Nghiên cứu một số đặc tính gây bệnh của vi khuẩn ESCHERICHIA, SALMONELLA gây tiêu chảy ở bê giống sữa nuôi tại ngoại thành Hà Nội và biện pháp phòng, trị

in cam đoan rằng kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phạm Hồng Ngân Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… ii LỜI CẢM ƠN! Trong quá trình học tập, nghiên cứu, tơi luơn nhận được sự giúp đỡ, ủng hộ vơ giá về kiến thức, tài liệu, kinh nghiệm nghề nghiệp cũng như động viên khuyến khích về tinh thần của thầy hướng dẫn. Tơi vơ cùng trân trọng và ghi nhớ bền lâu cơng ơn của PGS. TS. Trương Quang. Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, Ban Chủ nhiệm cùng tập thể cán bộ Khoa Thú y, Viện ðào tạo Sau đại học về sự giúp đỡ tận tình và đầy tinh thần trách nhiệm. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn cán bộ, cơng nhân viên Bộ mơn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Bộ mơn Ký sinh trùng, Bộ mơn Thú y cộng đồng, Bộ mơn Nội - Chẩn - Dược - ðộc chất Khoa Thú y, Truờng ðại học nơng nghiệp Hà Nội, Bộ mơn Vi trùng Viện Thú y, Chi cục Thú y Hà Nội, Cơng ty giống gia súc Hà Nội, Trạm thú y Gia Lâm, Long Biên, ðơng Anh, Thanh Trì vì sự giúp đỡ tinh thần và ủng hộ cơ sở vật chất, thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài. Một số kết quả nghiên cứu trong luận án này thực hiện được nhờ sự tài trợ của dự án Ford Foundation (Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội), Dự án Việt – Bỉ, FAO Việt Nam. Tơi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này. Trong quá trình thực hiện đề tài tơi đã nhận được sự giúp đỡ về nguyên vật liệu, dụng cụ và tài liệu của G.S. Maria Fe C. Vizmanos ðại học Quốc gia Philippin, G.S. Chris J. Murray Viện khoa học y học và thú y, Úc, GS Marion Duchet-Suchax Viện nghiên cứu nơng nghiệp Quốc gia Cộng hồ Pháp, tơi vơ cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu đĩ. Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn sự động viên, khuyến khích, ủng hộ về tinh thần và vật chất của bạn bè, bố, mẹ, vợ và các con. Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Tác giả luận án Phạm Hồng Ngân Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt viii Danh mục bảng x Danh mục hình xii Danh mục ảnh xiii MỞ ðẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 3 3 Ý nghĩa khoa học của đề tài 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn E.coli 5 1.1.1 Giáp mơ 7 1.1.2 Thành tế bào 8 1.1.3 Kháng nguyên pili 9 1.1.4 Plasmid 13 1.1.5 Enterotoxin 13 1.1.6 Hệ thống thu nhận sắt 19 1.2 ðặc điểm cấu tạo và đặc tính huyết thanh học các yếu tố kháng nguyên của vi khuẩn E.coli 20 1.2.1 Kháng nguyên O 20 1.2.2 Kháng nguyên K 25 1.2.3 Kháng nguyên pili 29 1.2.4 Kháng nguyên M 35 1.2.5 Kháng nguyên H 35 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… iv 1.3 Một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn Salmonella 36 1.3.1 Lipopolisaccharide (LPS) 36 1.3.2 Enterotoxin 43 1.3.3 Cytotoxin 44 1.3.4 Flagella 45 1.3.5 Khơng bào chứa sắt 45 1.3.6 Heat - Shock protein 46 1.3.7 Khả năng bám dính và xâm nhập tế bào 46 1.3.8 Plasmid độc lực 46 1.3.9 Khả năng tồn tại và nhân lên trong tế bào đại thực bào 47 1.4 Phương pháp phịng và điều trị bệnh do E.coli và Salmonella gây ra ở bê 48 1.4.1 Phịng bệnh 48 1.4.2 ðiều trị 53 Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 2.1 Nội dung 54 2.2 Nguyên liệu 54 2.2.1 ðộng vật thí nghiệm 54 2.2.2 Giống vi khuẩn và kháng huyết thanh 55 2.2.3 Dụng cụ, hố chất và mơi trường 55 2.3 Phương pháp nghiên cứu 56 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 56 2.3.2 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn 56 2.3.3 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, số lượng E.coli và Salmonella trong 1g phân 56 2.3.4 Xác định kháng nguyên pili của các chủng E.coli 57 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… v 2.3.5 Xác định khả năng sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn E.coli và Salmonella 58 2.3.6 Phương pháp xác định LD50 59 2.3.7 Phương pháp kiểm tra độc lực các chủng E.coli, Salmonella phân lập 60 2.3.8 Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli và Salmonella với kháng sinh và hố dược 60 2.3.9 Phương pháp xác định serotype của các chủng Salmonella 61 2.3.10 Phương pháp xác định Coliform và E.coli trong nước thải 63 2.3.11 Phương pháp xác định các chỉ tiêu lâm sàng 63 2.3.12 Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hố máu 63 2.3.13 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm trên bê với vi khuẩn enterotoxigenic E.coli 64 2.3.14 Bố trí thí nghiệm xử lý phân bị sữa bằng kỹ thuật ủ hiếu khí vi sinh vật 65 2.3.15 Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu lý, hĩa, vi sinh vật của đống ủ thí nghiệm kỹ thuật ủ hiếu khí vi sinh vật xử lý phân bị sữa 65 2.3.16 Xử lý số liệu 66 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 67 3.1 Kết quả phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm E.coli, Salmoneella ở bê giống sữa 67 3.1.1 Kết quả xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân bê khơng tiêu chảy và tiêu chảy 67 3.1.2 Kết quả xác định số lượng vi khuẩn E.coli trong 1 gram phân của bê khơng tiêu chảy và bê tiêu chảy 69 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… vi 3.1.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ phân bê tại một số cơ sở chăn nuơi bị sữa ở Hà Nội 73 3.1.4 Kết quả xác định số lượng vi khuẩn Salmonella spp trong 1 gram phân bê khơng tiêu chảy và bê tiêu chảy 75 3.2 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli và Salmonella 77 3.2.1 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh học các chủng E.coli phân lập từ bê giống sữa 77 3.2.2 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của một số chủng Salmonella spp phân lập từ bê giống sữa 83 3.3 Kết quả nghiên cứu một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn E.coli và Salmonella 86 3.3.1 Kết quả nghiên cứu một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn E.coli 86 3.3.2 Kết quả nghiên cứu một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella 100 3.4 Kết quả nghiên cứu sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hĩa máu của bê gây nhiễm thực nghiệm với vi khuẩn Enterotoxigenic E.coli 110 3.4.1 Số lượng hồng cầu, tỷ khối hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố ở bê gây bệnh thí nghiệm với enterotoxigenic Escheriachia coli 110 3.4.2 Số lượng và cơng thức bạch cầu ở bê gây bệnh thí nghiệm với vi khuẩn enterotoxigenic E.coli 112 3.4.3 Hàm lượng đường huyết và độ dự trữ kiềm trong máu bê gây nhiễm enterotoxigenic E.coli 116 3.4.4 Kết quả xác định hàm lượng protein tổng số và các tiểu phần protein trong huyết thanh bê gây nhiễm enterotoxigenic E.coli 118 3.5 Kết quả nghiên cứu một số biện pháp phịng và điều trị bệnh 122 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… vii 3.5.1 Kết quả nghiên cứu một số biện pháp xử lý mơi trường chuồng nuơi bị sữa vì mục đích phịng bệnh 122 3.5.2 Kết quả điều trị tiêu chảy do E.coli và Salmonella gây ra ở bê sữa 132 KẾT LUẬN - ðỀ NGHỊ 138 1 Kết luận 138 2 ðề nghị 139 Danh mục các cơng trình đã cơng bố cĩ liên quan đến luận án 140 Tài liệu tham khảo 141 Phụ lục 157 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosin triphosphate BGA Brilliant green agar BHI Brain Heart Infusion cAMP Cyclic adenosine monophosphate CFA Colonization factor antigen CFU Colony forming unit CHO Chinese Hamster Ovary CNF Cytotoxic necrotizing factors CT Choleratoxin DNA Deoxyribonucleic axit E.coli Escherichia coli EAEC Enteroaggrigative E.coli EHEC Enterohaemorrhagic E.coli EIEC Enteroinvasive E.coli EM Effective Microorganisms EMB Eosin-Methylene Blue EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC FAO Enterotoxigenic E.coli Food and Agriculture Organization FDA Food & Drug Administration Gr (-) Gram âm Gr (+) Gram dương GTP Guanosin triphosphate Hb Hemoglobin HF Holstein Friesian hLT Human heat labile enterotoxin HSP Heat-shock protein Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… ix IMViC Indole, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrat kDa Kilodalton KDO 2-keto-3-deoxymanlunosotonic axit LD50 Lethal Dose 50 LPS Lipopolysaccharide LT Heat labile enterotoxin MacC. MacConkey mEq Milliequivalent MPN Most Probable Number MR Methyl red mRNA Messenger Ribonucleic Axit NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide NADP Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NADPH Dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PGE2 Prostaglandin E2 pLT Porcine heat labile enterotoxin PMN Polymorphonuclear Leukocytes RNA Ribonucleic axit SLT Shigalike toxin ST Heat stable enterotoxin TNF Tumor necrosis factor TSA Triple soy agar TSI Triple sugar iron VP Voges proskauer VT Verotoxin WHO XLD World Health Organization Xylolysin deoxychocolat Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… x DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí và số loại khuẩn lạc trong 1 gram phân bê khơng tiêu chảy và tiêu chảy 68 3.2 Tổng số vi khuẩn E.coli trong 1 gram phân bê khơng tiêu chảy và tiêu chảy 70 3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân bê 73 3.4 Kết quả xác định số lượng vi khuẩn Salmonella trong phân bê khơng tiêu chảy và bê tiêu chảy 77 3.5 Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuơi cấy, sinh vật hố học của các chủng E.coli phân lập từ bê khơng tiêu chảy và tiêu chảy 79 3.6 Kết quả xác định kháng nguyên pili cĩ mặt ở các chủng E.coli phân lập từ bê 87 3.7 Tỷ lệ các chủng E.coli phân lập từ bê sản sinh enterotoxin 93 3.8 Kết quả xác định LD50 của chủng enterotoxigenic E.coli 95 3.9 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn enterotoxigenic E.coli trên chuột bạch 96 3.10 Kết quả kiểm tra lâm sàng bê gây nhiễm enterotoxigenic E.coli 97 3.11 Kết quả kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí và số lượng vi khuẩn E.coli trong chất chứa ruột non bê thí nghiệm 99 3.12 Kết quả kiểm tra khả năng bám dính của các chủng Salmonella spp phân lập từ bê 100 3.13 Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của các chủng Salmonella phân lập từ bê 102 3.14a Kết quả định type kháng nguyên O theo nhĩm các chủng Salmonella spp phân lập từ bê 104 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… xi 3.14b Kết quả xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella phân lập từ bê 106 3.15 Kết quả xác định LD50 của vi khuẩn Salmonella phân lập từ bê 107 3.16 Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng Salmonella trên chuột bạch 108 3.17 Kết quả kiểm tra lâm sàng trên bê gây nhiễm Salmonella dublin 109 3.18 Số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố và tỷ khối hồng cầu của bê gây bệnh bằng enterotoxigenic E.coli 110 3.19 Số lượng và cơng thức bạch cầu của bê gây bệnh thực nghiệm với enterotoxigenic E.coli. 112 3.20 Hàm lượng đường huyết, hàm lượng Natri, Kali huyết thanh và hàm lượng kiềm dự trữ trong máu bê thí nghiệm 117 3.21 Hàm lượng protein tổng số và các tiểu phần protein ở