCGCCTGGGG AGTACGGTCG CAAGACTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC CTCTGACAAT CCTAGAGATA GGACGTCCCC TTCGGGGGCA GAGTGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGA TCTTAGTTGC CAGCATTCAG TTGGGCACTC TAAGGTGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGACAGAAC AAAGGGCAGC GAAACCGCGA GGTTAAGCCA ATCCCACAAA TCTGTTCTCA GTTCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCACGAGAG TTTGTAACAC CCGAAGTCGT TGAGGTAACC TTTTAGGAGC CAGCCGCCGA AGGTGGGACA GATGATTGGG GTGAAGTCGT Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 72 Bảng 4: Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7 GCTCAGGACG AACGCTGGCG GCGTGCCTAA TACATGCAAG TCGAGCGGAC AGATGGGAGC TTGCTCCCTG ATGTTAGCGG CGGACGGGTG AGTAACACGT GGGTAACCTG CCTGTAAGAC TGGGATAACT CCGGGAAACC GGGGCTAATA CCGGATGGTT GTCTGAACCG CATGGTTCAG ACATAAAAGG TGGCTTCGGC TACCACTTAC AGATGGACCC GCGGCGCATT AGCTAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG GCGACGATGC GTAGCCGACC TGAGAGGGTG ATCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT CTTCCGCAAT GGACGAAAGT CTGACGGAGC AACGCCGCGT GAGTGATGAA GGTTTTCGGA TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG GGAAGAACAA GTGCCGTTCA AATAGGGCGG CACCTTGACG GTACCTAACC AGAAAGCCAC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GGGCTCGCAG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC ATTGGAAACT GGGGAACTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAGT GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT AACGCATTAA GCACTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAATCCTAG AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA GTTGCCAGCA TTCAGTTGGG CACTCTAAGG TGACTGCCGG TGACAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAATCATCA TGCCCCTTAT GACCTGGGCT ACACACGTGC TACAATGGAC AGAACAAAGG GCAGCGAAAC CGCGAGGTTA AGCCAATCCC ACAAATCTGT TCTCAGTTCG GATCGCAGTC TGCAACTCGA CTGCGTGAAG CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT AACACCCGAA GTCGGTGAGG TAACCTTTAT GGAGCCAGCC GCCGAAGGTG