bê thí nghiệm 119 3.22 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật nước thải chuồng nuơi bị sữa 123 3.23 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật nước thải chuồng nuơi bị sữa sau khi xử lý bằng chế phẩm EM 124 3.24a ðộ ẩm mẫu nguyên liệu ban đầu 128 3.24b ðộ ẩm của các lơ thí nghiệm trong quá trình xử lý 128 3.25a Một số chỉ tiêu vi sinh vật của nguyên liệu compost 129 3.25b Một số chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm compost sau khi ủ 28 ngày 130 3.26 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh và hĩa dược của các chủng enterotoxigenic E.coli phân lập từ bê 133 3.27 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella spp phân lập từ bê 135 3.28 Kết quả điều trị bệnh tiêu chảy ở bê 136 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… xii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Biến động số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram phân bê 72 3.2 Biến động số lượng vi khuẩn E.coli trong 1 gram phân bê 72 3.3 Kết quả phân lập Salmonella ở bê giống sữa 76 3.4 Số lượng vi khuẩn Salmonella trong 1 gram phân bê 76 3.5 Kết quả xác định kháng nguyên pili cĩ mặt ở các chủng E.coli phân lập từ bê 93 3.6 Tỷ lệ các chủng E.coli phân lập từ bê sản sinh enterotoxin 94 3.7 Số lượng hồng cầu của bê gây bệnh bằng enterotoxigenic E.coli 113 3.8 Số lượng bạch cầu ở bê gây bệnh thí nghiệm enterotoxigenic E.coli 113 3.9a Hàm lượng Natri trong huyết thanh bê thí nghiệm 120 3.9b Hàm lượng Kali huyết thanh bê thí nghiệm 120 3.10 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của 3 lơ thí nghiệm 126 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… xiii DANH MỤC ẢNH STT Tên ảnh Trang 3.1 Khuẩn lạc E.coli trên mơi trường MacC 80 3.2 Khuẩn lạc E.coli trên mơi trường Min ca 80 3.3 Vi khuẩn E.coli phát triển trên mơi trường TSI 81 3.4 Khuẩn lạc E.coli trên mơi trường EMB 81 3.5 Vi khuẩn E.coli (x 900) 82 3.6 Các phản ứng sinh hĩa của vi khuẩn E.coli 82 3.7 Khuẩn lạc Salmonella spp trên mơi trường MacC 83 3.8 Khuẩn lạc Salmonella spp trên mơi trường BGA 84 3.9 Khuẩn lạc Salmonella spp trên mơi trường XLD 84 3.10 Vi khuẩn Salmonelle phát triển trên mơi trường TSI 85 3.11 Vi khuẩn Salmonella (x 900) 86 3.12 Chuột bạch sơ sinh thí nghiệm 90 3.13 Kiểm tra độc tố ruột 91 3.14 Bê thí nghiệm 98 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 1 MỞ ðẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI Chăn nuơi bị là một trong những nghề truyền thống, gắn bĩ với người nơng dân Việt Nam. Từ lâu, người ta chăn nuơi bị để lấy sức kéo, phân bĩn cho cây trồng, thịt, sữa và nguyên liệu phục vụ cơng nghiệp, thủ cơng mỹ nghệ. Sản lượng sữa tươi sản xuất trong nước đạt 262160 tấn trong năm 2008, 234438 tấn trong năm 2007, năm 2006 là 215953 tấn so với 64703 tấn năm 2001 (Tổng cục thống kê, 2009). Chăn nuơi bị đang giữ vị thế quan trọng trong tiến trình phát triển kinh tế của đất nước, nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, xĩa đĩi giảm nghèo. Tốc độ tăng trưởng đàn bị liên tục tăng lên trong suốt 10 năm qua. Năm 2001 tổng đàn bị trong cả nước là 3899700 con, năm 2007 đạt con số 6724700 con so với năm 2006 là 6510800 con (Cục Chăn nuơi, 2007). Từ năm 2001 đến nay số lượng đàn bị sữa tăng lên rất nhanh. Chính phủ đã cĩ chủ trương đẩy mạnh phát triển chăn nuơi bị sữa ở Việt Nam thơng qua Quyết định 167/2001/Qð/TTg về chính sách phát triển chăn nuơi bị sữa. Theo chủ trương này từ năm 2001 đến 2004 một số địa phương trong cả nước đã nhập một số lượng lớn bị sữa (10000 con) từ các nước cĩ ngành chăn nuơi bị sữa phát triển như Mỹ, New Zealand. Cho đến năm 2006 tổng đàn bị sữa của cả nước đạt trên 113.200 con, tăng trưởng bình quân 25%/năm. Sản lượng sữa năm 2006 đạt 215953 tấn, tốc độ tăng trưởng trung bình đạt 31%/năm. Hiện cả nước cĩ khoảng 19600 hộ chăn nuơi bị sữa, trung bình 5,3 con/hộ (Hà Yên, 2006). Theo ước tính, 94,5% đàn bị sữa được nuơi trong khu vực gia đình, khoảng 0,5% trong các liên doanh, cịn lại 5% thuộc sở hữu các cơ sở chăn nuơi Nhà nước. Nhu cầu tiêu thụ sữa tươi của người tiêu dùng nước ta đang Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 2 ngày càng tăng, hiện nay mức tiêu thụ bình quân trong nước chỉ mới đạt 7 kg/người/năm. Khả năng tự sản xuất sữa tươi trong nước mới đạt 0,8 kg/người/năm, như vậy nước ta phải nhập khẩu 90% lượng sữa phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước (Nguyễn Hữu Lương, 2003). Như vậy cĩ thể thấy bức tranh tổng quan về lợi ích thiết thực và xu thế phát triển của nghề chăn nuơi bị, đặc biệt chăn nuơi bị sữa ở nước ta. Cùng với chủ trương phát triển đàn bị sữa của Chính phủ, chăn nuơi bị sữa đang ngày càng phát triển, trong đĩ cĩ Hà Nội. Mặc dù vậy, chăn nuơi bị ở nước ta, đặc biệt bị sữa đang đối mặt với một số nguy cơ làm chậm tốc độ tăng trưởng. Trong đĩ cĩ những nguyên nhân về điều kiện tự nhiên như khí hậu nĩng ẩm, thiếu đồng cỏ xanh, thiếu nguồn nước sạch và dịch bệnh là những thách thức phát triển đàn bị sữa ở nước ta trong giai đoạn hiện nay. Kết quả điều tra dịch bệnh ở gia súc và gia cầm các tỉnh phía Bắc cho thấy: Một số bệnh thường gặp ở trâu, bị khơng gây thành dịch lớn nhưng lại cĩ tỷ lệ chết trung bình hàng năm lên đến (6,62%). Hội chứng tiêu chảy do một số nguyên nhân gây ra gĩp phần làm tăng tỷ lệ chết ở đàn trâu, bị nước ta. Tỷ lệ chết do các bệnh đường tiêu hĩa (ngoại trừ các bệnh ký sinh trùng đường tiêu hĩa) trung bình là 1,28%, giao động trong phạm vi 0,39 - 2,83% (Hồ ðình Chúc, 1999). Bệnh tiêu chảy đặc biệt trầm trọng ở gia súc non, phổ biến ở hầu khắp các vùng sinh thái nước ta. ðặc biệt ở bê, nghé, cĩ tới 70% - 80% tổn thất nằm trong thời kỳ nuơi dưỡng bằng sữa đầu và 80% - 90% trong số đĩ là do hậu quả của tiêu chảy gây ra (Lê Minh Chí, 1995; Trích dẫn bởi Nguyễn Văn Sửu, 2005). E.coli và Salmonella là hai thành viên của họ vi khuẩn đường ruột (enterobacteriaceae) đĩng vai trị quan trọng gây nên các quá trình bệnh lý ở đường tiêu hĩa các lồi gia súc. Bệnh do chúng gây ra cĩ phạm vi phân bố rộng trên tồn thế giới (Wray và Sojka, 1977). Ở Việt Nam, một số tác giả đã Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 3 nghiên cứu vai trị gây bệnh của vi khuẩn E.coli, Salmonella ở trâu, bị, bê, nghé địa phương, trên nhiều khía cạnh khác nhau như nghiên cứu của các tác giả: Hồ Văn Nam và cs (1994), Nguyễn Quang Tuyên (1996), Phạm Ngọc Thạch (1998), Nguyễn Bá Hiên (2001), Nguyễn Văn Quang và cs (2002), Nguyễn Thị Oanh, Phùng Quốc Chướng (2003), Nguyễn Văn Sửu (2005). Các cơng trình nghiên cứu đã phân tích, đánh giá tác động và vai trị của vi khuẩn gây tiêu chảy ở trâu, bị, bê, nghé. Mặc dù vậy, chưa cĩ tác giả nào nghiên cứu một cách hệ thống về các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn enterotoxigenic E.coli gây ra trên đàn bê giống sữa nuơi tại thành phố Hà Nội và một số tỉnh chăn nuơi bị sữa chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam.Từ năm 2001 đến nay khi đàn bị sữa tăng nhanh về số lượng đã bộc lộ những yếu kém về chăm sĩc, nuơi dưỡng và quản lý dịch bệnh tại một số địa phương, trong đĩ cĩ bệnh tiêu chảy ở bê đã gây khơng ít khĩ khăn cho nghề chăn nuơi bị sữa. Chính vì vậy tại Hội nghị về Chương trình phát triển đàn bị sữa Việt Nam vào ngày 15/08/2006 tại Long An, Bộ trưởng Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn đã nhận xét: “Năm năm qua, chăn nuơi bị sữa đang chập chững những bước đi đầu tiên. ðây là ngành chăn nuơi cơng nghệ cao, khơng giống nuơi trâu, bị thường nên cần phải học tập” (Hà Yên, 2006). Xuất phát từ những vấn đề mang tính lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella gây tiêu chảy ở bê giống sữa nuơi tại ngoại thành Hà Nội và biện pháp phịng trị”. 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU + Xác định một số đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E.coli, Salmonella phân lập từ bê tiêu chảy. + ðề xuất biện pháp phịng trị bệnh tiêu chảy do E.coli và Salmonella gây ra ở bê. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 4 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI + Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung, làm phong phú thêm lý luận cơ sở về căn bệnh E.coli và Salmonella. + Bổ sung, ứng dụng các phương pháp nghiên cứu về vi khuẩn E.coli và Salmonella. + Kết quả nghiên cứu thu được của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo đồng thời đĩng gĩp thêm tài liệu tham khảo cho nghiên cứu, giảng dạy chuyên mơn chuyên ngành Thú y tại tại các trường ðại học, Cao đẳng và Trung học chuyên nghiệp, cho cán bộ thú y và người chăn nuơi. + Bổ sung các biện pháp phịng, trị hội chứng tiêu chảy ở bê, gĩp phần giải quyết một số vấn đề mà thực tiễn sản xuất đặt ra, đặt biệt là chăn nuơi bị sữa. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ YẾU TỐ ðỘC LỰC CƠ BẢN CỦA VI KHUẨN E.COLI E.coli tên của vi khuẩn bắt nguồn từ tên của người phát hiện Theobald Escherich và nơi cư trú thường xuyên của chúng ở kết tràng (colon). Vi khuẩn E.coli cĩ mặt rất sớm trong đường tiêu hố của động vật cĩ vú, chỉ 24h kể từ khi động vật non sinh ra, chúng đã đạt số lượng cực đại. Theo sự tăng lên về lứa tuổi của gia súc, số lượng E.coli giảm dần rồi ổn định khi đến tuổi trưởng thành của vật chủ và tồn tại ở đường tiêu hố trong suốt đời sống của chúng như một vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện chính của hệ vi khuẩn đường ruột. Hầu hết các chủng E.coli là vơ hại; Vì vậy, trong một thời gian dài, vai trị gây bệnh của chúng bị bỏ qua. Tuy nhiên những tổn thất kinh tế do chúng gây ra ngày càng nghiêm trọng đã thu hút nhiều nhà khoa học lưu tâm nghiên cứu đối với một số chủng cĩ khả năng gây bệnh nhờ cĩ các yếu tố độc lực (Timoney và cs, 1988). E.coli là căn bệnh quan trọng nhất gây ỉa chảy và nhiễm trùng ngồi đường tiêu hĩa kể cả nhiễm trùng huyết ở bê sơ sinh. Một số chủng E.coli nhất định phân lập ở động vật là nguyên nhân gây bệnh ở người truyền qua thực phẩm bị ơ nhiễm. Vi khuẩn E.coli thường cư trú tự nhiên trong đường tiêu hĩa của động vật, do vậy việc phân biệt các chủng gây bệnh với các chủng thuộc hệ vi sinh đường ruột bình thường dựa trên cơ sở xác định các yếu tố độc lực của chúng (Guler và cs, 2008). Các chủng E.coli gây bệnh mang các yếu tố độc lực khác nhau vì vậy thể hiện bệnh ở động vật dưới các biểu hiện bệnh lý lâm sàng khác nhau. Dựa vào các yếu tố độc lực và triệu chứng lâm sàng ở vật chủ, cho đến nay, bảy nhĩm E. coli gây tiêu chảy chính đã được thừa nhận. Chúng bao gồm: Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 6 ETEC (enterotoxigenic E.coli) là nhĩm E.coli mang kháng nguyên pili và sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin; EPEC (enteropathogenic E.coli) khơng sản sinh độc tố enterotoxin và gây viêm ruột bởi những cơ chế cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết tường tận; EIEC (enteroinvasive E.coli) xâm nhập vào trong tế bào niêm mạc ruột gây nên các biến đổi bệnh lý giống như trực khuẩn lỵ Shigella; EHEC (enterohaemorrhagic E.coli) gây xuất huyết ruột; VTEC (verotoxin E.coli) hay cịn gọi STEC (Shigaliketoxin E.coli) sản sinh độc tố tế bào (verotoxin hoặc Shigalike toxin) tác động đến kết tràng, hệ tiết niệu và hệ thần kinh; EAEC (enteroaggregative E. coli) bám dính và kết tập đường ruột đặc trưng bởi hiện tượng tập trung số lượng lớn, bám dính cục bộ trên vùng biểu mơ lơng nhung và sản sinh độc tố ST; Nhĩm NTEC (necrotoxigenic E. coli) sản sinh độc tố hoại tử tế bào ruột (Bela và Peter, 2005; Nagi và cs, 2008). Trong các nhĩm trên đây, ETEC là căn bệnh phổ biến gây tiêu chảy ở bê (Varnam và Evan, 1996; DeBroy và Maddox, 2001; Guler và cs, 2008). Nhĩm ETEC gây tiêu chảy ở hầu hết các lồi động vật và người. Chúng được ghi nhận như một căn bệnh phổ biến gây tiêu chảy cho trẻ em sơ sinh các nước đang phát triển và là nguyên nhân gây bệnh cho khách du lịch từ các quốc gia phát triển đến các quốc gia đang phát triển. Bệnh được gọi là: “Traveller disease”. Người trưởng thành ở các nước đang phát triển thường khơng mắc bệnh này. Bệnh đặc biệt nặng ở gia súc non trong thời kỳ bú sữa, gặp ở hầu hết các lồi gia súc. Nhĩm EPEC gây tiêu chảy chính cho lợn. Các nhĩm EIEC và EAEC gây bệnh chính ở người, riêng ở động vật ít gặp. Những vụ dịch tiêu chảy, gây chết trẻ em được mơ tả trong thời gian gần đây ở Mỹ, Nhật, Tây Ban Nha là do nhĩm VTEC gây ra với các loại độc tố mạnh như verotoxin hoặc Shigalike toxin. Một vài thành phần cấu trúc của tế bào vi khuẩn E.coli và sản phẩm do chúng tiết ra tham gia vào các yếu tố độc lực, tác Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 7 động lên ruột và các mơ bào khác. Thành phần cấu trúc liên quan đến độc lực của vi khuẩn bao gồm: Giáp mơ (capsule), thành tế bào, kháng nguyên pili. Sản phẩm do chúng tiết ra đảm nhận chức năng các yếu tố độc lực bao gồm: độc tố đường ruột (enterotoxin), độc tố tế bào (cytotoxins), yếu tố dung huyết (hemolysin) và aerobactin (Gyles và Theoen, 1993). 1.1.1 Giáp mơ Rất nhiều serotypes E.coli gây tiêu chảy ở động vật cĩ khả năng sinh giáp mơ với bản chất hố học là polysaccharide mà cấu tạo, đặc tính huyết thanh học, di truyền học đã được nghiên cứu kỹ từ nhiều năm qua. Bằng các phương pháp nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào vi khuẩn E.coli cho thấy giáp mơ gĩp phần giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mơ ruột. Do cĩ bản chất hố học là polysaccheride mang tính axit, chúng tạo ra trên bề mặt vi khuẩn điện tích âm gây nên một lực hút với lớp màng trong tế bào biểu mơ ruột mang điện tích dương. Hiện tượng trên giúp cho vi khuẩn bám dính, xâm nhập tế bào vật chủ một cách thuận lợi (Orskov và cs, 1977). Giáp mơ cịn được coi là một yếu tố bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào bằng cách ngăn trở quá trình hoạt hố bổ thể, đặc biệt là thành phần bổ thể C3b. Bổ thể C3b liên quan đến quá trình sản sinh anaphylatoxin, một chất hình thành trong huyết thanh sau khi bổ thể C3b hoạt hố, đến lượt mình anaphylatoxin phân giải tế bào mặt nạ giải phĩng histamin và tăng tính thấm thành mạch. Hai kết quả trên do hoạt động của bổ thể C3b dẫn đến phản ứng viêm phịng vệ. Giáp mơ ngăn trở bổ thể C3b hoạt hố và do vậy bảo vệ tế bào vi khuẩn đề kháng với quá trình tiêu diệt trung gian bổ thể của huyết thanh và quá trình thực bào của bạch cầu nhân đa hình thái (Gyles và Thoen, 1993). Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 8 1.1.2 Thành tế bào Thành tế bào vi khuẩn E.coli cĩ cấu tạo phức tạp, một số thành phần cấu trúc gĩp phần tăng độc lực của chúng. Quan trọng nhất là lipopolysaccharide (LPS) và protein màng ngồi của chúng. Mặc dù kháng nguyên O khơng liên quan đến cơ chế gây tiêu chảy ở động vật nhưng nĩ được coi là một yếu tố quan trọng tương tác với vật chủ. Chiều dài và thành phần hố học chuỗi kháng nguyên O tác động ảnh hưởng đến tế bào và hệ thống phịng vệ của cơ thể. Chiều dài chuỗi kháng nguyên O làm tăng độc lực của vi khuẩn bởi vì chúng tạo phức hợp với bổ thể ở một vị trí cách xa màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn do vậy bảo vệ chúng khơng bị dung giải. Thành phần hố học của chuỗi kháng nguyên O hoạt hố bổ thể ở mức độ chậm hơn so với khả năng của chúng vì vậy làm chậm quá trình opsonin hố, tiêu diệt tế bào vi khuẩn (Gyles và Thoen, 1993). Tác động độc lực chính của LPS là do thành phần lipit A quyết định. Lipit A kích thích tế bào đại thực bào và một số tế bào khác sản sinh một loạt hoạt chất sinh học thuộc nhĩm cytokine gây nên những biến đổi đáng kể ở cơ thể vật chủ. TNF (tumor necrosis factor) và interleukin – 1 là những hoạt chất sinh học nĩi trên được sản sinh dưới tác động của lipit A. Phản ứng shock, tăng tính thấm thành mạch, rối loạn hoạt động tuần hồn và hơ hấp là những triệu chứng thường thấy trong chứng nhiễm trùng do E.coli gây ra (Gyles, 1992). Protein màng ngồi tế bào vi khuẩn E.coli là một yếu tố làm tăng độc lực của chúng. Dạng protein này được gọi là TraT, cĩ bản chất hố học là lipoprotein. Yếu tố độc lực này liên quan đến khả năng đề kháng với hoạt động diệt khuẩn của huyết thanh. Hiện nay TraT được chiết tách từ màng ngồi tế bào vi khuẩn và chức năng sinh học của nĩ đã được chứng minh. TraT ngăn trở quá trình kết kợp với bổ thể C6. Nghiên cứu các chủng ETEC gây tiêu chảy ở gia súc cho thấy vai trị gây tiêu chảy của LPS là khơng rõ Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 9 ràng. Tuy nhiên một số nhĩm kháng nguyên O đảm bảo điều kiện thuận lợi đối với plasmid mang nguyên liệu di truyền mã hố cho quá trình tổng hợp độc tố đường ruột enterotoxin và kháng nguyên pili. Vì lẽ đĩ, chỉ cĩ một số nhĩm kháng nguyên O nhất định của E.coli là cĩ khả năng gây tiêu chảy cho động vật và người nhờ các yếu tố độc lực: kháng nguyên pili và độc tố đường ruột enterotoxin (Acres, 1977). 1.1.3 Kháng nguyên pili Một số serotype E.coli cĩ khả năng hình thành pili, yếu tố bám dính quan trọng giúp cho vi khuẩn tiếp cận các tế bào đích của cơ thể vật chủ. Mỗi seotype lại sản sinh các loại pili khác nhau và hướng tới các tổ chức mơ bào khác nhau và do vậy cũng gây nên các biểu hiện bệnh lý phân biệt. Nhờ khả năng bám dính, vi khuẩn vượt qua hàng rào bảo vệ đầu tiên đĩ là nhu động ruột. Pili là yếu tố độc lực quan trọng nhất của vi khuẩn E.coli. Nhờ yếu tố độc lực này, vi khuẩn bám dính vào tế bào đích và gây nên các quá trình bệnh lý. Yếu tố độc lực này bao gồm một số dạng pili cơ bản sau: 1.1.3.1 Type 1 pili ðĩ là những sợi protein mảnh nhơ lên trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử chúng cĩ dạng hình mũi tên, chiều dài 2µ, khác biệt với các dạng pili khác cĩ cấu tạo hình sợi xoắn. Hơn nữa phân tử bám dính nằm ở đỉnh của pili. Type 1 pili là yếu tố độc lực của các chủng E.coli gây nên bệnh đường tiết niệu, khơng tham gia vào các quá trình bệnh lý đường tiêu hố gây tiêu chảy ở động vật (Jones và cs, 1992). Type 1 pili cĩ khả năng ngưng kết hồng cầu người nhĩm A, hồng cầu chuột lang, khả năng đĩ bị cản trở bởi đường D-manoza. Gen điều khiển tổng hợp type 1 pili nằm trên plasmid bao gồm 10-11 gen mã hố cho quá trình tổng hợp type 1 pili quyết định chiều dài và đỉnh của chúng (De Graff và Roorda, 1982). Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 10 1.1.3.2 F4 pili F4 pili là một yếu tố độc lực của một số serotypes E.coli gây tiêu chảy ở lợn con. F4 pili giúp cho E.coli bám dính vào tế bào biểu mơ nhung mao phần trước ruột non lợn con, đặc biệt vùng khơng tràng và hồi tràng tập trung một số lượng lớn vi khuẩn, nơi mà trong điều kiện sinh lý bì._.nh thường, số lượng E.coli thấp hoặc khơng cĩ mặt. ðể cĩ thể gây bệnh, F4 pili cần cĩ các receptor đặc hiệu trên tế bào biểu mơ nhung mao ruột non cho quá trình bám dính. Những receptor đĩ là đặc hiệu với lồi, các lồi gia súc khác khơng cĩ receptor cho F4 pili và do vậy chúng cĩ khả năng đề kháng với các chủng E.coli thuộc nhĩm này. Hơn nữa những receptor này chỉ tồn tại trong thời gian nhất định ở lợn con sơ sinh. Sau đĩ, theo lứa tuổi tăng lên chúng bị mất dần, vì vậy lợn trưởng thành mang mầm bệnh E.coli cĩ F4 pili nhưng chúng cĩ khả năng đề kháng với vi khuẩn này. Hơn nữa trong cùng lồi, một số cá thể lợn khơng cĩ receptor đặc hiệu nĩi trên nên chúng cĩ khả năng đề kháng với căn bệnh. Gen mã hố quá trình tổng hợp receptor đặc hiệu cho F4 là gen trội, những cá thể mang gen lặn đồng hợp tử cĩ khả năng đề kháng với yếu tố độc lực F4 (Gaastra và De Graaf, 1982). 1.1.3.3 F5 pili Giống như F4, F5 pili thực hiện chức năng bám dính vào tế bào biểu mơ nhung mao ruột non. Bám dính của các chủng ETEC mang yếu tố độc lực F5 là cơ chế chính cho phép vi khuẩn vượt qua hàng rào bảo vệ đầu tiên, khơng bị nhu động ruột đào thải ra ngồi theo phân. Dựa vào khả năng này vi khuẩn tăng nhanh về số lượng, đủ để gây bệnh cho động vật. Trong điều kiện sinh lý bình thường, số lượng E.coli trong chất chứa ruột non (khơng tràng, hồi tràng) chỉ giao động trong phạm vi 104-106 CFU/g, ít khi vượt quá 107 CFU/g. Khi bê bị tiêu chảy do E.coli, số lượng vi khuẩn này tăng lên trên 1010 Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 11 CFU/g. Trong điều kiện sinh lý tiêu hĩa bình thường, bê khơng tiêu chảy, phần lớn E.coli lơ lửng trong chất chứa ruột, rồi bị đào thải ra ngồi theo phân (Acres, 1975). Nghiên cứu cơ chế bám dính ở mức phân tử của yếu tố độc lực F5, Acres (1985) thơng báo: cấu trúc bề mặt màng ngồi tế bào vi khuẩn E.coli và bề mặt màng ngồi tế bào biểu mơ nhung mao ruột đều mang điện tích âm. Theo lẽ tự nhiên, chúng sẽ đẩy nhau bằng lực đẩy trái dấu điện tích. Nhờ cấu trúc pili lồi lên khỏi bề mặt màng tế bào, vượt qua vùng chịu ảnh hưởng của lực đẩy trái dấu điện tích nĩi trên, tiếp cận với các receptor đặc hiệu trên tế bào biểu mơ nhung mao ruột. Sau khi bám được vào tế bào ruột, giáp mơ phát huy vai trị như một chất bao bọc và kết dính vi khuẩn với tế bào ruột, đảm bảo cho chúng khơng bị đào thải rồi nhân lên nhanh chĩng. Yếu tố độc lực F5 thường phát hiện được ở các chủng E. coli gây tiêu chảy ở bê, nghé, dê, cừu và lợn (Gyles và Thoen, 1993). 1.1.3.4 F6 pili Yếu tố độc lực F6 pili thực hiện chức năng bám dính lên các receptor đặc hiệu của tế bào biểu mơ nhung mao ruột theo cơ chế giống như F4 và F5. F6 pili cĩ mặt ở các chủng E.coli, phân lập được từ gia súc nhai lại và lợn. Một số serotype O:9, O:20, O:101, O:141 mang yếu tố độc lực F6, gây tiêu chảy ở lợn con sơ sinh. Lợn lớn tuổi hơn cĩ khả năng đề kháng với yếu tố độc lực này. Một số chủng ETEC gây tiêu chảy ở lợn con sơ sinh mang cả hai yếu tố độc lực F4 và F6 (Schneider và cs, 1982). 1.1.3.5 F41 pili F41 pili là yếu tố độc lực của các chủng ETEC thuộc nhĩm O9, O101 gây tiêu chảy ở gia súc nhai lại và lợn. Thành phần cấu tạo hố học và chức năng sinh học của yếu tố độc lực F41 pili giống như F4, F5 và F6. Chúng đều Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 12 là protein và thực hiện chức năng bám dính. Dưới kính hiển vi điện tử chúng cĩ hình thái khác biệt với các dạng pili nĩi trên (Duchet-Suchaux và cs, 1988). 1.1.3.6 Pili liên hệ với bệnh tiêu chảy và phù ở lợn con sau cai sữa. Một số các chủng ETEC thuộc nhĩm O:25, O:108, O:138, O:139, O:141và O:147 gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa. Các chủng E.coli này khơng mang các dạng pili F4, F5, F6 và F41 giống như đã mơ tả trên đây, chúng hình thành một dạng pili mới được gọi là F107 pili. F107 pili cĩ bản chất hố học và đặc tính hình thái gần giống với các dạng pili đã mơ tả trên đây. Tuy nhiên, F107 cĩ đặc tính kháng nguyên và chức năng sinh học khác với các dạng pili đã mơ tả. F107 pili thực hiện chức năng độc lực gây tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa bằng cách bám dính vào tế bào biểu mơ nhung mao ruột non tạo điều kiện cho vi khuẩn nhân lên và sản sinh độc tố. Tuy nhiên, chúng chỉ bám được vào các receptor đặc hiệu cĩ mặt ở lợn con sau cai sữa. Trong khi đĩ ở lợn con sơ sinh và trước cai sữa khả năng bám dính của chúng là rất kém và do vậy chúng chỉ gây bệnh ở lợn con sau cai sữa với tên bệnh postweaning diarrheal and edema disease (Nagy và cs, 1992). Gen mã hố quá trình tổng hợp F107 pili nằm trên plasmid và cĩ quan hệ gần gũi với gen điều khiển tổng hợp độc tố Shigalike toxin gây phù đầu ở lợn ký hiệu là fedA. Gen này cĩ mặt ở 20-24 serotype E.coli gây bệnh tiêu chảy và phù ở lợn con sau cai sữa (Methyiapun và cs, 1984). 1.1.3.7 Một số yếu tố kháng nguyên pili khác CFAI và CFAII (colonization factors I, II) là những yếu tố độc lực của các chủng ETEC phân lập từ người. ðĩ là những pili thực hiện chức năng bám dính tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập tế bào ruột và gây tiêu chảy ở trẻ em. CFAI và CFAII ngưng kết tế bào hồng cầu người, đề kháng với manoza, mang đặc tính kháng nguyên khác các dạng pili trên đây. Gen mã hố tổng hợp chúng nằm trên plasmids (Gyles và Thoen, 1993). Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 13 Một số ít các chủng E.coli gây nhiễm trùng bại huyết ở gia súc sản sinh Vir pili. Cho đến nay cĩ rất ít thơng tin về dạng pili này. Các chủng E.coli phân lập từ bị sữa viêm vú sản sinh curli, chúng thực hiện chức năng bám dính vào các tế bào biểu mơ tuyến vú, để từ đĩ gây bệnh viêm vú ở bị sữa do E.coli gây ra. Bệnh viêm vú do E.coli khá phổ biến ở bị sữa. Theo thống kê, ở Mỹ 49-50% số bị sữa bị viêm vú là do các chủng E.coli này gây ra (Acres và cs, 1977). 1.1.4 Plasmid Các chủng ETEC gây tiêu chảy cho động vật nhờ hai yếu tố độc lực cơ bản: kháng nguyên pili và độc tố đường ruột. Hai sản phẩm trên được điều khiển bởi các gen nằm ngồi nhiễm sắc thể, trong plasmids tồn tại trong nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn E.coli. ðiều đĩ cho thấy plasmid là yếu tố độc lực gắn liền với một số nhĩm kháng nguyên O và K nhất định. Những serotype này được coi như là những cá thể mang và bảo tồn yếu tố độc lực plasmid. Bằng phương pháp đột biến làm thay đổi các đoạn DNA mã hố quá trình tổng hợp kháng nguyên pili và độc tố đường ruột enterotoxin, tạo ra các chủng khơng cĩ khả năng tổng hợp các yếu tố độc lực trên. Các chủng đột biến này khơng cĩ khả năng gây bệnh. Như vậy một lần nữa khẳng định rằng palasmid là một yếu tố độc lực mang thơng tin di truyền mã hố cho quá trình tổng hợp một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn E.coli (Acres, 1985). 1.1.5 Enterotoxin Các chủng ETEC cĩ khả năng sản sinh hai loại độc tố đường ruột: heat labile enterotoxin (LT) và heat stable enterotoxin (ST). 1.1.5.1 Heat labile enterotoxin Các chủng ETEC gây tiêu chảy ở lợn con và trẻ em cĩ khả năng sản sinh độc tố LT chịu tác động của nhiệt. ðộc tố LT của các chủng ETEC nguồn Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 14 gốc từ người ký hiệu là hLT (human LT), cịn ở lợn ký hiệu là pLT (porcine LT). Các chủng ETEC cĩ nguồn gốc từ lợn sản sinh một loại độc tố LT giống nhau, trong khi đĩ hLT cĩ hai dạng khác nhau được ký hiệu là LTI và LTII, chúng cĩ cùng cơ chế tác động nhưng khác nhau về đặc tính kháng nguyên và đặc tính sinh vật học. LT là một protein, trọng lượng phân tử lớn (88 kDa), cấu tạo bởi một tiểu phần A và 5 tiểu phần B. Tiểu phần A, trọng lượng phân tử 30 kDa, bao gồm hai đoạn A1 và A2 (21kDa). ðoạn A1 chiếm các vị trí hoạt động và đoạn A2 với các chức năng nối đoạn A1 với tiểu phần B. Tiểu phần B chứa các điểm thực hiện chức năng liên kết với tế bào biểu mơ ruột. Tiểu phần A và B được tổng hợp bên trong tế bào rồi được vận chuyển qua màng tế bào, tại đây chúng liên kết với nhau tạo thành độc tố LT tồn phần (Gyles và Thoen, 1993). Cơ chế tác động của LT dựa trên hoạt động kích hoạt hệ thống men adenylat cyclaza tồn tại trên màng tế bào ruột, làm tăng cAMP dẫn đến tăng cường bài xuất nước và các chất điện giải từ tế bào vào xoang ruột, gây nên hiện tượng tiêu chảy (Fishman, 1990). Cơ chế tác động đĩ được tĩm tắt như sau: tiểu phần B của LT gắn với tế bào biểu mơ ruột thơng qua các receptor đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào. Tiếp đĩ đoạn A1 được vận chuyển qua bề mặt màng nhầy cho phép chúng tương tác với hệ thống adenylat cyclaza, tồn tại bên trong màng tế bào. Hệ thống adenylat cyclaza bao gồm ít nhất là 3 thành phần: phần thứ nhất thực hiện chức năng chuyển ATP thành cAMP. Phần thứ hai điều khiển chức năng enzym phụ thuộc GTP và phần thứ ba hoạt động như một receptor cho hĩc mơn. Bình thường hệ thống men này sẽ hoạt động hay liên kết các hĩc mơn với các receptor của chúng sau đĩ gắn GTP vào vị trí hoạt động nằm trên protein điều khiển. Adenylat cyclaza được hoạt hố khi nĩ tạo thành protein phức hợp với GTP và protein điều khiển. Hệ thống trên bị vơ hoạt khi GTP Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 15 chuyển thành GDP với sự xúc tác của men GTPaza. ðoạn A1 của phân tử LT cĩ bản chất là một enzym adenosin diphotphat ribosyltransferaza xúc tác chuyển ADP – riboza từ nicotinamid adenin dinucleotit (NDA) tới protein điều khiển gây nên hiện tượng ức chế GTPaza. Do GTPaza bị ức chế, hệ thống enzym trên thường xuyên hoạt động, dẫn đến tăng cAMP, hậu quả cuối cùng là bài xuất nước và các chất điện giải như Cl-, Na+ từ tế bào vào xoang ruột gây nên hiện tượng tiêu chảy (Gyles, 1992). Bằng thực nghiệm trên tế bào thận chuột cống trắng, Lasaro và cộng sự (2009) cho biết với liều 1 µg LT đã làm tăng nồng độ cAMP trong tế bào. Mức cAMP trong tế bào đạt giá trị 3500 pmol/ml sau 2 h thí nghiệm. 1.1.5.2 Heat stable enterotoxins (STs) STs là độc tố đường ruột chịu nhiệt, trọng lượng phân tử thấp. Cĩ hai nhĩm độc tố ST chúng được ký hiệu là STa và STb hay STI, STII. STa: Kích thích tập trung dịch mơ bào ruột vào ống ruột ở chuột bạch sơ sinh sau khi cho uống hoặc tiêm thẳng độc tố vào dạ dày, ruột. Cơ chế tác động trên được áp dụng rộng rãi như là một phương pháp phát hiện độc tố STa chính xác, tiết kiệm và đang được sử dụng rộng rãi hiện nay. Dạng độc tố này cĩ thể được sản sinh bởi các chủng ETEC nguồn gốc từ người, động vật nhai lại và lợn. ðây là dạng độc tố đường ruột chính do các chủng ETEC phân lập từ bê, nghé, dê, cừu sản sinh, cĩ bản chất cấu trúc là một mạch peptit. STa do các chủng ETEC nguồn gốc từ lợn và các gia súc sản sinh bao gồm 18 amino axit, trong khi đĩ peptit cấu tạo nên STa chứa 6 gốc cystein tham gia tạo nên các cầu nối disulfit. Vị trí hoạt động nằm ở các bon cuối cùng của 14 - amino axit. STa đề kháng với nhiệt, chịu đựng điều kiện pH thấp và khơng bị các men phân giải protein phân huỷ (Gyles và Thoen, 1993). Cơ chế tác động chính của STa cĩ thể được tĩm tắt như sau: cGMP Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 16 hoạt hố enzym 86 - kDa proteinkinaza cĩ mặt ở tế bào biểu mơ ruột dẫn đến hiện tượng photphoryl hố phosphotidyl enositol tạo ra diacyl glycerol và enositol 1, 4, 5 triphosphat, đồng thời hoạt hố enzym C – kinaza. Ba sản phẩm trên làm tăng hàm lượng Ca+2 nội bào. Chính nồng độ Ca+2 nội bào cao cản trở hấp thu Na+ và Cl- bởi nhĩm tế bào vili và kích thích bài xuất Cl- từ nhĩm tế bào crypt vào xoang ruột (Acres, 1985). Receptor cho STa là protein hoặc glycoprotein, thực hiện chức năng như là điểm bám dính đặc hiệu của độc tố với tế bào ruột. Bên cạnh đĩ, bản thân enzym guanylat cyclaza tự nĩ cũng là receptor cho STa. Khả năng bám dính của STa vào receptor đặc hiệu phụ thuộc vào lứa tuổi động vật. Lợn sơ sinh dưới 1 tuần tuổi cho khả năng bám dính STa vào tế bào ruột gấp 2 lần lợn sau cai sữa và lợn trưởng thành. Số lượng receptor cho STa ở tế bào kết tràng lớn gấp 3 lần ở hồi tràng. ðiều đĩ cho thấy hiện tượng cản trở hấp thu các chất điện giải ở kết tràng, kết hợp tăng cường phân tiết ở hồi tràng gây nên tình trạng tiêu chảy do STa gây ra (Gyles và Thoen, 1993). STb: STb là độc tố đường ruột bền với nhiệt được sản sinh bởi các chủng ETEC phân lập từ lợn và trẻ em tiêu chảy. Nĩ cĩ thể được sản sinh đơn lẻ hoặc kết hợp với STa, LT. ðộc tố này khơng hồ tan trong cồn methanol, khơng cĩ khả năng kích thích bài xuất dịch từ mơ bào vào ruột non chuột bạch sơ sinh và do vậy khơng phát hiện được độc tố này bằng phương pháp dùng chuột bạch sơ sinh. Chính những khác biệt trên đã dẫn tới ký hiệu độc tố ST thành 2 dạng riêng rẽ STa và STb (Acres, 1985). Trong thời gian gần đây độc tố STb đã được tinh chiết, bản chất cấu tạo là một chuỗi polypeptide bao gồm 48 amino axit với 2 cầu nối disulfit (Dubreuil và cs, 1991; Bela và Peter, 2005). Cho đến nay, những hiểu biết về cơ chế tác động của STb vẫn cịn rất ít. Urban và cs (1990), Dubreuil (1997) Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 17 cho rằng độc tố này khơng tác động đến hệ thống men guanilat cyclaza trên màng tế bào biểu mơ ruột vật chủ, STb tác động mở kênh trao đổi Ca2+ màng tế bào, tăng nồng độ Ca+2 trong tế bào, do vậy hoạt hĩa enzyme prostaglandin endoperoxydaza làm tăng hàm lượng prostaglandin E2 (PGE2) ở tế bào màng nhày ruột gây nên hiện tượng tiêu chảy. Tác động chính là kích thích bài xuất các muối bicarbonat từ mơ bào vào xoang ruột. Hiện tượng tiêu chảy được giải thích bằng cơ chế do LT, ST gây ra như đã trình bày ở trên đây. Ngồi ra một số tác giả như Stephen và Osborne (1988), Peterson và Ochoa (1989) cho rằng LT và ST tác động lên tế bào enterochromafin, nhĩm tế bào liên quan đến việc sản sinh serotonin và một số peptide hoạt động thành mạch đường ruột làm tăng cường quá trình phân tiết dịch từ mơ bào vào xoang ruột gây hiện tượng tiêu chảy. Bên cạnh đĩ LT và ST cịn tác động lên lớp tế bào villi làm mất chức năng hấp thu, gây tiêu chảy giống như tác động do nhĩm rotavirus gây ra. Cịn nhĩm ST tác động mạnh lên nhĩm tế bào crypt làm biến đổi nhĩm tế bào này, kích thích bài xuất Cl- và Na+ từ tế bào vào xoang ruột. 1.1.5.3 Shigalike toxin (Verotoxin) Một nhĩm độc tố khơng bền vững với nhiệt do các chủng E.coli phân lập từ lợn con cai sữa bị phù đầu (edema disease) sản sinh được gọi là shigalike toxin (SLT) hoặc verotoxin (VT). Nhĩm độc tố này là một thành viên của nhĩm độc tố cĩ bản chất protein. Tên gọi verotoxin dựa trên tác động của độc tố, gây chết tế bào vero dùng nuơi cấy tế bào. Cịn shigalike toxin bản thân tên gọi đĩ cho biết độc tố này cĩ cấu trúc và chức năng sinh học giống với độc tố shiga do Shigella dysenteria sản sinh. Nhĩm độc tố này liên quan đến bệnh phù ở lợn con cai sữa được gọi là VTe hay SLT-IIe (trước đây gọi là SLT-IIv). Một số chủng E.coli phân lập từ bơ, sản phẩm của bị sữa cĩ khả năng sản sinh verotoxin, chúng được gọi là verotoxigenic E.coli (VTEC). Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 18 VTEC cĩ nguồn gốc kể trên là nguồn gây bệnh quan trọng cho con người (Karmali, 1989). VTs cĩ bản chất cấu tạo là protein bao gồm tiểu phần A và 5 tiểu phần B. Tiểu phần A gồm hai đoạn A1 và A2 giống như đã mơ tả với LT (Gyles và Thoen, 1993). Cơ chế tác động của VTs đã được Gyles và Thoen (1993) tĩm tắt như sau: VTs gắn với globotriosyl hoặc globotetraosyl-ceramit ở màng tế bào rồi gây tác động độc bằng cách ức chế hoạt động của men glycosidaza cĩ mặt ở hệ thống men 28S ribosome thuộc RNA. Hoạt động trên cản trở quá trình gắn amino acyl-tRNA với ribosome, từ đĩ cản trở quá trình tổng hợp protein. Một đặc điểm phổ biến đối với bệnh do VTEC gây ra là quá trình phá huỷ nội mạc thành mạch do VTs. Quá trình gây bệnh hình như cĩ liên quan đến quá trình xâm nhập tế bào ruột bởi EIEC, sau đĩ sản sinh VTs ở ruột non, rồi chúng được hấp thu vào máu và gắn vào tế bào nội mạc thành mạch ở các cơ quan đích, gây tổn thương các tế bào đĩ dẫn tới triệu chứng phù, sốt, xuất huyết và tắc mạch (thrombosis). Rất nhiều nghiên cứu trong phịng thí nghiệm đã chứng minh rằng quá trình tổng hợp và bài xuất VTs sẽ được tăng cường khi cĩ các yếu tố như sắc tố mật, trypsin, và các tác nhân diệt khuẩn tồn tại trong đường tiêu hố. 1.1.5.4 Hemolysin Alpha - hemolysin được sản sinh bởi một số serotype E.coli gây tiêu chảy và phù ở lợn con sau cai sữa. Hemolysin cũng là một sản phẩm do các chủng E.coli liên quan đến các quá trình nhiễm trùng khác ngồi đường ruột ở người và bị. ðộc tố này giữ vai trị duy trì và nâng cao hàm lượng sắt cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật bằng cách dung giải tế bào hồng cầu vật chủ. Gen mã hố cho quá trình tổng hợp độc tố này nằm trên nhiễm sắc thể. Một số ít chủng VTEC cĩ nguồn gốc từ động vật nhai lại và người cĩ khả năng sản sinh enterohemolysin cĩ tác dụng dung giải chậm tế bào hồng cầu và xuất huyết ruột. Các chủng enteroinvasive E.coli (EIEC) sản sinh dạng Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 19 hymolysin khác gọi là contact hemolysin. ðộc tố này đĩng vai trị quan trọng trong quá trình gây bệnh của chủng EIEC, phân giải các thể vùi nội bào cho phép vi khuẩn xâm nhập vào nguyên sinh chất tế bào ruột. Gen mã hố cho quá trình tổng hợp độc tố này nằm trên plasmid (Gyles và Thoen, 1993). 1.1.5.5 Cytotoxic necrotizing factors (CNF) Một số chủng E.coli cĩ độc lực mạnh gây nhiễm trùng bại huyết ở gia súc sản sinh dạng độc tố gọi là vir toxin. Vir toxin là một thành viên của họ độc tố cytotoxic necrotizing factors (CNF) gần đây được đặt tên là CNF2. CNF1 là độc tố liên hệ với các chủng E.coli phân lập từ các trường hợp trẻ em tiêu chảy, hoặc các trường hợp nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu ở người. CNF2 là độc tố liên quan đến các chủng E.coli gây tiêu chảy ở lợn, người, bê, nghé, dê, cừu, chĩ. CNF2 là một protein cĩ trọng lượng phân tử 100-KDa, cĩ quan hệ miễn dịch với 115 - kDa CNF1 protein. Bằng thực nghiệm cho thấy cả hai dạng CNF gây phân chia nhân và biến đổi hoại tử tế bào Hela và tế bào da thỏ (De Rycke và cs, 1990). 1.1.6 Hệ thống thu nhận sắt Một số chủng E.coli gây bại huyết ở người và gia súc cĩ khả năng thu nhận sắt nhờ một hệ thống đặc biệt. Hệ thống này cho phép vi khuẩn tồn tại và nhân lên trong điều kiện mơi trường cĩ nồng độ sắt thấp khơng đáp ứng nhu cầu phát triển của chúng ở trong tế bào và dịch mơ bào vật chủ. Hệ thống này bao gồm acrobactin (một dạng khơng bào chứa sắt) và protein màng ngồi tế bào vi khuẩn. Protein đảm bảo chức năng như một receptor phức hợp sắt - acrobactin. Trong điều kiện nồng độ sắt thấp vi khuẩn tổng hợp acrobactin và bài xuất chúng vào mơi trường. Do cĩ ái lực mạnh với sắt, acrobactin tăng cường khả năng thu nhận sắt và hình thành phức hợp sắt - acrobactin. Phức hợp trên bám trở lại trên các receptor protein màng ngồi tế bào và được vận chuyển vào trong tế bào. Tại đây sắt được giải phĩng cho nhu cầu của vi khuẩn (Gyles và Thoen, 1993). Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 20 1.2 ðẶC ðIỂM CẤU TẠO VÀ ðẶC TÍNH HUYẾT THANH HỌC CÁC YẾU TỐ KHÁNG NGUYÊN CỦA VI KHUẨN E.COLI 1.2.1 Kháng nguyên O Kháng nguyên O là một thành phần của lipopolysaccharide (LPS). LPS là thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngồi của các vi khuẩn Gram âm (Gr-) như E.coli, Salmonella và là một yếu tố độc lực của chúng. Kháng nguyên O là nhĩm kháng nguyên bề mặt thành tế bào, bền vững với nhiệt, cĩ khả năng đề kháng với nhiệt độ 1000C trong 2 - 4h, được phát hiện ở hầu hết các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột dạng S. Do đặc tính chịu nhiệt nên vi khuẩn bảo tồn khả năng kích thích miễn dịch, thực hiện phản ứng ngưng kết sau khi đã bị đun sơi. Các chủng biến dị thường thiếu các nhĩm kháng nguyên O trong thành phần LPS do vậy làm giảm đi một phần độc lực của chúng. Như vậy kháng nguyên O được cấu tạo bởi chuỗi đường trên phân tử LPS. Người đầu tiên phân chia E.coli theo nhĩm kháng nguyên O dựa trên phản ứng huyết thanh học là Kauffmann. Sơ đồ nhĩm kháng nguyên O đầu tiên theo ơng bao gồm 20 nhĩm, sau đĩ Knipschildt đã ghi thêm vào sơ đồ 5 nhĩm nữa và cho đến nay đã cĩ ít nhất trên 200 dạng kháng nguyên O đã được phát hiện, chúng được ký hiệu bởi chữ O và các chữ số ả rập, ví dụ: O8, O9, O149 (Gyles và Thoen, 1993). 1.2.1.1 Cấu trúc và đặc tính hố học của kháng nguyên O Cấu trúc kháng nguyên O của vi khuẩn đường ruột đã được nghiên cứu khá đầy đủ từ những năm 60 của thế kỷ trước. Tuy nhiên, cĩ những đặc tính của chúng mãi đến những năm 80 của thế kỷ trước mới được cơng bố. Cấu trúc kháng nguyên O liên quan chặt chẽ đến cấu trúc và là một trong ba thành phần cấu tạo nên LPS. Vì lẽ đĩ mà trong một số tài liệu người ta coi LPS như là kháng nguyên O. Tuy nhiên, cần phải hiểu một cách chính xác rằng LPS cịn cĩ 2 thành phần khác giữ các chức năng đặc biệt quan trọng trong các quá trình bệnh lý. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 21 ðặc điểm cấu trúc phân tử LPS của vi khuẩn Gr (-) được mơ tả như sau: Kháng nguyên O được cấu tạo bởi các đơn vị oligosaccharide kế tiếp nhau. ðĩ là kiểu cấu trúc đa đường thường gặp ở vi khuẩn. Thành phần và cấu trúc của chúng là cơ sở hố học của kháng nguyên O thuộc các nhĩm vi khuẩn Gr (-), vì vậy trật tự và thành phần các loại đường sẽ quyết định tính đặc hiệu của kháng nguyên O. Bằng các phương pháp điện di, sắc ký người ta đã xác định được một số đường chính cấu tạo nên kháng nguyên O, đĩ là các đường cơ bản, bao gồm: glucoza, galactoza, heptoza…và một số dẫn xuất của một số đường cơ bản đĩ: glucosamine, 2 – keto - 3 - deoxymanlunosotonic axit (KDO). Trong rất nhiều nhĩm kháng nguyên O cĩ thể gặp một hoặc một vài đường cơ bản. Một số cơng bố trước đây về thành phần đường của chuỗi kháng nguyên O đã cĩ những sai lầm do đưa vào danh sách đĩ các đường của tồn bộ phân tử LPS. Chuỗi đa đường cấu tạo nên kháng nguyên O cĩ thể là chuỗi đa đường trung tính hoặc chuỗi đa đường axit. Như vậy, cĩ thể thấy rằng các đường cĩ gắn gốc amin rất ít gặp trong cấu trúc kháng nguyên O vi khuẩn E.coli, trong khi đĩ rhamnoza là thành phần khá phổ biến. Kháng nguyên O cĩ thể được cấu tạo từ 1 đến 6 loại đường khác nhau. Duy chỉ cĩ hai nhĩm kháng nguyên O8 và O9 được cấu tạo từ một loại đường mannoza. Từ một số đường trên đây, kháng nguyên O trung tính của vi khuẩn E.coli được cấu tạo bởi sự liên kết các đường đơn tạo thành chuỗi đa đường (Orskov và cs, 1977). Chuỗi đa đường axit (axitic polysaccharide chains): Trong một thời gian rất dài đã quan niệm rằng kháng nguyên O vi khuẩn E.coli chỉ được cấu O – specific polysaccharide Phần lõi Oligosaccharide Lipid A Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 22 tạo từ các đường trung tính. Cho đến những năm 80 của thế kỷ trước, khi nghiên cứu kỹ về LPS, người ta thấy rằng trong thành phần kháng nguyên O của E.coli cĩ chứa các thành phần đường mang tính axit như glycerolphosphat, hexuronic axit, neuraminic axit, glucolactilic axit. Những thành phần trên đã cấu tạo nên kháng nguyên O và LPS. Tương ứng với đặc tính khơng lắng cặn khi ly tâm siêu tốc, khác với kháng nguyên O cấu tạo từ các đường trung tính cĩ khả năng lắng cặn trong điều kiện trên (Orskov và cs, 1977). ðặc tính hố học của kháng nguyên R: Các chủng biến dị E.coli cĩ nguồn gốc từ dạng S cĩ thể được tạo ra trong phịng thí nghiệm bằng cách xử lý với các tác nhân gây biến dị. Những chủng biến dị đĩ bị khiếm khuyết trong cấu tạo LPS. Với các chủng khơng bị biến dị (dạng S), LPS được cấu tạo đầy đủ bởi 3 thành phần cơ bản như đã trình bày ở trên. Trong khi đĩ các chủng biến dị (dạng R) LPS thiếu thành phần kháng nguyên O. Các dạng LPS cĩ cấu tạo khiếm khuyết đĩ được gọi là kháng nguyên R. Kháng nguyên R được cấu tạo bởi phần lõi oligosaccharide và phần lipid A, mà ở đây phần lõi oligosaccharide cĩ thể đầy đủ hoặc khơng đầy đủ, ví dụ chủng E.coli K12 là chủng biến dị cĩ cấu tạo phần lõi đầy đủ, chủng E.coli B là chủng cĩ cấu tạo phần lõi khơng đầy đủ. Kháng nguyên R với phần lõi đầy đủ: những nghiên cứu từ trước năm 1940 cho rằng phần lõi trong cấu trúc LPS của tất cả các vi khuẩn Gr (-) chỉ cĩ một dạng và giống nhau. Mãi đến năm 1948, Moller phát hiện ra rằng cĩ hai dạng lõi khác nhau trong cấu trúc LPS của E.coli O8: K42, chúng được gọi là coli R1 và coli R2. Phần lõi trên cĩ thể cĩ các cấu trúc phụ do liên kết giữa KDO với galactoza như trong cấu trúc của E.coli K12 hoặc do liên kết giữa gốc đường glucoza cuối cùng với glucosamine hay N-acetyl mannosaminuronic axit. Tuy nhiên chức năng và ý nghĩa sinh học của phần cấu trúc phụ trên đây vẫn chưa rõ ràng. ðiều đáng lưu tâm ở đây là tất cả cấu trúc lõi oligosaccharide đều cĩ mạch nối với phosphate hoặc phosphorylethanolamine, Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 23 pyrophosphorylethanolamine thơng qua gốc carboxyl của KDO. Chính nhờ cấu trúc đĩ mà hình thành nên các cấu trúc bền vững trên thành tế bào cũng như duy trì cấu trúc màng ngồi của tế bào vi khuẩn và giữ vai trị quan trọng trong quá trình tương tác giữa tế bào vi khuẩn với các yếu tố thực bào cũng như kháng sinh. Kháng nguyên R với cấu trúc lõi khơng đầy đủ: khi xử lý các chủng E.coli dạng A hay dạng R với các tác nhân gây biến dị sẽ tạo nên các chủng E.coli biến dị cĩ kháng nguyên R với cấu trúc lõi khơng đầy đủ do mất đi một số đường trong lõi oligosaccharide. E.coli B, một chủng cổ điển trong phịng thí nghiệm, cĩ cấu trúc điển hình trên đây (Orskov và cs, 1977). 1.2.1.2 ðặc tính huyết thanh học của kháng nguyên O Như đã trình bày ở phần cấu tạo, kháng nguyên O cĩ bản chất là polysaccharide, cĩ khả năng chịu nhiệt 1000C trong 2h, kháng nguyên O của một vài chủng dạng nhầy cĩ khả năng chịu được nhiệt độ 1200C trong khoảng thời gian 2 h. Kháng nguyên O kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên O tương ứng. Tuy nhiên, khi nghiên cứu một số đặc điểm huyết thanh học, rất nhiều tác giả nhận thấy cĩ hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhĩm kháng nguyên O với nhau. Hiện tượng ngưng kết chéo đã gây nên rất nhiều khĩ khăn khi phân nhĩm huyết thanh E.coli, do vậy đã cĩ rất nhiều nghiên cứu tập trung giải quyết mối liên hệ trên đây (Orskov và cs, 1977). + Hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhĩm kháng nguyên O E.coli Kháng nguyên O khơng phải là kháng nguyên đơn lẻ, được cấu tạo bởi một vài thành phần kháng nguyên, do vậy được gọi là kháng nguyên nhĩm O. Các kháng nguyên nhĩm O cĩ một vài thành phần giống nhau do vậy chúng cĩ thể ngưng kết chéo với nhau. Rất nhiều phản ứng ngưng kết chéo xảy ra giữa các nhĩm kháng nguyên O. Một số yếu tố huyết thanh O hấp phụ chéo là Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 24 điều cần quan tâm khi xem xét kháng nguyên O. Tuy nhiên, khi sử dụng những huyết thanh này chúng ta gặp phải những khĩ khăn để cĩ thể kết luận liệu một chủng chưa biết thực sự thuộc một nhĩm kháng nguyên O nhất định, phân biệt rõ ràng với các nhĩm khác. Chỉ những huyết thanh sau khi đã hấp phụ chéo mới cho kết quả chính xác (Edwards và Ewing, 1972). + Hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhĩm kháng nguyên O vi khuẩn E.coli với một số thành viên họ vi khuẩn đường ruột Rất nhiều phản ứng ngưng kết chéo xảy ra giữa các nhĩm kháng nguyên O vi khuẩn E.coli với kháng thể kháng kháng nguyên O Shigella. Ewing và cộng sự (1952), Edwards và Ewing (1972) cho biết cĩ một số serovar Shigella cĩ các nhĩm kháng nguyên O gần giống với một vài serotype E.coli gây bệnh giống bệnh lỵ (dysentery-like disease). E.coli O28ac ngưng kết chéo với Shigella boydii 13, E.coli O53 với Shigella boydii, E.coli O124 với Shigella dysenteriae 3, E.coli O144 với Shigella dysenteriae 10, E.coli O144 với Shigella dysenteriae 10. Ngưng kết chéo giữa kháng nguyên O của E.coli với Klebsiella pneumoniae cũng xảy ra trong một số serotype cĩ các nhĩm kháng nguyên O tương đồng. Hiện tượng trên đã được Kauffmann (1949), Orskov và cs (1977) kiểm tra: Kháng nguyên O9 của E.coli ngưng kết với O3 Klebsiella pneumoniae, O20 với O4, O8 với O5, O19ab với O1, O19b. + Hiện tượng ngưng kết chéo giữa kháng nguyên O vi khuẩn E.coli với vi khuẩn khác Ngồi hiện tượng ngưng kết chéo giữa các kháng nguyên O của các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột, kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli cịn cĩ khả năng ngưng kết với các nhĩm kháng nguyên khác. Winkle và cộng sự (1972) (trích dẫn bởi Orskov và cs, 1977) đã mơ tả mối quan hệ giữa kháng Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 25 nguyên O vi khuẩn Vibrio cholerae với các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột và đi đến kết luận một số nhĩm kháng nguyên O vi khuẩn Vibrio cholerae cĩ khả năng ngưng kết chéo với một số nhĩm kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli, Salmonella, Citrobacter. Nghiên cứu hiện tượng ngưng kết xảy ra trong các nhĩm máu người, tác giả đã phát hiện kháng nguyên O86 của vi khuẩn E.coli cĩ khả năng ngưng kết chéo với kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu thuộc nhĩm máu B ở người. Tương tự như vậy, một số nhĩm kháng nguyên O E.coli cĩ khả năng ngưng kết với kháng nguyên bề mặt tế bào động vật cĩ vú như tế bào thận và một số tế bào nuơi cấy mơ khác (Orskov, 1962). 1.2.2 Kháng nguyên K Năm 1945, Kaufmann và Vahlne (trích dẫn bởi Orskov và cs, 1977) đã đưa ra khái niệm kháng nguyên K, K là chữ đầu của kapsel nguồn gốc từ tiếng ðức là ký hiệu chỉ vỏ bọc của chúng hoặc kháng nguyên vỏ bọc hay gi._.dụng làm giảm số lượng Coliform, E.coli và Salmonella. 1.8. Xử lý phân bằng kỹ thuật ủ hiếu khí vi sinh vât là biện pháp tối ưu. Nhiệt độ trong đống ủ tăng lên đến giá trị 71,10C vượt quá ngưỡng giới hạn chịu nhiệt của vi khuẩn E.coli và Salmonella. Số lượng Coliform, E.coli, giảm tới giá trị tối thiểu sau khi xử lý phân 28 ngày: Coliform <102/g, E.coli = 3 MPN/g, Salmonella đã bị tiêu diệt hồn tồn. 1.9. ðiều trị bê tiêu chảy theo các phác đồ thí nghiệm cho kết quả khỏi bệnh từ 71,39% đến 91,93%. Sử dụng norfloxacin 10%, với liều 1 ml/10 kg P, tiêm bắp, ngày 2 lần, trong 3 - 5 ngày; kết hợp tiêm truyền tĩnh mạch dung dịch ringerlactat với liều 500 ml/con/ngày, trong 3 - 5 ngày; khơi phục hoạt động tuần hồn, hơ hấp bằng cafein 5% với liều 5 ml/con/ngày. Sử dụng phác đồ trên cho kết quả điều trị cao nhất 91,93%. 2 ðỀ NGHỊ 2.1. Giải quyết tốt các biện pháp vệ sinh mơi trường chăn nuơi, xử lý phân, rác thải, chống ơ nhiễm, hạn chế sự lan truyền mầm bệnh vào đồng cỏ, nguồn nước gĩp phần hạn chế bệnh do Salmonella và E.coli gây ra ở bê, đặc biệt khu vực chăn nuơi bê tập trung. 2.2. Nghiên cứu bổ sung các phương pháp phịng bệnh tiêu chảy do E.coli, Salmonella gây ra ở bê giống sữa. 2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh do E.coli gây ra ở bê giống sữa sơ sinh cũng như Salmonella ở các cơ sở chăn nuơi bị sữa. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 140 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ðà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN ÁN 1. Phạm Hồng Ngân (2008), “Phân lập, xác định serotype và một số yếu tố gây bệnh của Salmonella từ bê dưới 6 tháng tuổi”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. Hội Thú y Việt Nam. Tập XV, Số 2: 39-44. 2. Phạm Hồng Ngân, Trương Quang, Maria Fe C. Vizmanos (2008), “Biến đổi một số chỉ tiêu huyết học ở bê gây bệnh thí nghiệm với vi khuẩn enterotoxigenic Escherichia coli”. Tạp chí Khoa học và Phát triển. ðại học Nơng nghiệp Hà Nội. Tập VI, Số 2: 139-145. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Vũ Triêu An (1978), ðại cương sinh lý bệnh học, Nxb Y học Hà Nội, tr. 171-153. 2. Báo Nơng nghiệp (09.04.2009), Cỏ hương bài giải pháp mới xử lý chất thải chăn nuơi. 3. Hồ ðình Chúc (1999), “Kết quả điều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm ở năm tỉnh phía Bắc”, Khoa học kỹ thuật thú y, (3), tr. 75-78. 4. Cục Chăn nuơi (2007), Số liệu thống kê, 5. Cục Thú y – Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn (2006), Tiêu chuẩn, quy trình ngành Thú y (Vệ sinh thú y và vệ sinh an tồn thực phẩm), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 225-226. 6. Vũ ðạt, ðồn Thị Băng Tâm (1995), “Vai trị gây bệnh của vi khuẩn Salmonella trong hội chứng tiêu chảy của trâu và nghé”, Kỷ yếu kết quả nghiên cứu khoa học Chăn nuơi – Thú y (1991-1995), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 158-161. 7. Hồng Kim Giao, ðào Lệ Hằng (2006), “Phát triển chăn nuơi và bảo vệ mơi trường”, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật, Viện Chăn nuơi, tr. 75-76. 8. Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), “Khả năng mẫn cảm của Salmonella, E.coli phân lập từ gia súc tiêu chảy nuơi tại ngoại thành Hà Nội với một số loại kháng sinh, hĩa dược và ứng dụng kết quả để điều trị hội chứng tiêu chảy”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn nuơi – Thú y (1999 – 2001), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr: 156-162. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 142 9. Nguyễn Bá Hiên (2001), “Một số vi khuẩn thường gặp và biến động số lượng của chúng ở gia súc khoẻ mạnh và bị tiêu chảy nuơi tại vùng ngoại thành Hà Nội. ðiều trị thử nghiệm”, Luận án tiến sĩ nơng nghiệp. Trường ðại học Nơng nghiệp I Hà Nội, 174 tr. 10. Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1999), “Một số kết quả nghiên cứu tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trong thú y”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn nuơi - Thú y (1996-1998), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 134 -138. 11. Phạm Khắc Hiếu, Hồng Văn Kỳ, Lê Thị Ngọc Diệp, Bùi Thị Tho, Phạm Ngọc Thạch, Chu ðức Thắng, Phạm Thị Khánh (2001), “Nghiên cứu tác dụng dược lý của chế phẩm EM đối với Salmonella và E.coli của lợn mắc tiêu chảy”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn nuơi- Thú y (1999 - 2001), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr: 154-155. 12. Nguyễn Hữu Lương (2003), Hiện trạng chăn nuơi bị sữa ở nước ta. Viện Chăn nuơi, 3 tr. 13. Hồ Văn Nam, Nguyễn Huy Thơng, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Trương Quang, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Bá Hiên, ðặng Như Phả (1994), “Bệnh viêm ruột ở trâu”, Báo cáo khoa học phần thú y, Hà Nội, tr. 107-111. 14. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị ðào Nguyên, Phạm Ngọc Thạch (1997), Bệnh viêm ruột ỉa chảy ở gia súc, Giáo trình bệnh nội khoa gia súc, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 205-210. 15. Nguyễn Ngã, Nguyễn Thiên Thu, Lê Lập, Lê Thị Thi, Vũ Khắc Hùng (2000), “ ðiều tra nghiên cứu hệ vi khuẩn trong hội chứng ỉa chảy của bê, nghé khu vực miền Trung”, Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 36-40. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 143 16. Nguyễn ðình Nhung, Trương Quang (2001), “Tìm hiểu sự biến động của một số vi khuẩn đường ruột trong phân trâu khỏe bình thường và trâu tiêu chảy sau khi uống chế phẩm EM và hiệu quả phịng trị tiêu chảy ở trâu bằng chế phẩm EM”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn nuơi – Thú y (1999 – 2001), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 91-96. 17. Nguyễn Thị Oanh, Phùng Quốc Chướng (2003), “Tình hình nhiễm Salmonella và một số đặc tính gây bệnh của Salmonella phân lập được trên trâu, bị tại ðắc Lăk”, Khoa học kỹ thuật thú y, tr. 26-32. 18. Phạm Văn Phú (2009), Phương pháp chế biến và sử dụng phân hữu cơ trong nơng nghiệp, 2 tr. 19. Cao Hồng Phú (2009), “Chơn lấp xác gia súc, gia cầm bị dịch bệnh đảm bảo an tồn”, 2 tr. 20. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, ðỗ Ngọc Thuý (2000), “Kết quả phân lập E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh hố học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phịng trị”, Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y 1996-2000, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội. 21. Vincent Porphyre, Nguyễn Quế Cơi (2006), Thâm canh chăn nuơi lợn, quản lý chất thải và bảo vệ mơi trường, CIRAD và Viện Chăn nuơi, 221 tr. 22. Nguyễn Văn Quang, Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngã, Nguyễn Thiên Thu, Lê Thị Thi, ðào Duy Hưng (2002), “ ðộc lực và khả năng gây bệnh trên động vật thí nghiệm của E.coli phân lập từ bê tiêu chảy ở các tỉnh Nam Trung Bộ”, Khoa học kỹ thuật Thú y (3), tr. 39-42. 23. Nguyễn Văn Sửu (2005), “Nghiên cứu tình hình tiêu chảy của bê, nghé dưới 6 tháng tuổi tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Escherichia coli, Samonella và Clostridium Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 144 perfringens phân lập được”, Luận án tiến sĩ nơng nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, 159 tr. 24. Phạm Ngọc Thạch (1998), “Một số chỉ tiêu lâm sàng, phi lâm sàng ở trâu viêm ruột ỉa chảy và biện pháp phịng trị”, Luận án tiến sĩ nơng nghiệp, Trường ðại học Nơng nghiệp I, Hà Nội, 174 tr. 25. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Giáo trình Vi sinh vật Thú y, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 81-85. 26. Nguyễn Như Thanh (2001), Cơ sở của phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 56-57. 27. Chu ðức Thắng, Lê Thị Ngọc Diệp, Bùi Thị Tho, Phạm Ngọc Thạch (2001), “Ứng dụng chế phẩm EM phịng bệnh viêm ruột tiêu chảy ở lợn con theo mẹ”, Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn nuơi – Thú y (1999 – 2001), Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 136-138. 28. Vũ ðình Tơn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy (2008), “ðánh giá hiệu quả xử lý chất thải bằng bể Biogas của một số trang trại chăn nuơi lợn vùng đồng bằng sơng Hồng”, Tạp chí Khoa học và Phát triển. Tập IV, (6), tr. 556-561. 29. Tổng cục thống kê Việt Nam (2009), Số liệu thống kê, 30. Nguyễn Quang Tuyên, ðồn Thị Băng Tâm (1994),“Vai trị của vi khuẩn trong rối loạn tiêu hố ở bê, nghé tại Bắc Thái”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, (1), tr. 24-31. 31. Nguyễn Quang Tuyên (1996), “Nghiên cứu đặc tính của một số chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé và biện pháp phịng trị”, Luận án Phĩ tiến sĩ Khoa học nơng nghiệp, tr. 53-92. 32. ðặng Khánh Vân, Bùi Thị Tho (1995), Tính mẫn cảm và tính kháng thuốc Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 145 của E.coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng ở Trung tâm gia súc Mỹ Văn, Hải Hưng, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội, tr. 110-114. 33. ðỗ ðức Việt (2006), “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hĩa, hình thái máu bị sữa Holstein Friesian (HF) nhập nội nuơi thích nghi ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cơng nghệ cấp Bộ. Mã số B2004 - 32 - 58, 34 tr. 34. Hà Yên (2006), Hơn 10 tỉnh sẽ phải xem xét ngừng nuơi bị sữa. Vietnamnet, 2 tr. Tài liệu tiếng Anh 35. Acres S. D., C. J. Laing, and O. M. Radostits (1975), “Acute undifferentiated neonatal diarrhea in beef calves I. Occurrence and distribution of infectious agents”, Ca. J. Comp. Med., (39), pp. 116-132. 36. Acres S. D., J R. Saunder and O. M. Radostits (1977), “Acute undifferentiated neonatal diarrhea of beef calves: the prevalence of enterotoxigenic E. coli, Reo-like (Rota) virus and other enteropathogens in cow-calf herds”, Can. Vet. J., (18), pp. 113-124. 37. Acres S. D. (1985), “Enterotoxigenic Escherichia coli in newborn calves - A review”, J. Dairy. Sci., (68), pp. 229-256. 38. Bela, N., and Z. F. Peter (2005), “Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine”, Inter. J. Med. Microbiol., (295), pp: 443-435. 39. Benjamin, W. H., C. N. Turnbough, B. S. Posey, and D. E. Briles (1985), “The ability of Salmonella typhimurium to produce siderophore enterobactin, a virulence factors”, Infect. Immun., (50), pp. 392-397. 40. Bradley, S. G. (1979), “Cellular and molecular mechanism of action of bacterial endotoxin”, Ann. Rev. Microbiol., (33), pp. 69-74. 41. Bradshow, M., R. Schneerson, J. C. Parke and J. B. Robbins (1971) Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 146 “Bacterial antigens cross - reactive with the capsular polysaccharide of Haemophilus influenza type B. Lancet,” pp. 1095-1096. 42. Briancesco, R., A. M. Coccia, G. Chiaretti, S. D. Libera, M. Semproni and L. Bonadonna (2008), “Assessment of microbiological and parasitological quality of composted wastes: health implication and hygienic measures”, Waste Management & Research, (26), pp. 196-202 43. Burton, C. H., and C. Turner (2003), “Heath risks from pathogens in livestock manures”, Manure management, treatment strategies for sustainable agriculture, Lister & Durling Printer, Flitwick, Bedford, UK, pp. 109-142. 44. Busque, P., A. Letellier, J. Harel, J. D. Dubrenil (1995), “Production of Escherichia coli ST Enterotoxin is subject to catabolite repression”, Microbiol., (141), pp. 1621-1627. 45. Carter, G. A., and J. R. Cole (1990), Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology, California, USA Academic Press, pp.114- 125. 46. Clarke, R. C., and C. L. Gyles (1993), “Salmonella”, Pathogenesis of bacterial infections in animals, Iowa State University Press, Iowa, pp. 133-153. 47. Clarke, R. C. (1988), “Virulence of wild and mutant strains of Salmonella typhimurium in calves”, J. Med. Microbiol., (25), pp. 139-146. 48. DebRoy, C., and C. W. Maddox (2001), “Identification of virulence attributes of gastrointestinal Escherichia coli isolates of veterinary significance”, Anim. Health. Res. Rev., (2), pp. 129-140. 49. De Graaf, F. K. and I. Roorda (1982), “Production, puricafition and characterization of the fimbrial adhisive antigen F41 isolates from calf Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 147 enteropathogenic Escherichia coli strain B41 M”, Infect. Immun., (36), pp. 751-758. 50. De Rycle J., E. A. Gonzales, and M. Balanco (1990), “ Evidence for two type of cytotoxic necrotizing factors in human and animal clinical isolates of Escherichia coli”, J. Clinical. Microbiol.,( 28), pp. 694-699. 51. Dean, A. G., Y. C. Ching, R.G. William and L.B. Harden (1972), “Test for Escherichia coli enterotoxin using infant mice: application in a study of diarrhea in children in Honolulu”, J. Infect. Dis., (125), pp. 407-411. 52. Dubreuil, J. D., J. M. Fairbrother, R. Lallier, and S. Lariviere (1991), “Production and purification of heat stable enterotoxin from a porcine Escherichia coli”, Infect. Immun, (60), pp. 3953-3961. 53. Dubreuil, J. D., (1997), “Escherichia coli STb enterotoxin”, Microbiolgy (143), pp. 1783-1795. 54. Duchet-Suchaux, M., A. Bertin and G. Dubray (1988), “Morphological description of surface structures on strain B41 of bovine enterotoxigenic Escherichia coli bearing both K99 and F41 antigens”, Infect. Immun., (134) 983-995. 55. Duchet-Suchaux, M. (1992), “Characteristic of enterotoxigenic Escherichia coli bearing F5, F41 antigens”, Infect Immun., (60), pp. 4468-4474. 56. Edwards R. D., and W. H. Ewing (1972), “Indentification of enterobacteriaceae”, Burgess Publishing Company, Minneapolis pp. 163-189. 57. Evans, D. J., D. G. Evans, H. L. Dupont, F. Orskov and I. Orskov (1977), “Patterns loss of enterotoxigenic by E. coli isolated from adults with Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 148 diarrhea: suggestive evidence for an interrelationship with serotype”, Infect. Immun., (17), pp. 105-111. 58. Evans, M. G., G. L. Waxle and J. P. Newman (1986), “Prevalence of K88, K99, and 987P pili of E.coli in neonatal pig with enteric colibacillosis”, Amer. J. Vet. Res., (47), pp. 2431-2434. 59. Ewing, W. H., M. C. Huchs and M. W. Taylor (1952), “Interrelationship of certain Shigella and Escherichia coli cultures”, J. Bacteriol., (63), pp. 319-325. 60. Fishman, P. H. (1990), “Mechanism of action choleratoxin”, American Society for Microbiology, Washington, pp. 129-140. 61. Frost, A. J., A. P. Bland, T. S. Wallis (1997), “The early dynamic response of the calf ileal ephithelium to Salmonella typhimurium”, Vet. Pathol., (34), pp. 369-386. 62. Gaastra, W., and F. De Graaf (1982), “Host-specific fimbrial adheshins of noninvasive enterotoxigenic Escherichia coli strains”, Microbiol. Rev., (46), pp. 129-161. 63. Ghazifard, A., R. K. Kermashahi, Z. E. Far (2001), “Identification of thermophilic and mesophilic bacteria and fungi in Esfahan (Iran) municipal solid waste compost”, Waste Management & Research, (19), pp. 257-261. 64. Giannella, R. A. (1976), “Suckling mouse model for detection of heat- stable Escherichia coli enterotoxin: characterstic of the model”, Infect. Immun., (14:95-99. 65. Gibson, E. A. (1961), “Symposium: Salmonellosis in man and animals. 1. Salmonellosis in caves”, Vet. Rec., (73), pp. 1284-1295. 66. Guinee, P. A. M., J. Veldkamp and W. H. Jansen (1977), “Improved Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 149 Minca medium for the detection of K99 antigen in calf enterotoxigenic strains of Escherichia coli isolated from calves and correlation with enterotoxigenicity”, Infect. Immun., (13), pp. 1369-1377. 67. Guler, L., K. Gunduz and U. Ok (2008), “Virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from calves in Turkey”, Zoonoses Public Health, (58), pp. 249-257. 68. Gyles, C. L., (1992), Escherichia coli cytotoxin and enterotoxin, Can. J. Microbiol., (53), pp. 734-746. 69. Gyles, C. L., and C. O Thoen (1993), “Escherichia coli”, Pathogenesis of bacterial infection in animals”, Iowa State University Press, USA, pp. 164-187. 70. Gyles, C. L., and C. O Thoen (1993), “Salmonella”, Pathogenesis of bacterial infection in animals, Iowa State University Press, USA, pp. 133-163. 71. Hanajiama, D., S. Haruta, T. Hori, M. Ishii, K. Haga and Y. Igarashi (2009), “Bacterial community dynamics during reduction of odourous compound in aerated pig manure slurry”. Waste Management & Research, (106), pp. 118-129. 72. Isaacson, R. E. (1977), “K99 surface antigen of Escherichia coli, purification and partical characterization”, Infect. Immun., (15), pp. 272-279. 73. Isaacson, R. E., H. W. Moon and R. A. Schneider (1978), “Distribution and virulence of Escherichia coli in the small intestine of calves with and without diarrhea”, Amer. J. Vet. Res., (39), pp. 1750-1755. 74. Jacks, T. M., and B. J. Wu (1974), “Biochemical properties of Escherichia coli low-molecula-weight, heat stable enterotoxin”, Infec. Immun., (9), pp. 342-347. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 150 75. Jones, C. H., F. Jackob-Dubuisson, K. Dodson and L. Solonim (1992), “Adhesin presentation in bacteria requires molecular chaperones and ushers”, Infect. Immun., (60), pp. 4445-4451. 76. Karmali, M. A. (1989), “Infection by verocytotoxin - producing Escherichia coli”, Clin. Microbiol. Rev., (2), pp. 15-38. 77. Kauffmann, F. (1949), “On the serology of the Klebsiella group”, Acta. Pathol. Microbiol. Scand., (26), pp. 381-406. 78. Kiyohiko Nakasaki, A. Ohtaki, H. Takano (2001), “Effec of bulking agent on the reduction of NH3 emissions during thermophilic composting nigh-soil sludge”, Waste Management & Research, (19), pp. 301-307. 79. Kuehne, R. W. (1983), “Rapid determination of Log10 50% Lethal Doses or 50% infective doses”, J. Clin. Microbiol., (17), pp. 702-703. 80. Lance, S. E., G. Y. Miller, D. D. Hancock, P. C. Bartlett and L. E. Heider (1992), “Salmonella infection in neonatal dairy calves”, Vet. Med. Assoc., (201), pp. 864-868. 81. Lasaro, M. A., C. M. Santos, J. F. Rodrigues, and L. C. S. Ferreira (2009), “Functional and immunological characterization of a natural polymorphic variant of a heat-labile enterotoxin (LT-I) produced by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)”, FEMS Immunol. Med. Microbiol., (55), pp. 93-99 82. Laviriere, S., R. Lallier and M. Morin (1979), “Evoluation of various methods for the detection of enterotoxigenic Escherichia coli in diarrhea calves”, Amer. J. Vet. Res., (40), pp. 130-134. 83. Maria, E. S., L. T. Lemos, A. Cristina Cunha – Queda, O. C. Nunes (2009), “Co-composting of poultry manure with low quantities of Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 151 carbon – rich materials”, Waste Management & Research, (27), pp. 119-128. 84. Mayer, H., C. Rapin, G. Schmidt and H. G. Boman (1976), “Immunochemical studies on lipopolysaccharide from wild-type and mutants of Escherichia coli K-12”, Eur. J. Biochem., (66), pp. 357-358. 85. Methyiapun, S., I. F.L. Pohlenz and H. U. Bertschingger (1984), “Ultrastructure of the intestine mucose in pigs experimentally inoculated with an edema disease-producing strain of Escherichia coli”, Vet. Pathol., (21), pp. 516-520. 86. Ministry of Agriculture, Food and Fisheries, Canada (2006), On – Farm Composting Hand Book. Northeast Regional Agricultural Engineering Services, 186 p. 87. Misra, R. V., and R. N. Roy (2006), “On - Farm Composting Methods” F.A.O. , Rome, 26 p. 88. Moon, H. W., S. C. Whipp and S. M. Skartvedt (1976), “Etiologic diagnosis of diarrheal diseases of caves: frequency and methods for detecting enterotoxin and K99 antigen production by Escherichia coli”, Amer. J. Vet. Res., (37), pp. 1025-1029. 89. Moon, H. W., B. Nagy, R. E. Isacson and O. Ida (1977), “Occurrence of K99 antigen on Escheriachia coli iaolated from pig and colonisation of pig ileuum by K99+ enterotoxigenic E.coli from calves and pigs”, Infect. Immun., (15), pp. 614-620. 90. Morin, M., S. Lariviere and R. Lallier (1976), “Pathological and microbilogical observations on spontaneous case of acute neonatal calf diarrhea”, Can. J. Comp. Med., (40), pp. 247-251. 91. Murray, C. J., (1987), “Detection of K88 and K99 fimbrial antigens on Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 152 Escherichia coli by coagglutination”, Aust. Vet. J., (64), pp. 239-240. 92. Myers, L. L., and P. A. N. Guinee (1976), “Occurrence and characteristics of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from calves with diarrhea”, Infect. Immun., (13), pp. 1117-1119. 93. Myers, L. L. (1980), “Enteric colibacillosis in calves: immunogenicity and antigenicity of Escherichia coli antigens”, Amer. J. Vet. Res., (39), pp. 761-765. 94. Nagi, A. A., N. S. Mariana, A. R. Raha, and Z. Ishak (2008), “Detection of diarrheagenic Escherichia coli isolated using molecular approaches”, Res. J. Microbiol., (3), pp. 359-367. 95. Nagy, B., T. A. Casey, S. C. Whipp, and H. W. Moon (1992), “Susceptibility of porcine intestine topilus-mediated adhesion by some isolates of piliated enterotoxigenic Escherichia coli increase with age”, Infect. Immun., (60) pp. 1285-1294. 96. Nakazawa N., N. Hisshasi (1982), “Enterophathogenic Escherichia coli”, Jap. J. Vet. Sci., (45), pp. 178-191. 97. Nguyen Xuan Thanh and Ninh Minh Phương (2008), Effects of multiple- purpose microoganic compost B2006-32-21 on paddy rice in degraded and alluvial soil in the North of Vietnam. Journal of Science and Development, (2), pp. 119-122. 98. Orskov, F. (1962), “Studies on a number of Escherichia coli strains belonging to O group 86”, Acta. Pathol. Microbiol. Scand., (55), pp. 99-109. 99. Orskov, I., F. Orskov, B. Jann and K. Jann (1977), “Serology, chemistry and genetic of O and K antigens of E.coli”, Bacteriol. Rev., (41), pp. 667-710. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 153 100. Patrick, A. D. G., and Francois - Xavier Weill (2007), “Antigenic formular of the Salmonella serovar”, 9th ed, W.H.O. collaborating center for reference and research on Samonella, Pari, Institute Pasteur, 166 p. 101. Peterson, J. W., and L. G. Ochoa (1989), “Role of prostagladin and cAMP in the secretory effects of choleratoxin”, Science, (245), pp. 867- 859. 102. Pham Hong Ngan, Nguyen Thu Thuy, Nguyen Thị Trang, Nguyen Thị Hoang Yen, Nguyen Thị Hong Chien, Aldrew Almond (2009), “To evaluate the effectiveness of aerobic composting process on carcass degradation of poultry, pathogen reduction potention and odour release”, Project report in cooperation between FAO Hanoi and Faculty of Veterinary Medicine, Hanoi University of Agriculture, 42 p. 103. Quinn, P. J., M. E. Carter, B. Markey and R. G. Carter (1994), “Bacterial cell counting technique”, Clinical Veterinary Microbiology, Wolfe Publishing, Mosby – Year Book Europe Limited, England, pp. 61-66. 104. Quinn, P. J., M. E. Carter, B. Markey, G. R. Carter (1994), “Enterobacteriaceae”, Clinical Veterinary Microbiology, Wolfe Publishing, Mosby – Year Book Europe Limited, England, pp. 209-236. 105. Radostits, O. M., D. C. Blood, and C. C. Gay (1994), “Colibacillosis of newborn calves, piglets, lambs and foals”, Veterinary Medicine - A Textbook of the Diseases of Cattle, Sheep, Pigs, Goats and Horses, Bailliere Tindall, Great Britain by The Bath Press, pp. 707-730. 106. Rahman, H., V. B. Singh, V. D. Sharma, and S. D. Harne (1992), “Salmonella cytotonic and cytolytic factor, their detection in Chinese Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 154 hamster ovary cells and antigenic relatedness” Vet. Microbiol., (31), pp. 397-398. 107. Reed, L. J., and H. Muench (1938), “A simple method of estimating fifty percent endpoints”. Amer. J. Hygiene., (27), pp. 493-497. 108. Schalm, O. V. (1964), “A simple and rapid method for staining blood films with new methylene blue”, J. Amer. Vet. Med. Ass., (145), pp. 1184-1190. 109. Schalm, O. V., N. C. Jain, E. J. Carroll (1975), “The leukocytes: structure, kinetics, function, and clinical interpretation”, Veterinary Hematology, Lea & Febiger, Philadelphia, Printed in the United State of America, pp. 471 – 538. 110. Schalm, O. V., N. C. Jain, E. J. Carroll (1975), “The plasma protein”, Veterinary Hematology, Lea & Febiger, Philadelphia, Printed in the United State of America, pp. 602-630. 111. Schifferli, D. M., E. H. Beachay, and R. K. Taylor (1991), “Genetic analysis of 987 adhesion and fimbriation of Escherichia coli: The fas genes link both phenotypes”, J. Bacteriol., (173), pp. 1230-1240. 112. Schneider, R. A., and S. C. M. To (1982), “Enterotoxigenic Escherichia coli strains that express K88 and 987P pilus antigens” Infect. Immun., (36), pp. 417-418. 113. Sojka W. J., (1965). Escherichia coli in domestic animals and poultry. Weybridge, England. Commenwealth Agricultural Bureau, pp. 36-45. 114. Sojka, W. J., (1971), “Enteric disease in newborn piglets, calves and lambs due to Escheriachia coli infection”, Vet. Bull., (41), pp. 509-522. 115. Stephen, J., and M. P. Osborne (1988), Pathophysiological mechanism of diarrhea disease. IRL press. Washington D. C., pp: 149-169. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 155 116. Steven, W. D., Robert, L. Jones and A. Rosychuk (1989), “Bacteriological specimens selection, collection, and transport for optimum results”, Small Animal, (11), pp. 686-701. 117. Stirm, S., I. Orskov, F. Orskov (1967), “Episome-caried surface K88 of Escherichia coli, isolated and chemical analysis”, J. Bacteriol., (93), pp. 731-739. 118. Sunderman, F. W. (1953), “Symponium on clinical hemoglobinometry”, Amer. J. Clin. Path., (23), pp. 519-524. 119. Suvawamy, S., and C. L. Gyle (1976), “Characterzation of enterotoxigenic bovine Escherichia coli” Can. J. Comp. Med., (40), pp. 247-251. 120. Suvawamy, S., and C. L. Gyle (1976), “The prevalence of enterotoxigenic Escherichia coli in the feces of calves with diarrhea” Can. J. Comp. Med., (40), pp. 241-246. 121. Timoney, J. F., J. H. Gillespie, F. W. Scott, J. E. Barlough (1988), “The Enterobacteriaceae – The Lactose Fermenters”, Hagan and Bruner’s microbiology and infectious diseases of domestic animals. Ithaca and London Comstock Publishing Associates. A Division of Cornel University Press, pp. 61-71. 122. Timoney, J. F., J. H. Gillespie, F. W. Scott, J. E. Barlough (1988), “The Enterobacteriaceae – The Non Lactose Fermenters”, Hagan and Bruner’s microbiology and infectious diseases of domestic animals, Ithaca and London Comstock Publishing Associates. A Division of Cornel University Press, pp. 74-88. 123. Urban, R. G., L. A. Dreyfus and S. C. Whipp (1990), “Contruction of a bifunctional Escherichia coli heat - stable enterotoxin (STb) alkaline phosphatase fusion protein” Infect. Immun., (50), pp. 307-313. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 156 124. Ueda, H., N. Terakado, T. Sekizaki, K. Hashimoto and K.Takesue (1982), “Distribution of enterotoxigenic Escherichia coli in diarrheal calves and healthy cattle”, Jpn. J. Vet. Sci., (44), pp. 751-757. 125. Varnam, A. H., and M. G. Evan (1996), “Escherichia coli”, Foodborne pathogens, Monson Publishing, Corringham Road, London, UK, pp. 101-128. 126. Waltner-Tower, D., S. W. Martin, and A. H. Meek (1986), “An epidemiological study of selected calf pathogens on Holstein dairy farms in Ontario”, Amer. J. Vet. Res., (50), pp. 307-313. 127. Wintrobe, M. M. (1929), “The volum and hemoglobin content of the red blood corpuscle”, Amer. J. Med. Sci., (177), pp. 513-519. 128. Wray, C., and W. J. Sojka (1977), “Reviews of the progress of dairy science: bovine Salmonellosis”, J. Dairy Res., (44), pp. 383-425. 129. Wray, C., I. M. McLaren and P. J. Caroll (1993), “Escherichia coli isolated from farm animals in England and Wales between 1986 and 1991”, Vet. Rec., (133), pp. 439-442. 130. Zeman, D. H., J. U. Thomson, D. H. Fransis (1989), “Diagnosis, treatment and management of enteric colibacilosis” Veterinary Medicine, (84), pp. 794-802. Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 157 PHỤ LỤC Phụ lục 1 Sơ đồ 1. Phân lập và giám định vi khuẩn E.coli (Theo Carter và Cole, 1990) ðộc tố ruột (enterotoxin) Mẫu xét nghiệm Mơi trường MacC Mơi trường EMB Mơi trường BGL Mơi trường TSI Indole MR VP C Ureaza Lên men đường Kiểm tra đặc tính gây bệnh Kháng nguyên pili Mơi trường TSA Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 158 Phụ lục 2 Sơ đồ 2. Xác định kháng nguyên pili của vi khuẩn E.coli (Theo Murray, 1987) Vi khuẩn E.coli Kháng thể đồng ngưng kết Mơi trường Minca (370C, 24h) F5 F41 F6 F5 + F41 Phản ứng đồng ngưng kết trên phiến kính ðối chứng dương ðối chứng âm Kết luận, giữ giống Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 159 Phụ lục 2 Sơ đồ 3. Phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella (Theo Quinn và cộng sự, 1994) Mẫu xét nghiệm Muller Kauffmann (24-48h) Mơi trường MacCA Mơi trường XLD Mơi trường BGA Mơi trường TSI Hình thái Indole MR VP C Ureaza Lên men đường ðịnh type Trường ðại học nơng nghiệp Hà Nội - Luận án tiến sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 160 Phụ lục 3 Sơ đồ 4. Phát hiện và đếm số vi khuẩn hiếu khí, E.coli, Salmonella (Theo Quinn và cộng sự, 1994). Mẫu xét nghiệm Pha lỗng theo đậm độ thập phân Cấy 0,1ml MacC ðếm số khuẩn lạc E.coli BGA ðếm số khuẩn lạc Salmonella PCA ðếm khuẩn lạc Kiểm tra đặc tính sinh hĩa. Xác định tỷ lệ Kiểm tra đặc tính sinh hĩa. Xác định tỷ lệ Tính tốn kết quả ._.